Open Access

Kirsten Oesterwind

• The brain is characterized by its immune privileged state. However, recent studies suggest an extended contribution of hematopoietic cells to the brain. After transplantation of genetically labeled bone marrow into bone marrow depleted mice, not only labeled blood cells but also labeled neurons and other non-hematopoietic cells can be observed. Initially interpreted as transdifferentiated hematopoietic stem cells, this contribution later was identified as cell fusion of hematopoietic cells and neurons. Our lab previously addressed the question whether these fusion events also occur under non-invasive conditions. A Cre-LoxP based transgenic mouse line was used to irreversibly label all hematopoietic cells. In these mice, Cre expression is controlled by a hematopoietic promoter, thus causing recombination and subsequent marker gene expression restricted to blood cells. Interestingly, contribution of these hematopoietic cells to non-hematopoietic tissues was observed, but fusion could be excluded as the underlying mechanism. The Cre mRNA or protein seems to reach the non-hematopoietic cells from an external source. Extracellular vesicles, specifically exosomes, are increasingly recognized as a vehicle for the intercellular transfer of cellular components such as proteins or mRNAs. However, if they contribute to signaling between tissues in vivo is completely unknown and would represent a major paradigm shift for intercellular communication. Therefore, the aim of this PhD study is to investigate whether an exosomal transfer between the hematopoietic system and the brain exists. To confirm the previous results, a second Cre-LoxP mouse line that expresses the Cre recombinase under a different hematopoietic promoter is used additionally. Both mouse lines are screened for recombination and show comparable numbers and types of different non-hematopoietic cells. Besides hepatocytes and cells in lung and intestine, recombined Purkinje neurons in the cerebellum are detectable. To assess the influence of inflammation on these recombination events, different lesions such as peripheral tumors or peritonitis are applied to the mice. Inflammatory stimuli strongly increase the numbers of recombined Purkinje neurons. These neurons remain mononuclear, indicating that fusion does not occur. Also in human cerebellar material, no evidence for inflammation induced cell fusion is detectable. To screen for Cre recombinase containing exosomes, exosome purification protocols such as differential ultracentrifugation and sucrose gradient fractioning, are applied. The exosomal content is analyzed with nested PCR and western blot. Hematopoietically expressed Cre mRNA is detectable in blood plasma and hematopoietic cell culture conditioned medium. Further analysis reveals that this Cre mRNA but no Cre protein is contained in exosomes. The exosomal ability to induce recombination is investigated by injections into Cre reporter mice. After direct cerebellar injection, exosomes are sufficient to induce recombination of Purkinje neurons. Brain tissue of mice that received an inflammation is analyzed further to reveal other recombined cell types. The main immune cells of the brain, microglia, are not recombined. Mainly neuronal cell types are recombined in different areas of the brain. The observations made in this study are consistent with the hypothesis that a previously unrecognized way to communicate RNA based signals between the immune system and the brain exists. Specifically neurons are target cells for the uptake of hematopoietic exosomes and seem able to translate exosomal mRNA into functional protein. Microglial cells are neither involved as target cells, nor do they release Cre containing exosomes. By using the Cre-LoxP system, in vivo tracing of exosomes could be achieved for the first time. With this knowledge, other exosomal routes can be uncovered in future. The discovery of the exosomal transfer between the blood and the brain enables further research about the relevance of this signaling pathway. It will be important to investigate its role especially in the context of neural malfunctions and further studies might help to find new therapeutical approaches.
• Nur wenige Zellen hämatopoetischen Ursprungs infiltrieren das Hirngewebe, es wird daher als immunprivilegiert bezeichnet. Die Interaktionen zwischen Blut- und Hirnzellen sind dennoch enger als lange angenommen. Sekretierte Faktoren wie Zytokine gelangen von der Peripherie ins Gehirn und beeinflussen neurale Funktionen. Eine Beteiligung des Immunsystems an verschiedenen neurologischen Erkrankungen ist bekannt, wenn auch nicht vollständig verstanden. Hinweise auf diese direkte Beteiligung von hämatopoetischen Zellen am neuronalen Netzwerk des zentralen Nervensystems gab es in Studien, die sich mit der Plastizität hämatopoetischer Zellen beschäftigten. Das gesamte hematopoetische System tödlich bestrahlter Empfängermäuse wurde durch Transplantation von GFP-markiertem Knochenmark wiederhergestellt. Alle daraufhin gebildeten hämatopoetischen Zellen waren durch die GFP-Markierung in anderen Geweben detektierbar. Im Kleinhirn fanden sich GFP-exprimierende voll ausgebildete Purkinjeneurone. Zuerst wurde angenommen, dass es sich bei diesen Zellen um transdifferenzierte hämatopoetische Zellen handelt. Eine genauere Analyse der betroffenen Neurone zeigte, dass diese Zellen zwei Kerne besitzen. In einer Transplantationsstudie, bei der anhand unterschiedlicher Markierungssysteme Zellfusion von Transdifferenzierung unterschieden werden konnte, wurde daraufhin bestätigt, dass die markierten Zellen durch Fusion entstanden sind. Allogene hämatopoetische Zellen fusionierten mit Purkinjeneuronen und führten auf diese Weise zur Markerexpression in diesen Zellen. Eine dieser Doktorarbeit vorausgegangene Veröffentlichung unseres Labors beschäftigte sich mit der Frage, ob hämatopoetische und nicht-hämatopoetische Zellen auch unter endogenen, nicht-invasiven Bedingungen fusionieren. Um endogene Blutzellen verfolgen zu können wurde ein transplantationsunabhängiges Cre-LoxP Maussystem verwendet. Cre-Rekombinase wird in diesem System unter der Kontrolle eines hämatopoetischen Promotors transkribiert und daher nur in hämatopoetischen Zellen exprimiert. Es erkennt LoxP-Stellen im Genom, die ein Stop-Codon flankieren, welches die Expression eines Reportergens (β-Gal oder GFP) unterdrückt. Nach erfolgter Rekombination, das heißt nach dem Entfernen von Teilen der LoxP-Stellen inklusive des Stop-Codons, kommt es zu einer irreversiblen Expression des Markergens unabhängig vom Zelltyp. Mit Hilfe dieses Systems konnten Fusionsereignisse zwischen hämatopoetischen und nicht-hämatopoetischen Zellen unter endogenen, nicht-invasiven Bedingungen untersucht werden. Tatsächlich war ein hämatopoetischer Beitrag zu nicht-hämatopoetischen Zellen wie den Purkinjeneuronen detektierbar. Die markierten nicht-hämatopoetischen Zellen wiesen jedoch keinerlei Anzeichen für eine vorausgegangene Zellfusion auf. Die Cre-Rekombinase scheint auf einem anderen Weg, etwa einem interzellulären Transfer, in die nicht-hämatopoetischen Zellen gelangt zu sein. Interzellulärer Transfer von Zellbestandteilen wie Proteinen und mRNAs kann von extrazellulären Vesikeln durchgeführt werden. Eine Subkategorie dieser Vesikel sind Exosome. Sie sind endosomalen Ursprungs und werden aus multivesikulären Körperchen in den Extrazellulärraum freigegeben. Exosome enthalten diverse Lipide, Proteine und RNA Spezies, mit denen sie gezielt beladen werden. Diese exosomale Fracht kann von Zielzellen aufgenommen werden. In vitro wurde zudem nachgewiesen, dass eine Translation der exosomal transportierten mRNA in der Zielzelle möglich ist. Exosome werden unter anderem von hämatopoetischen Zellen abgegeben. Bei immunologischen Fragestellungen ist ihre Funktion am besten untersucht, sie scheinen aber auch in anderen Systemen, z.B. im neuralen System, eine Rolle zu spielen. Das Ziel dieser Arbeit besteht darin, unter Verwendung des Cre-LoxP Maussystems herauszufinden, ob es einen exosomalen Transfer zwischen dem hämatopoetischen System und dem Gehirn gibt. Mittels Vav1Cre-RosaLacZ/GFP-Mäusen wurde bereits gezeigt, dass ein hämatopoetischer Beitrag zu nicht-hämatopoetischen Geweben stattfindet, der nicht auf Zellfusion beruht. Diese Daten werden in der vorliegenden Arbeit bestätigt. Um sie weiter zu untermauern wird eine zweite Mauslinie (Tie2Cre-RosaLacZ/GFP) analysiert. In beiden Mauslinien kann eine Markierung von einzelnen Purkinjeneuronen im Cerebellum nachgewiesen werden. Diese Neurone enthalten keinen zweiten Kern und auch sonst keine Merkmale, die auf eine Zellfusion hindeuten würden. Neben dem Hirn finden sich markierte Zellen in weiteren Organen. In Lunge, Dünndarm und Leber lassen sich markergen-exprimierende Zellen nachweisen. Mehrere Studien berichten dass die Anzahl fusionierter Zellen, wie sie im invasiven Knochenmarktransplantationsmodell vorkommen, durch eine zusätzlich hervorgerufene Entzündung stark erhöht wird. Um den Einfluss von Entzündungen auf einen hämatopoetischen Beitrag an nicht-hämatopoetischen Zellen zu untersuchen, wurden zwei Entzündungsmodelle angewendet. Sowohl bei einer Bauchfellentzündung, als auch bei Mäusen mit einem subkutan gesetzten Lungenkarzinom finden sich stark erhöhte Mengen markierter Purkinjeneurone im Kleinhirn. Die Erhöhung ist in den beiden verwendeten Mauslinien vergleichbar und lässt sich bei akuten Entzündungen bereits drei Tage nach dem Entzündungsstimulus detektieren. Die rekombinierten Zellen weisen alle die Morphologie voll ausgereifter Purkinjeneurone auf. Ein zusätzlicher Nukleus ist, auch nach dem Auslösen der rekombinationsbedingten Zellmarkierung durch die Entzündung, nicht nachweisbar. Dies zeigt, dass im endogenen System auch eine Entzündung nicht zu Zellfusionsereignissen führt. Die Ergebnisse sind daher konsistent mit der Hypothese, dass die Rekombinationen unter endogenen Bedingungen durch exosomalen Transfer hervorgerufen werden. Offensichtich spielen Entzündungsprozesse bei der Rekombination nicht-hämatopoetischer Zellen eine entscheidende Rolle. Dies deutet auf eine physiologische Relevanz des Transfers von Cre-Rekombinase hämatopoetischen Ursprungs zu Neuronen und anderen nicht-hämatopoetischen Zellen hin. Exosomensekretion kann durch Entzündungsprozesse moduliert werden. Zudem stellen Exosome einen Transportmechanismus dar, der für einen interzellulären Transfer der Cre-Rekombinase in Frage kommen könnte. Ein exosomaler Transfer zwischen Blut- und Hirnzellen ist bislang nicht beschrieben. Überhaupt gibt es bislang keine in vivo-Daten zu endogener exosomaler Signalübertragung. Um Cre mRNA in hämatopoetischen Exosomen nachzuweisen wird sowohl Plasma von peripherem Blut als auch Kulturüberstand von primären Blut- und Knochenmarkszellen untersucht. In beiden zellfreien Flüssigkeiten kann Cre mRNA detektiert werden. Diese übersteht zudem einen RNase-Verdau, was darauf hinweist, dass die RNA geschützt sein muss, wie es etwa durch eine umgebende Vesikelmembran der Fall wäre. Weitere exosomenspezifische Aufreinigung mittels differenzieller Ultrazentrifugation zeigt, dass die mRNA sich nach der Ultrazentrifugation im Pellet, nicht aber im Überstand befindet. Dies sind weitere Indizien für eine exosomale Lokalisation der mRNA. Im Ultrazentrifugationspellet lassen sich zudem mittels elektronenmikroskopischer Untersuchung und „Nanoparticle tracking“ Analyse 50 bis 100 nm große, becherförmige Vesikel nachweisen, die der Größe und Morphologie von Exosomen entsprechen. Um eine genauere Charakterisierung der mRNA enthaltenen Vesikel vorzunehmen, wird zusätzlich eine Fraktionierung der Pellets mittels eines Dichtegradienten durchgeführt. Auch diese Analyse bestätigt anhand der Vesikeldichte und des Vorhandenseins exosomenspezifischer Marker, die exosomale Identität der Vesikel im Pellet. In den Exosomen wiederum kann Cre mRNA, aber kein Cre Protein nachgewiesen werden. Um zu testen, ob Exosomen in der Lage sind, durch Transfer von Cre mRNA eine Rekombination in Purkinjeneuronen auszulösen, werden sie in Cre-Reportermäuse (RosaLacZ) injiziert. Nach intravenöser Injektion lassen sich keine rekombinierten Zellen finden. Weder im Hirn noch in anderen Organen kommt es zur Markerexpression. Injektionen direkt ins Kleinhirn führen jedoch zur Rekombination einzelner Purkinjezellen. Dies deutet darauf hin, dass die Rekombinationsereignisse in Vav1iCre-RosaLacZ/GFP- und Tie2Cre-RosaLacZ/GFP-Tieren auf exosomalen Transfer von Cre-Rekombinase mRNA zurückzuführen sind. Da die exosomenvermittelte Rekombination von Purkinjeneuronen mit Entzündungsprozessen einhergeht, wurde die Rolle der mikroglialen Zellen näher betrachtet. Diese Immunzellen des zentralen Nervensystems zeigen allerdings keine Rekombination. Das bedeutet, sie sind an dieser spezifischen Signalübertragung nicht beteiligt. Trotz ihrer, durch in vitro Studien belegten Fähigkeit Exosome aufzunehmen und abzugeben, findet eine Aufnahme und Prozessierung der Cre mRNA enthaltenden hämatopoetischen Exosomen nicht statt. Weiter können Mikroglia als Quelle Cre mRNA enthaltender Exosome im Gehirn, und damit als Grund für die Rekombination von Neuronen, ausgeschlossen werden. Rekombination im Hirn ist nicht auf Purkinjeneurone beschränkt. In den Vorderhirnen der Mäuse die einen entzündlichen Stimulus erhalten haben, zeigen sich ebenfalls viele rekombinierte Zellen. In verschiedenen Hirnbereichen lassen sich markierte Zellen finden, die zumeist als Neurone identifiziert werden können. Dies deutet eine spezifische Auswahl von Empfängerzellen an. Verschiedene induzierte Entzündungen führen alle zu übereinstimmender Erhöhung der Purkinjezellrekombination. Daher war von Interesse, ob jede Art der Verletzung, auch ohne massive systemische Entzündungsreaktion, zu einer vermehrten Markierung der Purkinjezellen führt. Um eine örtliche, zelltypbeschränkte Läsion hervorzurufen wird das MPTP-Neurotoxinmodell angewendet. Bei diesem Parkinson-Mausmodell degenerieren spezifisch dopaminerge Neurone, ohne eine systemische Entzündung hervorzurufen. Die Analyse der Cerebella zeigt dabei keine Erhöhung der Anzahl rekombinierter Purkinjezellen. Im Vorderhirn selbst zeigt sich ein Rekombinationsmuster das mit den Entzündungsmodellen vergleichbar ist. Neurone in der Substantia nigra und im Ventralen tegmentum, den Bereichen, die von MPTP betroffen sind, exprimieren den Marker. Dies zeigt, dass die Art der Entzündung relevant ist und auf die Auswahl der Zielzellen dieses Signalwegs einen Einfluss hat. Zusammenfassend wird ein bisher unbekannter Signalweg zwischen dem hämatopoetischen System und dem Hirn identifiziert. Die Nachverfolgung exosomalen Transfers in vivo wird mittels des Cre-LoxP-Systems im endogenen System erstmals ermöglicht. Durch Verwendung weiterer Cre exprimierender Maus- und Zelllinien können zukünftig unterschiedliche exosomale Signalwege mit Beteiligung verschiedenster Zell- und Gewebetypen entdeckt und untersucht werden. Im hier detektierten Signalweg zwischen Blut und Hirn wird die Abgabe von hämatopoetischen Exosomen durch inflammatorische Prozesse stimuliert. Die Exosomen enthalten Proteine und RNAs, die von den Zielzellen aufgenommen und weiterverwendet werden. Bei den Zielzellen handelt es sich überwiegend um Neurone, mikrogliale Zellen sind nicht involviert. Die Entdeckung dieses exosomalen Transfers eröffnet Möglichkeiten herauszufinden, ob er eine physiologische Rolle spielt. Das Verständnis über diese enge Kommunikation des Immunsystems mit dem Gehirn eröffnet möglicherweise neue Einblicke in Krankheitsprozesse oder hilft bei der Entwicklung neuer therapeutischer Ansätze.