Strukturelle Organisation und Mobilisierung des Primaten-spezifischen Non-LTR-Retrotransposons SVA

  • SVA-Elemente repraesentieren die juengste Familie der Non-LTR-Retrotransposons, welche das humane Genom fortwaehrend modifizieren. SVA-Elemente zeichnen sich durch ihre Organisation aus zusammengesetzten repetitiven Elementen aus. Um Rueckschluesse auf den Assemblierungsprozess, der zur gegenwaertigen Organisation der SVA-Elemente fuehrte, und ueber transkriptionelle Regulation dieser Elemente zu ziehen, wurden Unterschiede in der Struktur der 116 SVA-Elemente, die auf humanem Chromosom 19 lokalisiert sind, detailliert untersucht. SVA-Elemente konnten in sieben unterschiedliche Strukturvarianten eingeteilt werden, einschliesslich neuer Varianten wie SVA2, 3`-verkuerzte Elemente und Elemente mit 5`- flankierenden Transduktionen. Ich habe auch eine extrem erfolgreiche human-spezifische 5`-Transduktionsgruppe identifiziert, SVA_F1, die trotz ihres jungen evolutionaeren Alters ca. 32% aller Mitglieder der SVA-Subfamilie SVA_F umfasst. Die transkriptionelle Kontrolle einer retrotransponierten und 5`-verkuerzten SVA_F-Kopie durch den Promotor des MAST2-Gens diente als urspruengliches Source-Element dieser umfangreichen 5`- Transduktionsgruppe, die mindestens 84 Elemente einschliesst. Die zusaetzlichen 5`- sowie 3`-Transduktionsereignisse der vollstaendigen Alu-Sequenzen bei Mitgliedern der SVA_F1-Transduktionsgruppe 4 weisen auf ihre wichtige Rolle in der erfolgreichen Expansion im humanen Genom hin. Diese nachtraeglich erworbenen Alu-Sequenzen machen SVA_F1-Familienmitglieder offensichtlich zum besseren Substrat fuer die Trans- Mobilisierung durch die L1-Proteinmaschinerie. Die unterschiedlichen konsekutiven 5`- Tansduktionsereignisse der SVA_F1-Familienmitglieder deuten auf transkriptionelle Kontrolle ihrer Source-Elemente durch eine Vielzahl externer zellulaerer Promotoren hin, die im Laufe der Evolution in Keimzellen aktiv waren. Ausserdem zeigt die Existenz von 5`-Transduktionen, dass SVA-Elemente sich die 5`-flankierenden Sequenzen aneignen koennen. Die Daten zeigen auch, dass SVA-vermittelte 5-Tansduktionsereignisse alternatives RNA-Spleissen an putativen Spleissstellen involvieren. Aus der EST- Datenbankanalyse ist ersichtlich, dass Mitglieder der SVA_F1-Subfamilie auch gegenwaertig transkribiert werden. SVA-Elemente sind hoch aktiv im humanen Genom, aber der Mechanismus ihrer Retrotransposition wurde bislang nicht aufgeklaert. Vorangehende Analysen genomischer SVA-Kopien liessen auf eine L1-vermittelte Mobilisierung schliessen; allerdings wurde der experimentelle Beweis dieser Hypothese bislang nicht geliefert. Mit Hilfe der Zellkultur-basierten Trans-Mobilisierungsassays wurde in dieser Arbeit zum ersten Mal experimentell bewiesen, dass SVA-Elemente tatsaechlich durch die L1-kodierten Proteine in trans mobilisiert werden. Zu diesem Zweck wurden HeLa-Zellen mit einem vollstaendigen oder mit einem 5`-verkuerzten SVA-Retrotranspositionsreporterkonstrukt sowie mit einem L1-Expressionsplasmid bzw. Leervektor kotransfiziert und dann die jeweiligen Raten der SVA-Retrotransposition anhand Neo-resistenter Kolonien, die mindestens ein de novo-Retrotranspositionsereignis widerspiegeln, bestimmt. Die Experimente zeigen, dass die Entstehung der Neo-resistenten Kolonien von der Koexpression L1-kodierter Proteine abhaengig ist. Ich konnte auch zeigen, dass das vollstaendige SVA-Testkonstrukt - im Gegensatz zum 5`-verkuerzten SVA-Konstrukt - mit einer signifikant hoeheren Retrotranspositionsrate als die Kontrollkonstrukte, die zur Generierung der prozessierten Pseudogenformation eingesetzt wurden, trans-mobilisiert wird. Die Ergebnisse der Trans-Mobilisierungsassays belegen, dass SVA-Elemente ein bevorzugtes Substrat fuer die L1-Proteinmaschinerie darstellen, und ihre 5`-Region einschliesslich der Alu-homologen Sequenz fuer die hohe Retrotranspositionsrate essentiell ist. Die elf analysierten SVA de novo-Integrationsereignisse weisen Merkmale der L1- vermittelten Retrotransposition auf, wie Poly(A)-Enden, L1-EN-spezifische Konsensus- Zielsequenz (NNAUNA), Zielsequenz-Verdoppelungen (TSDs), Mikrohomologien und zusaetzliche Guanosin-Nukleotide am 5`-UEbergang. Zusammenfassend demonstrieren die Ergebnisse dieser Studien, dass ein signifikanter Teil der Mitglieder der human-spezifischen SVA-Subfamilie aus transkriptioneller Kontrolle ihrer Source-Elemente durch externe Promotoren hervorgeht. Durch die in dieser Arbeit durchgefuehrten in silico-Analysen wurde auch gezeigt, dass SVA-vermittelte 5`- Transduktionsereignisse zur strukturellen Vielfalt der SVA-Elemente fuehren, und eine neue Art von genomischen Umstrukturierungen darstellen, die zur Plastizitaet des humanen Genoms beitragen. Ausserdem bestaetigen die Ergebnisse der Trans- Mobilisierungsassays die Hypothese, dass SVA-Elemente tatsaechlich durch die L1- kodierte Proteinmaschinerie trans-mobilisiert werden. Dabei sind Module am 5`-Ende der SVA-Elemente fuer diesen Prozess hoechst relevant. Die Ergebnisse der Dualen-Luciferase-Reportergen-Assays unterstuetzen die Hypothese, dass innerhalb der SINE-R-Sequenz von SVA H19_27 cis-aktive Elemente vorhanden sind, die auf aehnliche Weise wie die cis-aktiven Elemente innerhalb der 5`LTR von HERV-K reguliert werden. Ausserdem wurde in dieser Arbeit die Existenz interner reguatorischer Sequenzen innerhalb der SVA-Sequenz bestaetigt. Mit Hilfe der Dualen-Luciferase-Reportergen- Assays konnte zum ersten Mal gezeigt werden, dass SVA-Elemente cis-aktive Elemente enthalten, die hauptsaechlich in der SINE-R-Region lokalisiert sind. Diese cis-aktiven Elemente werden auf aehnliche Weise wie die cis-aktiven Elemente innerhalb der 5`LTR von HERV-K reguliert. Die starke transkriptionelle Aktivitaet des vollstaendigen SVA- Testelements und des L1RP-Promotors in den Teratokarzinom-Zelllinien bekraeftigen die Annahme, dass haeufige SVA-Mobilisierung in Keimzellen durch die gleichzeitig hochregulierte SVA- und L1-Transkription bedingt sein koennte. Es konnte gezeigt werden, dass SVA-Elemente cis-aktive Elemente enthalten, die hauptsaechlich in der SINE-R-Region lokalisiert sind, und auf aehnliche Weise wie die cis- aktiven Elemente innerhalb der 5`LTR von HERV-K reguliert werden. Die starke transkriptionelle Aktivitaet des vollstaendigen SVA-Testelements und des L1RP-Promotors in Teratokarzinom-Zelllinien bestaetigen die Annahme, dass haeufige SVA- Retrotransposition in Keimzellen durch die gleichzeitig hochregulierte SVA- und L1- Transkription bedingt sein koennte.

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Metadaten
Author:Julija Raiz
URN:urn:nbn:de:hebis:30:3-262894
Referee:Gerald G. Schumann, Anna Starzinski-PowitzORCiDGND
Document Type:Doctoral Thesis
Language:German
Year of Completion:2011
Year of first Publication:2011
Publishing Institution:Universitätsbibliothek Johann Christian Senckenberg
Granting Institution:Johann Wolfgang Goethe-Universität
Date of final exam:2011/07/07
Release Date:2012/09/13
Page Number:220 S.
Note:
Diese Dissertation steht außerhalb der Universitätsbibliothek leider (aus urheberrechtlichen Gründen) nicht im Volltext zur Verfügung, die CD-ROM kann (auch über Fernleihe) bei der UB Frankfurt am Main ausgeliehen werden.
HeBIS-PPN:426683854
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Institutes:Biowissenschaften / Biowissenschaften
Dewey Decimal Classification:5 Naturwissenschaften und Mathematik / 57 Biowissenschaften; Biologie / 570 Biowissenschaften; Biologie
Sammlungen:Universitätspublikationen
Sammlung Biologie / Biologische Hochschulschriften (Goethe-Universität; nur lokal zugänglich)
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