Open Access

Matthias Leisegang

• Ribosome biogenesis is best understood in the yeast Saccharomyces cerevisiae. In human or mammalian ribosome biogenesis, it has been shown that basic principles are conserved to yeast, but additional features have been reported. Our understanding about the interplay between proteins and RNA in human ribosome biogenesis is far from complete. The present study focused on the analysis of the human ribosome biogenesis co-factors PWP2, EMG1 and Exportin 5 (XPO5) to understand the degree of conservation of ribosome biogenesis. The proteins were characterized in respect to their localization and interaction partners. For the early 90S co-factor, PWP2, it was possible to pull down and identify the human UTP-B complex with MALDI mass spectrometry. Besides the orthologues of the members of this complex known in yeast (TBL3, WDR3, WDR36, UTP6, UTP18), the human UTP-B complex is not only conserved from yeast to humans, but contains also additional components, like the DEAD-box RNA helicase DDX21, which lacks a yeast orthologue. DDX21 was localized to the nucleus, assembled to the native UTP-B complex and co-precipitated also with other UTP-B complex members, presumably extending the functions of this complex in ribosome biogenesis. This phenomenon was also observed for the 90S co-factor EMG1, an RNA methyltransferase, whose mutant form causes the Bowen-Conradi syndrome, if aspartic acid is mutated to glycine at position 86. This study revealed that the mutant, EMG1-D86G, clearly lost its nucleolar localization and co-precipitated to histones for unknown reasons. A participation of the nuclear export receptor XPO5 in human ribosome biogenesis was shown in this study. Pulldown analysis, sucrose density gradients and UV crosslinking and analysis of cDNAs of XPO5 revealed the involvement of XPO5 in pre-60S subunit maturation. Moreover, besides the known pre-miRNAs and tRNAs as substrates for nuclear export, XPO5 crosslinked to snoRNAs. XPO5 was further demonstrated to interact with the miRNA Let-7a, which has an important regulatory function for MYC, a transcription factor required for ribosome biogenesis. All results support a role of these proteins in human ribosome biogenesis and therefore it seems that the biogenesis of ribosomes in human cells requires additional components, like DDX21 and XPO5.
• Ribosomen sind makromolekulare Komplexe, die aus Ribonukleinsäuren (RNA) und Proteinen bestehen. Während der Proteinsynthese übersetzen diese Komplexe die Nukleotidsequenz der Boten-RNA (mRNA) in die Aminosäuresequenz von Proteinen. Ribosomen sind essentiell und werden benötigt, damit die Zellen wachsen, sich teilen und differenzieren können. Die Biogenese der Ribosomen ist in der Bäckerhefe, Saccharomyces cerevisiae (S. cerevisiae), am besten untersucht. Die Gene, die für die ribosomale RNA (rRNA) kodieren, machen 10% des Hefe-Genoms aus. Deutlich werden der Energieaufwand und die Wichtigkeit der Ribosomenbiogenese durch die große Menge von rRNA (ca. 80%) an der gesamten RNA einer Hefezelle. Ribosomen kommen im Zytoplasma und Mitochondrien sowie bei Pflanzen auch in Chloroplasten vor. Während sich Ribosomen aus Mitochondrien und Chloroplasten und Ribosomen aus Prokaryonten vermutlich sehr ähneln, sind der Aufbau und die Biogenese zytoplasmatischer Ribosomen in Eukaryonten im Vergleich deutlicher komplexer. In S. cerevisiae bestehen zytoplasmatische Ribosomen aus vier rRNAs und 79 ribosomalen Proteinen. Dabei sind die rRNAs 25S, 5,8S und 5S Teil der großen 60S Untereinheit, während die 18S rRNA Teil der kleinen 40S Untereinheit ist. Die Biogenese der Ribosomen beginnt mit der Transkription eines langen, primären Vorläufertranskripts im Nukleolus. Dieses reift in vielen Schritten sequentiell im Nukleolus, Nukleus und Zytoplasma, zu den ribosomalen RNAs. Für die Biogenese werden alle drei RNA Polymerasen (I, II, III), 75 kleine nukleoläre Ribonukleoproteine (snoRNPs) und über 200 nicht-ribosomale Proteine als Kofaktoren benötigt. RNA Polymerase I transkribiert ribosomale Desoxyribonukleinsäure (rDNA), RNA Polymerase III vermittelt die Transkription der 5S rDNA und RNA Polymerase II die Transkription von Protein-kodierenden Genen, deren Produkte unter anderem ribosomale Proteine und Kofaktoren sind. SnoRNPs sind Protein-RNA Komplexe, die spezifische Modifikationen an der rRNA vermitteln. Unter den Kofaktoren sind Helikasen, GTPasen, Nukleasen, RNA modifizierende Enzyme und Exportfaktoren. Mutationen oder Depletionen einzelner Kofaktoren führen oft zu Defekten während der Ribosomenbiogenese und beinträchtigen damit die Funktion von Ribosomen. Im Menschen gibt es viele Krankheiten, welche auf die Defekte während der Ribosomenbiogenese zurückgehen. In der Literatur gibt es einige Veröffentlichungen, die zeigen, dass grundlegende Prinzipien der Ribosomenbiogenese zwischen Hefe und Mensch konserviert sind. Es wurden aber bereits zusätzliche Wirbeltier-spezifische Eigenschaften bzw. Faktoren der Ribosomenbiogenese entdeckt. Die Reifung von Ribosomen in menschlichen Zellen ist prinzipiell ähnlich der Ribosomenbiogenese in Hefe. Sie wird initiiert durch die Transkription des langen primären 47S rRNA Vorläufertranskripts (Prä-rRNA) im Nukleolus durch RNA Polymerase I. Nach Assemblierung der 47S Prä-rRNA mit snoRNPs, ribosomalen Proteinen und einigen Kofaktoren werden (wie in Hefe) die beiden äußeren Bereiche, die 5‘ und 3‘ äußeren transkribierten Platzhalter (ETS), entfernt. Nach Spaltung im inneren transkribierten Platzhalter 1 (ITS1) werden der Prä-40S Partikel und der Prä-60S Partikel voneinander getrennt. Der Prä-40S Partikel wird zum 21S Prä-rRNA, und danach zum 21S-C Prä-rRNA konvertiert und als 18S-E Prä-rRNA Partikel ins Zytoplasma exportiert. Dort findet die finale Reifung zur 18S rRNA Untereinheit statt. Der Prä-60S Partikel reift als 32S Prä-rRNA zur 28S rRNA und über 12S Prä-rRNA und 7S Prä-rRNA zur 5,8S rRNA. Die Assemblierung der 5S rRNA in den 60S Partikel erfolgt im Zellkern vor dem Export in das Zytoplasma. Während des letzten Jahrzehnts hat sich unser Wissen über die Reifung der rRNA und der daran beteiligten Proteine enorm vergrößert. Parallel zu dieser Entwicklung wurde die Ära der Proteomics und Transkriptomics eingeleitet, die auf vielen technischen Innovationen und Verbesserungen auf den Gebieten der Proteinauftrennung, Massenspektrometrie, DNA Sequenzierung und Informatik basiert. Nichtsdestotrotz wurde das Zusammenspiel zwischen Proteinen und RNA sowie Eigenheiten in der menschlichen Ribosomenbiogenese kaum untersucht. Das Ausmaß der Konservierung der Ribosomenbiogenese zwischen Hefe und Mensch ist also weiterhin unklar. Die vorliegende Arbeit befasst sich mit der Analyse der Konservierung der Ribosomenbiogenese zwischen Mensch und Hefe. Dazu wurden drei Proteine, PWP2, EMG1 und XPO5, in menschlichen HEK293T Flp-In T-REx Zellen molekularbiologisch und biochemisch untersucht. PWP2 ist als klassischer 90S Kofaktor bekannt, welcher in Hefe Teil des UTP-B Komplexes ist. Die RNA Methyltransferase EMG1 zählt zu den 90S/40S Kofaktoren in Hefe, und eine Mutation des Proteins an Position 86 führt im Menschen zum Bowen-Conradi-Syndrom. XPO5 besitzt keine Funktion als Kofaktor in der Hefe-Ribosomenbiogenese, ist aber bekannt als Exportfaktor von Präkursor-mikro RNAs (PrämiRNAs) und wurde hier aufgrund der Feststellung eines Zusammenhangs mit der Prä-60S Biogenese in menschlichen Zellen näher untersucht. Zunächst galt es, eine Methode zu entwickeln, um Interaktionspartner dieser Proteine zu isolieren und zu identifizieren. Anschließend wurde im Falle von PWP2 der humane UTP-B Komplex näher charakterisiert, während bei EMG1 das Bowen-Conradi-Syndrom und bei XPO5 dessen Funktion in der Biogenese von 60S Untereinheiten und nicht-kodierenden RNAs untersucht wurde. In der Hefe ist Pwp2 als nukleoläres Protein bekannt, welches essentiell für die Ribosomenbiogenese und vermutlich durch die 5’ ETS mit der 35S Prä-rRNA assoziiert ist. Es ist Teil des UTP-B Komplexes, der neben Pwp2 die Proteine Utp6, Utp12, Utp13, Utp18 und Utp21 beinhaltet. Um Interaktionspartner des humanen PWP2 Proteins zu identifizieren, wurden humane HEK293T Flp-In T-REx (Invitrogen) Zellen mit einem Konstrukt stabil transduziert, welches das humane PWP2 fusioniert an einen His6- Prescission Protease Seite-2xFlag Marker (Flag) enthält. PWP2-Flag assoziierte Proteine wurden über eine Pulldown-Analyse angereichert und entweder über SDS-PAGE, In-Gel Verdau und Matrix-unterstützte Laser-Desorption/Ionisation-time of flight-time of flight (MALDI-TOF-TOF) oder über In-Lösung Verdau und nano-Flüssigchromatographie (nLC) gekoppelt an MALDI-TOF-TOF identifiziert. Als Kontrolle dienten HEK293T Zellen, welche stabil mit einem Konstrukt transformiert wurden, das nur den Flag Marker exprimiert. Neben dem Köderprotein PWP2 konnten die Proteine DDX21, WDR36, WDR3, TBL3, NOP2, FBL und NPM1 identifiziert werden. WDR36, TBL3 und WDR3 sind Orthologe der Hefeproteine Utp21, Utp13 und Utp12 und Bestandteil des Hefe UTP-B Komplexes. Interessanterweise wurden mit den RNA Methyltransferasen FBL und NOP2, sowie mit NPM1 und der RNA Helikase DDX21 vier Proteine identifiziert, welche als zusätzliche Komponenten im humanen UTP-B Komplex in Frage kommen. Zudem besitzen weder NPM1 noch DDX21 ein Hefe Ortholog. In Immunopräzipitationsexperimenten mit PWP2-Flag und DDX21-Flag als Köder konnten die Interaktionen mit WDR36, NOP2 und TBL3 bestätigt werden. Zudem wurden die zwei fehlenden Komponenten aus dem Hefe UTP-B Komplex, UTP6 und UTP18, ebenfalls in Immunopräzipitationsexperimenten als PWP2-Bindeproteine nachgewiesen werden. Davon konnten nur UTP18, aber nicht UTP6 als DDX21- Bindeprotein nachgewiesen werden. Als Negativkontrolle diente das Protein hU3-55k, das in Hefe als Rrp9 bekannt ist. Es ist nicht Teil des Hefe UTP-B Komplexes und zeigte in dieser Studie ebenfalls keine Kopräzipitation mit PWP2, UTP6 oder DDX21. Mittels Saccharosedichtegradienten konnte gezeigt werden, dass NOP2 und DDX21 mit den Mitgliedern des humanen UTP-B Komplex kosedimentierten. Lokalisationstudien mit PWP2 und DDX21 zeigten Kolokalisation mit FBL im Nukleolus, dem Ort der frühen Ribosomenbiogenese. Über histidine-deoxycholate native PAGE (HDN-PAGE) konnte der Komplex in seiner nativen Form aufgetrennt und PWP2, WDR36 sowie DDX21 durch Western Analyse nachgewiesen werden. Die Ergebnisse zeigen, dass der UTP-B Komplex in menschlichen Zellen vorhanden ist und in seiner Komposition dem der Hefe sehr ähnelt. Der humane UTP-B Komplex besitzt mit der RNA Helikase DDX21 vermutlich eine zusätzliche Komponente. Als nächstes wurde das Ausmaß der Konservierung zwischen Hefe und humaner Ribosomenbiogenese anhand des 90S/40S Kofaktors EMG1 ermittelt. Fokussiert wurde auf eine Mutante von EMG1, welche der Auslöser für das Bowen-Conradi-Syndrom ist. EMG1 ist eine RNA Methyltransferase beteiligt an frühen Schritten der Ribosomenbiogenese. Im Menschen löst die Mutation D86G bei EMG1 das Bowen-Conradi-Syndrom aus. Über Pulldown-Analysen von EMG1-Flag und EMG1-D86G-Flag als Köder mit anschließender MALDI-TOF-TOF Messung konnte gezeigt werden, dass beide unter anderem das Protein PARP1 binden, welches in höheren Eukaryonten eine Funktion während der Ribosomenbiogenese und der Chromatin Modulation inne hat. Die Mutante zeigte hier im Gegensatz zum Wildtyp Protein Kopräzipitationen mit allen Kern-Histonen (H2A, H2B, H3, H4), was auf eine Fehllokalisation schließen ließ. Die anschließenden Lokalisationsstudien konnten diese Fehllokalisation für EMG1-D86G bestätigen; die nukleoläre Lokalisation geht verloren, stattdessen lokalisiert die Mutante im Zellkern und zusätzlich im Zytoplasma. Um weitere Unterschiede zwischen Hefe und menschlicher Ribosomenbiogenese zu untersuchen, wurde auf den Exportadapter Exportin 5 (XPO5) fokussiert, der wahrscheinlich eine Rolle bei der Reifung der Prä-60S Untereinheit spielt. Das Hefe-Ortholog von XPO5, Msn5, hat keine bekannte Rolle in der Ribosomenbiogenese. HEK293T Zellen wurden stabil mit XPO5-Flag transfiziert; XPO5 lokalisierte vermehrt im Zellkern, aber auch im Zytoplasma, was zu erwarten war. Nach Pulldown-Analysen und MALDI-TOF-TOF Messungen konnten viele Proteine aus verschiedenen Prozessen nachgewiesen werden, darunter Proteine beteiligt an der Ribosomenbiogenese und der mikro-RNA Biogenese. Es konnte zudem gezeigt werden, dass die Bindung von XPO5 an diese Proteine abhängig von RNA ist. Das könnte implizieren, dass XPO5 diese Proteine über RNA bindet. Die ersten Hinweise auf eine Beteiligung von XPO5 an der Reifung der 60S Untereinheit konnten mittels Saccharosedichtegradienten nachgewiesen werden; XPO5 konnte vermehrt in Fraktionen festgestellt werden, welche aufgrund der Präsenz von NMD3 und DHX15 den Prä-60S Untereinheiten zugeschrieben wurde. Zudem kopräzipitierte XPO5 mit NMD3-Flag und 32S Prä-rRNA. Ein weiterer Hinweis konnte durch UV-Quervernetzung und Analyse von komplementärer DNA (CRAC) mit XPO5-Flag Zelllinien gewonnen werden. XPO5 konnte in Quervernetzung mit 28S rRNA, Prä-miRNAs, transfer RNAs (tRNAs) und snoRNAs detektiert werden. Neben der Funktion von XPO5 in der Reifung von 60S Untereinheiten wurde nun auf die Analyse von Prä-miRNAs und snoRNAs fokussiert. Bei näherer Betrachtung der CRAC Ergebnisse konnte festgestellt werden, dass XPO5 spezifisch an Prä-miRNAs bindet. Zudem konnte im Fall von snoRNAs eine Bevorzugung einer Bindung in der Nähe des 3‘ Endes ermittelt werden. Um die Daten zu verifizieren, wurde nach RNA Interferenz (RNAi) gegen XPO5 die Reifung der mikroRNA Let-7a untersucht, welche eine regulatorische Funktion auf c-MYC ausübt, einem wichtigen Transkriptionsfaktor. Durch RNAi von XPO5 konnte eine Verringerung der reifen mikroRNA Let-7a festgestellt werden. Über Pulldown-Analysen mit anschließender Northern Analyse wurde darüber hinaus gezeigt, dass XPO5 im Zellkern mit den snoRNAs ACA34, HBI-43 und U13 kopräzipitiert. Zusammenfassend konnte gezeigt werden, dass der UTP-B Komplex zwischen Hefe und humanen Zellen konserviert ist. Der humane UTP-B Komplex enthält mit der RNA Helikase DDX21 vermutlich eine zusätzliche Komponente. Gerade mit dieser Komponente und dem zusätzlich gefundenen NPM1 könnte der humane UTP-B Komplex mit anderen Signalwegen, wie der Modulation des Chromatins, einer Funktion im Zellzyklus sowie der p53 Signalkaskade, verbunden sein. Diese Arbeit konnte zudem eine Fehllokalisation der Bowen-Conradi-Mutante feststellen, sowie mit der Identifikation des in Hefe fehlenden PARP1 Proteins als möglichen Interaktionspartner von EMG1 einen zusätzlichen Unterschied zwischen der Hefe und humanen Ribosomenbiogenese ermitteln. EMG1 hätte damit auch einen Zusammenhang zur Chromatinmodulation. Dieser konnte durch die Kopräzipitation der Mutante mit den Kernhistonen und der somit vermutlich fehlenden Bindung des Proteins an die Prä-rRNA im Nukleolus, bekräftigt werden. Die weiteren Untersuchungen an dem Exportadapter XPO5 ergaben, dass es Indizien in höheren Eukaryonten für einen erweiterten, und somit unterschiedlichen Prä-60S Export gibt. XPO5 kopräzipitierte mit NMD3 und 28S rRNA im Zellkern. Desweiteren wurde durch CRAC die Quervernetzung von XPO5 an Prä-miRNAs und tRNAs bestätigt und eine mögliche Funktion im Zusammenhang mit snoRNAs entdeckt. Diese Ergebnisse zeigen ebenfalls, dass XPO5 durch seine große Anzahl an Substraten möglicherweise die Ribosomenbiogenese mit anderen Biogenesewegen (miRNA, tRNA, snoRNA) verknüpft. In dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass grundlegende Mechanismen der humanen Ribosomenbiogenese im Vergleich zur Hefe-Ribosomenbiogenese konserviert sind. Durch die Entdeckung von zusätzlichen spezifischen Proteinen, die kein Hefe-Ortholog besitzen und durch alle drei hier untersuchten Kofaktoren gefunden wurden, ist die Ribosomenbiogenese in humanen Zellen unterschiedlich und offensichtlich mit anderen Signal- und Biogenesewegen verknüpft, was für eine Multifunktionalität der einzelnen Proteine und gegen eine isolierte Ribosomenbiogenese spricht.