Open Access

Tobias Kensche

• Posttranslationale Modifikationen regulieren wesentliche Eigenschaften von Proteinen, wie z. B. Lokalisation, Konformation, Aktivität, Stabilität und Interaktionsfähigkeit. Eine besondere Form der Proteinmodifikation ist die Ubiquitylierung, bei der das kleine Protein Ubiquitin mit seinem C-Terminus kovalent an ein Substratprotein gebunden wird. Die am besten untersuchte Funktion der Ubiquitylierung ist die Markierung eines Substrates für den Abbau durch das Proteasom. In den letzten Jahren wurde jedoch entdeckt, dass Ubiquitylierung in vielen Bereichen der Zelle eine wichtige Rolle spielt. Dazu gehören der Transport von Vesikeln, die Reparatur von DNA-Schäden und zelluläre Signalübertragung. Ubiquitin kann verschieden-artige Ketten bilden, indem ein Ubiquitin an eines der sieben Lysine (K6, K11, K27, K29, K33, K48, K63) oder den N-Terminus eines anderen gebunden wird. Diese unterschiedlichen Kettentypen regulieren verschiedene Prozesse. Z. B. dienen K48-verknüpfte Ubiquitinketten als Signal für den proteasomalen Abbau, wohingegen über K63 verknüpfte Ketten hauptsächlich eine Rolle bei Signalübertragungen spielen. Die meisten Funktionen die durch Ubiquitylierung reguliert werden, werden durch Ubiquitinrezeptoren vermittelt, die eine Ubiquitinbindedomäne (UBD) besitzen. Manche UBDs binden selektiv nur einen Ubiquitinkettentyp und sind somit in der Lage gezielt Prozesse regulieren zu können, indem sie nur durch diesen speziellen Kettentyp aktiviert werden. Das Protein NEMO ist ein Ubiquitinrezeptor, dessen UBD UBAN selektiv bestimmte Ubiquitinketten bindet. NEMO spielt eine zentrale Rolle bei der Aktivierung der Transkriptionsfaktorfamilie NF-κB, indem es den IKK-Kinasekomplex reguliert. Dieser Kinasekomplex sorgt durch die Phosphorylierung des NF-κB-Inhibitors IκBα für dessen proteasomalen Abbau, wodurch schließlich NF-κB aktiviert wird. Die NF-κB-Aktivierung kann u. a. durch den TNF-Rezeptor (TNFR) induziert werden. Am aktivierten TNFR werden viele Proteine durch verschiedene Ubiquitinketten modifiziert. Bisher wurde angenommen, dass die spezifische Bindung von NEMO an K63-verknüpfte Ubiquitinketten ausschlaggebend für die Aktivierung von IKK ist. Jedoch spielen lineare Ubiquitinketten, die über den N-Terminus verknüpft sind, auch eine wichtige Rolle bei der Aktivierung von NF-κB und die UBAN von NEMO hat eine sehr hohe Affinität zu linearen Ubiquitinketten. Um die genauen Vorgänge zu verstehen, die zur Aktivierung von NF-κB am TNFR führen, ist es nötig, zu analysieren, welche Proteine mit welchen Ubiquitinketten modifiziert werden und welche Ubiquitinrezeptoren daran binden. In dieser Studie sollte detailliert untersucht werden, mit welchen Ubiquitin-ketten NEMO bevorzugt interagiert. Dazu wurden in vitro-Bindungsstudien mit bakteriell aufgereinigtem NEMO und verschiedenen Ubiquitinketten durchgeführt. Des Weiteren sollte geprüft werden, wie die Bindung von NEMO an bestimmte Ubiquitinketten die Aktivierung von NF-κB reguliert. Dabei ergab sich, dass sowohl NEMO in voller Länge, als auch die UBAN, bevorzugt mit linearen Ubiquitinketten interagieren, wohingegen die Interaktion von NEMO mit anderen Ubiquitinketten relativ schwach ist. Ausgehend von einer Kristallstruktur eines Komplexes aus der NEMO-UBAN und linearem di-Ubiquitin, wurden NEMO-Mutanten generiert, die seletkiv die Bindung von NEMO an lineare Ubiquitinketten verhindern, während die schwache Bindung von NEMO an längere K63-verknüpfte Ketten erhalten blieb. Um die Relevanz der Interaktion von NEMO mit linearen Ubiquitinketten für die Aktivierung von NF κB zu überprüfen, wurden diese NEMO-Mutanten dann verwendet um Zellen die kein NEMO exprimieren zu rekonstituieren. Nach Stimulation dieser Zellen mit TNFα wurde NF-κB kaum aktiviert, womit gezeigt werden konnte, dass NEMO gezielt an lineare Ubiquitinketten binden muss, um NF-κB zu aktivieren. Zusätzlich zu seiner Rolle bei der Aktivierung von NF-κB ist NEMO ein wichtiger Inhibitor der durch den TNFR induzierten Apoptose. In dieser Studie wurde gezeigt, dass diese Apoptoseinhibierung abhängig von der Bindung von NEMO an lineare Ubiquitinketten ist, da die Zellen die NEMO-Mutanten exprimierten, die keine linearen Ketten binden können, durch Apoptose starben, währen Wildtyp-Zellen überlebten. Zusammenfassend konnte in dieser Studie gezeigt werden, dass NEMO bevorzugt und mit vergleichsweise hoher Affinität an lineare Ubiquitinketten bindet und dass diese spezifische Bindung wichtig für die Inhibierung von TNFR-induzierter Apoptose sowie für die Aktivierung von NF-κB ist.
• Many types of ubiquitin chains can modify several proteins at the activated TNFR. Additionally many UBD-containing ubiquitin receptors localise there to mediate the signal constituted by these chains. Among these ubiquitin receptors is the NF-κB regulator NEMO and in the present study it was shown that NEMO preferentially binds linear ubiquitin chains and that this interaction is important for its function at the TNFR. The ZnF7 of A20 also has a selective affinity towards linear ubiquitin chains, however, it can interact with longer lysine linked ubiquitin chains as well and its ZnF4 was shown to preferentially interact with K63-linked chains. A lot of progress has been made in the understanding of the role of ubiquitin at the TNFRSC. However, many details are still not very clear. Although various proteins have been identified to be ubiquitylated, the specific role of the respective modification is most of the time not clear or controversial. E. g. the ubiquitylation of RIP1 was shown to be important for the activation of NF-κB113, however in another study RIP1 deficient MEFs can still activate TNFR-dependent NF-κB signalling147. Thus a future task is to exactly identify the substrates for ubiquitylation as well as their residues and then analyse the role of this modification in vivo. This could be accomplished with sophisticated protein purification and separation methods combined with mass spectrometrical analysis. For instance ubiquitylated substrates at the activated TNFR could be isolated with ubiquitin-linkage specific antibodies or UBDs and separated by 2D-gel electrophoresis. Such purified ubiquitylation substrates could then be identified by mass spectrometrical analysis. In order to confirm the importance of a given modification, knock-out cells could be utilised to reconstitute them with mutants of residues of proteins discovered to be modified in the mass spectrometrical analysis and the activation of the TNFR-signalling could then be monitored. This way it might also be possible to detect further substrates for linear ubiquitin chains in the TNFRSC that might be crucial for the interaction with NEMO and the induction of NF-κB signalling. It is also important to dissect when ubiquitylation happens and how long the chains are. This could be accomplished by utilising ubiquitin chain selective sensors in vivo. The usage of such sensors has recently been shown in a study from van Wijk et al., where the K63-linked chain specific UIMs of RAP80 and the linear ubiquitin chain specific UBAN-domain of NEMO were applied to selectively detect these chain types in fixed as well as in living cells148. In order to detect the production of certain ubiquitin chains at the TNFR and to get a temporal resolution of this process, FRET (fluorescent resonance energy transfer)-sensors could be utilised. To this end e. g. a TNFR-RAP80-UIM-chimera could be tagged with a YFP-protein, while ubiquitin mutants that can only form K63-linked chains could be tagged with CFP, which together form a FRET-couple that enables detection of binding in real-time. A sudden production of K63-linked ubiquitin chains upon TNFR activation could thus be detected as a FRET-signal as soon as these chains would interact with the UIMs at the TNFR and this would indicate the time of the chain production. So far the role of the interaction of NEMO with linear ubiquitins chain has mainly been studied at the TNFR. Some reports indicated a role for LUBAC in the CD4056 the RIG-1149 and the NOD2150 signalling pathways and there is also evidence that different stimuli rely on the interaction of NEMO with linear ubiquitin chains to activate NF-κB, however detailed analysis of the role of linear ubiquitin chains hasn’t been performed99. Thus it would be interesting to analyse in more detail if the interaction of NEMO with linear ubiquitin chains is also responsible for the regulation of NF-κB with other stimuli and in other cell types. Additionally, it is mechanistically not clear how the interaction of NEMO with linear ubiquitin chains activates the IKK-complex. The structure of the UBAN with linear diUb shows that the binding of diUb induces a conformational change in the UBAN, which might play a role in the activation of IKK99. However, it is also possible that the interaction with linear ubiquitin chains provokes just the right concentration of the IKK-complex on the right site at the right time, which is necessary for its efficient activation. A more detailed structural analysis of the IKK-complex with and without linear ubiquitin chains could help to understand ubiquitin induced conformational changes that might lead to IKK activation. An immune system that is not properly regulated can lead to autoimmune diseases or uncontrolled inflammation, which might be responsible for the development of cancer151. Since NEMO is the central regulator of NF-κB, which is an important transcription factor for genes promoting inflammation, the detailed understanding of the processes that lead to NEMO dependent activation of NF-κB by ubiquitin interaction, could help to develop drugs that specifically target these interactions.