Function of ephrinBs in Reelin signaling during nervous system development and plasticity

  • Nervous system development requires a sequence of processes such as neuronal migration, the development of dendrites and dendritic spines and the formation of synapses. The extracellular matrix protein Reelin plays an important role in these processes, Reelin regulates for example the migration of neurons from proliferative zones to their target positions in the brain. As a consequence, layered structures are formed in the neocortex, the hippocampus and cerebellum (Lambert de Rouvroit et al., 1999). Reelin exerts its functions by binding to two transmembrane receptors, apolipoprotein E receptor 2 (ApoER2) and very-low-density lipoprotein receptor (VLDLR). This binding causes phosphorylation of the intracellular adapter protein Disabled-1 (Dab1) (D’Arcangelo et al., 1999) via activation of Src-family kinases (SFKs) (Bock and Herz, 2003), leading to cytoskeletal reorganization which enables cell migration and morphological changes (Lambert de Rouvroit and Goffinet, 2001). Since ApoER2 and VLDLR do not possess intrinsic kinase activity to activate SFKs, the existence of a co-receptor was suggested. EphrinBs are transmembrane ligands for Eph receptors and have signaling capabilities required for axon guidance (Cowan et al., 2004), dendritic spine maturation (Segura et al., 2007) and synaptic plasticity (Essmann et al., 2008; Grunwald et al., 2004). As stimulation of cultured cortical neurons with soluble EphB receptors causes recruitment of SFKs to ephrinB-containing membrane patches and SFK activation (Palmer et al., 2002), we investigated whether ephrinB ligands would be the missing co-receptors in the Reelin signaling pathway functioning during neuronal migration, dendritic spine maturation and synaptic plasticity. We found that the extracellular part of ephrinBs directly binds to Reelin and that ephrinBs interact with Dab1, phospho-Dab1, ApoER2 and VLDLR. EphrinB3 is localized in the same neurons as ApoER2 and Dab1 in the cortex and hippocampus, and in the cerebellum ephrinB2 is detected in neurons that express Dab1. To investigate the requirement of ephrinBs for neuronal migration, triple knockout mice lacking all ephrinB ligands were analyzed. The cortical layering of ephrinB1, B2, B3 knockout brains is inverted, showing the outside-in pattern typical for the reeler cortex. The hippocampus and cerebellum of triple knockout mice also exhibit reeler-like malformations, although less penetrant than the cortical defects. Dab1 phosphorylation is impaired in mice lacking ephrinB3 and this effect is strongly enhanced in neurons lacking all ephrin ligands. Moreover, activation of ephrinB3 reverse signaling induces Dab1phosphorylation in reeler primary neurons. In agreement with an important regulatory function of ephrinBs in Reelin signaling, activation of ephrinB3 reverse signaling is even able to rescue reeler defects in cortical layering in organotypic slice cultures. In summary, all these results identify ephrinBs as co-receptors for Reelin signaling, playing essential roles in neuronal migration during the development of cortex, hippocampus and cerebellum (Sentürk et al., 2011).
  • Die korrekte Entwicklung des Säugetiergehirns beinhaltet zahlreiche Prozesse wie die Migration von Neuronen, die Entwicklung von neuronalen Dendriten und dendritischen Spines und das Entstehen von Synapsen. Das extrazelluläre Matrixprotein Reelin spielt eine wichtige Rolle in diesen Prozessen. Während der Gehirnentwicklung wandern Neuronen von proliferativen Zonen, in denen sie entstehen, zu ihren Zielpositionen im Gehirn. Dadurch entstehen geordnete und geschichtete Strukturen wie im Cortex, Hippocampus und Cerebellum. Reelin ist ein wichtiger Faktor, der für mehrere Prozesse der neuronalen Migration an ihre korrekten Positionen verantwortlich ist (Lambert de Rouvroit et al., 1999). Das sekretierte Glykoprotein übt seine Funktionen durch die Bindung an zwei Transmembranrezeptoren aus, Apolipoprotein E Rezeptor 2 (ApoER2) und Very-low-density lipoprotein Rezeptor (VLDLR). Die Bindung von Reelin an ApoER2 und VLDLR ruft die Phosphorylierung des intrazellulären Adapterproteins Disabled-1 (Dab1) hervor (D’Arcangelo et al., 1999), indem sie Kinasen der Src-Familie (SFKs) aktiviert (Bock and Herz, 2003). Dab1 bindet an die cytoplasmatischen Domänen von ApoER2 und VLDLR und aktiviert nach seiner Phosphorylierung Signalwege, die zu Änderungen des Cytoskeletts führen (Lambert de Rouvroit and Goffinet, 2001); so wird eine Wanderung von Zellen oder eine Formänderung ermöglicht. Die molekulare Grundlage der Aktivierung dieses Signalwegs an der Zellmembran ist noch kaum charakterisiert. Da ApoER2 und VLDLR keine intrinsische Kinaseaktivität besitzen, um SFKs zu aktivieren, wurde die Existenz eines Korezeptors vermutet. EphrinBs, Transmembranliganden für Eph-Rezeptoren, beeinflussen die Gehirnentwicklung, indem sie neuronales Wachstum entlang bestimmter Bahnen leiten (Kullander et al., 2001), synaptische Plastizität über AMPA- (α-amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazolepropionic acid) Rezeptoren regulieren (Essmann et al., 2008) und die Bildung von Dendriten (Zhou et al., 2001) und Spines (Penzes et al., 2003) kontrollieren. Die Stimulation von kortikalen Neuronen in Kultur mit EphB-Rezeptoren führt zur Rekrutierung und Aktivierung von SFKs in Membranpatches, in denen sich ephrinB-Liganden befinden (Palmer et al., 2002). Deshalb untersuchten wir, ob ephrinB Liganden die fehlenden Korezeptoren für den Reelin-Signalweg in der Migration von Neuronen, der Reifung dendritischer Spines und in synaptischer Plastizität sind. Die korrekte Entwicklung des Säugetiergehirns beinhaltet zahlreiche Prozesse wie die Migration von Neuronen, die Entwicklung von neuronalen Dendriten und dendritischen Spines und das Entstehen von Synapsen. Das extrazelluläre Matrixprotein Reelin spielt eine wichtige Rolle in diesen Prozessen. Während der Gehirnentwicklung wandern Neuronen von proliferativen Zonen, in denen sie entstehen, zu ihren Zielpositionen im Gehirn. Dadurch entstehen geordnete und geschichtete Strukturen wie im Cortex, Hippocampus und Cerebellum. Reelin ist ein wichtiger Faktor, der für mehrere Prozesse der neuronalen Migration an ihre korrekten Positionen verantwortlich ist (Lambert de Rouvroit et al., 1999). Das sekretierte Glykoprotein übt seine Funktionen durch die Bindung an zwei Transmembranrezeptoren aus, Apolipoprotein E Rezeptor 2 (ApoER2) und Very-low-density lipoprotein Rezeptor (VLDLR). Die Bindung von Reelin an ApoER2 und VLDLR ruft die Phosphorylierung des intrazellulären Adapterproteins Disabled-1 (Dab1) hervor (D’Arcangelo et al., 1999), indem sie Kinasen der Src-Familie (SFKs) aktiviert (Bock and Herz, 2003). Dab1 bindet an die cytoplasmatischen Domänen von ApoER2 und VLDLR und aktiviert nach seiner Phosphorylierung Signalwege, die zu Änderungen des Cytoskeletts führen (Lambert de Rouvroit and Goffinet, 2001); so wird eine Wanderung von Zellen oder eine Formänderung ermöglicht. Die molekulare Grundlage der Aktivierung dieses Signalwegs an der Zellmembran ist noch kaum charakterisiert. Da ApoER2 und VLDLR keine intrinsische Kinaseaktivität besitzen, um SFKs zu aktivieren, wurde die Existenz eines Korezeptors vermutet. EphrinBs, Transmembranliganden für Eph-Rezeptoren, beeinflussen die Gehirnentwicklung, indem sie neuronales Wachstum entlang bestimmter Bahnen leiten (Kullander et al., 2001), synaptische Plastizität über AMPA- (α-amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazolepropionic acid) Rezeptoren regulieren (Essmann et al., 2008) und die Bildung von Dendriten (Zhou et al., 2001) und Spines (Penzes et al., 2003) kontrollieren. Die Stimulation von kortikalen Neuronen in Kultur mit EphB-Rezeptoren führt zur Rekrutierung und Aktivierung von SFKs in Membranpatches, in denen sich ephrinB-Liganden befinden (Palmer et al., 2002). Deshalb untersuchten wir, ob ephrinB Liganden die fehlenden Korezeptoren für den Reelin-Signalweg in der Migration von Neuronen, der Reifung dendritischer Spines und in synaptischer Plastizität sind. Um herauszufinden, ob ephrinBs mit Molekülen des Reelin-Signalwegs interagieren, wurden zuerst Pulldown- und Immunpräzipitationsexperimente durchgeführt. Diese Versuche zeigten, dass der extrazelluläre Bereich von ephrinB-Liganden direkt an Reelin bindet. Außerdem binden ephrinBs an Dab1 und an die phosphorylierte Form von Dab1 (phospho-Dab1), an ApoER2 und VLDLR. Um die Interaktion auch in Neuronen in Gehirnregionen, in deren Entwicklung Reelin eine Rolle spielt, zu beobachten, wurden Schnitte von Mäusegehirnen, die sich in der Entwicklung befanden, untersucht. Im Cortex und Hippocampus zeigen Immunfärbungen von ephrinB3, ApoER2 und Dab1, dass ephrinB3 und ApoER2 in den gleichen Zellen in der Zellmembran lokalisiert sind; auch das Signal von ephrinB3 und Dab1 ist in den gleichen Zellen zu finden. Im Cerebellum befindet sich ephrinB2 in der Membran von Neuronen, die Dab1 exprimieren. Die Notwendigkeit von ephrinB-Liganden für die korrekte Schichtung des Cortex wurde mit ephrinB1, B2, B3-Knockout-Mäusen, denen alle ephrinB-Liganden fehlen, untersucht. Koronale Gehirnschnitte wurden gegen Marker für bestimmte kortikale Schichten angefärbt. Im Cortex der Dreifach-Knockouts sind Tbr1-positive Neuronen, die normalerweise in den unteren Schichten angeordnet sind, in den oberen Schichten zu finden. Brn1-positive Zellen sind im Cortex des Wildtyps in den oberen Schichten lokalisiert, im ephrinB-Knockout befinden sie sich in den unteren Schichten. Diese Umkehrung der kortikalen Schichten im Dreifach-Knockout ähnelt dem sogenannten outside-in Muster, das in der reeler-Maus, welche kein funktionsfähiges Reelin exprimiert, auftritt. Auch im Hippocampus weist die ephrinB1, B2, B3-Knockout-Maus Defekte auf, die denen der reeler-Maus ähneln. Die CA1-Region ist in beiden Mutanten stark verbreitert und die zelluläre Organisation des Gyrus dentatus und des Hilus sind gestört. Im Cerebellum sind Calbindin-positive Purkinjezellen, die normalerweise in der Purkinjezellschicht angeordnet sind, außerhalb dieser Zellschicht verteilt, und dieser Migrationsdefekt ist ähnlich wie der in der reeler-Maus. Da eine Aktivierung des Reelin-Signalwegs zur Phosphorylierung von Dab1 führt, kann die Menge an phospho-Dab1 als Maß für die Funktionsfähigkeit des Signalwegs betrachtet werden (Arnaud et al., 2003). Lysate von ephrinB1, B2, B3-Knockout-Gehirnen zeigen im Western Blot deutlich erniedrigte Mengen an phospho-Dab1 im Vergleich zu Lysaten aus Wildtypgehirnen. Die Reduktion an phospho-Dab1 ist ähnlich stark wie in reeler-Gehirnlysaten. Gehirnlysate von Mäusen, denen nur ephrinB3 fehlt, zeigen ebenfalls weniger phospho-Dab1 als der Wildtyp. Ephrin-Liganden können nicht nur Signale in der Zelle, die Eph-Rezeptoren exprimieren, auslösen, sondern sie können auch selbst als Rezeptoren wirken.

Download full text files

  • Thesis_Sylvia_Pfennig_UB.pdf
    eng

Export metadata

Additional Services

Share in Twitter Search Google Scholar
Metadaten
Author:Sylvia Pfennig
URN:urn:nbn:de:hebis:30:3-333575
Referee:Amparo Acker-PalmerORCiDGND, Herbert Zimmermann
Document Type:Doctoral Thesis
Language:English
Date of Publication (online):2014/05/07
Year of first Publication:2013
Publishing Institution:Universitätsbibliothek Johann Christian Senckenberg
Granting Institution:Johann Wolfgang Goethe-Universität
Date of final exam:2014/02/19
Release Date:2014/05/07
Page Number:165 S.
Last Page:165
Note:
Diese Dissertation steht außerhalb der Universitätsbibliothek leider (aus urheberrechtlichen Gründen) nicht im Volltext zur Verfügung, die CD-ROM kann (auch über Fernleihe) bei der UB Frankfurt am Main ausgeliehen werden.
HeBIS-PPN:364931515
Institutes:Biowissenschaften / Biowissenschaften
Dewey Decimal Classification:5 Naturwissenschaften und Mathematik / 57 Biowissenschaften; Biologie / 570 Biowissenschaften; Biologie
Sammlungen:Universitätspublikationen
Sammlung Biologie / Biologische Hochschulschriften (Goethe-Universität; nur lokal zugänglich)
Licence (German):License LogoArchivex. zur Lesesaalplatznutzung § 52b UrhG