Formation of PGE 2 in the tumor microenvironment and its impact on tumorigenesis

  • Tumor development usually follows predictable paths where tumor cells acquire common characteristics and features known as the hallmarks of cancer. Recently, additional characteristics have been added to these hallmarks since solid tumors are composed of a very heterogeneous population of transformed, formerly normal tissue cells and stromal cells, e.g. immune cells and fibroblasts. Compelling evidence suggests that stromal cells and tumor cells maintain a symbiotic relationship to build up the tumor microenvironment and to fuel tumor growth. In cancer therapies, common features of tumors such as unrestricted cell growth, suppression of immunological responses, and the ability to form new blood vessels (angiogenesis) have emerged as the main targets of interest. The lipid mediator prostaglandin E2 (PGE2) is known to promote all these features and thus, is connected to cancer progression in general. Its synthesis is triggered in response to stress factors or during inflammation. Inducible PGE2 production relies on the enzymes cyclooxygenase 2 (COX-2) and microsomal prostanglandin E synthase 1 (mPGES-1), which are simultaneously expressed in response to a variety of different stimuli and are functionally coupled. Inhibition of COX-2 with non-steroidal antiinflammatory drugs (NSAIDs) for cancer treatment is, however, limited by cardiovascular risks, since selective COX-2 inhibition disrupts the prostacyclin/thromboxane balance. Therefore targeting mPGES-1 downstream of COX-2 for PGE2 inhibition was evaluated in this work in different steps of carcinogenesis. Knockdown of mPGES-1 in DU145 prostate cancer cells revealed that the mPGES-1 status did not affect growth of monolayer tumor cells, but significantly impaired 3D growth of multi-cellular tumor spheroids (MCTS). Spheroid formation induced COX-2 in DU145 and other prostate cancer spheroids. High levels of PGE2 were detected in supernatants of DU145 MCTS as opposed to monolayer DU145 cells. Pharmacological inhibition of COX-2 and mPGES-1 confirmed the pivotal role of PGE2 for DU145 MCTS growth. Besides promoting spheroid growth, MCTS-derived PGE2 also inhibited cytotoxic T lymphocyte (CTL) activation. When investigating the mechanisms of COX-2 induction during spheroid formation, the typical tumor microenvironmental factors such as glucose deprivation, hypoxia or tumor cell apoptosis failed to enhance COX-2. Interestingly, when interfering with apoptosis in DU145 spheroids, the pan-caspase inhibitor Z-VAD-FMK triggered a Summary 12 shift towards necrosis, thus enhancing COX-2 expression. Coculturing viable DU145 monolayer cells with isolated heat-shocked-treated necrotic DU145 cells, but not with necrotic cell supernatants, induced COX-2 and PGE2, confirming the impact of necrosis for MCTS growth and CTL inhibition. As mentioned, in vivo tumors are very heterogenous mixtures of tumor cells and stromal cells e.g. immune cells. Hence, the interaction of the immune system with tumors was investigated in further experiments. When coculturing MCF-7 breast cancer spheroids with human peripheral blood mononuclear cells (PBMCs), only low levels of PGE2 were detected, since MCF-7 cells did not upregulate COX-2 during spheroid formation and did not induce PGE2 production by PBMCs. Under inflammatory conditions, by adding the toll-like receptor 4 (TLR4) agonist lipopolysaccharide (LPS) to cocultures, PGE2 production was triggered, spheroid sizes were reduced, and numbers of high levels of granzyme B expressing (GrBhi) CTLs were increased, while CD80 expression by tumor-associated phagocytes was also elevated. Inhibition of CD80 but not CD86 diminished numbers of GrBhi CTLs and attenuated spheroid lysis. To determine the role of ctivation-induced PGE2 production, use of the COX-2 inhibitor celecoxib and the experimental mPGES-1 inhibitor C3 further increased CD80 expression. Addition of PGE2, the prostaglandin E2 (EP2) receptor agonist butaprost, and the phosphodiesterase 4 (PDE4) inhibitor rolipram reduced LPS/C3-triggered CD80 expression, confirming the impact of COX- 2/mPGES-1-derived PGE2 on shaping phagocyte phenotypes in an EP2/cAMP-dependent manner. In a spontaneous breast cancer model (MMTV-PyMT), mPGES-1-deficiency significantly delayed tumor growth in mice, confirming an overall protumorigenic role of mPGES-1 in breast cancer development in vivo. However in tumors of mPGES-1-/- mice, tumor-infiltrating phagocytes expressed low levels of CD80 similar to their wildtype counterparts. These data suggest that the immunosuppressive microenvironment does not allow for immunostimulatory effects by mPGES-1 inhibition without an activating stimulus. Evidences in this study recommend the application of mPGES-1 inhibitors for treating cancer diseases, since mPGES-1 promotes tumor growth in multiple steps of carcinogenesis, ranging from well-characterized effects of tumor cell growth to immune suppression of CTL activity and phagocyte polarization. Regarding the latter, blunting PGE2 during immune activation may limit the tumor-favoring features of inflammation and improve the efficiency of TLR4 based immune therapies.
  • Die Synthese des Lipids Prostaglandin E2 (PGE2) durch die Enzyme COX-2 und mPGES-1 und dessen Akkumulation ist ein fester Bestandteil von Entzündungsreaktionen und wird auch vermehrt mit Tumorerkrankungen in Verbindung gebracht. Die Hemmung der PGE2 Synthese mit nicht-steroidalen Anti-Rheumatika (NSAID) wird zur Behandlung von entzündungsvermittelten Krankheiten klinisch eingesetzt und zeigte auch Wirkung bei der Bekämpfung von Tumorerkrankungen. Leider führt die COX-2 Hemmung zu kardiovaskulären Nebenwirkungen, weswegen mPGES-1 zur selektiven Hemmung von PGE2 pharmakologisch an Bedeutung gewonnen hat. In dieser Studie wird die Rolle der mPGES-1 in verschiedenen tumorrelevanten Prozessen evaluiert, um zu überprüfen ob eine therapeutische Anwendbarkeit von mPGES-1 Inhibitoren bei der Therapie von Tumorerkrankungen empfehlenswert ist. Nebst klassischen etablierten Tumormodellen wie zum Beispiel der zweidimensionalen Kultivierung von humanen Tumorzelllinien in der Zellkulturschale und der Anwendung eines spontanen Brustkrebsmodels in der Maus, werden in der Arbeit auch dreidimensionale Experimentaltumore in der Zellkultur, sogenannte multizelluläre Tumorsphäroide (MCTS), beschrieben. Durch die Sphäroidbildung wurde COX-2 hochreguliert und die effektive Ausschaltung von COX-2 oder mPGES-1 verhindert die PGE2 Produktion fast komplett in MCTS und verlangsamte das Wachstum der Experimentaltumore. Es zeigte sich, dass Glukoseentzug, Hypoxie und auch die Tumorzellapoptose jeweils nicht die Ursache für das Phänomen darstellten. Jedoch wurde die COX-2 Expression durch eine Verlagerung des Zelltodes von der Apoptose in Richtung Nekrose begünstigt. Die Kokultivierung von DU145 2D-Kulturen mit isolierten hitzeschock-behandelten nekrotischen Tumorzellen konnte schließlich bestätigen, dass nekrotischen Zellen nötig waren um die COX-2 Expression und PGE2 Produktion zu induzieren. Zusätzlich konnte in dieser Studie noch nachgewiesen werden dass PGE2 von MCTS Überständen die Aktivierung von cytotoxischen T Lymphozyten (CTL) hemmt. Damit hat die Nekrose in MCTS eine doppelte Wirkung: Durch die Induktion von PGE2 fördert sie das Tumorwachstum und gleichzeitig schützt sie den Tumor vor der Zerstörung durch CTL. Um Interaktionen des Immunsystems mit dem Tumor zu untersuchen, wurden Zellen des peripheren Blutes (PBMCs) zusammen mit MCTS von MCF-7 Brustkrebszellen kokultiviert. Es konnte kein erhöhter Gehalt an PGE2 in den Kokulturen gefunden werden, was darauf zurückzuschließen war dass MCF-7 Brustkrebszellen bei der Sphäroidbildung COX-2 nicht hochregulieren und ebenfalls keine PGE2 Produktion durch PBMCs provozieren. Unter inflammatorischen Bedingungen nach Einsatz von Toll-like Rezeptor 4 (TLR4) Liganden Lipopolysaccharid (LPS) wurde die PGE2 Produktion von PBMCs aktiviert und gleichzeitig war eine Verringerung des Sphäroiddurchmessers in diesen Kokulturen zu beobachten. Mit der LPS-Aktivierung wurde eine erhöhte Anzahl an hoch Granzym B exprimierenden (GrBhi) CTL detektiert, während die CD80 Expression der tumor-assoziierten Phagozyten ebenfalls erhöht war. Das durch die COX-2/mPGES-1 gebildete PGE2 hemmt bei der Aktivierung von Phagozyten die CD80 Expression über den Prostaglandinrezeptor EP2, das schließlich zur intrazellulären Akkumulation von cAMP führt und die Phagozytenaktivierung als Negativfeedbackregulation blockiert. Dieser Mechanismus war jedoch nur im Kokulturmodel zu beobachten, während in aktivierten Knochenmarksmakrophagen mPGES-1 nicht die Expression von CD80 beeinflusste. Die Anwendung des Kokulturmodels ist somit für die Beschreibung von immunologischen Fragestellungen den der Makrophagenmonokultur überlegen, da sie komplexe Zellinteraktionen zwischen Phagozyten, T Zellen und Tumorzellen ermöglicht, die wiederum die Feinregulierung von immunologisch relevanten Vorgängen zulassen. Im spontanen murinen Brustkrebsmodel (MMTV-PyMT) konnte dann festgestellt werden dass mPGES-1-/- PyMT Mäuse eine verlangsamte Tumorentwicklung aufweisen. Um die Stärke einer Immunantwort in den PyMT Mäusen zu ermitteln, wurde die CD80 Expression von Tumor-assoziierten Phagozyten in Tumorgeweben und der Milz untersucht. Interessanterweise exprimierten Tumor-assoziierte Phagozyten unabhängig vom mPGES-1 in etablierten PyMT Tumoren generell minimale Mengen an CD80- in etwa im gleichen Umfang dem nicht-stimulierten Knochenmarksmakrophagen entsprechend. Ohne immunaktivierende Substanzen ist die Abwesenheit von mPGES 1 nicht ausreichend, um das stark immunhemmende Milieu in PyMT Tumoren zu überwinden. In fortführenden in vivo PyMT Studien sollte deshalb evaluiert werden, ob die mPGES-1-Defizienz im immunstimulierenden Kontext unter Einsatz von therapeutischen TLR-Agonisten Relevanz hat und die Kombination von mPGES-1-Inhibitoren mit TLR-Agonisten sollte in Wildtyp PyMT Mäusen diskutiert werden. Die Ergebnisse deuten daraufhin, dass mPGES-1 in diesem Model das Tumorwachstum eher durch klassische Parameter beeinflusst wie z.B. Tumorzellproliferation und Angiogenese. Nicht nur im Zusammenhang mit klassisch onkologischen Parametern kann die selektive Hemmung von PGE2 wertvoll sein, sondern auch eine Kombination mit immunaktivierenden Substanzen wie z.B. TLR-Agonisten ist therapeutisch denkbar, um aktivierungsvermittelte Entzündungsreaktionen auszuschalten, die sonst tumorförderlich sein könnten und den Erfolg der Therapie beeinflussen würden. Die Anwendung von mPGES-1-Inhibitoren zur selektiven Hemmung von PGE2 bei der Krebstherapie wird anhand der Daten dieser Studie empfohlen und würde eine risikominimierte Alternative zu nicht-steroidalen Anti-Rheumatika darstellen. Die Kontrolle von Entzündungsreaktionen ist somit der Schlüssel der zukünftigen Krebstherapie.

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Metadaten
Author:Weixiao Sha
URN:urn:nbn:de:hebis:30:3-336262
Publisher:Univ.-Bibliothek
Place of publication:Frankfurt am Main
Referee:Dieter SteinhilberORCiDGND, Bernhard BrüneORCiD
Advisor:Bernhard Brüne
Document Type:Doctoral Thesis
Language:English
Date of Publication (online):2014/05/16
Year of first Publication:2014
Publishing Institution:Universitätsbibliothek Johann Christian Senckenberg
Granting Institution:Johann Wolfgang Goethe-Universität
Date of final exam:2014/05/14
Release Date:2014/05/16
Tag:PGE2 Cancer Tumorigenesis
Page Number:107
HeBIS-PPN:340217448
Institutes:Biochemie, Chemie und Pharmazie / Biochemie und Chemie
Dewey Decimal Classification:5 Naturwissenschaften und Mathematik / 57 Biowissenschaften; Biologie / 570 Biowissenschaften; Biologie
Sammlungen:Universitätspublikationen
Sammlung Biologie / Biologische Hochschulschriften (Goethe-Universität)
Licence (German):License LogoDeutsches Urheberrecht