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Claudia Scherer

• Vorhofflimmern ist die am weitesten verbreitete Herzrhythmusstörung. Die bisherige antiarrhythmische Therapie ist durch erhebliche kardiale und extrakardiale Nebenwirkungen nur wenig zufriedenstellend. Die Erforschung neuer antiarrhythmischer Substanzen ist aufgrund begrenzt zur Verfügung stehenden menschlichen Probematerials erschwert. Vorhofgewebe wird z.B. bei Herzoperationen gewonnen und kann dann für Forschungszwecke eingesetzt werden. Die Herzzellen sind allerdings sehr empfindlich, weswegen sie meist bereits nach einigen Stunden nicht mehr für weitere Untersuchungen zu gebrauchen sind. Man ist daher auf das Tiermodell angewiesen. Da das Schweineherz dem des Menschen sehr ähnlich ist, stellt es hier ein ideales Testsystem für neue Antiarrhythmika dar. In neuesten Studien wurde in Schweineherzen der IK,PO als ein vielversprechenden Angriffspunkt vorhofselektiver Antiarrhythmika beschrieben. Die diesem Strom zugrundeliegenden Kanaleinheiten sind jedoch zum jetzigen Zeitpunkt nicht genau erforscht. Ziel der Arbeit war, ein stabiles Modell der Zellkultur mit atrialen Kardiomyozyten zu etablieren. An den kultivierten Herzzellen sollten elektrophysiologische aber auch molekular- und proteinbiologische Methoden angewandt werden. Das Modell sollte mit Zellen aus Schweineherzen erprobt werden und dazu dienen Untersuchungen an Zellen aus einer Gewebepräparation über mehrere Tage durchzuführen. Darüber hinaus sollte die Zellkultur dazu dienen einen Gen-„Knockdown“ anwenden zu können. Der IK,PO und dem diesem Strom möglicherweise zugrundeliegenden Kanaluntereinheiten Kv1.5, Kv4.3, KChIP2 und TASK-1 sollten hierbei charakterisiert werden. Atriumzellen aus Schweineherzen wurden isoliert und direkt nach Zellisolation sowie unter dem Einfluss der Zellkultur nach bis zu 48 Stunden untersucht. Es kamen die Patch-Clamp-Technik, Real-time-PCR- und Western-Blot-Analysen zum Einsatz. Die Wirkung verschiedener Substanzen auf den IK,PO wurde getestet. Das Kv1.5-Protein wurde dargestellt und mRNA-Analysen für Kv1.5, Kv4.3, KChIP2 und TASK-1 durchgeführt. Ein Teil der Zellen wurde mit einer gegen Kv1.5 gerichteten siRNA behandelt und anschließend mRNA-Analysen durchgeführt sowie der IK,PO–Strom gemessen. Die atrialen Kardiomyozyten des Schweines in Kultur zeigten bis zu 48 Stunden vitale Eigenschaften und zeigten sich für die Patch-Clamp-Technik, Real-time-PCR und Western-Blot-Analysen als geeignet. Im Vergleich zu den frisch präparierten Zellen war eine signifikante Zunahme der Stromdichte für den IK,PO zu messen. Die Kinetik des IK,PO-Stroms sowie das Verhalten gegenüber den Substanzen AV0118, Heteropodatoxin und PAP-1 blieben im Vergleich zu den frisch präparierten Zellen unverändert. In Western-Blot-Analysen war im Vergleich zu frisch isolierten Zellen eine Zunahme des Kv1.5-Proteins zu sehen. Die mRNA-Expression des Kv1.5 war dagegen auf ca. ein Sechstel verringert. Eine Abnahme der mRNA-Expression auf ein Zehntel konnte für die Kanaleinheit KChIP2 gesehen werden. Kv4.3 wurde hingegen bis fast auf ein Zweieinhalbfaches vermehrt exprimiert, während die RNA-Expression für TASK-1 konstant blieb. Ein „Knockdown“ des Kv1.5 mit siRNA zeigte eine weitere Reduktion der Kv1.5 mRNA ohne eine messbare zusätzliche Veränderung des IK,PO. Die Arbeit hat gezeigt, dass primäre Kulturen atrialer Kardiomyozyten des Schweines für elektrophysiologische sowie molekularbiologische Versuche geeignet sind. Der im Interesse stehende Strom IK,PO hat sich unter Kulturbedingungen zwar vergrößert, jedoch blieben Kinetik und vor allem die Eigenschaft auf verschiedene Substanzen zu reagieren unverändert. Es ist somit möglich neue Substanzen in der Entwicklung von Antiarrhythmika an kultivierten Herzzellen zu testen und somit die Anzahl der für die Experimente benötigten Tiere zu verringern. Die Ergebnisse deuten darauf hin, dass neben dem Kv1.5 die Kanaleinheiten der Kv4.3 und KChIP2 wesentlich zum IK,PO betragen. Die vorliegenden Ergebnisse deuten darauf, dass Kv1.5 den Grundstrom des IK,PO bildet und Kv4.3 vornehmlich den Spitzenstrom des IK,PO ausmacht. Kv1.5 wird dabei vermutlich wesentlich durch KChIP2 gehemmt. KChIP2 spielt eine nachweisliche Rolle in der Pathogenese von Herzrhythmusstörungen und zeigt im Vergleich zu Kv1.5 und Kv4.3 eine höhere Gewebespezifität. KChIP2-Blocker könnten in der Entwicklung vorhofselektiver Antiarrhythmika vielversprechende Ergebnisse liefern.
• Background: Atrial fibrillation is the most common cardiac arrhythmia. Because of its cardiac and extracardiac side effects of the antiarrhythmic therapy further investigation is necessary. Due to the rare availablilty of human sample material the exploration of new antiarrhythmic agents is limited. Atrial tissue obtained during cardiac surgery can be used for research purposes. Heart cells from of the atrial tissue are very difficult to handle for what these cells are not commonly used for cell culture experiments. Investigation on antiarrhythmic agents still dependents on animal models. Since the human heart is very similar to the pig heart it here represents an ideal model. In recent studies IK,PO found in pig hearts seemed to be a promising target for atrial selective antiarrhythmic drugs. The current underlying channel units are not thoroughly explored at this time. The aim of this study was to establish a stable model of cell culture of atrial cardiomyocytes. Based on this model electrophysiological, molecular and protein biological methods should be tested. The methods should be tested on the cells from porcine heart after tissue isloation and cell culture of several days. Based on the cell culture model technics like gene knockdown should be performed. The IK,PO and its possible underlying channel subunits Kv1.5, Kv4.3, KChIP2 and TASK 1 should be characterized. Methods: Atrium cells from pig hearts were isolated and analyzed directly after cell isolation and under the influence of cell culture after up to 48 hours. The used methods were patch-clamp, real-time PCR and Western blot analyzes. The effect of various substances on the IK,PO was tested. The Kv1.5 protein has been detected and mRNA analysis for Kv1.5, Kv4.3, KChIP2 and TASK 1 were made. Part of the cells was treated with siRNA targeted against Kv1.5 mRNA. After knock-down of Kv1.5 mRNA the current IK,PO in this cells was measured. Results: The atrial cardiomyocytes in culture of the pig showed vital properties up to 48 hours and were compatible for patch-clamp technic, real-time PCR and Western blot analyzes. In comparison to the freshly prepared cells a significant increase in the current density for the IK,PO was measured. The kinetics of the IK,PO current as well as the behavior towards the substances AVE0118, Heteropodatoxin and PAP 1 remained unchanged compared to the freshly prepared cells. In Western blot analysis was seen an increase of Kv1.5 protein as compared to freshly isolated cells. The mRNA expression of Kv1.5 was however reduced to about one-sixth. A decrease in the mRNA expression could be seen on one-tenth for the channel unit KChIP2. The mRNA expression of Kv4.3 however increased up on two and a half times, while the mRNA expression of TASK 1 remained constant. A knock-down of the Kv1.5 mRNA showed further reduction in the Kv1.5 mRNA quantity without a measurable change in the IK,PO current. Conclusion: The results have shown that primary cultures of atrial cardiomyocytes of the pig heart are suitable for electrophysiological and molecular biological experiments. The mainly analized IK,PO current has increased under culture conditions without changing kinetics. Furthermore it remained its properties in the reaction to various substances. In future cultured model of pig heart cells could be used in the development of antiarrhythmic drugs. In this way also less number of animals would be required for the experiments. The results suggest that besides Kv1.5 the channel units Kv4.3 and KChIP2 are important underlying subunits of the IK,PO current. The present results suggest that Kv1.5 forms the base current of IK,PO and Kv4.3 constitutes mainly the peak current of IK,PO. Kv1.5 is thereby presumably inhibited significantly by KChIP2. KChIP2 plays a demonstrable role in the pathogenesis of cardiac arrhythmias and shows in comparison to Kv1.5 and Kv4.3 a higher tissue specificity. Therefore substances targenting KChIP2 could provide promising results in the development of atrial- selective antiarrhythmic drugs.