Open Access

Sebastian Robert Barthel

• Hepatitis B caused by infection with the hepatitis B virus (HBV) still ranks among the most challenging infectious diseases of our time. Despite the availability of an effective prophylactic vaccine, 240 million people worldwide are estimated to be chronically infected with HBV and are at risk of developing life-threatening liver diseases, including cirrhosis and liver cancer. The underlying pathogenic mechanisms of HBV-associated liver diseases are only incompletely understood. It is widely accepted that liver pathology results from long-term immune-mediated liver injury and inflammation as a consequence of inefficient viral elimination. This injury can be naturally compensated by liver regeneration. However, chronic liver damage and permanent inflammation debilitates the regenerative capacity of the liver and fosters fibrosis as well as accumulation of chromosomal aberrations, which both contribute to cirrhosis and liver cancer. Liver regeneration requires the presence of the redox-sensitive transcription factor Nrf2 and intact insulin receptor signaling. A lack of Nrf2 causes increased intracellular levels of reactive oxygen species (ROS) that inactivate insulin receptor signaling and induce insulin resistance. Interestingly, HBV was observed to activate Nrf2 and the expression of Nrf2-regulated genes. This argues against an inhibitory effect of HBV on insulin receptor signaling by increased ROS levels. However, chronic HBV infection is associated with dysregulation of hepatocyte proliferation and retardation of liver regeneration. Hence, the aim of this thesis was to investigate the influence of HBV on the process of liver regeneration with respect to the insulin receptor signaling pathway. After short-term carbon tetrachloride (CCl4)-induced liver damage, HBV transgenic mice present prolonged liver damage and impaired liver regeneration as reflected by reduced hepatocyte proliferation and increased apoptosis. Impaired hepatocyte proliferation in HBV transgenic mice correlates with diminished activation of the insulin receptor. It was further observed in vitro that the activation of Nrf2 by HBV induces increased levels of the insulin receptor mRNA and protein in HBV-expressing cells. Strikingly, stably HBV-expressing cells as well as primary mouse hepatocytes from HBV transgenic mice bind less insulin due to reduced amounts of insulin receptor on the cell surface. This is caused by intracellular retention of the insulin receptor in HBV-expressing cells as a consequence of increased amounts of the cellular trafficking factor α-taxilin. The reduced amounts of insulin receptor on the cell surface impair insulin sensitivity in HBV-expressing cells and inactivate downstream signaling cascades that initiate insulin-dependent gene expression and glucose uptake. As a consequence of impaired hepatocyte proliferation and liver regeneration, HBV transgenic mice exhibit increased development of fibrosis after long-term CCl4-induced liver damage. Taken together, in this thesis, a novel pathomechanism could be uncovered that includes inactivation of insulin receptor signaling by HBV via intracellular retention of the insulin receptor leading to impaired liver regeneration after liver damage and promotion of liver fibrosis. These findings significantly contribute to an enhanced understanding of HBV-associated liver pathogenesis.
• Trotz der Verfügbarkeit eines prophylaktischen Impfstoffes sind weltweit ca. 240 Millionen chronisch mit dem Hepatitis-B-Virus infiziert. Eine chronische Hepatitis B-Infektion ist die Ursache für schwerwiegende und letale Lebererkrankungen, wie z. B. der Leberzirrhose oder dem Leberkrebs (Hepatozelluläres Karzinom). Jährlich sterben ca. 780.000 Menschen an den Folgen der chronischen Hepatitis B. Die genauen Mechanismen der HBV-assoziierten Pathogenese sind bisher nicht vollständig aufgeklärt. Da HBV selbst nicht zytopathogen ist, geht man davon aus, dass das Immunsystem des Wirtes für die Schädigung des Lebergewebes verantwortlich ist. Bei der chronischen HBV-Infektion bleibt jedoch eine vollständige Eliminierung des Virus aus und es manifestiert sich eine dauerhafte Entzündung der Leber, die das Entstehen einer Lebererkrankung begünstigt. Geschädigtes Lebergewebe kann durch den Prozess der Leberregeneration wiederhergestellt werden. Für die Leberregeneration sind die Funktion des zytoprotektiven Transkriptionsfaktors NF-E2 related factor 2 (Nrf2) sowie ein intakter Insulinrezeptor-Signalweg unabdingbar. Nrf2-regulierte Gene kodieren u.a. für Enzyme, die in der Lage sind reaktive Sauerstoffspezies (ROS) zu detoxifizieren. Beim Fehlen von Nrf2 verursachen erhöhte ROS-Konzentrationen in der Zelle oxidativen Stress, welcher zu einer Inaktivierung des Insulinrezeptor-Signalweges und zu einer Insulinresistenz führt. Interessanterweise wurde beobachtet, dass HBV in der Lage ist diesen Transkriptionsfaktor zu aktivieren und dadurch verstärkt die Expression Nrf2-regulierter Gene zu induzieren. Die Aktivierung von Nrf2 durch HBV spricht dabei gegen einen inhibitorischen Effekt durch erhöhte ROS-Konzentrationen auf den Insulinrezeptor-Signalweg in HBV-exprimierenden Zellen. Dennoch ist bekannt, dass HBV mit dem Prozess der Leberregeneration negativ interferiert und dadurch deren Regenerationsfähigkeit beeinträchtigt. Berücksichtigt man die Relevanz von Nrf2 für die Leberregeneration und den Insulinrezeptor-Signalweg erscheint dies zunächst widersprüchlich. Hiervon ausgehend war das Ziel der vorliegenden Dissertation die Untersuchung des Einflusses von HBV auf den Prozess der Leberregeneration unter besonderer Berücksichtigung des hepatischen Insulinrezeptor-Signalweges. Zunächst wurden HBV-transgene Mäuse mit dem Lebertoxin Tetrachlorkohlenstoff (CCl4) behandelt, um eine Schädigung der Leber zu evozieren und den Einfluss von HBV auf den Regenerationsprozess in vivo zu untersuchen. Hierbei zeigte sich, dass bei HBV-transgenen Mäusen im Vergleich zu entsprechend behandelten Wildtyp-Mäusen eine länger anhaltende Schädigung der Leber zu beobachten ist. Ursächlich dafür ist eine verminderte Zellproliferation sowie eine erhöhte Apoptose der Hepatozyten nach Leberschädigung und damit verbunden eine verringerte Regenerationsfähigkeit der Leber HBV-transgener Mäuse. Eine Langzeitbehandlung mit CCl4 induzierte zudem eine verstärkte Fibrosierung des Lebergewebes in HBV-transgenen Mäusen im Vergleich zu Wildtyp-Mäusen. Um einen möglichen Einfluss von HBV auf den Insulinrezeptor-Signalweg während der Leberregeneration zu untersuchen, wurde das Ausmaß der Insulinrezeptor-Aktivierung bestimmt. Hierbei zeigte sich, dass Hepatozyten von HBV-transgenen Mäusen unmittelbar nach Leberschädigung eine verringerte Insulinrezeptor-Aktivierung aufweisen im Vergleich zu entsprechend behandelten Wildtyp-Mäusen. Auf der Suche nach einem molekularen Mechanismus für diese Beobachtungen, wurde der Insulinrezeptor-Signalweg eingehend in vitro untersucht. Auf transkriptioneller Ebene in stabil HBV-exprimierenden Zellen konnte eine Induktion des Insulinrezeptor-Gens durch eine erhöhte Nrf2-Aktvität nachgewiesen werden. Der Insulinrezeptor wird jedoch durch die erhöhten Mengen an α-Taxilin in HBV-exprimierenden Zellen intrazellulär zurückgehalten, sodass dieser nicht an die Zelloberfläche gelangen kann. Dadurch ist die Bindung von Insulin vermindert, was eine verringerte Insulinrezeptor-Aktivierung und eine verringerte Expression insulin-abhängiger Gene zur Folge hat. Folglich können durch die intrazelluläre Retention des Insulinrezeptors HBV-exprimierende Hepatozyten von mitogenen Signalwegen wie dem Insulinrezeptor-Signalweg abgekoppelt werden und weisen dadurch ein eingeschränktes Proliferationsverhalten auf. Hierdurch wird die Leberregeneration nach einer Leberschädigung inhibiert, was wiederum die Fibrosierung der Leber und dadurch die Entwicklung schwerwiegender Lebererkrankungen begünstigt. Zusammengenommen tragen die Ergebnisse dieser Arbeit zu einem besseren Verständnis des Einflusses von HBV auf die Leberpathogenese der chronischen Hepatitis B bei.