Open Access

Denise Schütz

• Structural biology often employs a combination of experimental and computational approaches to unravel the structure-function paradigm of biological macromolecules. This thesis aims to approach this combination by the application of Pulsed Electron-Electron Double Resonance (PELDOR/DEER) spectroscopy and structural modelling. In this respect, PELDOR spectroscopy in combination with site-directed spin labelling (SDSL) of proteins is frequently used to gain distance restraints in the range from 1.8 to 8 nm. The inter-spin distance and the flexibility of the spin labelled protein domains are encoded in the oscillation and the dampening of the PELDOR signal. The intrinsic flexibility of the commonly used MTSSL (1-Oxyl-2,2,5,5-tetramethylpyrroline-3-methyl) spin label itself can be an obstacle for structural modelling if the flexibility of the label is large compared to the flexibility of the protein domains. In this thesis the investigation of two multi-domain proteins by the 4-pulse PELDOR sequence is presented. At first, the N-terminal polypeptide transport-associated (POTRA) domains of anaOmp85, a rigid three domain protein, giving well-defined PELDOR distance restraints, is investigated. The experimental restraints are used for structure refinement of the X-ray structure and reveal a strong impact of the intrinsic flexibility of MTSSL on the accuracy of structural refinement. The second example, K48-linked diubiquitin, is a highly flexible multi-domain protein on which the flexibility of MTSSL is of minor impact on structural modelling. In this case, the distance restraints are utilized to determine conformational ensembles. Due to the high intrinsic flexibility already characterizing diubiquitin the recently developed 7-pulse Carr-Purcell (CP) PELDOR sequence was applied to investigate longer ubiquitin chains. This sequence enables to measure dipolar oscillations with an extended time window, allowing a good separation between inter- and intramolecular contributions even for long distance and broad conformational distributions, thereby providing an increased accuracy of the obtained distance distributions.
• Die heutige Strukturbiologie verwendet häufig eine Kombination aus experimentellen Datensätzen und computergestützten rechnerischen Methoden, um das Struktur-Funktion Paradigma von biologische Makromolekülen, wie zum Beispiel multi-Domänen Proteinen, zu entschlüsseln. In dieser Arbeit wurde dieser kombinierte Ansatz mittels der Anwendung von PELDOR (Pulsed Electron-Electron Double Resonance = Gepulste Elektronen-Elektronen Doppelresonanz) Spektroskopie und der computergestützten Modellierungen von Konformationsräumen verfolgt, um die relative Domänen-Domänen Orientierung und die konformelle Flexibilität zweier multi-Domänen Proteine zu untersuchen. Die PELDOR Spektroskopie in Kombination mit SDSL (Site-Directed Spin Labelling = Zielgerichtete Nitroxid-Markierung von Proteinen) ist eine häufig verwendete Methode, um Abstände zwischen zwei ungepaarten Elektronenspins, im Bereich von 1.8 bis 8 nm, und deren Verteilung zu bestimmen. Hierbei, ist sowohl die inter-Spin Distanz als auch die Flexibilität des verwendeten Spin Markers und des Proteins im experimentellen PELDOR Signal in Form der Oszillationsfrequenz und deren Dämpfung kodiert. Im Rahmen der Analyse wurden Hindernisse, die durch (i) die intrinsische Flexibilität des gängigen Nitroxid-Markers MTSSL (1-Oxyl-2,2,5,5-tetramethylpyrroline-3-methyl), (ii) eine hohe Flexibilität des Proteinrückgrates sowie (iii) große inter-Spin Abstände entstehen, evaluiert. Zuerst wurden die drei N-terminalen POTRA (POlypeptid TRansport-Assoziierten) Domänen des β-Fass Proteins anaOmp85 des Cyanobakteriums Anabaena sp. PCC 7120 (Anabaena species Pasteur Culture Collection 7120) untersucht und der Einfluss der Flexibilität von MTSSL auf Strukturverfeinerungen, mittels PELDOR Abstandsverteilungen, diskutiert. Besonders im Vordergrund stand hierbei die Genauigkeit der Vorhersage der Flexibilität von MTSSL auf der Basis von Rotamer-Bibliotheken anhand eines statischen Modells (NMR (Nuclear Magnetic Resonance = Kernmagnetische Resonanz; auch Kernspinresonanz), X-ray (Kristallstruktur)). Die Analyse zeigte, dass im Falle von multi-Domänen Proteinen mit eingeschränkter inter-Domänen Flexibilität die Überschätzung der Flexibilität von MTSSL, durch die Rotamer-Bibliotheken, zu einem Auflösungslimit der Strukturverfeinerung führt. Als Zweites wurde der Konformationsraum von K48-verknüpften Ubiquitinketten, sowie dessen Änderung durch die Bindung von UBDs (Ubiquitin Bidungs Domänen) oder eines DUB (DeUBquitinierende Enzyme) ermittelt. Hierbei zeigte sich, dass die inter-Domänen Flexibilität von K48-verknüpften Diubiquitinen die durch Rotamer-Bibliotheken vorhergesagte Spin Marker Flexibilität übersteigt und die Spin Marker Flexibilität somit die Modellierung des Konformationsraumes nicht oder nur wenig beeinflusst. Die weitere Untersuchung des Konformationsraumes von Komplexen dieser Diubiquitinketten mit verschiedenen Interaktionspartnern ermöglichte die Bestimmung der unterschiedlichen Mechanismen der Ubiquitin Bindung im Rahmen des Aufbaus und des Abbaus von Ubiquitinketten. Die PELDOR Experimente an K48-verknüpften Di-, Tri-, und Tetraubiquitinketten zeigten eine Zunahme der Flexibilität mit der Kettenlänge. Anhand der Tri- und Tetraubiquitinketten wurde daher die Notwendigkeit eines hinreichenden Zeitfensters für die Untersuchung langer inter-Spin Abstände und bereiter Abstandsverteilungen erörtert werden. Die Anwendung von 7-pulse CP (Carr-Purcell) PELDOR auf diese Systeme erlaubte eine signifikante Verlängerung des detektier baren Zeitfensters und so eine verlässliche Abschätzung der inter-Domänen Flexibilität dieser Ketten. In diesem Zusammenhang konnte die Kristallstruktur von K48-verknüpftem Tetraubiquitin evaluiert werden. Ein Vergleich der experimentellen und simulierten Abstandsverteilung zeigte, dass die Konformation der Kristallstruktur zwar innerhalb der experimentellen Verteilungsbreite liegt, jedoch nicht die vornehmliche Konformation von K48-verknüpftem Tetraubiquitin darstellt. Des Weiteren erlaubte die Anwendung von 7-pulse CP PELDOR die Detektion von Konformationsänderungen von Tri- und Tetraubiquitinketten durch die Bindung von Interaktions-partnern, die mit der Standard 4-pulse PELDOR Sequenz nur schwer zu beobachten waren. Die erhaltenen Ergebnisse werden zu dem in den biologischen Kontext eingeordnet.