Open Access

Julia Varga

• Colorectal cancer (CRC) has the third highest incidence and the fourth highest mortality rate worldwide and represents a substantial health care burden and affects the life of millions of people. CRC is a genetic disease caused by the stepwise accumulation of genetic alterations. The initiating event in colorectal carcinogenesis is the aberrant activation of the WNT pathway, but other pathways are also commonly deregulated, including the PI3K/AKT pathway. A number of previous studies using genetically engineered mouse models aimed at dissecting the exact role of PI3K/AKT pathway in CRC, but have yielded in rather conflicting results. Despite the inconsistent results, these studies already put forward the idea that PI3K/AKT signaling in combination with other genetic events might substantially contribute to tumor progression. Since the PI3K/AKT pathway is frequently activated in CRC, it represents an ideal candidate for therapeutic intervention. Although extensive efforts had led to the development of numerous inhibitors targeting the PI3K/AKT pathway, the diversity of genetic alterations can challenge the identification of the most effective therapeutic targets. Therefore, the discovery of shared tumor-promoting mechanisms downstream of these genetic alterations might unravel new biomarkers and druggable targets. The aim of this study was to elucidate the precise role of PI3K/AKT pathway during the course of colorectal carcinogenesis and to decipher novel protumorigenic molecular mechanisms downstream of PI3K/AKT activation that can be used for therapeutic intervention. To obtain a better insight into the role of the PI3K/AKT pathway during colorectal carcinogenesis, mice expressing an oncogenic variant of AKT1 (AktE17K) specifically in the intestinal epithelial cells (IEC) were used. At the age of 6 months untreated AktE17K mice showed clearly perturbed intestinal homeostasis, but no tumor formation. To induce colonic tumorigenesis, AktE17K mice were subjected to treatment with the colonic carcinogen azoxymethane (AOM). In response to AOM, AktE17K mice developed invasive but non-metastatic tumors, which showed strong nuclear accumulation of TP53. To investigate the role of PI3K/AKT signaling specifically in CRC progression, AktE17K mice were crossed to TP53-deficient mice (Tp53ΔIEC). Unlike AktE17K mice, untreated Tp53ΔIEC; AktE17K, developed highly invasive small intestinal tumors by the age of 6 months. To investigate the role of AKT hyperactivation in colonic tumor progression, Tp53ΔIEC; AktE17K mice were subjected to AOM treatment. AKT hyperactivation significantly enhanced tumor progression and induced metastatic dissemination. To get a better insight how AKT signaling can promote tumor progression, whole tumor tissues from AOM-treated Tp53ΔIEC and Tp53ΔIEC; AktE17K mice were subjected to next generation mRNA sequencing and phospho-proteomic analysis by mass spectrometry. Both analyses indicated that AKT hyperactivation expands the inflammatory tumor microenvironment and upregulates pathways associated with invasion and metastasis. Importantly, Gene Set Enrichment Analysis revealed that AOM-induced colon tumors of Tp53ΔIEC; AktE17K animals, are highly similar in their gene expression profile to the CMS4 subtype of human CRC, which is associated with worse overall- and relapse-free survival. Gene expression analysis also suggested elevated NOTCH signaling in the Tp53ΔIEC; AktE17K tumors. Interestingly, while the expression of Notch3 mRNA was increased in the tumors of Tp53ΔIEC; AktE17K mice, the expression of the other NOTCH receptors was unaffected by AKT hyperactivation. In vitro experiments using TP53-deficient mouse tumor organoids with hyperactive AKT signaling confirmed the direct, tumor cell-intrinsic link between AKT activation and increased Notch3 expression. Moreover, inhibition of EZH2 mimicked the effect of AKT hyperactivation on Notch3 expression, suggesting that AKT regulates Notch3 via an epigenetic mechanism. Knock-down of Notch3 in TP53-deficient mouse tumor organoids with hyperactive AKT signaling resulted in differential regulation of several pathways with potential role in invasion and metastasis and in cell death and survival. Subsequent in vivo experiments confirmed the role of NOTCH3 signaling in CRC progression. Treatment of AOM-induced Tp53ΔIEC; AktE17K mice with a NOTCH3 antagonistic antibody or the γ-secretase inhibitor DAPT significantly reduced invasion and metastasis. Importantly, NOTCH3 expression was also found to be associated with human CRC progression, suggesting that NOTCH3 represent a valid target for the treatment of CRC. This work, using genetically engineered mouse models and advanced in vitro techniques, has demonstrated a strong tumor promoting role for PI3K/AKT signaling in CRC progression and has identified NOTCH3 signaling as a potential therapeutic target downstream of the PI3K/AKT pathway.
• Unter allen Krebsarten besitzt der kolorektale Krebs (CRC, colorectal cancer) die dritthöchste Inzidenz und die vierthöchste Mortalitätsrate weltweit und stellt somit eine wesentliche Belastung für das Gesundheitssystem dar und beeinträchtigt das Leben von Millionen Patienten und ihrer Familien. Obwohl viele Faktoren zur Entstehung von CRC beitragen können, ist es doch unbestreitbar eine genetische Erkrankung, die durch die schrittweise Ansammlung von genetischen Veränderungen verursacht wird. Der initiale Prozess der kolorektalen Karzinogenese ist die abnormale Aktivierung des WNT-Signalweges, allerdings gibt es auch andere Signalwege, die in CRC häufig fehlreguliert sind, unter anderem der PI3K/AKT-Signalweg. Der PI3K/AKT-Weg verbindet Signale von Wachstumsfaktoren, Zytokinen und anderen äußerlichen Faktoren mit der intrazellulären Signaltransduktion und reguliert eine Vielzahl von essentiellen Prozessen wie Proliferation, Überleben, Beweglichkeit und Metabolismus17. Eine beträchtliche Anzahl an Genen, die für Mitglieder des PI3K/AKTSignalweges kodieren, sind in Krebserkrankungen mutiert oder in ihrer Kopienanzahl verändert. Eine Gesamtanalyse von 32 verschiedenen Krebsarten zeigte, dass die häufigsten Veränderungen PIK3CA-Mutationen, PIK3CA- und PIK3CB-Amplifikationen, PIK3R1- und PIK3R2-Mutationen, PTEN-Deletionen oder inaktivierende Punktmutationen und AKT1Mutationen beinhalteten22. In einer kürzlich durchgeführten, groß angelegten Studie an metastasierenden Krebsarten war PIK3CA das Top-Onkogen und PTEN der am dritthäufigsten mutierte Tumorsuppressor, was die Bedeutung des PI3K/AKT-Signalweges bei der Krebsprogression hervorhebt26. Ein ähnliches Bild ergibt sich für CRC, in dem PIK3CA- und PIK3R1-Mutationen und PTEN-Deletionen und -Mutationen am häufigsten vertreten sind. Amplifikation und Überexpression von IGF2 und IRS2 sind ebenfalls häufige Vorkommnisse in CRC und weisen eine gegenseitige Exklusivität gegenüber anderen Veränderungen des PI3K/AKT-Signalweges auf5. Nachgeschaltet von PI3K repräsentiert AKT eines der zentralen Signal-Knotenpunkte. AKT gehört zur Familie der AGC-Serin-Threonin-Proteinkinasen und besitzt drei hoch homologe Isoformen: AKT1, AKT2 und AKT3. Es konnten mehr als 200 Substrate für AKT identifiziert werden und in den meisten Fällen führt eine Phosphorylierung am RXRXXS/TKonsensusmotif zu einer negativen Regulierung der Effektorfunktionen28. Ähnlich den anderen Mitgliedern des PI3K/AKT-Signalweges ist in Krebs auch AKT genetischen Veränderungen unterworfen, allerdings in geringerem Ausmaß als PTEN oder PI3K. Aktivierende hotspot-Mutationen im AKT-Gen konnten in verschiedensten Krebsarten identifiziert werden39. Eine Reihe früherer Studien mit gentechnisch veränderten Mausmodellen, die darauf abzielten, die exakte Funktion des PI3K/AKT-Signalweges in CRC zu analysieren, ergaben eher widersprüchliche Aussagen36, 73, 77. Trotz der inkonsistenten Ergebnisse legten diese Studien die Idee nahe, dass der PI3K/AKT-Weg in Kombination mit anderen genetischen Ereignissen wie dem Verlust von APC oder der Expression von onkogenem KRAS wesentlich zur Tumorprogression beitragen könnte74, 76. Da der PI3K/AKT-Signalweg bei Krebserkrankungen häufig aktiviert ist und genetische Veränderungen bei allen Krebsarten auftreten, stellt dieser Signalweg ein ideales Ziel für therapeutische Interventionen dar. Trotz umfangreicher Bemühungen, die zur Entwicklung zahlreicher PI3K-, AKT- und mTOR-Inhibitoren führten, erschwert die Diversität der genetischen Alterationen die Identifizierung geeigneter therapeutischer Ziele, zumal bisher keine zuverlässigen Biomarker bekannt sind, die einen PI3K/AKT-abhängigen Krebs eindeutig identifizieren. Daher könnte die Erforschung gemeinsamer tumorigener Signalkaskaden, die den genetischen Veränderungen nachfolgen, neue Biomarker und therapierbare Ziele aufdecken. Das Ziel dieser Arbeit war es, die genaue Rolle des PI3K/AKTSignalweges im Verlauf der kolorektalen Karzinogenese aufzuklären und neuartige protumorigene molekulare Mechanismen downstream der PI3K/AKT-Aktivierung zu entschlüsseln, die für therapeutische Interventionen genutzt werden können. Um einen besseren Einblick in die Rolle des PI3K/AKT-Signalweges in der kolorektalen Karzinogenes zu erlangen, wurden Mäuse verwendet, die ein Allel mit einer onkogenen Variante von AKT1 (LSL-AktE17K) besitzen. Die Substitution von Glutaminsäure mit einem Lysin an der Aminosäureposition 17 in AKT1 führt zu einer Konformationsänderung in der Lipidbindungstasche, wodurch es AKT1 ermöglicht wird PIP2 anstelle von PIP3 zu binden, was eine konstante Membran-Lokalisierung und Aktivierung von AKT1 zur Folge hat40, 41. Mäuse, die das LSL-AktE17K-Transgen enthielten, wurden mit Mäusen gekreuzt, die die Cre-Rekombinase unter der Kontrolle des Villin-Promoters (villin-Cre) exprimierten. Da die Expression von AktE17K durch die Lox-Stopp-Lox (LSL) -Sequenz blockiert wird, wird AktE17K nur in Zellen exprimiert, die auch die Cre-Rekombinase enthalten. Diese Strategie führt zur spezifischen Expression von AktE17K in intestinalen Epithelzellen (IEC, intestinal epithelial cells). Diese Tiere werden im Folgenden als AktE17K-Mäuse bezeichnet. Im Alter von 6 Monaten wiesen unbehandelte AktE17K-Mäuse im Vergleich zu Wildtyp-Tieren (wt) verschiedene Abnormalitäten im Dünn- und Dickdarm auf. Zu diesen Veränderungen gehörten vergrößerte Dünndarmkrypten, die Expansion des Stammzell-/VorläuferRepertoires, aberrante Lokalisierungen der Paneth-Zellen und zottenähnliche Protrusionen im Dickdarm, was darauf hindeutet, dass die Hyperaktivierung von AKT die Darmhomöostase stört. Um die Kolonkarzinogenese zu induzieren, wurden AktE17K-Mäuse wiederholt mit dem Karzinogen Azoxymethan (AOM) behandelt. Als Folge entwickelten sowohl wt- als auch AktE17K-Mäuse Tumore, aber während keines der wt-Tiere invasive Kolontumore aufwies, konnten in 43% der mit AOM behandelten AktE17K-Mäuse mindestens ein invasiver Tumor beobachtet werden. Trotz der Anwesenheit dieser invasiven Tumore in den AktE17K-Tieren, zeigte sich jedoch keine Metastasierung. Darüber hinaus wiesen invasive Tumore in, mit AOM behandelten AktE17K-Mäusen eine starke nukleäre Akkumulation von TP53 auf, was auf eine TP53-Stabilisierung oder Mutation hinweisen könnte. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass die AKT-Aktivierung zur Tumorprogression beiträgt und dass dies von der TP53Funktion abhängig sein könnte. Um die Rolle des PI3K/AKT-Signalweges spezifisch in der CRC-Progression zu untersuchen, wurde das zuvor etablierte TP53-defiziente Mausmodell von fortgeschrittenem CRC verwendet. Mäuse mit IEC-spezifischer Deletion des Tp53-Gens (Tp53ΔIEC-Mäuse) entwickeln invasive Dickdarmtumore und etwa 20 bis 30% der Versuchstiere zeigen eine Lymphknotenmetastasierung als Folge der Karzinogenbehandlung auf271. Um ein TP53-defizientes Modell mit hyperaktiviertem AKT zu generieren wurden AktE17K-Mäuse mit solchen verpaart, deren Exons 2-10 des Tp53-Gens von loxP-Sequenzen flankiert waren (Tp53fl/fl). Diese Kreuzungsstrategie führt zu Nachkommen mit IECspezifischer, simultaner Tp53-Deletion und AktE17K-Expression (Tp53ΔIECAktE17K-Mäuse). Unbehandelte Tp53ΔIECAktE17K-Mäuse weisen die gleichen Veränderungen in Dünn- und Dickdarm auf wie AktE17K-Mäuse. Im Gegensatz zu diesen entwickeln allerdings fast alle Tp53ΔIECAktE17K-Tiere in einem Alter von 6 Monaten hochinvasive Dünndarmtumore. Diese Beobachtungen deuten darauf hin, dass die AKT-Hyperaktivierung alleine nicht ausreicht, um die Tumorgenese zu induzieren. In Gegenwart zusätzlicher onkogener Mutationen, wie der Tp53-Deletion, beschleunigt die AKT-Hyperaktivierung jedoch die spontane Tumorinitiierung und -progression. Da Tp53ΔIECAktE17K-Mäuse nur kleine Dünndarmtumore entwickeln, wurden sie wiederholt mit AOM behandelt um die Rolle der AKT-Hyperaktivierung im Kolonkarzinom zu untersuchen. Die Tumorinitiierung und das primäre Wachstum in Tp53ΔIECAktE17K-Mäusen wurde durch die AKT-Hyperaktivierung nicht beeinflusst, die AKT-Hyperaktivierung führte jedoch zu einer signifikant verstärkten Tumorprogression. Tp53ΔIECAktE17K-Mäuse entwickelten vermehrt invasive Tumore mit größeren invasiven Regionen, die häufiger zu Metastasierungen führten. Diese Befunde belegen, dass die AKT-Hyperaktivierung mit dem TP53-Verlust zusammenwirkt und die Tumorprogression wesentlich beschleunigt. Um einen Einblick zu bekommen, auf welche Weise der AKT-Signalweg die Tumorprogression fördert, wurde Tumorgewebe von AOM-behandelten Tp53ΔIEC und Tp53ΔIECAktE17K-Mäusen mittels next generation mRNA-Sequenzierung und das PhosphoProteom per Massenspektrometrie untersucht. Beide Analysen zeigten, dass die AKTHyperaktivierung das inflammatorische Tumor-Mikromilieu verstärkt und Signalwege hochreguliert, die mit Invasion und Metastasierung assoziiert sind. Interessanterweise zeigte die Gene-Set-Enrichment-Analyse (GSEA), dass AOM-induzierte Kolonkarzinome von Tp53ΔIECAktE17K-Tieren in ihrem Genexpressionsprofil hohe Ähnlichkeit mit dem CMS4Subtyp des humanen CRC aufweisen7. Dieser molekulare Subtyp ist durch stromale Infiltration, erhöhte mesenchymale und verminderte epitheliale Signaturen, die Aktivierung von EMT und TGFβ, die Herunterregulation des WNT-Signalweges, der Angiogenese und der Matrixremodulierung gekennzeichnet. Der CMS4-Subtyp ist sowohl mit einem geringerem rezidivfreien als auch allgemeinem Überleben assoziiert. Genexpressionsanalysen deuten außerdem auf eine erhöhte NOTCH-Signalgebung in Tp53ΔIECAktE17K-Tumoren hin. Während die Notch3-mRNA in diesen Tumoren erhöht war, wurden die anderen NOTCH-Rezeptoren interessanterweise nicht durch die AKTHyperaktivierung beeinflusst. Obwohl es bisher relativ wenige Studien gibt, die sich speziell mit der Rolle von NOTCH3 in humanem CRC befassen, beginnt ein Beitrag von NOTCH3 in der CRC-Progression deutlich zu werden. Erhöhte NOTCH3-Expressionslevel wurden in primären und metastasierenden CRC identifiziert159 und eine Herunterregulation von NOTCH3 führte zu einer reduzierten Invasivität von humanen CRC-Zellen242. In vitro-Experimente mit TP53-defizienten, murinen Tumororganoiden mit Ptenknock-down oder myristolysiertem AKT bestätigten eine direkte Verbindung zwischen der Aktivierung von AKT und einer erhöhten Notch3-Expression. Im Gegensatz dazu führte die Inhibierung von AKT mittels des small molecule inhibitors AKT1-3 (AZD5363)277 zu stark verringerten Notch3-mRNA-Konzentrationen. Diese Ergebnisse bestätigen, dass die Notch3mRNA durch AKT reguliert wird und dass diese Regulation unabhängig von NOTCH-Liganden ist, die von den Zellen der Tumormikroumgebung präsentiert werden. Trotz der deutlichen Verbindung zwischen AKT-Aktivierung und erhöhter Notch3-Expression im TP53-defizienten Hintergrund zeigte die Genexpressionsanalyse von Tumoren von AOM-behandelten wt- und AktE17K-Mäusen keine Hochregulation der Notch3-Expression als Reaktion auf die AKTHyperaktivierung, was darauf hindeutet, dass die Induktion der Notch3-Expression abhängig von dem Fehlen von funktionellem TP53 ist. Um zu überprüfen ob NOTCH3 nachgeschaltet der PI3K/AKT-Signalkaskade zur Tumorprogression beiträgt, wurden Tumororganoide mit Hyperaktivierung von AKT und einer induzierbaren Notch3-Herunterregulation generiert und mittels RNA-Sequenzierung analysiert. Die resultierenden Daten wiesen auf die differentielle Regulation verschiedener Signalwege hin, die eine potentielle Rolle in der Invasion, Metastasierung, dem Zelltod und Überleben besitzen. Darauffolgende in vivo-Experimente bestätigten die Rolle von NOTCH3 in der CRC-Progresssion. Die Behandlung von AOM-induzierten Tp53ΔIECAktE17K-Mäusen mit einem antagonistischen NOTCH3-Antikörper (α-NRR3) oder des γ-Sekretase-Hemmers DAPT, führte zu einer signifikanten Reduktion der Invasivität und Metastasierung. Eine Ansammlung von Beweisen legt nahe, dass AKT die Genexpression neben der Phosphorylierungs-vermittelten Kontrolle verschiedener Transkriptionsfaktoren außerdem über die Regulation von epigenetischen Modifikatoren beeinflusst. Eines der bekannten Ziele von AKT ist EZH2, die Methyltransferase-Untereinheit des PRC2-Komplexes. Dieser Komplex ist für die Tri-Methylierung des Histons 3 an der Position 27 (H3K27me3) verantwortlich, welche eine hemmende Markierung ist und die Genexpression inhibiert. Der PRC2-Komplex reguliert verschiedene entwicklungsrelevante Gene und seine Funktion ist in Krebs häufig dereguliert84. Es ist bekannt, dass AKT EZH2 am Serin 21 phosphoryliert85, was zu einer reduzierten Affinität des PRC2-Komplexes führt. Daher lag die Hypothese nahe, dass eine AKT-abhängige Inhibierung von EZH2 zu einer Re-Expression von Notch3 führen könnte. Tatsächlich führte eine pharmakologische Inhibition von EZH2 in TP53-defizienten, murinen Tumororganoiden zu einer erhöhten Notch3-Expression. Zusätzlich zeigten Chromatin-Immunpräzipitationen verringerte H3K27-Trimethylierungen und reduzierte SUZ12-Bindung an den Notch3-Promotor als Folge von hyperaktiviertem AKT. Obwohl diese Daten belegen, dass Notch3 ein Zielgen von EZH2 ist, konnte eine direkte EZH2Phosphorylierung durch AKT nicht beobachtet werden, was darauf hindeutet, dass die AKTvermittelte Beeinträchtigung von EZH2 über einen anderen Mechanismus abläuft. Hinzu kommt, dass eine erhöhte NOTCH3-Expresssion in humanen CRC-Patienten mit einer signifikant verschlechterten Überlebensrate assoziiert ist. Außerdem korreliert die NOTCH3-Expression positiv mit dem Tumorstadium, der lymphovaskulären Invasion und dem Status der lymphatischen, sowie der peripheren Metastasierung. Diese Befunde deuten an, dass der NOTCH3-Signalweg auch in der Entwicklung von humanem CRC eine Rolle spielt, was eine therapeutische Bedeutung impliziert. Die Tatsache, dass die NOTCH3Expression positiv mit der Progression humanem CRCs korreliert ist und dass die NOTCH3Inhibition ausreicht um die Invasivität und Metastasierung in Mäusen zu reduzieren, könnte die Verwendung von γ-Sekretase-Inhibitoren umgehen und dazu beitragen Nebenwirkungen zu verhindern, die durch die generelle Blockierung der NOTCH-Kaskade auftreten. Tatsächlich wurden bereits Antikörper entwickelt, die spezifisch gegen NOTCH3 gerichtet sind und erfolgreich in präklinischen Modellen getestet wurden251, 256. Alles in Allem hat diese Arbeit verschiedene wichtige Erkenntnisse erbracht. Zunächst konnte eine unerwartete Rolle des PI3K/AKT-Signalweges in der Aufrechterhaltung der Darmhomöostase demonstriert werden. Zweitens konnte gezeigt werden, dass der PI3K/AKT-Signalweg stark zur Entwicklung von CRC im Mensch und in der Maus beiträgt und in Kombination mit dem Verlust von TP53 hoch-invasive und metastasierende Tumore in Mäusen erzeugt, die einem Karzinogen ausgesetzt wurden. Drittens konnte ein intrinsisches Zusammenspiel von PI3K/AKT- und NOTCH3-Signalwegen aufgedeckt werden. Zu guter Letzt wurde demonstriert, dass die NOTCH3-Inhibierung die AKT-vermittelte Tumorprogression vermindert und daher eine effektive Strategie einer Krebstherapie darstellt.