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Irina Melnikov

• Weltweit stellt das kolorektale Karzinom die dritthäufigste Krebsdiagnose bei Männern und die zweithäufigste bei Frauen dar. Von den bekannten beeinflussbaren Risikofaktoren sind Ernährung, Rauchen und körperliche Aktivität zu nennen, hingegen gelten Alter, familiäre Belastung und männliches Geschlecht als nicht beeinflussbare Risikofaktoren. Neben Genmutationen, welche beispielsweise bei der Familiären Adenomatösen Polyposis coli und beim “Lynch Syndrom” eine wichtige Rolle spielen, kann auch die pathologisch verstärkte Expression von tumorrelevanten Proteinen wie z.B. induzierbare COX-2, Cyclin A, B und D, c-Fos, EGF, MMP-9, VEGF sowie das ubiquitäre RNA-Bindeprotein HuR maßgeblich zur Entstehung des Kolonkarzinoms beitragen. Viele der bislang identifizierten Zielgene des HuRs sind an der Regulation tumorpromovierender Eigenschaften wie Proliferation, Invasion, Metastasierung und Apoptose beteiligt, was HuR zu einem hochattraktiven Target der molekularen Tumortherapie macht. Bislang ist bekannt, dass eine gesteigerte HuR-Bindung an AREs in der 3’UTR vieler Zielgene entweder zur Stabilisierung und/oder Translationsveränderung von kurzlebigen mRNAs von tumorrelevanten Genprodukten führen kann. Eine pathologisch erhöhte zytosolische HuR Akkumulation, welche bekanntlich oft mit einer ungünstigen Prognose der Tumorpatienten korreliert, wird jedoch im Wesentlichen als Folge eines fehlerhaft regulierten erhöhten Exportes des überwiegend im Zellkern lokalisierten HuR Proteins ins Zytoplasma (sogenanntes “HuR-Shuttling”) betrachtet, während genomische oder epigenetische Mechanismen vermutlich nur eine untergeordnete Rolle spielen. Der Gegenstand der vorliegenden Arbeit war die Aufklärung der bisher nur wenig bekannten zugrunde liegenden Mechanismen des erhöhten HuR-Shuttlings in der Kolonkarzinom-Zelllinie DLD-1 unter besonderen Berücksichtigung PKCδ-abhängiger Signalwege. Durch Zugabe des pharmakologischen PKCδ-Inhibitors Rottlerin konnte die subzelluläre HuR-Lokalisation in den Kolonkarzinom Zelllinien DLD-1 und SW-620 deutlich reduziert werden, wobei die maximale Wirkung erst nach einer Inhibitionszeit von 16 Stunden erreicht wurde. Diese Beobachtung lässt vermuten, dass Rottlerin die PKCδ Aktivität in DLD-1 Zellen hemmt. Hingegen konnten Inhibitoren von verschiedenen MAPK-Kinasen (SB203580, SP600125, PD98059, Raf-1-Inhibitor) die basale zytoplasmatische HuR Lokalisation nicht beeinflussten, ebensowenig der pharmakologische Inhibitor der Calcium-abhängigen PKCs (PKCα und PKCβ) Gö6976. Auf der anderen Seite bewirkte das Phorbolester PMA eine deutliche Steigerung der PKC-Aktivität. Des Weiteren wurde in dieser Arbeit nach tumorrelevanten Genen gesucht, deren Expression in humanen Kolonkarzinomzellen posttranskriptionell von HuR und gleichzeitig von PKCδ kontrolliert wird. Mit Hilfe von RNA-Pulldown Experimenten konnte gezeigt werden, dass die Hemmung der PKCδ funktionell zu einer starken Reduktion der an HuR-gebundenen mRNAs wie c-myc, cyclin A und D sowie COX-2 führt. Schließlich haben Aktivitätsmessungen der Gesamt-PKC-Aktivität gezeigt, dass diese in Kolonkarzinom-Zelllinien nachweisbar und damit basal aktiv ist. Die Untersuchungsergebnisse dieser Arbeit können zum besseren Verständnis der pathophysiologischen Bedeutung des ubiquitären RNA-Bindeproteins HuR für die Kolonkarzinogenese sowie der prokarzinogenen Rolle der PKCδ im Kolongewebe beitragen.
• Colorectal carcinoma is the third most common cancer diagnosis made in men and the second most common in women worldwide. Whereas nutrition, smoking and physical activity are known risk factors that can be influenced directly, others such as age, familial predisposition and male gender account as risk factors which can not be influenced. In addition to gene mutations which play an important role in familial adenomatous polyposis coli and in the "Lynch syndrome", the pathological overexpression of tumor-relevant proteins such as e.g. inducible COX-2, cyclin A, B and D, c-Fos, EGF, MMP-9, VEGF and the ubiquitous RNA binding protein HuR seem to essentially contribute to the development of colorectal cancer. Since many target genes of HuRs which have been identified so far, are involved in the regulation of tumor-promoting processes including proliferation, invasion, metastasis and apoptosis, HuR represents a highly attractive target for a molecular tumor therapy. It is well established that increased HuR binding to AU-rich elements in the 3’UTR of the target RNAs leads to a stabilization and/or altered translation of short-lived mRNAs of tumor-relevant gene products. However, the pathologically increase in cytosolic HuR expression within many cases correlates with a negative prognosis of tumor patients, is considered as result of an increased export of the predominantly nuclear-localized HuR protein into the cytoplasm (so-called "HuR-shuttling"). By a contrast, genomic or epigenetic mechanisms probably play only a minor role in this scenario. The object of the present work was to elucidate the mechanisms underlying the increased HuR-shuttling in the colon carcinoma cell line DLD-1, with a particular focus put on the PKCδ-mediated signalling pathways. By employing the pharmacological PKCδ inhibitor rottlerin the cytoplasmic HuR abundance in the colon carcinoma cell lines DLD-1 and SW-620 was significantly reduced with maximal effects were observed at 16 hours. Upon inhibitor treatment this result illustrates that Rottlerin interferes with the basal HuR shuttling in colon carcinoma cells and reduced basal PKCδ activity as shown by a PKC activity assay. In contrast neither inhibitors of various MAPK kinases (SB203580, SP600125, PD98059, Raf-1 inhibitor) nor a pharmacological inhibitor of calcium-dependent PKCs (PKCα and PKCβ) Gö6976, could affect basal cytoplasmic HuR levels in tumor cells. On the other hand, the phorbol ester PMA caused a substantial increase in PKC activity. I tried also to identify novel tumor-relevant genes under the post-transcriptional control of HuR and PKCδ. By means of RNA pulldown experiments I could demonstrate that inhibition of PKCδ functionally leads to a strong reduction of the HuR-bound mRNAs coding for c-myc, cyclin A and D and COX-2. The latest ones were additionally identified as target genes which were strongly downregulated after depletion of PKCs. Finally, activity measurements of total PKC activity implicates a clear increase in basal PKCδ activity in colon carcinoma cell lines. The results of this work can contribute to a better understanding of the pathophysiological relevance of the ubiquitous RNA binding protein HuR for colon carcinogenesis and the potential tumorigenic role of PKCδ in colon cancer cells.