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Julia Canet Pons

• Cerebellar ataxias are a group of neurodegenerative disorders primarily affecting the cerebellum. Although causative mutations in several genes have been identified there is currently no cure for ataxias. The first part of this dissertation is focused on Spinocerebellar ataxia type 2 (SCA2). SCA2 is a dominant ataxia caused by repeat expansion mutations in the ATXN2 gene, which encodes the protein Ataxin2 (ATXN2). A polyglutamine (polyQ) tract consisting of CAG repeats interrupted by CAA was identified at exon 1 of ATXN2. Healthy individuals have between 22 and 23 glutamines, while expansions longer than 33 CAG repeats cause SCA2. The most noticeable symptom that SCA2 patients show is ataxic gait; however, they also show cerebellar dysarthria, dysdiadochokinesia, and ocular dysmetria caused by the progressive cerebellar degeneration. To model the SCA2 disease, we generated a new mouse model where 100 CAG repeats were introduced in the mouse Atxn2 gene via homologous recombination. The characterization of this mouse model, Atxn2-CAG100-KIN, demonstrated that it reproduces the symptomatology observed in SCA2 patients. These animals showed significant loss of weight over time, brain atrophy, and motor deficits. In addition, ATXN2 intermediate expansions have been linked to the pathology of Amyotrophic lateral sclerosis (ALS) as a risk factor. ALS is a fatal neurodegenerative disease where the motor neurons in the brain and spinal cord degenerate. A hallmark of ALS is the presence of TDP43-positive inclusions in neurons and glia. Further studies of post mortem spinal cord samples from SCA2 patients showed severe and widespread neurodegeneration of the central somatosensory system. Therefore, it was of interest to further investigate the pathology affection of this tissue in the Atxn2-CAG100-KIN line and the relationship between ATXN2 and TDP43. The characterization of the spinal cord pathology via protein quantification, transcript quantification, and immunohistochemistry showed a preferential affection of RNA binding proteins (RBP) in the spinal cord rather than the cerebellum. The ALS-linked factors TDP43 and TIA1 showed time-dependent co-aggregation with ATXN2 in spinal cord sections together with an increase of CASP3 levels. Therefore, this mouse model can help develop new therapies and evaluate their effect in differently affected areas. A transcriptome data set from Atxn2-CAG100-KIN spinal cord samples at the final disease stage of this mouse model showed a strong up-regulation of RNA toxicity-, immune- and lysosome-implicated factors. These data pointed to a pathological reactivation of the synaptic pruning and phagocytosis in microglia. ATXN2-positive aggregates were found in microglia from spinal cord sections of 14-month-old Atxn2-CAG100-KIN via immunohistochemistry. The characterization of microglial response and the potentially deleterious effects of the expanded ATXN2 in this cell type could lead to therapies to improve patients’ living standards or delay the symptoms’ onset. The second part of this thesis was focused on an autosomal recessive form of cerebellar ataxia, Ataxia Telangiectasia (A-T), with childhood onset. A-T patients show severe cerebellar atrophy manifesting as ataxia when the child starts to walk. The genetic cause of A-T is loss-of-function-mutations in the Ataxia Telangiectasia Mutated gene (ATM). ATM is a kinase involved in DNA damage response, oxidative stress, insulin resistance, autophagy via mTOR signaling, and synaptic function. Working with proteome data from cerebrospinal fluid of 12 A-T patients and 12 healthy controls, we aimed to define novel biomarkers that would allow following the neurodegeneration in extracellular fluid. Additional validation efforts with ~2-month-old Atm-knock-out (Atm-/-) cerebellar samples helped us to define a scenario were the deficit of vesicle-associated ATM alters the secretion of ApoB, reelin, and glutamate. As extracellular factors, apolipoproteins and their cargo such as vitamin E may be useful for neuroprotective interventions.
• Der erste Teil dieser Dissertation befasste sich mit der spinozerebellären Ataxie Typ 2 (SCA2). SCA2 ist eine dominante Ataxie, die durch wiederholte Expansionsmutationen im ATXN2-Gen verursacht wird, welches Protein Ataxin2 (ATXN2) kodiert. Ein Polyglutamin (polyQ) -Trakt, der aus durch CAA unterbrochenen CAG-Wiederholungen bestand, wurde im Exon 1 von ATXN2 identifiziert. Gesunde Personen haben zwischen 22 und 23 Glutamine, während Expansionen, die länger als 33 CAG-Wiederholungen sind, SCA2 verursachen. Das auffälligste Symptom bei SCA2-Patienten ist der ataxische Gang. Sie zeigen jedoch auch Kleinhirn-Dysarthrie, Dysdiadochokinese und Augendysmetrie, die durch die fortschreitende Kleinhirn-Degeneration verursacht werden. Um die SCA2-Krankheit zu modellieren, haben wir ein neues Mausmodell erstellt, bei dem 100 CAG-Wiederholungen über homologe Rekombination in das Maus-Atxn2-Gen eingeführt wurden. Die Charakterisierung dieses Mausmodells, Atxn2-CAG100-KIN, zeigte, dass es die bei SCA2-Patienten beobachtete Symptomatik reproduziert. Diese Tiere zeigten im Laufe der Zeit einen signifikanten Gewichtsverlust, eine Hirnatrophie und motorische Defizite. Darüber hinaus wurden ATXN2-Zwischenexpansionen mit der Pathologie der Amyotrophen Lateralsklerose (ALS) als Risikofaktor in Verbindung gebracht. ALS ist eine tödliche neurodegenerative Erkrankung, bei der die Motoneuronen im Gehirn und Rückenmark entartet sind. Ein Kennzeichen von ALS ist das Vorhandensein von TDP43-positiven Einschlüssen in Neuronen und Glia. Weitere Studien an post mortem-Rückenmarkproben von SCA2-Patienten zeigten eine schwere und weit verbreitete Neurodegeneration des zentralen somatosensorischen Systems. Daher war es von Interesse, die Pathologie dieses Gewebes in der Atxn2-CAG100-KIN-Linie und die Beziehung zwischen ATXN2 und TDP43 weiter zu untersuchen. Die Charakterisierung der Pathologie des Rückenmarks mittels Proteinquantifizierung, Transkriptquantifizierung und Immunhistochemie zeigte eine bevorzugte Beeinflussung von RNA-bindenden Proteinen im Rückenmark anstelle des Kleinhirns. Die ALS-verknüpften Faktoren TDP43 und TIA1 zeigten eine zeitabhängige Co-Aggregation mit ATXN2 in Rückenmarksschnitten zusammen mit einem Anstieg der CASP3-Spiegel. Daher kann dieses Mausmodell dazu beitragen, neue Therapien zu entwickeln und deren Wirkung in unterschiedlich betroffenen Bereichen zu bewerten. Die Erzeugung eines Transkriptomdatensatzes aus Atxn2-CAG100-KIN-Rückenmarksproben im Endstadium der Erkrankung dieses Mausmodells zeigte eine starke Hochregulation der RNA-Toxizitäts-, Immun- und Lysosomen-implizierten Faktoren. Diese Daten wiesen auf eine pathologische Reaktivierung des synaptischen Schnitts und der Phagozytose in Mikroglia hin. ATXN2-positive Aggregate wurden in Mikroglia aus Rückenmarksschnitten des 14 Monate alten Atxn2-CAG100-KIN mittels Immunhistochemie gefunden. Die Charakterisierung der Mikroglia-Reaktion und die potenziell schädlichen Wirkungen des expandierten ATXN2 in diesem Zelltyp könnten zu Therapien führen, mit denen der Lebensstandard der Patienten verbessert oder der Beginn der Symptome verzögert werden kann. Der zweite Teil dieser Arbeit befasste sich mit einer autosomal rezessiven Form der Kleinhirnataxie, Ataxia Telangiectasia (A-T), mit Beginn während der Kindheit. A-T-Patienten zeigen eine schwere Atrophie des Kleinhirns, die sich als Ataxie manifestiert, wenn das Kind zu laufen beginnt. Die genetische Ursache von A-T sind Funktionsverlustmutationen im Ataxia Telangiectasia Mutated Gen (ATM). ATM ist eine Kinase, die an DNA-Schadensantwort, oxidativem Stress, Insulinresistenz, Autophagie über mTOR-Signalübertragung und synaptischer Funktion beteiligt ist. In Zusammenarbeit mit Proteomdaten aus der Liquor cerebrospinalis von 12 A-T-Patienten und 12 gesunden Kontrollpersonen sollten neue Biomarker definiert werden, mit denen die Neurodegeneration in der extrazellulären Flüssigkeit verfolgt werden kann. Zusätzliche Validierungsbemühungen mit ~2 Monate alten Atm-Knock-out Kleinhirnproben halfen uns, ein Szenario zu definieren, in dem das Defizit von vesikelassoziierten ATM die Sekretion von ApoB, Reelin und Glutamat verändert. Als extrazelluläre Faktoren können Apolipoproteine und ihre Ladung wie Vitamin E für neuroprotektive Interventionen nützlich sein.