Open Access

Ivana Josipović

• Aim: Long noncoding RNAs (lncRNAs) belong to the interface of epigenetics and exhibit diverse functions. Their features depend on their sequence, genomic location and tertiary structure. The aim was to identify novel lncRNAs and characterise their physiological functions and mechanisms in endothelial cells. Three different approaches were performed: The hypothesis that pseudogene-annotated lncRNA NONHSAT073641 regulates the expression of their parental gene platelet activating factor acetylhydrolase 1b regulatory subunit 1 (PAFAH1B1) was examined. The physiological functions and in vivo relevance of most lncRNAs are still unknown, therefore a part of this work aimed to identify lncRNAs in response to a pathophysiological stimulus (high amplitude stretch) in endothelial cells. The long intergenic noncoding RNA antisense to S1PR1 (LISPR1) gene, is located within the promotor of sphingosine-1-phosphate receptor 1 (S1PR1) and shares a part of the promotor region. This study examined additionally the hypothesis that LISPR1 controls the S1PR1 expression in endothelial cells. Methods: The angiogenic functions of NONHSAT073641 and LISPR1 were examined with spheroid-outgrowth and scratch wound assays. Furthermore, stretch experiments were performed in order to identify differently expressed lncRNAs in human umbilical vein endothelial cells (HUVECs). In addition, the in vivo relevance of both lncRNAs was examined in samples from pulmonary arterial hypertension patients. Knockdown (e.g. LNA GapmeRs), knockout (CRISPR/ Cas9) and overexpression experiments (e.g. CRISPR activation) were performed to analyse target genes. The molecular mechanism of LISPR1 was investigated with RNA and Chromatin immunoprecipitation. Results: NONHSAT073641 and PAFAH1B1 exhibited angiogenic function in endothelial cells. It could be observed that NONHSAT073641 is not regulating the expression of PAFAH1B1. The pro-angiogenic feature of PAFAH1B1 might be attributed to the target gene matrix Gla protein (MGP). NONHSAT073641 and PAFAH1B1 were significantly induced in CTEPH samples and might be important in the development of this disease. It could be speculated that NONHSAT073641 is regulating the expression of the cell-cycle regulator BCL2L11 as has been investigated in mice. LISPR1 is a cis-acting lncRNA which maintains S1PR1 gene transcription by intercepting the transcriptional repressor ZNF354C and enabling Polymerase II (PolII) to bind. ZNF354C regulates S1PR1 expression in HUVECs. However, the role of ZNF354C in pulmonary arterial hypertension (PAH) is unknown. LISPR1 and S1P1 receptor were both significantly depleted in COPD samples. It can be assumed that due to higher S1P production, the signalling is attenuated through reduction of the lncRNA LIPSR1 and thus the receptor S1P1. The stretch experiments present a possible in vitro model in order to mimic the condition of endothelial cells during high blood pressure, such as in PAH. Referring to published data, it could be confirmed that stretching of endothelial cells alters the gene expression, which is on the other hand linked to cardiovascular disease. In cardiovascular disease mechanical stretch altered genes, which are participating in the vascular remodelling process. The role of differently expressed lncRNAs (TGFβ2-AS1, CTD-2033D15.2, INHBA-AS1, RP11-393I2.4, TAPT1-AS1, TPM1-AS1, CFLAR-AS1 and HIF1α-AS2) upon mechanical stretch is yet not clarified. Conclusion: NONHSAT073641 and LISPR1 are important for the endothelial angiogenic function. Both lncRNAs were deregulated in PAH samples. The pathophysiological stimulus had an impact on the expression of different lncRNAs (e.g. TGFβ2-AS1) and pathways (e.g. TGF-β) in endothelial cells.
• Der Großteil des menschlichen Genoms wird in RNA transkribiert, aber nur eine geringe Menge des Genoms (~1-2 %) wird translatiert. RNAs, die nicht für Proteine kodieren, werden in kleine nicht-kodierende RNAs und lange nicht-kodierende RNAs (lncRNAs) klassifiziert. LncRNAs sind länger als 200 Nukleotide (nt), kodieren nicht für Proteine und können ein 5'-Cap-Element und einen 3'-Poly-A-Schwanz aufweisen. LncRNAs sind Teil der Epigenetik, wie kovalente Modifikationen von Histonproteinen (z. B. Acetylierung, Methylierung und Phosphorylierung) und Methylierungen von DNA (z. B. CpG). LncRNAs können zell- oder gewebespezifisch exprimiert sein. Außerdem sind sie zwischen den Arten gering konserviert. Dregulierte lncRNAs können an der Entstehung von Krankheiten beteiligt sein oder den Verlauf dieser beinflussen (z. B. Arteriosklerose). Die Funktionen und Mechanismen der lncRNAs wurden bisher in vielen Erkrankungen wie z. B. pulmonaler arterieller Hypertonie (PAH) nicht untersucht. Die Erforschung in diesem Bereich und das Wissen, dass die Expression von lncRNAs zelltyp- und gewebespezifisch ist, könnten somit neue therapeutische Möglichkeiten eröffnen. LncRNAs könnten spezifisch mit z. B. Antisense-Oligonukleotide reguliert werden und Nebenwirkungen der traditionellen Medizin könnten minimiert werden. Durch die Innovation von Hochdurchsatzverfahren (RNA-Sequenzierung) werden immer mehr lncRNAs identifiziert, deren Funktionen und Mechanismen jedoch noch untersucht werden müssen. In Endothelzellen wurde die Bedeutung von lncRNAs kaum untersucht. Um funktionelle lncRNAs in Endothelzellen zu untersuchen, wurden drei verschiedene Ansätze in dieser Studie verwendet. Die Idee war, die Menge an lncRNA-Kandidaten einzugrenzen und deren Funktion und Mechanismus in Endothelzellen zu untersuchen. Zusätzlich wurde die Funktion der lncRNAs aus in vivo Proben von Patienten, die an PAH leiden, untersucht. PAH ist eine Erkrankung des Lungenkreislaufs, die mit erhöhtem Blutdruck einhergeht, die zu Herzversagen führen kann. Die Krankheit wird anhand ihrer Ursache in fünf Klassen unterteilt. Zur ersten Klasse zählen PVOD (pulmonale venookklusive Erkrankung), die mit Veränderungen in den Arterien, Arteriolen, des Bindegewebes oder mit seltenen Blutanomalien assoziiert sind. Weiterhin wird die IPAH (Idiopathische pulmonalarterielle Hypertonie) zur ersten Klasse gezählt. Diese Erkrankung ist gekennzeichnet durch unbekannte morphologische Veränderungen. Die zweite Klasse von PAH wird durch Veränderungen des linken Herzens verursacht, wie Kardiomyopathien, linksventrikuläre systolische oder diastolische Dysfunktion und Mitral- oder Aortenstenose. Zur dritten Klasse wird COPD (chronisch obstruktive Lungenerkrankung) gezählt. COPD geht mit Lungenerkrankungen oder Atemprobleme einher, die zur Hypoxie führen können. Die vierte Klasse (CTEPH: Chronisch thromboembolische pulmonale Hypertonie) wird durch Blutgerinnsel (Lungenembolie oder Lungenthrombose) verursacht, die die Gefäße in der Lunge blockieren. Die letzte Klasse wird durch verschiedene Faktoren verursacht wie z.B. Organentzündung (z. B. Lunge, Lymphknoten), Blutgefäßkompression und andere unbekannte Ursachen. Ziel: Die Eigenschaften von lncRNAs hängen von ihrer Sequenz, genomischen Position und Tertiärstruktur ab. Ziel war es, neue lncRNAs zu identifizieren und ihre physiologischen Funktionen und Mechanismen in Endothelzellen zu charakterisieren. In drei verschiedenen Projekten wurde die Funktion von lncRNAs in Endothelzellen untersucht. 1. Zu diesem Zweck wurde die Hypothese untersucht, dass pseudogen-annotierte lncRNAs die Expression ihrer Elterngene regulieren. Pseudogene werden als nicht-funktionelle Duplikationen von Protein-kodierenden Genen mit einer signifikanten Sequenzähnlichkeit kategorisiert. Diese Gene weisen Stopcodons und / oder Leserasterverschiebungen auf und können daher nicht in Proteine übersetzt werden. Im Gegensatz dazu, können pseudogen-annotierte lncRNAs von der cDNA einer mRNA abstammt und nur ein Exon aufweist. Darüber hinaus wird diskutiert, dass diese pseudogen-abgeleiteten lncRNAs ihre Paraloge (Elterngene) regulieren und geringer exprimiert werden als diese. Verschiedene Mechanismen pseudogen-annotierter lncRNAs sind bekannt. Sie können miRNAs aufgrund ihrer Sequenzähnlichkeit binden und so die parentale mRNA (z. B. PTENP1 und PTEN) nachahmen. Pseudogen-annotierte lncRNAs können möglicherweise Krankheiten wie Diabetes oder Krebs auslösen. In diesem Projekt wurde die Expression des Elterngens PAFAH1B1 (platelet activating factor acetylhydrolase 1b regulatory subunit 1) in Bezug auf die lncRNA NONHSAT073641 untersucht. 2. Um die Funktionen von lncRNAs bei einem pathophysiologischen Stimulus zu identifizieren und zu untersuchen, wurden HUVECs 15 % zyklischer Dehnung ausgesetzt. Dieses in vitro Modell stellt einen neuen Weg dar, um die Entwicklung pathophysiologischer Zustände wie z.B. in PAH zu untersuchen und neue therapeutische Ansätze zu testen. Außerdem kann dieser Ansatz die involvierten Signalwege aufzeigen und eine breitere Sicht auf die Interaktion von Genen bzw. lncRNAs und Proteinen ermöglichen. In vitro Dehnungsversuche wurden durchgeführt, um die Wirkung von mechanischer Dehnung auf die lncRNA Expression in menschlichen Endothelzellen zu untersuchen. Der Blutfluss und Blutdruck werden durch die Pumpfunktion des Herzens aufrechterhalten. Große Arterien (Halsschlagader und Lungenarterien) und insbesondere die Aorta haben eine Windkessel-Funktion. Dies bedeutet, dass die Arterien während der Systole maximal gedehnt werden und während der Diastole sich zusammenziehen, was zum einen den Druck abfängt und zum anderen den Blutfluss unterstützt. Der Blutdruck wird daher vom Lumen zur Gefäßwand (Tunica intima zur Tunica adventitia) übertragen. Dementsprächend sind die Gefäße und die Endothelzellen verschiedenen Kräften (hydrostatischen Druck, rhythmischen Dehnungskräften und Wandschubspannung) ausgesätzt. Es ist bekannt, dass unter physiologischen Bedingungen die menschliche Aorta ca. 8-10 % und kleinere Arterien um ca. 5 % gedehnt werden. Bluthochdruck führt zu Änderungen in der Gefäßwand um einer Ruptur entgegenzuwirken. 3. Mit dem letzten Ansatz wurde die Hypothese untersucht, dass Promotor-assoziierte lncRNAs (LISPR1, Long intergenic noncoding RNA antisense to S1PR1) die Expression ihrers Nachbar-Gens (Sphingosin-1-Phosphat-Rezeptor 1) beeinflussen können. Studien zeigten, dass Promotor-assoziierte lncRNA in entgegengesetzter Richtung umgeschrieben werden und teilweise überlappend mit dem Nachbar-Gen oder sich einen Teil des Promoters teilen können (z. B. Khps1 und SPHK1). Khps1 bildet einen DNA / DNA / RNA-Triplex am SPHK1-Promotor und rekrutiert dadurch die Histonacetyltransferase p300 / CBP, um die Chromatinstruktur zu öffnen. Die Transkription wird damit induziert. Methoden: In dieser Arbeit wurden physiologische Methoden angewendet um die angiogenen Funktionen von lncRNAs (NONHSAT073641 und LISPR1), sowie von Protein-kodierenden Genen (PAFAH1B1 und S1P1 Rezeptor) zu untersuchen. Dazu wurde der Sphäroid-Auswuchs-Assay (spheroid outgrowth assay) und der Kratz-Wunden-Assay (scratch wound assay) angewendet. Weiterhin wurden Dehnungsexperimente durchgeführt, um unterschiedlich exprimierte lncRNAs in humanen Endothelzellen der Nabelschnurvene (HUVECs) zu identifizieren. Dies wurde mit dem FX-5000 Tension System durchgeführt. Diese Vorrichtung ermöglicht die Anwendung verschiedener Parameter (Amlituden, Frequenzen und Art der Dehnung). Die in vivo Relevanz von lncRNAs wurde in Proben von Patienten, die an COPD, CTEPH, IPAH oder PVOD leiden, untersucht. Knockdown- (z. B. sthealt siRNAs, LNA Gapmers), Knockout- (CRISPR / Cas9) und Überexpressionsexperimente (z. B. CRISPR Aktivierung) wurden durchgeführt, um die Funktion der untersuchten Gene zu analysieren. CRISPR / Cas9 wurde angewendet, um die Expression von RNAs in HEK293 Zellen zu verringern. Dieses System wurde in Prokaryoten als Teil des adaptiven Immunsystems entdeckt. Cas9 ist eine DNA Endonuklease, die DNA Doppelstrangbrüche induziert. Heutzutage wird es als Werkzeug zur Deletion von Gene Abschnitten werwendet. In den letzten Jahren wurde das CRISPR / Cas9 System weiterentwickelt, so dass verschiedene CRISPR Techniken verfügbar sind, z. B. CRISPR Aktivierung (CRISPRa). Hier ist Cas9 innerhalb der katalytischen Tasche mutiert, was zu einer endonukleasedefizienten Cas9 (dCas9) führt. Durch die Verknüpfung eines künstlichen Transkriptionsfaktor (VP64), induziert dieser die Transkription an der gewünsten Stelle. Ähnlich wie CRISPRa ist CRISPR/ dCas13a nicht katalytisch aktiv. dCas13a ist eine RNA geführte katalytisch inaktive Ribonuklease (RNase). In diesem Falle ist dCas13a mit einem GFP und KRAB Protein fusioniert. Somit akkumuliert dCas13a an der gewünschten RNA und mit Hilfe des Fluoreszenzsignals lässt sich die Lokalisation der RNA detektieren. Der molekulare Mechanismus von LISPR1 wurde jeweils mit RNA, Chromatin- Immunopräzipitation, Mnase und FAIRE untersucht. Ergebnisse: NONHSAT073641 und PAFAH1B1 zeigen eine angiogene Funktion in Endothelzellen. Es konnte festgestellt werden, dass NONHSAT073641 die Expression von PAFAH1B1 nicht reguliert. Die pro-angiogene Funktion von PAFAH1B1 könnte dem Zielgen matrix Gla protein (MGP) zugeschrieben werden. NONHSAT073641 und PAFAH1B1 wurden signifikant in CTEPH-Proben induziert und könnten für die Entwicklung dieser Krankheit wichtig sein. Es könnte spekuliert werden, dass NONHSAT073641 die Expression des Zellzyklusregulators BCL2L11 reguliert, wie in Mäusen untersucht wurde. LISPR1 ist eine cis-regulierende lncRNA, die die S1PR1 Gentranskription aufrechterhält, indem sie den Transkriptionsrepressor ZNF354C abfängt und die PoIymerase II Bindung ermöglicht. ZNF354C reguliert die Expression von S1PR1 in HUVECs. Die Rolle von ZNF354C in PAH ist weiterhin unbekannt. LISPR1 und S1P1-Rezeptor waren beide in COPD-Proben signifikant herunterreguliert. Dies könnte ein Kompensationsmechanismus sein, da die S1P-Produktion in COPD Patienten erhöht ist. Zusammengefasst stellt das Dehnungs Projekt ein mögliches in vitro Modell dar, das verwendet werden kann, um den Zustand von Endothelzellen während eines hohen Blutdrucks wie etwa bei PAH nachzuahmen. Es konnte mit veröffentlichten Daten bestätigt werden, dass Dehnung von Endothelzellen die Genexpression verändert, die bei Herz-Kreislauf Erkrankungen beteiligt sind. Dieser Prozess umfasst die Induktion von Migration, Proliferation und Apoptose von Endothelzellen und die Veränderung der extrazellulären Matrix und der vaskulären Integrität (EGR1, ATF3, SMAD6, CCL2, FABP4, CYP1A1, CYP1B1, TSP-1, AQP1 und TGF-β2). Die Rolle von unterschiedlich exprimierten lncRNAs (TGFβ2-AS1, CTD-2033D15.2, INHBA-AS1, RP11-393I2.4, TAPT1-AS1, TPM1-AS1, CFLAR-AS1 und HIF1α-AS2) während mechanischer Dehnung bleibt derzeit unklar. Schlussfolgerung: NONHSAT073641 und LISPR1 sind wichtig für die Angiogenese in Endothelzellen. Beide lncRNAs waren in PAH-Proben dereguliert. Der pathophysiologische Stimulus hat einen Einfluss auf die Expression verschiedener lncRNAs (z. B. TGFβ2-AS1) und Signalwege (z. B. TGF-β) in Endothelzellen.