Open Access

Bernd Patrick Maul

• Acute and chronic inflammation play a pivotal role in various diseases, such as rheumatoid arthritis, atherosclerosis, bacterial as well as viral infections and therefore are an everyday-challenge in clinical practice. In this context, biologically active products of the cyclooxygenases and the prostanoid synthases, e.g. prostaglandins, critically contribute to various aspects of the inflammatory response in almost every tissue of the body. Emerging evidence over the past decades has demonstrated that these mediators are not only responsible for a pro-inflammatory response, but also show anti-inflammatory and pro-resolving properties. The relevance of biologically active lipids in this context is strengthened by the clinical efficacy of nonsteroidal anti-inflammatory drugs (NSAIDs), e.g. Aspirin®, which block the biosynthesis of the mediators via the cyclooxygenase (COX) enzymes. Notably, microsomal prostaglandin E synthase-1 (mPGES-1)-derived prostaglandin E2 (PGE2) is a well-studied, functionally versatile PG, which promotes its effects via specific G protein-coupled receptors (GPCRs). Activation of these receptors elicits an internal signal transduction cascade, including activation of the adenylyl cyclase (AC). Active AC contributes to an elevated intracellular cyclic adenosine monophosphate (cAMP) level, which in turn activates the transcription factor cAMP response element-binding protein (CREB) via phosphorylation. While the role of PGE2 in the inflammatory context has been well-documented in previous literature, relatively little is known about CREB-dependent transcriptional changes in inflammation. Therefore, the aim of this study was to investigate the effect of mPGES-1-derived PGE2 on CREB-mediated transcriptional changes specifically in murine wild-type (WT) and mPGES-1 knock-out (KO) macrophages in an inflammatory context. To address this issue, bone marrow-derived macrophages (BMDMs) were treated with either the bacterial cell wall component lipopolysaccharide (LPS) in combination with interferon-γ (IFN-γ) or the yeast extract zymosan. To analyze effects on CREB activation we determined protein expression profiles of relevant PGE2-synthesizing enzymes, i.e. COX-2 and mPGES-1, as well as activity of the downstream transcription factor CREB. The activity of mPGES-1 was simultaneously determined by the analysis of the prostanoid kinetics. Under these experimental conditions we showed that COX-2 is strongly induced, and we also observed elevated activated CREB levels in WT as well as in mPGES-1 KO macrophages. Further, both LPS+IFN-γ and zymosan increased expression of mPGES-1 in WT but not in mPGES-1-deficient macrophages. These findings go in hand with largely similar alterations in the PGD2, TXB2, PGF2α profiles in WT and mPGES-1 KO macrophages upon stimulation. Of note, an elevated PGE2 production was also observed in mPGES-1-deficient macrophages at later stages upon inflammatory conditions. Subsequently, potential CREB-regulated targets were identified in macrophages upon inflammatory stimuli after 16 h by chromatin immunoprecipitation (ChIP) followed by Next-Generation-Sequencing (NGS). Surprisingly, despite equal levels of pCREB the characterization of CREB binding sites revealed different targetome profiles between WT and mPGES-1 KO macrophages. Specifically, the fatty acid metabolic processes-associated targets appeared to be selectively lost in mPGES-1-deficient vs. WT macrophages. We further validated one of those targets, i.e. the endoplasmic reticulum lipid raft-associated protein 1 (Erlin1), at the mRNA expression level, which indeed was differentially transcribed in response to different PGE2 synthesizing conditions. Mechanistically, CREB is a well-characterized phosphorylation-dependent transcription factor in cell survival, proliferation, differentiation, and immune responses. Yet, our understanding of the functions of CREB in inflammation, specifically with respect to its activation by PGE2, is insufficient. Due to its biological relevance in inflammation it clearly requires additional studies to shed light on the details of CREB activation in macrophages to provide possibilities of therapeutic interventions.
• Entzündungen sind lebensnotwendige physiologische Immunreaktionen, aber auch Ursache einer Vielzahl von Krankheiten wie rheumatoider Arthritis, Atherosklerose, bakterieller sowie viraler Infektionen. Die Behandlung von chronischen und akuten Entzündungserkrankungen ist daher eine große Herausforderung im klinischen Alltag. In diesem Zusammenhang spielen biologisch-aktive Lipide, wie Prostaglandine, eine zentrale Rolle. Diese werden u. a. durch die Aktivität von Cyclooxygenasen und Prostanoidsynthasen gebildet und können sowohl als pro-entzündliche als auch als Entzündungs-auflösende Mediatoren agieren. Die Relevanz von Lipiden im Entzündungskontext zeigt sich insbesondere im breiten therapeutischen Einsatz von nicht-steroidalen Antirheumatika (NSAIDs), zu welchen Cyclooxygenase-Hemmer, wie Aspirin®, zählen. Diese können global die Bildung von Prostaglandinen hemmen. Hierbei ist u.a. die Reduktion von Prostaglandin E2 (PGE2) von großer Bedeutung. PGE2 löst in Makrophagen nach Bindung an spezifische, G-Protein-gekoppelte Rezeptoren die Aktivierung der Adenylat-Zyklase aus, wodurch vermehrt cAMP gebildet wird, welches wiederum zur Aktivierung des Transkriptionsfaktors cAMP response element-binding protein (CREB) führt. Während die Rolle von PGE2 im Entzündungskontext gut beschrieben ist, sind über CREB-abhängige transkriptionelle Veränderungen im Entzündungsgeschehen vergleichsweise wenig bekannt. Um dabei den Einfluss von PGE2 untersuchen zu können, wurden Makrophagen mit einem Knockout (KO) für die mikrosomale PGE-Synthase (mPGES-1) mit wildtypischen (WT) Makrophagen verglichen und Transkriptionsveränderungen als Antwort auf bakterielle Oberflächenbestandteile (Lipopolysaccharide) in Kombination mit Interferon-γ oder das in Hefezellwand vorkommende Homoglykan Zymosan untersucht. Um den Effekt auf die Aktivierung von CREB zu analysieren, schauten wir uns die Proteinexpression der relevanten PGE2-synthetisierenden Enzyme COX-2 und mPGES-1, sowie die Aktivität des Transkriptionsfaktors CREB an. Außerdem wurden parallel zur Aktivität von mPGES-1, die Kinetiken von PGE2 und weiteren Prostanoiden bestimmt. Unter diesen experimentellen Bedingungen konnten wir eine starke Induktion von COX-2 und erhöhte pCREB Mengen sowohl in WT als auch in mPGES-1 KO Makrophagen nachweisen. Desweiteren zeigte sich unter Stimulation mit LPS+IFN-γ und Zymosan eine verstärkte Expression von mPGES-1 im WT, aber nicht im mPGES-1 KO. Ähnliche Veränderungen konnten wir auch in den Prostanoiden PGD2, TXB2, PGF2α in WT und mPGES-1 KO Makrophagen festhalten. Trotz des KO für die mikrosomale PGE-Synthase beobachteten wir in den späteren Phasen der Stimulation in mPGES-1 KO Makrophagen, entgegen unseren Erwartungen, ebenfalls eine erhöhte PGE2 Produktion. Um spezifisch CREB-vermittelte Transkriptionsveränderungen untersuchen zu können, wurden die Bindungsstellen von CREB auf der DNA mittels Chromatin-Immunopräzipitation und anschließender Hochdurchsatz-Sequenzieranalyse bestimmt. Hierbei konnten wir im Entzündungskontext differentielle Bindungsmuster von CREB nachweisen. Wir konnten zeigen, dass insbesondere Targets, die dem Fettsäuremetabolismus angehören in mPGES-1 KO Makrophagen weniger gebunden wurden. Die Validierung eines der Targets aus diesem Prozess auf mRNA Expressionslevel zeigte ferner, dass dieses in Antwort auf verschiedene PGE2-synthetisierenden Bedingungen unterschiedlich transkribiert wird. Mechanistisch gesehen ist CREB ein gut charakterisierter Transkriptionsfaktor, der verschiedenste zelluläre Effekte wie Zellüberleben, Proliferation, Differenzierung und Immunantwort vermittelt. Dennoch sind die aktuellen Erkenntnisse über CREB im Entzündungsgeschehen, insbesondere die über PGE2 vermittelten transkriptionellen Veränderungen, limitiert. Auf Grund seiner biologischen Relevanz im Entzündungsgeschehen sollte die CREB Aktivierung im Detail weiter charakterisiert werden, um neue Ansätze für therapeutische Interventionen zu schaffen.