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Nick Larry Valentin Neubacher

• Photorhabdus and Xenorhabdus bacteria live in a highly specific symbiosis with nematodes that belong to the genus of Heterorhabditis and Steinernema, respectively. These cruiser type nematodes actively search for soil-dwelling insects and infect them via natural openings. Inside of the insect, the bacteria are released into the hemocoel where they start producing an array of secondary metabolites to bypass the insect immune system and kill the prey within 48 hours. Many of those natural products possess bioactivities against other bacteria, fungi, protozoa or insects, which makes them interesting candidates for pharmaceutical applications. Even though advanced molecular biological methods in combination with bioinformatics tools can now be used to predict biosynthetic gene clusters (BGCs) and their products, there are still many BGCs with unknown products. Even for the plethora of natural products that were successfully identified in the last couple of years, the exact ecological function often remains elusive, as laboratory conditions can vary considerably from the natural environment of the bacteria. Knowledge about the natural conditions that stimulate, or repress production of certain natural products and their underlying regulatory mechanisms yield new approaches for natural product research and enables possibilities for selective manipulations of the regulatory cascades. The overarching goal of this work was to examine the regulatory networks in Photorhabdus and Xenorhabdus strains. The first part of this work focused on the Hfq-dependent regulation of specialized metabolite production. In those genera, the RNA chaperone, Hfq, represses expression of hexA, which encodes for a global transcriptional regulator that acts as the master repressor for SM production. Multiple global approaches were used to identify the sRNA ArcZ, which targets a specific region in the 5’-untranslated region of the hexA mRNA and ultimately guides Hfq in order to repress its expression. It was shown that a deletion of arcZ led to a drastic reduction of SM production in Photorhabdus and Xenorhabdus, consistent with the phenotype of their respective hfq deletion mutants. Transcriptomic profiling revealed far-reaching effects on the transcriptome, with up to 735 coding sequences significantly affected in the arcZ deletion strain. Finally, it was shown that the resulting chemical background, devoid of SMs, in combination with targeted promotor exchange can be used to exclusively overproduce a desired natural product, representing an alternative route of genetic manipulation. The second part of this work focused on the influence and identification of insect related compounds that affect SM production in P. laumondii, X. szentirmaii and X. nematophila. Insect homogenate was generated from G. mellonella larvae, a model host for these bacteria. Supplementation of the cultivation medium with homogenate induced considerable shifts in the SM profiles of those bacteria. A global effect on the transcriptional output was determined by transcriptomic profiling. The core response to the simulation of an insect environment consisted of ten CDS, eight of which are involved in the degradation of fatty acids or the import of maltose and maltodextrin into the cells. Two abundant components in the insect homogenate, trehalose and putrescin, were added to the cultivation medium of those strains and subsequent HPLC-MS analysis revealed a direct correlation of their concentration in the medium and the production titres of certain SMs. These results indicated that the bacteria sense the insect environment via different insect specific components in order to initiate a metabolic adjustment, which is probably required for adaptation to the insect host. The last part of this work examined the influence of other, so far not directly related genes on SM production, based on the isolation of P. laumondii transposon-insertion mutants with clear phenotypic alterations. Re-sequencing and SM profiling of the mutant strains revealed that a transposon-insertion in the gene encoding for a putative DNA-adenine methyltransferase affected SM production. The phenotype was confirmed by deleting this gene. Based on Single-Molecule Real-Time sequencing, the complete methylome of the WT, deletion- and complementation mutant were analysed (experimental work performed by Sacha J. Pidot, Melbourne, Australia). No obvious alterations were detected in the methylation patterns of the strains, indicating that the dam gene product does not methylate the adenine in GATC-motifs, as it was described in literature for E. coli. This data raises the question what the function of the putative DNA-adenine methyltransferase is in P. laumondii and how it can influence the secondary metabolism. Even though there is currently no clear evidence, the potential role of epigenetic gene regulation mechanisms should be considered in further work.
• Photorhabdus und Xenorhabdus sind zwei Vertreter von insektenpathogenen (entomopathogenen) Bakterien. In ihrem komplexen Lebenszyklus durchlaufen die Bakterien sowohl eine symbiotische Phase mit Fadenwürmern (Nematoden) der Gattung Heterorhabditis bzw. Steinernema als auch eine insektenpathogene Phase. Das „infektiöse Dauerform“ (infective juvenile) Stadium der Nematoden bietet den Bakterien durch die umgebende Cuticula Schutz vor äußeren Einflüssen. Nachdem der Fadenwurm ein im Erdreich lebendes Insekt aufgespürt hat, infiziert er es über natürliche Öffnungen oder Tracheen. Im Inneren des Insekts werden die Bakterien in die Hämolymphe entlassen, wo sie beginnen sich rasant zu vermehren. Es wird angenommen, dass die Bakterien insektenspezifische Signalmoleküle wahrnehmen, welche den Wechsel vom harmlosen Symbiosepartner des Nematoden zum hocheffizienten Insektenpathogen einleiten. Daraufhin produzieren die Bakterien eine Vielfalt von Naturstoffen, die zum einen der Überwindung des Immunsystems des Insekts dienen und dieses zum anderen innerhalb von 24-48 Stunden töten. Die enzymatische Zersetzung des Insekts liefert Nährstoffe für die Bakterien und Nematoden, welche daraufhin mehrere Entwicklungszyklen durchlaufen. Einige der produzierten Naturstoffe weisen eine biologische Aktivität gegen andere Bodenorganismen wie Bakterien, Pilze, Protozoen oder Insekten auf und dienen der Verteidigung des Insektenkadavers zur Sicherung der Nahrungsquelle. Andere Naturstoffe sind darüber hinaus auch für die Entwicklung der Nematoden notwendig. Sobald die Nährstoffquelle versiegt, reassoziieren Bakterien und Nematode und das Symbiosepaar bricht aus der Insektenhülle aus, um sich auf die Suche nach neuen Insektenwirten zu machen. Während die symbiotische Interaktion zwischen Bakterien und Nematoden hochspezifisch ist, können die Bakterien eine Vielzahl von Insektenarten töten, wovon einige Schädlinge in der Landwirtschaft darstellen. Dort werden die Nematoden bereits als Alternative zu Insektiziden eingesetzt. Der außergewöhnliche Lebenszyklus qualifiziert Photorhabdus und Xenorhabdus als herausragenden Modelorganismus zur Untersuchung von Symbiose und Pathogenität, und vor allem dem Einfluss von Naturstoffen in den jeweiligen Phasen. Die Bakterien können in herkömmlichem Nährmedium bei 30°C kultiviert werden, was die Untersuchung der bakteriellen Naturstoffe zusätzlich erleichtert. Darüber hinaus eignet sich die einfach kultivierbare Insektenlarve der Wachsmotte Galleria mellonella als Modelorganismus für die Untersuchung der Insektenpathogenität. Massenspektrometrische Verfahren wie „high performance liquid chromatography-mass spectrometry“ (HPLC-MS) werden zur Identifizierung und Analyse von Naturstoffen herangezogen. Viele Genome von Xenorhabdus und Photorhabdus Stämmen sind mittlerweile sequenziert worden. Bioinformatische Werkzeuge wie antiSMASH ermöglichen die Analyse von Biosynthesegenclustern und eignen sich für eine erste Einschätzung der chemischen Struktur eines Naturstoffs. Obwohl fortgeschrittene molekularbiologische Methoden wie heterologe Expression und Promoteraustausch in den letzten Jahren wesentlich zur Identifizierung einer Vielzahl bakterieller Naturstoffe beigetragen haben, gibt es immer noch einige kryptische Gencluster in diesen Stämmen, für die bisher kein Produkt bekannt ist. So können beispielsweise fehlende Vorstufen oder Signalmoleküle im Standard-Kulturmedium dazu führen, dass die Produktion bestimmter Naturstoffe ausbleibt. Selbst für bereits identifizierte Naturstoffe ist die Erforschung der exakten ökologischen Funktion oft nur beschränkt möglich, da die Laborbedingungen häufig weit vom den natürlichen Umgebungsbedingungen der Bakterien abweichen. Oft ist unklar, welche Faktoren die Produktion von Naturstoffen unter natürlichen Bedingungen stimulieren und welchen Regulationsmechanismen diese unterliegen. Eine Identifizierung solcher Faktoren bietet die Möglichkeit, Kultivierungsbedingungen gezielt anzupassen, um die Produktion bestimmter Naturstoffe anzuregen. Die zugrundeliegenden Regulationsmechanismen können darüber hinaus manipuliert werden, um die Produktionstiter bekannter und unbekannter Naturstoffe zu erhöhen, was wiederum die Erforschung der natürlichen Funktion der Naturstoffe ermöglicht. Neben der Grundlagenforschung ist dies auch von pharmazeutischem Interesse, da einige Naturstoffe mit bekannter biologischer Funktion auch einen Startpunkt für die Entwicklung verbesserter Antibiotika oder sogar Alternativen zu Antibiotika darstellen können. ...