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Kevin Klann

• Correct cellular function is ensured by a complex network of proteins and enzymes, regulating protein synthesis and degradation. This protein network, maintaining the so-called protein homeostasis, regulates those processes on multiple levels, producing new or degrading old proteins to cope with changing intra- and extracellular environments. Disturbance of this tightly regulated machinery can have severe effects on the cell and can lead to a variety of pathologies on organism level. Diseases including cancer, neurodegeneration and infections are associated with causative or consequent alterations in protein homeostasis. To understand the pathologies of these diseases, it is therefore critical to examine how perturbations of protein homeostasis affect cellular pathways and physiology. In the recent years, analysis of protein homeostasis networks has resulted in the development of novel therapeutic approaches. However, for many factors it remains unclear how the cell is affected, if they are disturbed. Protein synthesis and degradation represent immediate responses of the cell to changes and need to be studied in the right timeframe, making them difficult to access by common methodology. In this work we developed a new mass spectrometry (MS) based method to study protein synthesis and degradation on a system-wide scale. Multiplexed enhanced protein dynamic (mePROD) MS was developed, overcoming these limitations by special sample mixing and novel data analysis protocols. MePROD thereby enables the measurement of rapid and transient (e.g. minutes) changes in protein synthesis of thousands of proteins. During responses of the cell to stressors (e.g. protein misfolding, oxidation or infection), two major pathways regulate the protein synthesis: the Integrated Stress Response (ISR) and mammalian target of rapamycin (mTOR). Both pathways have been connected with various diseases in the past and are common therapy targets. Although both pathways target protein synthesis in stress responses, the set of targets regulated by these pathways was believed to differ. Through the new mePROD MS method we could measure a comprehensive comparison of both pathways for the first time, revealing comparable system-wide patterns of regulation between the two pathways. This changed the current view on the regulation elicited by these pathways and furthermore represents a useful resource for the whole field of research. We could further develop the mePROD method and decrease MS measurement time needed to obtain an in-depth dataset. Through implementation of logic based instrument methods, it was possible to enhance the number of measured proteins by approximately three-fold within the same measurement time. The dynamics of protein synthesis and degradation are frequently modulated by pathogens infecting the cell to promote pathogen replication. At the same time, the cell counteracts the infection by modulating protein dynamics as well. To develop useful therapy approaches to fight infections, it therefore is necessary to understand the complex changes within the host cell during infections on a system-wide scale. In 2019, a novel coronavirus spread around the world, causing a world-wide health-crisis. To better understand this novel virus and its infection of the host cell we conducted a study applying the mePROD methodology and classical proteomics to characterize the dynamic changes during the infection course in vitro. We discovered that the infection remodeled a diverse set of host cell pathways (e.g. mRNA splicing, glycolysis, DNA synthesis and protein homeostasis) and thereby showed possible targets for antiviral therapy. By targeted inhibition of these pathways, we could observe that these pathways indeed are necessary for SARS-CoV-2 replication and their inhibition could reduce viral load in the cells. Another experimental approach focused on the dynamic changes of protein modification, namely phosphorylation, after infection with SARS-CoV-2. Here, we could show the very important participation of growth factor signaling pathways in viral proliferation. Both studies together revealed critical pathways that are needed for the viral proliferation and hence are promising candidates for further therapies. Subsequent targeting of these pathways by either already approved drugs (Ribavirin and Sorafenib) or drugs in clinical trials (2-deoxyglucose, Pladienolide-B, NMS-873, Pictilisib, Omipalisib, RO5126766 and Lonafarnib) could block viral replication in vitro and suggests important clinical approaches targeting SARS-COV-2 infection.
• Die Funktion aller Zellen wird durch ein komplexes Netzwerk von Proteinen aufrechterhalten, welches nach Bedarf neue Proteine synthetisiert und beschädigte, beziehungsweise nicht benötigte Enzyme/Proteine abbaut. Dieses Netzwerk der sogenannte Proteinhomeostase benötigt Regulation auf unterschiedlichen Ebenen um korrekt zu arbeiten. Störungen dieser Maschinerie sind an der Pathogenese von malignen Neoplasien und neurodegenerativen Erkrankungen beteiligt. Außerdem beeinträchtigen verschiedene humanpathogene Bakterien und Viren dieses Netzwerk der Proteinhomeostase. Um diese Krankheitsbilder besser zu verstehen ist es daher notwendig die Regulation dieses Netzwerks und die Auswirkungen von Pertubationen auf zellulärer Ebene zu beobachten um Rückschlüsse auf die Pathogenese ziehen zu können. Es konnten bereits für einige Krankheiten Therapieansätze entwickelt werden, die das Proteinhomeostase-Netzwerk gezielt modulieren. Trotz dieser Fortschritte ist weiterhin für viele Störfaktoren unklar, wie sie das Proteinnetzwerk der Zelle beeinflussen. Dies ist teilweise dem Umstand geschuldet, dass die resultierenden Effekte innerhalb der Zelle hochdynamisch und daher oft schwer messbar sind. Teil dieser Arbeit war es eine Messmethode zu entwickeln, die es ermöglicht die Auswirkungen von proteotoxischem Stress, d.h. Störungen der Proteinhomeostase, auf die Dynamik von Proteinsynthese und –abbau in der Zelle mit Hilfe von Massenspektrometrie (MS) zu untersuchen. Um diese Messungen zu ermöglichen wurde eine neue Methode entwickelt, multiplexed enhanced protein dynamic (mePROD) MS, welche durch besondere Probenzusammenstellung und Datenanalyse ermöglicht, schnelle und transiente Veränderungen (im Zeitraum von Minuten) in der Proteinbiosynthese von tausenden Proteine zu messen. Zwei der prominentesten Regulatoren der Proteinbiosynthese die Integrated Stress Response (ISR) und mammalian target of rapamycin (mTOR) werden mit vielen verschiedenen Krankheiten in Verbindung gebracht und sind unter anderem Ziele für neue Therapien in der Onkologie. Obwohl beide die Proteinbiosynthese beeinflussen, wurden sie bisher als Signalwege mit unterschiedlichen Effekten auf die Proteinsynthese gesehen. Mittels der neu entwickelten mePROD-Methode konnte im Rahmen dieser Arbeit erstmals der globale Effekt beider Regulationswege auf das Proteinnetzwerk gezeigt werden. Es fanden sich überlappende Muster zwischen mTOR- und ISR-vermittelter Regulation der Proteinsynthese. Dies verändert die bisherige Modellvorstellung für diese zellulären Vorgänge und stellt eine wichtige Ressource für das Forschungsfeld dar. Des Weiteren wurde die entwickelte mePROD Methodik verbessert um den Probendurchsatz zu erhöhen. Durch die Kombination mit logik-basierter Messmethoden, konnte die Anzahl der durch mePROD quantifizierten Proteinen bei gleicher Messzeit verdreifacht werden. Die Dynamik von Proteinsynthese und -abbau wird häufig während Infektionen verändert um die Vermehrung des Krankheitserreger zu ermöglichen oder selbiges zu bekämpfen. Für eine rationale Entwicklung von Therapien gegen diese Infektionen ist es daher unumgänglich die Veränderungen ausgehend von dem Erreger zu erfassen, zu verstehen und die Antwort der Wirtszelle auf die Infektion zu charakterisieren. Ende des Jahres 2019 wurde ein neues Virus entdeckt, SARS-CoV-2, welches sich, hochinfektiös, rasant verbreitet hat und zu einer weltweiten Pandemie geführt hat. Um das neuartige Virus zu verstehen und auf Basis molekularbiologischer Erkenntnisse Therapieansätze zu entwickeln, haben wir die zuvor entwickelte mePROD Methode angewandt um die dynamischen Veränderungen im Wirtsproteom zu erforschen. Es konnte erstmals beobachtet werden, dass nach Infektion mit SARS-CoV-2 verschiedenste Prozesse dereguliert wurden (mRNA Splicing, Glykolyse, DNS Synthese oder Proteinhomeostase. Durch gezielte Inhibierung dieser Prozesse konnte gezeigt werden, dass diese Funktionen der Wirtszelle wichtig für die Replikation von SARS-CoV-2 und durch Medikation modulierbar sind. In einer weiteren Studie konnte zudem durch Analyse von zellulären Signaltransduktionswegen nachgewiesen werden, dass die Aktivierung von Wachstumsfaktor-Signalwegen für die effiziente Replikation der Viren notwendig ist. Die getestete Anwendung von Medikamenten, die bereits zugelassen (Ribavirin, Sorafenib) oder sich in klinischen Studien befinden, blockierte die Virusreplikation vollständig in vitro und zeigt somit mögliche, in die Klinik übertragbare, Therapieansätze.