Open Access

Tatjana Ullmann

• Development of treatment strategies of chronic inflammatory disorders relies on on-going progress in drug discovery approaches and related molecular biologics. This study presents a gene reporter-based approach of phenotypic screening for anti-inflammatory compounds in the context of rheumatoid arthritis (RA). CEBPD gene, used as the target gene for the screening readout, encodes CCAAT/enhancer binding protein delta (C/EBPδ) transcription factor (TF). Structural and regulatory characteristics of CEBPD gene as well as function of C/EBPδ TF in the context of inflammation satisfied assay requirements. C/EBPδ TF acts as a key regula-tor of inflammatory gene transcription in macrophages (Mϕ) and is observed to con-tribute to disease development in both a rodent model of RA and RA patient biopsies. Despite well-described pro-inflammatory effects of C/EBPδ TF, it functions as a cell context-specific signal integrator showing also an anti-inflammatory activity. Conse-quently, both activation and inhibition of CEBPD alike may display a desired anti-inflammatory effect. The aim of this study was to develop a high-throughput screening assay for CEBPD-modulating compounds and confirm hit compounds’ anti-inflammatory effects via gene expression analysis. Generation and characterization of a multi-gene-reporter cassette 1.0 encoding enzy-matic secreted alkaline phosphatase (SEAP) gene reporter was a priority during the assay development. Chemiluminescent SEAP assay demonstrating high assay sensitivi-ty, broad linear range, high reproducibility and repeatability was chosen to monitor activity of the defined CEBPD promoter (CEBPD::SEAP). PMA-differentiated and M1-polarized THP-1-derived Mϕ stably expressing multi-gene-reporter cassette 1.0 were used as the assay’s cellular system. mRNA expression of both reporter CEBPD::SEAP and endogenous CEBPD mirrored each other in response to a LPS and IFN-g-triggered inflammatory stimulus (M1 treatment), even though the defined CEBPD promoter re-gion, utilized in the assay, contained only the most proximal and known regulatory se-quences. SEAP chemiluminescence in the reporter cells´ supernatant reliably correlat-ed with the M1 treatment-induced CEBPD::SEAP gene expression. The final screening protocol was developed for semi-automatic screening in the 384-well format. In total, 2054 compounds from LOPAC®1280 and ENZO®774 libraries were screened twice using the enzymatic SEAP readout with subsequent analysis of 18 selected compounds: nine with the highest and nine with the lowest signals, further characterized by qPCR. Gene expression levels of endogenous CEBPD, CEBPD::SEAP reporter as well as, IL-6, IL-1β, and CCL2 as inflammatory markers were quantified. qPCR assays failed to corre-late to SEAP readout in 15 compounds within three standard deviations (SDs) from sol-vent control: nine low signal and six high signal compounds. Demonstrating both assay sensitivity and specificity, a correlation between qPCR gene expression and SEAP readout was observed for three hit compounds with signals above three SDs: BET inhib-itors (BETi) GSK 1210151A and Ro 11-1464 as well as an HDAC inhibitor (HDACi) vori-nostat. The control compound trichostatin A (TSA) that reproducibly upregulated SEAP readout is also an HDAC inhibitor with a similar structure to vorinostat and was there-fore included in the anti-inflammatory phenotype analysis. The observed suppression of IL-6, IL-1ß, and CCL2 gene expression by hit compounds suggested their anti-inflammatory effect in THP-1 reporter Mϕ. mRNA expression of IL-6 and CCL2 was suppressed by HDACi and BETi at both 4 and 24 hours, while BETi reduced IL-1β mRNA expression 24 hour time point. BETi significantly upregulated gene expression of both reporter CEBPD::SEAP and endogenous CEBPD, 4 hours after M1 treatment. At the same time point, HDACi completely abolished the mRNA expres-sion of the endogenous CEBPD, while simultaneously upregulating mRNA expression of the reporter CEBPD::SEAP. The use of the most proximal 300 base pairs region of en-dogenous CEBPD promoter, making the upstream regulatory elements unavailable in the assay, may account for differential expression levels of SEAP and C/EBPδ TF. This observation corroborated the need to include a longer and more extensive CEBPD´s gene regulatory area. Thus, an improved multi-gene-reporter cassette 2.0 was gener-ated to be used on the basis of a bacterial artificial chromosome (BAC) covering CE-BPD´s genomic area of about 200,000 base pairs. The generated screening assay is flexible, reliable, and sensitive displaying potential for drug discovery and drug repurposing. The pharmacological modulation of CEBPD gene expression, first reported for GSK 1210151A, Ro 11-1464, and vorinostat, contrib-utes to the understanding of inflammatory responses in Mϕ and may have RA thera-peutic applications.
• Die Entwicklung alternativer Behandlungsstrategien von chronisch-entzündlichen Er-krankungen baut auf dem kontinuierlichen Fortschritt in der Wirkstoffentdeckung und der damit verbundenen Molekularbiologie auf. Diese Arbeit präsentiert einen genre-porterbasierten Ansatz eines phänotypischen Screenings zum Erkennen anti-entzündlich wirkender Verbindungen im Kontext von Rheumatoide Arthritis (RA). Das CEBPD Gen, das für den CCAAT/enhancer binding protein delta (C/EBPδ) Tran-skriptionsfaktor (TF) kodiert, stellte das Zielgen für den Screening-Readout dar. Struk-turelle und regulatorische Charakteristika von CEBPD sowie die Rolle von C/EBPδ TF im Entzündungsprozess erfüllten die Anforderungen des gewählten Screening-Ansatzes. C/EBPδ TF fungiert als zentraler Regulator entzündlicher Gentranskription in Makro-phagen (Mϕ) und wurde beobachtet, sowohl im RA-Tiermodell als auch in Gewebe-proben von RA-Patienten, zur Krankheitsentwicklung beizutragen. Trotz prominenter pro-entzündlicher Wirkung von C/EBPδ TF, fungiert er als zellkon-textspezifischer Signalintegrator, der auch eine anti-entzündliche Wirkung zeigt. Folg-lich können sowohl Aktivierung als auch Hemmung von CEBPD eine erwünschte anti-entzündliche Wirkung hervorrufen. Ziel dieser Arbeit war es, einen Hochdurchsatz-Screening-Assay für CEBPD-modulierende Verbindungen zu entwickeln und die entzün-dungshemmende Wirkung der Trefferverbindungen (Hits) durch Genexpressionsanaly-se zu untersuchen. Die Generierung und Charakterisierung der Multigenreporterkassette 1.0, die sezer-nierte alkalische Phosphatase (SEAP) als Genreporter exprimiert, war eine Schlüssel-aufgabe bei der Assay-Entwicklung. Der chemilumineszente SEAP-Assay zeigte eine hohe Sensitivität, einen breiten linearen Bereich, sowie eine hohe Wiederholbarkeit und Reproduzierbarkeit und wurde daher zur Aktivitätsüberwachung des definierten CEBPD-Promoters (CEBPD::SEAP) gewählt. PMA-differenzierte und M1-polarisierte THP-1 Reporter Mϕ, die die generierte Multigenreporterkassette 1.0 stabil exprimier-ten, stellten das zelluläre System des Assays dar. Die mRNA-Expression des CEBPD::SEAP Reporters und des endogenen CEBPD spiegelten sich in Reaktion auf die Behandlung mit LPS und IFN-g (M1-Behandlung), obwohl der definierte CEBPD-Promoter, der im Assay verwendet wurde, nur die proximalsten regulatorischen Se-quenzen enthielt. SEAP zeigte die M1-behandlungsinduzierte CEBPD::SEAP Genexpres-sion durch ihr erhöhtes Niveau im Überstand von THP-1 Reporterzellen zuverlässig an. Das endgültige Protokoll wurde für das halbautomatische Screening im 384-Well-Format entwickelt. Insgesamt wurden 2054 Verbindungen von LOPAC®1280 und ENZO®774 Bibliotheken mit Hilfe des enzymatischen SEAP-Readouts zweimal untersucht und anschließend 18 Ver-bindungen - neun mit dem höchsten und neun mit dem niedrigsten SEAP-Signal - mit-tels qPCR analysiert. Die Genexpressionsniveaus von endogenem CEBPD, CEBPD::SEAP Reporter sowie IL-6, IL-1ß und CCL2 Entzündungsmarker wurden quantifiziert. qPCR-Assays korrelierten nicht mit dem SEAP-Readout bei 15 Verbindungen innerhalb von drei Standardabweichungen (SDs) von der Lösungsmittelkontrolle: neun mit dem nied-rigsten und sechs mit dem höchsten SEAP-Signal. Bei drei Hits mit SEAP-Signalen über drei SDs, den BET-Inhibitoren (BETi) GSK 1210151A und Ro 11-1464 sowie einem HDAC-Inhibitor (HDACi) Vorinostat, wurde eine Korrelation zwischen dem qPCR-Assay und dem SEAP-Readout beobachtet, was sowohl die Assay-Spezifität als auch die Sensi-tivität zeigte. Die Kontrollverbindung Trichostatin A (TSA), die reproduzierbar ein hohes SEAP-Signal verursachte, gehört auch zu den HDACi und wurde daher in die Hit-Analyse mit einbezogen. Alle vier Hits zeigten ihre entzündungshemmende Wirkung durch die Suppression der Genexpression von IL-6, IL-1ß und CCL2. HDACi und BETi unterdrückten die mRNA-Expression von IL-6 und CCL2 4 und 24 Stunden nach der M1-Behandlung, während BETi die IL-1ß mRNA-Expression reduzierten. BETi regulierten Genexpression des CEBPD::SEAP und des endogenen CEBPD 4 Stunden nach der M1-Behandlung hoch. Zum gleichen Zeitpunkt, unterdrückten HDACi die mRNA-Expression des endogenen CEBPD, während sie diese des CEBPD::SEAP Reporters hochregulierten. Für die unter-schiedlichen Expressionsniveaus von SEAP und C/EBPδ TF kann die Verwendung der proximalsten 300 Basenpaare Region des CEBPD-Promoters verantwortlich sein, wodurch die distalen regulatorischen Elemente im Assay nicht verfügbar waren. Diese Beobachtung zeigte die Notwendigkeit, einen umfassenderen regulatorischen Bereich von CEBPD zu verwenden. Dafür wurde eine verbesserte Multigenreporterkassette 2.0 generiert, die auf einem bakteriellen künstlichen Chromosom (BAC) exprimiert wer-den sollte, das ein CEBPD-Genumfeld von 200.000 Basenpaaren umfasst. Der entwickelte Screening-Assay ist flexibel, zuverlässig, sensibel und zeigt ein Potenti-al für die Wirkstoffentdeckung. Die pharmakologische Modulation von CEBPD, erst-mals gezeigt für BETi und Vorinostat, trägt zum Verständnis von Entzündungsreaktio-nen in Mϕ bei und weist mögliche therapeutische Anwendungen für RA auf.