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David Simon Kleinhans

• In order to form an organ, cells need to take up specialized functions and tasks. Cellular specialization is guided by an interplay of chemical signals and physical forces, where one influences the other. One aspect in cellular identity is its shape, which e.g. defines how susceptible the cell may be to intercellular signaling or in which section of the cell cycle it is and therefore can tell us about its current state. Shape changes are introduced by motor proteins that are controlled and activated in a locally confined manner. For my thesis, I was interested to understand better how cellular shape and geometry impacts downstream cell and organ development. What happens if a cell cant transition to a specific shape? How does it affect tissue structure? How does it affect further development? One regulator of motor proteins like non-muscle myosin is Shroom3, which recently has been been shown to be expressed and involved in the development of the zebrafish lateral line organ (1 ). Development of the lateral line occurs through a migrating cluster of initially about 150 cells, the posterior lateral line primordium (pLLP), which migrates from the anterior (head) to the posterior (tail) while depositing cell clusters in a regular pattern. Literature on development of the lateral line suggests that in order for a cell cluster to be deposited from the pLLP, rosette formation is a key requirement. Therefore our expectation from the shroom3 mutant was that the number of clusters deposited was significantly reduced. To our surprise, when we first inspected the end of migration lateral line phenotype we found many individuals with a significant increase in cell clusters deposited. This made us re-think the role of Shroom3 during rosette assembly and the processes its involved in. To study the effects of Shroom3 on lateral line development, a mutant line was generated and crossed with various transgenic lines which express fluorescently labeled proteins that locate to organelles such as the plasmamembrane or the nucleus. Following, the mutant with its fluorescent labels was microscopically imaged under different conditions to quantify and analyze various cell-morphometric features. Even though the zebrafish is a popular model organism and its perfectly suited for developmental biology and advanced microscopy, there were no methods that would allow for a standardized and more automated pipeline of data acquisition and processing. Therefore, in order to accurately quantify the morphogenic processes Shroom3 is involved in, I developed a new toolset that significantly improved and facilitated my research. The toolset consists of (1) a new sample mounting method that is based on a 3D agarose gel that increases the number of embryos that can be mounted and imaged at once and speeds up the imaging process significantly (2) for subseqent image analysis I developed four programs that automate the process and therefore make the results much more reproducible and the analysis much more efficient. The first program is used for end of migration analyses, to deduce the pattern, count and size of Lateral Line cell clusters. The second is used not for end of migration, but for migration analyses (on timelapse recordings). Besides this it also prepares the images for more advanced downstream migration analyses and allows to analyse fluorescence signal on a second channel. The third program is used to analyse the pLLP only at high spatial resolution and to deduce the cell count, 3D cell morphometrics (like the volume) and cell orientation. The fourth program finally is used downstream of the second and third program and is capable of detecting and comparing them with the look of wildtype rosettes. Here I show that in absence of Shroom3 rosette formation in the migrating pLLP is destabilized leading to facilitated cell cluster deposition and I show how this might be related to traction forces due to a possible interdependence of pLLP acceleration and speed of migration. Furthermore I show that apical constriction and rosette formation is not blocked in Shroom3 deficient embryos, but that larger rosettes are fragmented into many smaller ones. Finally, I give an outlook on how the absense of Shroom3 and hence the absense of morphological changes may deregulate gene transcription by elevating the levels Atoh1a, a transcription factor necessary for hair cell development. My results and methodology demonstrate the importance of morphology in guiding developmental processes and how rather small morphological changes on the cellular level can impact further development significantly. My work also shows how powerful modern genetics, imaging and image analysis are and how diverse they are in terms of range of questions they are capable of answering. The methods and tools I developed prepare the ground for at least three quarters of the analyses I carried out and together with the documentation and data I provide, they are highly reproducible. In that regard I am especially happy that one of my developments, an improved sample preparation method, is already used by many different labs all over the world helping them to make their results more reproducible.
• Die Entwicklungsbiologie untersucht den kontinuierlichen Prozess der Anpassung von Zellen an ihre sich ständig verändernde Umgebung, von der befruchteten Eizelle bis zu einem vollständigen Organismus. Um ein Organ zu bilden, müssen Zellen spezialisierte Funktionen und Aufgaben übernehmen. Die zelluläre Spezialisierung wird gesteuert indem Proteine zu bestimmten Zeiten während der Entwicklung und bei bestimmten Zelltypen unterschiedlich exprimiert werden. Die Expression der Proteine wiederrum wird durch ein Zusammenspiel von chemischen Signalen und physikalischen Kräften gesteuert, wobei das eine das andere beeinflusst. Um ein Gewebe oder ein Organ mit einer Vielzahl von spezialisierten Zellen zu bilden, ist es wichtig, dass die einzelne Zelle Informationen darüber hat, wo sie sich befindet, was ihre Nachbarn tun, wie dicht sie gepackt ist und wie die chemische Zusammensetzung ihrer Umgebung ist. Dies wird erreicht, indem sie in ständiger Rückkopplung mit ihren Nachbarzellen steht und ihre Umgebung wahrnimmt. Nachdem die Informationen verarbeitet wurden, reagiert die Zelle, indem sie die Menge der exprimierten Proteine anpasst, um sich zu vermehren oder spezialisierte Strukturen wie Flimmerhärchen oder Axone zu entwickeln. Ein Aspekt der zellulären Identität ist ihre Form, die z.B. definiert, wie empfänglich die Zelle für interzelluläre Signale ist oder in welchem Abschnitt des Zellzyklus sie sich befindet und somit etwas über ihren aktuellen Zustand aussagen kann. Die Veränderung der Zellform kann auf zwei verschiedene Arten erfolgen. (1) aktiv: Jede Zelle hat ein dynamisches Skelett, das aus einer komplexen Matrix miteinander verbundener Proteine besteht - dem Zytoskelett. Es setzt sich aus drei grundlegenden Klassen von Filamenten zusammen, die unterschiedliche physikalische Eigenschaften haben. Mikrotubuli (die starrsten), Intermediär- und Mikrofilamente (die weichsten). Motor-Proteine wie Myosin können an Aktin-Mikrofilamenten haften und diese zusammenziehen, wodurch z.B. eine Verengung des Zelldurchmessers bewirkt wird. (2) passiv: In einem Gewebe sind Zellen neben ihren einzelnen Zytoskelettelementen auf der suprazellulären Ebene über Aktin durch Adherens junctions verbunden. Wenn sich das Gewebe an einer Stelle verformt, werden dadurch auch andere, weiter entfernte Zellen verformt. Für diese Thesis war ich daran interessiert, besser zu verstehen, wie die zelluläre Form und Geometrie die nachfolgende Zell- und Organentwicklung beeinflusst. Was passiert, wenn eine Zelle nicht in eine bestimmte Form übergehen kann? Wie wirkt sich das auf die Gewebestruktur aus? Wie wirkt es sich auf die weitere Entwicklung aus? Ein bestimmter Typ von Zellverformung ist die apikale Konstriktion, der sich durch eine aktive Verschmälerung der apikalen Oberfläche manifestiert und eine Epithelzelle flaschen- oder keilförmig statt quaderförmig erscheinen lässt. Sie wird in der Regel von mehreren Zellen innerhalb einer Epithelschicht koordiniert, die die zur Verformung eines Gewebes notwendigen Kräfte aufbringen. Epitheliale Rosetten sind radial organisierte Zellcluster innerhalb eines Epithelgewebes, deren Spitzen ein gemeinsames Zentrum berühren, ähnlich wie eine Knoblauchknospe oder ein Kuchen, der entlang seiner Mitte in Stücke geschnitten wurde. Man geht davon aus das apikale Konstriktion erdorderlich für die Bildung Epithelialer Rosetten ist. Zur Untersuchung der Embryonalentwicklung ist der Süßwasserfisch Danio rerio (auch Zebrabärbling) in den letzten Jahren zu einem wichtigen Modellorganismus geworden. D. rerio ist ein diploider Organismus mit einem vollständig sequenzierten Genom und ist etwa 70% homolog zu menschlichen Genen. D. rerio hat einen relativ kurzen Generationswechsel von 12-16 Wochen, eine regelmäßig große Anzahl von Embryonen von 100 / Woche & Weibchen und ist relativ anspruchslos in Bezug auf den Platzbedarf für die Zucht. Außerdem bietet D. rerio etablierte Methoden zur Mutagenese, zum Screening und zur Generierung transgener Linien. Da die Embryonen von Natur aus transparent sind und sich von außen entwickeln, ist es ein ideales System für mikroskopische Untersuchungen mit molekularen Farbstoffen und Tags, um inter- und intrazelluläre Komponenten auch tief im Gewebe sichtbar zu machen (z.B. Zellkerne oder Zellmembran-Fluoreszenz-Tags). Zusammen mit den Fortschritten bei den bildgebenden Verfahren ermöglicht dies eine hochauflösende in vivo Langzeit-Bildgebung mit hohem Durchsatz. Insbesondere die Expression von fluoreszierenden Proteinen, gewebe- oder organspezifisch, in transparenten Embryonen bietet enorme Möglichkeiten interessante und lange offene Fragen zu adressieren. In der Natur ist der Zebrabärbling in den flachen Gewässern des indischen und pakistanischen Ganges-Zuflusses zu finden. Er weist eine ovale Körperform auf und kann im Erwachsenenalter eine Länge von bis zu 5 cm erreichen. Das Seitenliniensystem ist ein mechano-sensorisches Organ, das allen aquatischen Wirbeltieren gemeinsam ist. Es ermöglicht dem Tier Wasserbewegungen wahrzunehmen und sich so zu orientieren, sowie Beute und Fressfeinde zu erkennen. Das voll entwickelte Seitenliniensystem besteht aus Hunderten von Zellhaufen, die in einem geordneten Muster über den gesamten Körper des Tieres verteilt sind. ...