Synthese und biochemische Charakterisierung selektiver Modulatoren der beiden Atg8-Homologen LC3A und LC3B

  • Die Autophagie ist ein in Eukaryonten evolutionär konservierter Prozess, bei dem es zu einem lysosomalen Abbau von cytosolischen Bestandteilen kommt. Die dabei entstehenden biochemischen Bausteine stehen anschließend erneut zum Aufbau benötigter Strukturen zur Verfügung. Verschiedene Stimuli, wie beispielsweise Nährstoffmangel, können die Aktivität der Autophagie erhöhen und ermöglicht Zellen dadurch die Aufrechterhaltung der Zellhomöostase, selbst unter Stressbedingungen. Im Verlauf der Autophagie bildet sich eine tassenförmige Doppelmembran-Struktur, das sogenannte Phagophor. Dieses wächst, um das abzubauende Material zu umschließen und wird dabei von sogenannten Atg-Proteinen (autophagy-related genes) prozessiert. Nach der Schließung spricht man vom Autophagosom, welches letztlich mit einem Lysosom verschmilzt und das Autophagolysosom bildet, welches wiederum die eingeschlossenen Bestandteile zerlegt und die recycelten Bausteine freigibt. Die einzelnen Schritte während der Autophagie sind hochgradig durch die Atg-Proteine reguliert. Eines dieser Atg-Proteine, das Atg8, ist an einigen entscheidenden Schritten wie dem Phagophor-Wachstum, der Autophagosom-Reifung sowie der Schließung beteiligt. Während es in Hefen nur ein einziges Atg8-Protein gibt, so zeigt sich in höheren Eukaryonten meist eine gewisse Diversität. So codiert beispielsweise das humane Genom mindestens sechs Atg8-Homologe. Neben den drei Proteinen der LC3-Familie (A, B, C) zählen auch GABARAP, GABARAPL1 und GABARAPL2 dazu. Die Gründe für diese Diversität sind noch nicht vollständig aufgeklärt, weshalb es wichtig ist, möglichst selektive Modulatoren zu entwickeln, um so die Aufgaben der einzelnen Homologen entschlüsseln zu können. Eine weitere wichtige Aufgabe übernimmt Atg8 beim Binden des abzubauenden Materials über sogenannte Autophagie-Rezeptoren, wie beispielsweise p62. Der Bindevorgang beruht dabei auf der Interaktion von p62 mit ubiquitinierten Zellbestandteilen auf der einen Seite und der Interaktion zwischen p62 und LC3 auf der anderen Seite. Letztgenannte beruht auf dem Binden des LIR-Motivs (LC3-interagierende Region) von p62 an die LDS (LIR-docking site) des LC3-Proteins. Das LIR-Motiv zeichnet sich durch Aminosäure-Sequenz D-D-D-W/F/Y-X1-X2-L/I/V aus. Währende die aromatische Seitenkette (W/F/Y) die hydrophobe Tasche 1 (HP1) der LDS besetzt, ragt die aliphatische Seitenkette (L/I/V) in die HP2 hinein. Damit sollte es möglich sein, die LIR-LC3-Interaktion, durch das Besetzen der LDS zu stören bzw. zu inhibieren. Solche Inhibitoren könnten zum einen der weiteren Aufklärung der Prozesse, an denen die Autophagie beteiligt ist, dienen, zum anderen jedoch auch die Untersuchung fehlerhafter Autophagie ermöglichen. Ausgangspunkt für diese Arbeit stellt die Verbindung Novobiocin dar, die im Rahmen eines Mitteldurchsatz-Screenings als potenzieller Inhibitor der LIR-LC3-Interaktion identifiziert und mittels ITC, TSA und 1H-15N-HSQC verifiziert werden konnte. Die Struktur des Novobiocins setzt sich aus dem 3-Amino-4-hydroxy-8-methylcoumarin-Kern, der über eine Amidbindung an 3-iso-Prenyl-4-Hydroxybenzoesäure gebunden ist, sowie einer O-glykosidischen Bindung in Position C7 des Coumarins mit L-Noviose zusammen. Da es sich bei Novobiocin (XL6) um ein verhältnismäßig komplexes Molekül handelt, wurde der Einfluss einzelner funktionellen Gruppen des Moleküls auf die Bindungsaffinität hin untersucht. Hierfür wurden Synthesestrategien sowohl für die Coumarin-Gerüste als auch verschiedene Benzoesäuren entwickelt. Die erhaltenen Verbindungen wurden mittels ITC und TSA untersucht. Dabei wurde die Verbindung MH507 als geeigneter Ausgangspunkt für die Untersuchung der Struktur-Aktivitätsbeziehungen (SAR) bezüglich der Benzamid-Seite identifiziert. Im Rahmen einer ersten SAR-Untersuchung wurden neben verschiedenen 3-Alkyl-benzoesäuren, auch verschiedene divalente Isostere (-O-, -S-, -NHSO2-) der benzylischen Methylengruppe synthetisiert. Diese, sowie kommerzielle Aminosäuren, wurden mit 3-Amino-4,7-dihydroxycoumarin zu den entsprechenden Endverbindungen gekuppelt. Ergänzend dazu wurden auch eine Verbindung mit umgekehrter Konstitution der Amidbindung dargestellt, um den Einfluss der Reihenfolge zu verifizieren. In einer weiteren SAR-Studie wurden Derivate synthetisiert, die zusätzlich eine Funktionalisierung am C7 des Coumarin-Gerüstes über Amidkupplung, Sulfonamid-Bildung bzw. Suzuki-Reaktion erlauben und somit eine Interaktion mit der HP1 ermöglichen könnten. Dafür wurde eine weitere Synthesestrategie zur Darstellung von 7-Nitro- bzw. 7-Brom-3-amino-4-hydroxycoumarinen ausgearbeitet und eine Reihe von Endverbindungen dargestellt. Neben den Coumarin-Derivaten wurden auch vier Peptidomimetika synthetisierten. Hierfür wurde, basierend auf den Interaktionen zwischen dem LIR-Motiv und der LC3 Proteinoberfläche, ein Pharmakophor-Modell erstellt. Neben einem Pentapeptid wurden auch drei Verbindungen dargestellt, die ein 5-Amino 2-methoxybenzohydrazid-Gerüst besitzen. Um die synthetisierten Verbindungen auf ihre inhibitorische Aktivität auf LC3A bzw. LC3B gegenüber dem LIR-Motiv von p62 hin untersuchen zu können, wurde ein HTRF-basierter Verdrängungsassay entwickelt. Dabei diente ein mit dem LIR-Motiv modifiziertes sGFP als FRET-Akzeptor, während das jeweilige Terbium-Kryptat-gelabelte SNAP-LC3-Fusionsprotein als FRET-Donor fungierte. Neben den Titrationsexperimenten zur Bestimmung der IC50-Werte wurden auch die jeweiligen Dissoziationskonstanten (Kd) von LC3A und LC3B gegenüber dem LIR-sGFP-Fusionsprotein bestimmt, um die IC50-Werte in inhibitorische Konstanten (Ki) zu überführen, da diese untereinander besser vergleichbar sind. Die Verbindung MH209 zeigte die höchste Aktivität auf LC3A bzw. LC3B und besitzt aufgrund der Noviose-Einheit eine gute Wasserlöslichkeit, weshalb sie für die weiteren Untersuchungen ausgewählt wurde. Im Zuge von Kristallisationsexperimenten gelang die Isolierung und Vermessung eines Co-Kristalls von LC3A mit Verbindung MH209. Durch die Kristallstruktur wurden wichtige Einblicke in die intermolekularen Wechselwirkungen der 4-Hydroxycoumarine mit der LC3A- bzw. LC3B-Proteinoberfläche gewonnen und die Bindungsmode aufgeklärt. Diese Erkenntnisse passen gut zu den Ergebnissen aus den durchgeführten TSA-, ITC- und HTRF-Assays, wie beispielsweise der korrekten Konstitution der Amidbindung am C3 des Coumarin-Gerüstes. Mittels ITC wurde die Verbindung MH209 auf ihre Bindungsaffinität gegenüber den anderen humanen Homologen der Atg8-Proteinfamilie hin untersucht. Dabei zeigte sich, dass MH209 abgesehen von LC3A und LC3B keinerlei Aktivität auf den humanen Atg8-Homologen besitzt. Diese Selektivität ist nützlich, um die biologische Bedeutung der Diversität von Atg8-Homologen in höheren Eukaryonten zu untersuchen und Prozesse, in die diese involviert sind, aufzuklären.
  • Autophagy is an evolutionarily conserved process in eukaryotes that involves the lysosomal degradation of cytosolic components into biochemical building blocks. These building blocks are then available again to build required structures. Various stimuli, such as nutrient starvation, can increase the activity of autophagy, thereby allowing cells to maintain cell homeostasis, even under stressful conditions. During the process of autophagy, a cup-shaped double-membrane structure called phagophore forms. The phagophore grows to enclose the material that has to be degraded and is processed during autophagy by so-called Atg proteins. After closure, this is referred to as the autophagosome, which ultimately fuses with a lysosome to form the autophagolysosome, which then breaks down the enclosed components and releases the recycled building blocks. The individual steps during autophagy are highly regulated by Atg proteins. One of these Atg proteins is Atg8, which is involved in several crucial steps such as phagophore growth, autophagosome maturation as well as closure. While there is only one Atg8 protein in yeasts, higher eukaryotes usually show a higher diversity. For example, the human genome encodes at least six Atg8 homologs. In addition to the three LC3 family proteins (A, B, C), these also include GABARAP, GABARAPL1, and GABARAPL2. The reason for this diversity has not yet been fully elucidated, therefore it is important to develop modulators that are as selective as possible so that the functions of the individual homologs can be deciphered. Atg8 also plays an important role in binding the material to be degraded via so-called autophagy receptors, such as p62. The binding process is based on the interaction of p62 with ubiquitinated cell components on the one hand and the interaction between p62 and LC3 on the other. The latter is based on the binding of the LIR motif (LC3-interacting region) of p62 to the LDS (LIR-docking site) of the LC3 protein. The LIR motif is characterized by the amino acid sequence D-D-D-W/F/Y-X1-X2-L/I/V. While the aromatic side chain (W/F/Y) occupies hydrophobic pocket 1 (HP1) of the LDS, the aliphatic side chain (L/I/V) protrudes into HP2. Thus, it should be possible to disrupt or inhibit the LIR-LC3 interaction, by occupying the LDS. Such inhibitors could be used for further elucidation of other processes involving autophagy as well as for the investigation of defective autophagy. The starting point for this work is the compound novobiocin, which was identified as a potential inhibitor of the LIR-LC3 interaction in a medium throughput screen and verified by ITC, TSA and 1H-15N-HSQC. The structure of novobiocin is composed of the 3-amino-4-hydroxy-8-methylcoumarin core bound to 3-isoprenyl-4-hydroxybenzoic acid via an amide bond and an O-glycosidic bond in position C7 of coumarin with L-noviose. Since novobiocin (XL6) is a relatively complex molecule, the influence of individual functional groups of the molecule on the binding affinity was investigated. For this purpose, synthesis strategies were developed for the coumarin scaffolds and for various benzoic acids as well. The compounds obtained were investigated by ITC and TSA. Thereby compound MH507 was identified as a suitable starting point for a SAR investigation with respect to the benzamide side. In a first SAR round, in addition to various 3-alkyl benzoic acids, different divalent isosteres (-O-, -S-, -NHSO2-) of the benzylic methylene group were synthesized. These, as well as commercial amino acids, were coupled with 3-amino-4,7-dihydroxycoumarin to give the corresponding final compounds. Complementarily, a compound with reversed constitution of the amide bond was also prepared to verify the influence of the amide bond sequence. In the further SAR study, derivatives were synthesized that additionally allowed functionalization at C7 of the coumarin scaffold via amide coupling, sulfonamide formation, or Suzuki reaction, respectively, and thus could allow interaction with HP1. For this purpose, another synthetic strategy for the preparation of 7-nitro- or 7-bromo-3-amino-4-hydroxycoumarins was elaborated and a series of final compounds was synthesized. In addition to the coumarin derivatives, four peptidomimetics were also synthesized. For this purpose, based on the interactions between the LIR motif and the LC3 protein surface, a pharmacophore model was constructed. In addition to a pentapeptide, three compounds possessing a 5-amino-2-methoxybenzohydrazide scaffold were also represented. In order to screen the synthesized compounds for their inhibitory activity on LC3A or LC3B toward the LIR motif of p62, an HTRF-based displacement assay was developed. Here, an sGFP modified with the LIR motif served as the FRET acceptor, while the respective terbium cryptate-labeled SNAP-LC3 fusion protein acted as the FRET donor. In addition to the titration experiments to determine the IC50 values, the respective dissociation constants (Kd) of LC3A and LC3B toward the LIR-sGFP fusion protein were also determined to convert the IC50 values to inhibitory constants (Ki), as these are more comparable to each other. Compound MH209 showed the highest activity on LC3A and LC3B, respectively, and has good water solubility due to the L-noviose unit, so it was selected for further studies. During crystallization experiments, we succeeded in isolating and measuring a co-crystal of LC3A with compound MH209. The crystal structure provided important insights into the intermolecular interactions of the 4-hydroxycoumarins with the LC3A and LC3B protein surfaces, respectively, and elucidated the binding mode. These findings fit well with the results obtained from the TSA, ITC, and HTRF assays performed, such as the correct constitution of the amide bond at C3 of the coumarin scaffold. By ITC, compound MH209 was evaluated for its binding affinity towards the other human homologues of the Atg8 protein family. This revealed that apart from LC3A and LC3B, MH209 has no activity on the human Atg8 homologs. This selectivity is useful to study the biological significance of the diversity of Atg8 homologs in higher eukaryotes and to elucidate processes involving them.

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Metadaten
Author:Markus Richard HartmannGND
URN:urn:nbn:de:hebis:30:3-641087
Place of publication:Frankfurt am Main
Referee:Eugen ProschakORCiDGND, Stefan Knapp
Advisor:Eugen Proschak
Document Type:Doctoral Thesis
Language:German
Year of Completion:2021
Year of first Publication:2021
Publishing Institution:Universitätsbibliothek Johann Christian Senckenberg
Granting Institution:Johann Wolfgang Goethe-Universität
Date of final exam:2021/08/26
Release Date:2021/12/02
Page Number:226
First Page:1
Last Page:204
Note:
Diese Dissertation steht außerhalb der Universitätsbibliothek leider (aus urheberrechtlichen Gründen) nicht im Volltext zur Verfügung, die CD-ROM kann (auch über Fernleihe) bei der UB Frankfurt am Main ausgeliehen werden.
Institutes:Biochemie, Chemie und Pharmazie
Dewey Decimal Classification:5 Naturwissenschaften und Mathematik / 57 Biowissenschaften; Biologie / 570 Biowissenschaften; Biologie
Sammlungen:Universitätspublikationen
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