The age of the bone marrow microenvironment influences B-cell acute lymphoblastic leukaemia progression via CXCR5-CXCL13

  • B-cell acute lymphoblastic leukaemia (B-ALL) is characterized by the overproduction of lymphoblasts in the bone marrow (BM), and it is the most common cancer in children while being comparatively uncommon in adults. On the other hand, in chronic myeloid leukaemia (CML), 70% of cases are found in patients older than 50 years, making it uncommon in children. All CML cases and up to 3% of paediatric B- ALL (and 25% of adult B-ALL) cases are due to fusion gene BCR-ABL1, which gives rise to the cytoplasmatic, constitutively active oncoprotein, tyrosine kinase BCR-ABL1 through a reciprocal translocation between chromosomes 9 and 22. The constitutively active BCR-ABL tyrosine kinase leads to deregulation of different signal transduction pathways such as cell growth, proliferation and cell survival. The role of the bone marrow microenvironment (BMM) can mediate disease initiation (only in mice), progression, therapy resistance, and relapse, as has been increasingly recognized over the last two decades. In general, the BMM is a very complex arrangement of various cell types such as osteoblasts, osteoclasts, endothelial cells, adipocytes, mesenchymal stromal cells, macrophages and several others. In addition, the BMM is composed of multiple chemical and mechanical factors and extra cellular matrix (ECM) proteins which contribute to the BMM’s features influencing leukaemia behaviour. Considering the incidence of B-ALL and CML in children and in adults respectively, we hypothesized that the young and/or an aged BMM might also play a previously unrecognized role in the aggressiveness of B-ALL and CML. We proposed that BM, transduced with BCR-ABL1-expressing retrovirus in the murine transduction/transplantation model of B-ALL, transplanted into young versus old recipient mice would lead to a more aggressive disease in young mice, and similarly CML would be more aggressive in old recipient mice. In close recapitulation with the human incidence, induction of CML led to a significantly shorted survival in old recipient mice. On the other hand, induction of B-ALL showed a shortened survival in young compared to old syngeneic mice, as well as in a xenotransplantation model. Among the highly heterogenous composition of the BMM, we implicate young BM macrophages as a supportive niche for B-ALL cells. The results were found to be mostly due to potential soluble factors differentially secreted from young and old macrophages. Therefore, we hypothesized that the chemokine CXCL13, which has been demonstrated to play a role in B cell migration and act as a diagnostic marker in the cerebrospinal fluid of patients with neuroborreliosis, might be responsible for the observed phenotype. CXCL13 was found to be more highly expressed in healthy and leukaemic young mice as well as in conditioned medium of young macrophages. Using a variety of in vitro experiments, CXCL13 showed to significantly increase the proliferation and the migration of leukaemia cells when exposed to young macrophages, and the phenotype was rescued while using a CXCL13 neutralizing antibody. The CXCL13 role was also confirmed in vivo, since macrophage ablation led to a prolongation of survival in young mice and a reduction of CXCL13 levels. The use of an additional mouse model, leukaemia cells with CXCR5 deficiency, led to a significant prolongation of survival of young mice, confirming the importance of the CXCL13-CXCR5 axis in B-ALL. In line with our murine results, we found that human macrophages and CXCL13 levels were higher in pediatric B-ALL patients than in adults. Consistent with our murine data, the expression level of CXCR5 may act as a prognostic marker in B-ALL, as well as a predictive marker for central nervous system relapse in human B-ALL. The overall findings show that a young BMM, and in particular macrophages, influences B-ALL progression. We specifically identified CXCL13, secreted by young macrophages, as a promoter of proliferation of B-ALL cells, influencing survival in B-ALL via CXCR5. The CXCR5-CXCL13 axis may be relevant in human B-ALL, and higher CXCR5 expression in human B-ALL may act as a predictive marker.
  • Leukämie ist eine hämatologische Erkrankung, die durch eine Funktionsstörung normaler hämatopoetischer Stammzellen (HSC) und/oder stärker differenzierter Vorläuferzellen verursacht wird und zu einer unkontrollierten Vermehrung und Anhäufung nicht funktionsfähiger Leukozyten führt. Die B-Zell akute lymphoblaalstische Leukämie (B-ALL) ist durch eine Überproduktion von Lymphoblasten im Knochenmark gekennzeichnet und ist die häufigste Krebserkrankung bei Kindern, während sie bei Erwachsenen vergleichsweise selten vorkommt. Von allen Patienten mit chronisch myeloische Leukämie (CML) sind 70% über 50 Jahre alt, während Kindern eher selten betroffen sind. Sowohl bei der CML als auch bei bis zu 3 % der pädiatrischen B-ALL-Fälle wird das Fusionsgen BCR-ABL1 diagnostiziert, das durch eine reziproke Translokation zwischen den Chromosomen 9 und 22 das zytoplasmatische, konstitutiv aktive Onkoprotein, die Tyrosinkinase BCR-ABL1, hervorbringt. Die konstitutiv aktive BCR-ABL-Tyrosinkinase führt zur Deregulierung verschiedener Signaltransduktionswege wie Zellwachstum, Proliferation und Zellüberleben. Die Rolle des Knochenmarksmikromilieu (KMM) als extrinsischer Faktor, der die Krankheitsentstehung bei den Leukämien, das Fortschreiten, die Therapieresistenz und den Rückfall beeinflussen kann, wurde in den letzten zwei Jahrzehnten zunehmend anerkannt. Im Allgemeinen ist das KMM ein sehr komplexes Gefüge aus verschiedenen Zelltypen wie Osteoblasten, Osteoklasten, Endothelzellen, Adipozyten, mesenchymalen Stromazellen, Makrophagen und einigen anderen. Darüber hinaus besteht das KMM aus einer Vielzahl chemischer und mechanischer Faktoren und EZM (extrazelluläre Matrix) Proteinen, die zu den Eigenschaften des KMM beitragen und das Verhalten von HSC und Leukämie beeinflussen. In Anbetracht der bereits beschriebenen Häufigkeit von B-ALL und CML bei Kindern bzw. Erwachsenen stellten wir die Hypothese auf, dass das junge und/oder alte KMM eine bisher unerkannte Rolle für die Aggressivität von B-ALL und CML spielen könnte. Wir vermuteten, dass junges KM, also KM von 6 Wochen alten Mäusen, transduziert mit BCR-ABL1-exprimierendem Retrovirus im murinen Transduktions-/Transplantationsmodell der B-ALL, transplantiert in junge gegenüber alten, unbestrahlten Empfängermäusen, zu einer aggressiveren Erkrankung in jungen Mäusen führen würde, und dass in ähnlicher Weise die CML in alten Empfängermäusen aggressiver sein würde. In der Tat führte die Induktion von CML in alten Empfängermäusen (BALB/c) zu einer signifikanten Verkürzung der Überlebenszeit, was dem Verhalten dieser Erkrankung beim Menschen sehr nahekommt. Andererseits zeigte sich bei der Induktion von B-ALL eine signifikant höhere Anzahl von Leukozyten und eine höhere Tumorlast im peripheren Blut sowie eine Verkürzung der Überlebenszeit bei jungen im Vergleich zu alten (BALB/c und C57/BL6) Empfängermäusen. In Übereinstimmung mit dem syngenen Modell führte die Transplantation menschlicher BALL-Zellen in NOD-SCID-Mäuse mit Interleukin-2-Rezeptor-γ-Immundefizienz zu einer verkürzten Überlebenszeit bei jungen Mäusen. Da die Lokalisierung von Leukämiezellen im KMM mit der Aggressivität und dem Fortschreiten der Krankheit korreliert sein könnte, stellten wir mit Hilfe des 2-Photonen-Mikroskops fest, dass Leukämiezellen bei jungen Mäusen näher am Endosteum lokalisiert waren und eine höhere Geschwindigkeit mit einem stärker gerichteten Wanderungsverhalten zeigten als bei alten Mäusen. Dies veranlasste uns zu der Annahme, dass spezifische Reaktionen auf Faktoren in der jungen und nicht im alten KMM die Aufrechterhaltung von Leukämiezellen unterstützen könnten. Wie bereits erwähnt, untersuchten wir im Rahmen der sehr heterogenen Zusammensetzung des KMM, die den beobachteten Phänotyp beeinflusst haben könnte, die Rolle von jungen und alten Makrophagen in vitro. Die Bedeutung von Monozyten/Makrophagen wurde teilweise bei B-ALL, T-ALL und chronischer lymphatischer Leukämie (CLL) durch andere Gruppen, sowie bei der normalen Hämatopoese in unseren früheren Arbeiten im Labor beobachtet. In mehreren in-vitro-Experimenten haben wir eine unterschiedliche Interaktion von B-ALL-Zellen mit Makrophagen aus jungem und altem KMM beobachtet. Die Ergebnisse zeigten, dass Leukämiezellen einen Proliferationsvorteil haben, wenn sie jungen Makrophagen ausgesetzt sind, insbesondere sinkt die Wachstumskurve disproportional, wenn die Leukämiezellen gemeinsam mit Makrophagen zunehmenden Alters kultiviert werden. In Bezug auf die Stärke der Adhärenz gab es keine signifikanten Unterschiede, während die Migration der Leukämiezellen zu jungen Makrophagen im Vergleich zu alten Makrophagen verstärkt war. In Anbetracht der Tatsache, dass unterschiedliche Faktoren unterschiedlich sezerniert werden könnten, zeigte die Exposition von Leukämiezellen gegenüber konditioniertem Medium von jungen Makrophagen eine erhöhte Proliferation. Aufgrund der in unseren Experimenten beobachteten Unterschiede zwischen jungen und alten Makrophagen analysierten wir die Alterungsmerkmale in jungen und alten Makrophagen. Alte Makrophagen zeigten im Vergleich zu jungen Makrophagen einen seneszenzähnlichen Phänotyp mit einem veränderten Transkriptom und einer veränderten epigenetischen Signatur. Insbesondere wurde eine globale und auffällige epigenetische Veränderung festgestellt, die bei jungen Makrophagen funktionelle Eigenschaften im Zusammenhang mit Entzündungen und Immunreaktionen erkennen ließ. Die Auswirkungen der konditionierten Medien auf die Proliferation, die Migration und die potenzielle Entzündungsreaktion veranlassten uns, Zytokine und/oder Chemokine zu identifizieren, die für die beobachteten Unterschiede verantwortlich sein könnten. Da das Chemokin CXCL13 nachweislich eine Rolle bei der Migration von B-Zellen spielt und als diagnostischer Marker in der Zerebrospinalflüssigkeit von Patienten mit Neuroborreliose fungiert, stellten wir die Hypothese auf, dass ein solches Chemokin für das verstärkte Wachstum von Leukämiezellen in einem jungen KMM verantwortlich sein könnte. Auf transkriptioneller Ebene wurden keine signifikanten Unterschiede in der CXCL13-Expression zwischen jungen und alten Makrophagen festgestellt. Allerdings wiesen gespültes Knochenmark junger Mäuse und konditionierte Medien junger Makrophagen eine höhere Konzentration von CXCL13 auf als die entsprechenden alten Kontrollen, sowohl im gesunden als auch im B-ALL-Modell. Da wir wissen, dass CXCL13 über seinen Rezeptor CXCR5 die Migration von B-Zellen fördert, haben wir die Expression von CXCR5 auf B-ALL-Zellen untersucht. In der Tat fanden wir eine höhere Expression von CXCR5 auf B-ALL-Zellen im peripheren Blut und in der Milz junger Mäuse im Vergleich zu alten Mäusen. Daher untersuchten wir die potenzielle Funktion der CXCR5-CXCL13-Achse im jungen und alten KMM im Zusammenhang mit Leukämiezellen genauer. Die Hemmung von CXCL13 reduzierte signifikant die Proliferation und Migration von Zellen, wenn sie jungen Makrophagen ausgesetzt waren, und der Phänotyp wurde durch die Verwendung von rekombinantem CXCL13 umgekehrt. Zur Bestätigung der pro-proliferativen Rolle von CXCL13 beschleunigte die In-vitro-Vorbehandlung von B-ALL mit rekombinantem CXCL13 vor der Transplantation die Leukämieentwicklung in Empfängermäusen erheblich. In Anbetracht der Beteiligung junger Makrophagen wollten wir diese Ergebnisse in vivo validieren. Zu diesem Zweck verabreichten wir Clodronat-Liposomen in leukämischen Mäusen, einem gut etablierten Modell, um Makrophagen zu entfernen. Die Entfernung von Makrophagen führte zu einer signifikanten Verringerung der Tumorlast sowie zu einer Verlängerung der Überlebenszeit bei jungen Mäusen. Die weitere Quantifizierung von CXCL13 im Knochenmark und im Plasma bestätigte, dass der Phänotyp teilweise auf eine Verringerung der CXCL13-Menge zurückzuführen ist. Diese Daten deuten daher darauf hin, dass CXCL13, das zumindest teilweise von Makrophagen sezerniert wird, die Migration und Proliferation von B-ALL-Zellen fördert und damit das Überleben bei B-ALL beeinflusst. Um die Beteiligung der CXCL13-CXCR5-Achse in vivo weiter zu validieren, wurde ein weiteres Mausmodell (CXCR5-defiziente Mäuse) verwendet. In Übereinstimmung mit unseren früheren Ergebnissen führten Leukämiezellen mit CXCR5-Mangel zu einer signifikanten Verlängerung des Überlebens junger Empfängermäuse. Neben der Beobachtung verschiedener Mäusestämme und Mausmodelle, um den Beitrag von Makrophagen und CXCL13 in der jungen Mikroumgebung zu bestätigen, untersuchten wir diese Proteine auch in Proben erkrankter Menschen. Zu diesem Zweck führten wir immunhistochemische Untersuchungen an menschlichen KM-Schnitten durch. In Übereinstimmung mit unseren Daten aus Mäusen konnten wir zeigen, dass CD68+ Makrophagen und CXCL13 in Knochenschnitten von pädiatrischen Patienten im Vergleich zu erwachsenen Patienten mit B-ALL häufiger vorkommen. In Anbetracht der neuartigen Rolle einer Untergruppe von Monozyten, die als nicht-klassische Monozyten bezeichnet werden und deren Häufigkeit prädiktiv für B-ALL ist, untersuchten wir außerdem, ob es einen unterschiedlichen Beitrag dieser Zelltypen in der Mikroumgebung von jungen und alten Patienten gibt. Tatsächlich fanden wir in Knochenschnitten von Patienten mit pädiatrischer B-ALL eine erhöhte Anzahl dieser Zellen, die auch CXCL13 produzierten. In Anbetracht unserer Daten aus Mäusen war die Expression von CXCR5 bei B-ALL-Patienten ebenfalls stratifizierbar, was darauf hindeutet, dass dies als prognostischer Marker sowie als prädiktiver Marker für einen Rückfall im zentralen Nervensystem bei menschlicher B-ALL fungieren könnte. Insgesamt zeigen die Ergebnisse, dass junges KMM und insbesondere Makrophagen das Fortschreiten der B-ALL beeinflussen. Wir zeigen deutliche Unterschiede in der Interaktion von jungem und altem KMM mit Leukämiezellen. Vor allem sezernierte Faktoren beeinflussen die Proliferation, den Zellzyklus und die Migration von Leukämiezellen, obwohl ein Einfluss des Zell-Zell-Kontakts oder von Leukämiezell-immanenten Faktoren nicht ausgeschlossen werden kann. Wir konnten zeigen, dass CXCL13, das zum Teil von jungen Makrophagen sezerniert wird, die Migration und Proliferation von B-ALL-Zellen fördert und das Überleben bei B-ALL über seinen verwandten Rezeptor CXCR5 beeinflusst. Die CXCR5-CXCL13-Achse könnte bei menschlicher B-ALL von Bedeutung sein, und eine höhere CXCR5-Expression bei menschlicher B-ALL könnte als prädiktiver Marker dienen.

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Metadaten
Author:Costanza Zanetti
URN:urn:nbn:de:hebis:30:3-673454
DOI:https://doi.org/10.21248/gups.67345
Place of publication:Frankfurt am Main
Referee:Rolf Maschalek, Daniela Sandra KrauseGND
Document Type:Doctoral Thesis
Language:English
Date of Publication (online):2022/03/17
Year of first Publication:2021
Publishing Institution:Universitätsbibliothek Johann Christian Senckenberg
Granting Institution:Johann Wolfgang Goethe-Universität
Date of final exam:2022/02/08
Release Date:2022/03/30
Tag:Akute lymphoblastische Leukämie; Alterung; CXCL13; CXCR5; Knochenmarksmikromilieu; Makrophagen
Page Number:129
Last Page:129
HeBIS-PPN:492438552
Institutes:Biochemie, Chemie und Pharmazie
Dewey Decimal Classification:5 Naturwissenschaften und Mathematik / 57 Biowissenschaften; Biologie / 570 Biowissenschaften; Biologie
6 Technik, Medizin, angewandte Wissenschaften / 61 Medizin und Gesundheit / 610 Medizin und Gesundheit
Sammlungen:Universitätspublikationen
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