Open Access

Jonas Benjamin Michaelis

• Mitochondria are important for cellular health and their dysfunction is linked to a variety of diseases, especially neurodegeneration. Thus, the renewal and degradation of dysfunctional mitochondria is crucial for the well-being of organisms. The selective digestion of damaged mitochondria via the lysosome (mitophagy), is the main pathway to do so. In my dissertational work, I investigated the connection between protein misfolding, protein import into mitochondria and the degradation of mitochondria via mitophagy. Here, I present a new model for the initiation of mitophagy without collapse of the membrane potential. This model provides the link between protein import into mitochondria, stress signal transduction to the cytosol and the mitochondrial stress sensor PINK1. To comprehensively examine how mitophagy can be triggered, I performed a genome-wide CRISPR knockout screen utilizing the mitophagy reporter mitochondrial mKEIMA. Thereby, I observed numerous novel gene deletions that induce mitophagy. Prominently, I identified an accumulation of gene deletions of the protein import and of protein quality control factors. I validated several of those and examined HSPA9 (mitochondrial HSP70) and LONP1 (a mitochondrial matrix AAA protease) in more detail, regarding their effect on mitophagy and protein import. For this, I used an established fluorescence-based, mitochondrial-targeted EGFP, as well as a newly-developed pulsed-SILAC mass spectrometry approach (mePRODmt). Depletions of both genes resulted in reduced protein import and PINK1-dependent mitophagy. Strikingly, I did not observe any loss of mitochondrial membrane potential, which was hitherto believed to be essential for activation of PINK1-mediated mitophagy. Literature shows that certain mitochondrial stressors can also induce mitophagy without mitochondrial membrane depolarization, which I confirmed with my assays. Next, I characterized the impact of LONP1 and HSPA9 depletion, which are involved in proteostasis maintenance, and the mtHSP90 inhibitor GTPP on mitochondrial protein folding in more detail. GTPP treatment and LONP1 depletion both resulted in the accumulation of an insoluble protein fraction, as judged by proteomic analysis. This insoluble protein fraction enriched several components of the presequence translocase-associated motor PAM, including TIMM44. TIMM44 acts as a link between the translocon, the import pore of the inner mitochondrial membrane (TIM) complex and the PAM complex. Thus, I hypothesized that TIMM44 dissociates from the TIM complex upon protein folding stress, when it becomes part of the insoluble protein fraction. To validate this model, I measured the TIMM44 interactome upon proteostasis disturbance using proximity labeling. Indeed, interaction of TIMM44 with the import pore was almost completely abolished, explaining the loss of matrix-targeted import upon protein folding stress. From these findings, I reasoned that an import reduction mediated by the PAM complex would likely also inhibit the degradation of PINK1. Consistent with this hypothesis, I observed that mitophagy induced by HSPA9 or LONP1 deletion was prevented when PINK1 was genetically deleted. In comparison, non-processed PINK1 was stabilized on mitochondria in wild type cells when mitochondrial protein import was impaired. On this basis, I drew the conclusion that the loss of mitochondrial import was the stress signal, which leads to the stabilization of PINK1, as it could not be processed anymore via the inner mitochondrial membrane protease PARL. PINK1 auto-activates itself upon accumulation and signals to the cytosol that this mitochondrion is damaged. Mitophagy is subsequently initiated by the ubiquitin kinase activity of PINK1. As a result, the autophagy apparatus gets activated, damaged mitochondria are engulfed by a double membrane and removed via lysosomal digestion. This proposed model is, to the best of my knowledge, the first to provide an explanation for protein folding stress-induced and protein import inhibition-triggered mitophagy without mitochondrial depolarization. The model thus extends the PINK1/PARKIN-dependent mitophagy pathway to milder stresses and clears some of the open questions in the field. Furthermore, this work is also important, because protein misfolding stress and dysfunctional mitochondria are two hallmarks of neurodegeneration. In particular, mitochondrial protein import inhibition during Parkinson’s and Huntington disease might be driver of mitochondrial dysfunction. Hence, I hope and anticipate that the newly developed protein import method, mePRODmt, and the proposed model will be beneficial to further characterize underlying processes and to establish which factors prevent or drive these disorders on molecular level.
• Mitochondrien versorgen die Zelle mit Energie, Metaboliten und Eisen-Schwefel-Clustern, die essentiell für die zelluläre Gesundheit sind. Die Erneuerung und der Abbau dysfunktionaler Mitochondrien ist mithin entscheidend für die Funktion des Organismus. Mitochondriale Fehlfunktion wird daher auch mit einer Reihe von Krankheiten in Verbindung gebracht, insbesondere mit Neurodegeneration und Herzkrankheiten. Der zelluläre Selbstverdau, die sogenannte „Autophagie“ spielt hierbei eine wichtige Rolle. Geschädigter Mitochondrien werden dabei, durch eine Doppelmembran umschlossen und mittels Fusion mit dem Lysosom abgebaut werde. Diese Form der selektiven Autophagie wird bei Mitochondrien als Mitophagie bezeichnet. Sie ist der wichtigste Weg, um Mitochondrien abzubauen und der Akkumulation beschädigter Mitochondrien vorzubeugen. In meiner Dissertation untersuchte ich den Zusammenhang zwischen Proteinfehlfaltung, Proteinimport in Mitochondrien und dem Abbau von Mitochondrien durch Mitophagie. Hier stelle ich ein neues Modell für die Einleitung der Mitophagie ohne Zusammenbruch des mitochondrialen Membranpotenzials vor. Dieses Modell erklärt die Verbindung zwischen dem Proteinimport in die Mitochondrien, der Weiterleitung von Stresssignalen an das Zytosol und wie der mitochondriale Stresssensor PINK1 auf Mitochondrien stabilisiert werden kann. Um umfassend zu testen, welche Faktoren Mitophagie auslösen können, führte ich einen genomweiten CRISPR-Knockout-Screen mit dem Mitophagie-Reporter mKEIMA durch. Hierbei konnten zahlreiche neue Gendeletionen identifizieren werden, die Mitophagie auslösen. Innerhalb dieser Gendeletionen beobachtete ich eine Anhäufung von Genen, die für Proteinimportfaktoren und für die Qualitätskontrolle von Proteinen kodieren. Zunächst validierte ich mehrere von diesen Kandidaten mittels individueller Gendeletion und untersuchte anschließend HSPA9 (mitochondriales HSP70, ein Chaperon notwendig für Proteinimport in Mitochondrien und Proteinfaltung in der Matrix) sowie LONP1 (eine mitochondriale AAA-Protease, notwendig für den Abbau von beschädigten Proteinen in Mitochondrien) genauer in Hinblick auf ihre Wirkung auf Mitophagie. Dabei interessierte mich vor allem, wie der Verlust dieser Proteine Mitophagie initiierte. Der aktuell bekannteste Mechanismus zur Mitophagie-Aktivierung resultiert aus dem Zusammenbruch des mitochondrialen Membranpotentials, welches sich mittels der Atmungskette zwischen der Matrix und dem Intermembranraum aufbaut. Hierbei sorgt der Verlust des Membranpotentials dafür, dass der Mitophagiesensor PINK1 nicht mehr über die innere mitochondriale Membran transportiert werden kann, wo er unter Normalbedingungen durch die PARL Protease geschnitten und hierdurch destabilisiert würde. Anschließend würde destabilisiertes PINK1 im Zytosol durch das Proteasom, die Hauptprotease der Zelle, abgebaut werden. Bei verringerten Proteinlevel von HSPA9 oder LONP1 in Mitochondrien, sehe ich allerdings keinen Zusammenbruch des Membranpotentials, nichtsdestotrotz wird PINK1 unter diesen Bedingungen stabilisiert. In der Literatur wurden ebenfalls weitere Behandlungen beschrieben, bei denen das eben dargestellte Modell nicht erklären kann, wie der Abbau der Mitochondrien über PINK1 aktiviert werden konnte. Um diese offene Frage zu klären, untersuchte ich den mitochondrialen Proteinimport genauer. Hierzu verwendete ich zum einen ein etabliertes fluoreszenzbasiertes Untersuchungsverfahren bei dem mitochondriales grün fluoreszierendes Protein zusammen mit dem mitochondrialen Farbstoff Mitotracker Deep Red lokalisiert, falls mitochondriale Proteinimport vorhanden ist und schließe daraus auf Proteinimportdefekte, sowie zum anderen unser neu entwickeltes Massenspektrometrie-verfahren, mePRODmt, welches auf gepulster Stable Isotope Labeling by/with Amino acids in Cell culture (SILAC)-Markierung basiert. Das letztgenannte Verfahren erlaubte es, neben der generellen Auswirkung auf den Proteinimport, auch Proteine individuell zu messen und festzustellen in wie weit diese noch in Mitochondrien aufgenommen werden...