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Simon Harth

• In Europe, the sugar refinery is largely based on sugar beets. This route for obtaining household sugar results in a large amount of biomass waste, consisting mainly of the insoluble beet resi-dues, e.g., cell wall fragments. To a vast moiety this debris consists of the polymer pectin (up to 20% in the dry total solids). The structure of pectin is based on a backbone of D-galacturonic acid units (GalA), but also contains various other sugar monomers, predominantly L-arabinose, D-galactose, L-rhamnose and D-xylose. The amount of GalA adds up to a moiety of up to 70% with-in this sugar cocktail. So far, this debris is only fed to cattle or simply burnt. In nature, pectin is a common substrate for various organisms. The degradation of pectin-rich biomass is often per-formed by filamentous fungi like Hypocrea jecorina (also known as Trichoderma reesei) and As-pergillus niger, which evolved pectinases to degrade the pectin backbone and pathways to con-sume the monomer GalA as a sole carbon source. The fungal catabolism of pectin residues starts with the reduction of GalA to L-galactonate (GalOA) by a GalA-reductase. Even though filamen-tous fungi are native hosts of the GalA-catabolism and certain engineering approaches have al-ready been demonstrated, this class of organisms remains challenging with regard to bioreactor cultivation and tedious genetic accessibility. In contrast, the yeast S. cerevisiae is well known in fermentation processes and easily modified by a versatile set of genetic tools. So far, first ap-proaches have already been conducted to transfer the GalA utilization pathways into S. cerevisiae, but these approaches indicated limitations regarding GalA-uptake and redox cofac-tor replenishment due to the relatively high oxidative state of GalA compared to other sugars like glucose and galactose. Furthermore, the generally strongly increased demand for redox co-factors must be met by GalA reduction by finding new cofactor sources or redirecting reactions of the core metabolism. This work aimed at the production of GalOA, which is the first intermediate of the fungal GalA catabolism. This compound shows an interesting range of potential applications, for instance as a food and cosmetic additive. To overcome the oxidized character of GalA, the presence of a more reduced co-substrate as a redox donor and as a carbon and energy source was required. To further enhance the reduction of GalA, modulation of the redox-cofactor supply and enzyme engineering were performed.
• In Europa basiert die Zuckerraffination weitgehend auf Zuckerrüben. Dieser Weg zur Gewinnung von Haushaltszucker resultiert in einer großen Menge an Biomasseabfällen, die hauptsächlich aus den unlöslichen Rübenrückständen, z.B. Zellwandbruchstücken, bestehen. Diese Abfälle bestehen hauptsächlich aus dem Polymer Pektin (bis zu 20 % der Gesamttrockensubstanz). Das Grundgerüst von Pektin besteht aus D-Galakturonsäureeinheiten (GalA), enthält aber auch verschiedene andere Zuckermonomere, wie L-Arabinose, D-Galaktose, L-Rhamnose und D-Xylose. In diesem Zuckercocktail beträgt der Anteil von GalA bis zu 70%. Bisher werden die Reste der Zuckerraffinerie hauptsächlich in der Landwirtschaft verfüttert oder zur Entsorgung verbrannt. In der Natur jedoch ist Pektin ein häufiges Substrat für verschiedene Organismen. Die Ascomyceten Hypocrea jecorina (auch bekannt als Trichoderma reesei) und Aspergillus niger können die pektinreiche Biomasse nutzen, da sie Pektinasen zum Abbau des Pektingerüsts und Stoffwechselwege zum Verbrauch des Monomers GalA als Kohlenstoffquelle entwickelt haben. Der pilzliche Katabolismus von Pektinresten beginnt mit der Reduktion von GalA zu L-Galaktonat (GalOA) durch GalA-Reduktasen. Obwohl filamentöse Pilze native Wirte für den GalA-Katabolismus sind und vereinzelt schon Anwendungen für den Einsatz dieser Pilze zur Verwertung von pektinreicher Biomasse gezeigt wurden, bleibt diese Klasse von Organismen eine Herausforderung im Hinblick auf ihre Kultivierung in Bioreaktoren und ihrer schwer zugänglichen Genetik. Im Gegensatz dazu ist die Hefe S. cerevisiae in Fermentationsprozessen gut bekannt und lässt sich mit einer Vielzahl von genetischen Methoden leicht modifizieren. Bisher wurden bereits erste Versuche unternommen, die Fähigkeit zur GalA-Verwertung in S. cerevisiae zu übertragen. Diese Ansätze stießen jedoch oft auf Einschränkungen hinsichtlich des Transports von GalA in die Zelle und der Bereitstellung von Redox-Cofaktoren, da GalA im Vergleich zu anderen Zuckern wie Glucose und Galaktose einen relativ hohen oxidativen Zustand vorweist. Weiter muss der generell stark erhöhte Bedarf an Redox-Cofaktoren durch die GalA-Reduktion gedeckt werden indem neue Cofaktor-Quellen gefunden oder Reaktionen des Zentralmetabolismus umgeleitet werden. Diese Arbeit hatte die Herstellung von GalOA zum Ziel. GalOA ist das erste Zwischenprodukt des nativen GalA-Abbaus und könnte in verschiedenen interessanten Anwendungen eingesetzt werden, so z. B. als Lebensmittel- und Kosmetikzusatzstoff. Die hohe Oxidationsstufe von GalA stellt eine Herausforderung für den Metabolismus dar, um dies zu umgehen ist ein stärker reduziertes Co-Substrats als Redox-Donor und als Kohlenstoff- und Energiequelle erforderlich. Um die Reduktion von GalA weiter zu verbessern, mussten Recyclingsysteme und die Versorgung der Reaktion mit Redox-Cofaktoren verbessert werden, darüber hinaus wurde das zentrale Enzym, die GalA-Reduktase, in ihrer Cofaktor-Präferenz optimiert. Dafür wurden gezielt Aminosäuren in der Cofaktorbindetasche des nativen Enzyms mutiert.