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Silke Hutschenreiter

• The detailed mechanism of the 20 S proteasome from Thermoplasma acidophilum is unknown. Substrates are degraded processively to small fragments without the release of intermediates, but the basis for this unique degradation mode remains obscure. The proteasome is a molecular machine, but how the different nanocompartments interplay and whether more than one substrate can be treated simultaneously has not been elucidated yet. To address these questions we had to disable the functionality of one aperture in order to dissect whether the other pore can compensate for the loss. As it is challenging to introduce mutations solely around one pore aperture of the highly symmetrical construct, we chose a novel approach by unique orientation of the proteasome at interfaces. For this purpose we purified recombinant 20 S proteasomes, where hexahistidine tags were fused either around the entrances or at the sides. According to electron microscopic studies we immobilized these constructs uniformly either end-on or side-on at metal-chelating interfaces (lipid vesicles, lipid monolayers and self-assembled thiol monolayers). Degradation of small fluorogenic peptides and large proteins like casein was analyzed. Small substrates were degraded with comparable activity by free and immobilized proteasomes, irrespective of their orientation. Thus it can be assumed that peptides can pass the sealed entrance of the 'dead-end' proteasome. However, larger substrates like fluorescently labeled casein were processed near the temperature optimum by side-on immobilized and soluble proteasomes with threefold activity compared to end-on immobilized proteasomes. Hence it can be concluded that one pore is sufficient for substrate entry and product release. In other words, the pore and antechamber can fulfil a triple function in the import and unwinding of substrates and the egress of products. With means of surface plasmon resonance the exact substrate/proteasome stoichiometry could be determined to ~1 for 'dead-end' proteasomes and ~2 for side-on immobilized (active and inactive) proteasomes. Most importantly, a fit with the Hill equation revealed positive cooperativity for side-on immobilized (Hill coefficient ~2) in contrast to end-on immobilized proteasomes (Hill coefficient ~1). Thus in case of soluble proteasomes two substrates bind presumably in opposite antechambers with positive cooperativity. The off-rate of casein as substrate is twofold for the active side-on immobilized proteasome in comparison to the end-on immobilized proteasome. The exact 2:1 stoichiometry of the off-rates equals the ratio of exit pathways amenable in case of side-on orientated versus 'dead-end' immobilized proteasomes. Thus crevices along the cylindrical body of the 20 S proteasome seem not to participate in the egress of small products. An inactive proteasome mutant displays a concentration-dependent off-kinetic against casein. Accordingly, the off-rate of the bisubstrate:proteasome complex can be attributed around half the value of the monosubstrate:proteasome complex. Consequently, substrates exit the inactive proteasome via the route of access due to obstruction of the trans side with an entering substrate. Hence the active proteasomes have to chop substrates down to small fragments prior to release through both pores. Thus the processive degradation mode might result from positive binding cooperativity. The on-rate constants for casein suggested that substrate association represents a two-step process comprising a rate-limiting translocation step and a fast binding step. As fluorescence cross-correlation revealed that two substrates can be co-localized in the proteasome and bind successively with increasing affinity (KD,1 = 8 µM versus KD,2 = 700 nM), an allosteric transition in the proteasome can be assumed. Combining our results with the data from other research groups led to a mechanistic model for the 20 S proteasome. Accordingly, the first substrate undergoes a slow translocation step, binds in the antechamber and diffuses subsequently to the catalytic centers, where it is degraded. By switching on the catalytic activity, the pores at both termini are dilated via conformational changes. Hence entry of the second substrate into the proteasome is facilitated due to omission of the rate-determining translocation step. The second substrate is either accommodated in the antechamber before it is processed (alternating degradation) or, most probably, is directly threaded into the central cavity (simultaneous degradation). As effusing peptides compete with entering proteins for binding in the antechamber, the pores are kept in an open state. After finishing digestion the pores are closed and a new degradation cycle can be reinitiated. In summary, substrate association with the proteasome underlies an ordered alternating binding mechanism in contrast to the random mode of degradation. Thus the two-stroke engine offers the advantage of speeding up degradation without enhancing complexity.
• Der detaillierte Mechanismus des 20 S Proteasoms von Thermoplasma acidophilum ist unbekannt. Substrate werden prozessiv ohne Freisetzung von Intermediaten degradiert, aber die Grundlage für diesen einzigartigen Degradationsmodus bleibt unklar. Das Proteasom ist eine molekulare Maschine, aber wie die verschiedenen Nanokompartimente miteinander interagieren und ob mehr also ein Substrat gleichzeitig berarbeitet werden kann, ist noch unerforscht. Zur Beantwortung dieser Fragen musste die Funktionalität einer Öffnung ausgeschaltet werden, um herauszufinden, ob die andere Pore den Verlust kompensieren kann. Da es eine Herausforderung darstellt, Mutationen nur um eine Porenöffnung des hochsymmetrischen Konstruktes einzuführen, wählten wir mittels einzigartiger Orientierung des Proteasoms an Grenzflächen einen neuartigen Zugang. Zu diesem Zweck reinigten wir rekombinante 20 S Proteasomen auf, an denen entweder um die Porenöffnungen herum oder an den Seiten Hexahistidinsequenzen fusioniert wurden. Wir immobilisierten diese Konstrukte eletronenmikroskopischen Untersuchungen zufolge einheitlich entweder aufrecht oder seitlich an metall-chelatisierenden Grenzschichten (Lipidvesikel, Lipidmonolayer und selbstassemblierte Thiolschichten). Die Degradation kleiner fluorogener Peptide und grosser Proteine wie Casein wurde untersucht. Kleine Substrate wurden, ungeachtet ihrer Orientierung, mit vergleichbarer Aktivität von löslichen und immobilisierten Proteasomen degradiert. Folglich kann angenommen werden, dass Peptide die versiegelte Eintrittsöffnung des "Sackgassen"-Proteasoms passieren können. Grössere Substrate jedoch, wie fluoreszenzmarkiertes Casein, wurden nahe des Temperaturoptimums von seitlich immobilisierten und freien Proteasomen mit dreimal so hoher Geschwindigkeit prozessiert wie von aufrecht immobilisierten Proteasomen. Daraus kann gefolgert werden, dass eine Pore für den Substrateintritt und die Produktfreisetzung ausreichend ist. Mit anderen Worten, Pore und Vorkammer erfüllen eine dreifache Funktion beim Import und der Entfaltung von Substraten sowie dem Austritt von Produkten. Über Oberflächenplasmonresonanz konnte die exakte Substrate/Proteasomstöchiometrie zu ~1 für "Sackgassen"-Proteasomen und zu ~ 2 für seitlich immobilisierte (aktive und inaktive) Proteasomen bestimmt werden. Bedeutsamerweise ergab ein Fit mit der Hill-Gleichung positive Kooperativität für seitlich immobilisierte (Hill-Koeffizient ~2) im Gegensatz zu aufrecht immobilisierten Proteasomen (Hill-Koeffizient ~1). Also binden im Falle freier Proteasomen zwei Substrate mit positiver Kooperativität vorzugsweise in gegenüberliegenden Vorkammern. Die Dissoziationsrate von Casein als Substrat ist zweimal so hoch für das aktive seitlich immobilisierte Proteasom wie für das aufrecht immobilisierte Proteasom. Die exakte 2 : 1- Stöchiometrie der Dissoziationsraten gleicht dem Verhältnis der Austrittswege, die im Falle des seitlich immobilisierten gegenüber dem "Sackgassen"-Proteasom zugänglich sind. Folglich scheinen kleine Seitenöffnungen entlang dem zylindrischen 20 S Proteasom nicht am Austritt kleiner Produkte beteiligt zu sein. Eine inaktive Proteasommutante zeigt eine konzentrationsabhängige Dissoziationskinetik gegenüber Casein. Dergemäss nimmt die Dissoziationsrate des Zweisubstrat-Proteasomkomplexes die Hälfte des Wertes des Einsubstrat-Proteasomkomplexes an. Folglich verlassen Substrate das inaktive Proteasom wegen Blockade der trans-Seite mit einem eintretenden Substrat über ihren Eintrittsweg. So müssen die aktiven Proteasomen Substrate vor ihrer Freisetzung zu beiden Poren vollständig zu kleinen Fragmenten abbauen. Daher resultiert der prozessive Degradationsmechanismus möglicherweise aus der positiven Bindungskooperativität. Die Assoziationsratenkonstanten für Casein lassen vermuten, dass die Substratassoziation einen Zweistufenprozess darstellt, der einen geschwindigkeitsbestimmenden Translokationsschritt und einen schnellen Bindungsschritt umfasst. Da Fluoreszenz-Kreuzkorrelation aufdeckte, dass zwei Substrate im Proteasom kolokalisiert werden können und nacheinander mit steigender Affinität binden (KD,1 = 8 µM gegenüber KD,2 = 700 nM), kann ein allosterischer Übergang im Proteasom angenommen werden. Kombiniert man unsere Resultate mit den Daten anderer Forschungsgruppen, kommt man zu einem mechanistischen Modell für das 20 S Proteasom. Demgemäss unternimmt das erste Substrat einen langsamen Translokationsschritt, bindet in der Vorkammer und diffundiert danach an die katalytischen Zentren, wo es degradiert wird. Beim Anschalten der katalytischen Aktivität werden die Poren an beiden Enden aufgrund eines Konformationswechsels erweitert. So wird der Eintritt des zweiten Substrates in das Proteasom wegen Aufhebung des geschwindigkeitsbestimmenden Translokationsschrittes erleichtert. Das zweite Substrat wartet in der Vorkammer, bevor es prozessiert wird (alternierende Degradation) oder, wahrscheinlicher, es wird direkt in die Zentralkammer eingefädelt (simultane Degradation). Da entlassene Peptide mit eintretenden Proteinen um Bindung in der Vorkammer konkurrieren, werden die Poren in einem geöffneten Zustand gehalten. Nach Beendigung des Abbaus werden die Poren geschlossen, und ein neuer Degradationszyklus kann reinitiiert werden. Zusammengefasst unterliegt die Substratassoziation mit dem Proteasom einem geordneten alternierenden Bindungsmechanismus im Gegensatz zum ungeordneten Degradationsmodus. Folglich bietet der Zweitaktmotor den Vorteil, die Degradation zu beschleunigen, ohne die Komplexität zu erhöhen.