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Sven Geibel

• Zur Generierung der transmembranären elektrochemischen Ionengradienten kann in den Archaea die Protonenpumpe Bakteriorhodopsin Lichtenergie in einen aktiven, auswärtsgerichteten Protonentransport konvertieren. In Vertebraten erlaubt die Aktivität der Na+, K+-ATPase den Aufbau von Ionengradienten, indem sie unter ATP-Hydrolyse Na+-Ionen aus der Zelle und K+-Ionen in die Zelle transportiert. Die molekularen Mechanismen, die es diesen Ionenpumpen ermöglicht, primär aktiven, gerichteten Ionentransport zu bewerkstelligen sind fein abgestimmten und ortsspezifischen Konformationsänderungen. Die Untersuchung der Dynamik und der Ortsspezifität der Konformationsgleichgewichte der Na+,K+-ATPase und des Bakteriorhodopsin, sowie eines homologen bakteriellen Proteins, sind Gegenstand der vorliegenden Arbeit. Na+,K+-ATPase: Die Methode der Voltage-Clamp-Fluorometrie auf Basis zielgerichteter Fluoreszenzmarkierung erlaubte es Konformationsänderungen der Na+,K+-ATPase zeitaufgelöst und ortsspezifisch nachzuweisen und diese partiellen Reaktionen des Na+,K+-ATPase Reaktionszyklus zuzuordnen. Dazu wurden elektrophysiologische Messungen an heterolog exprimierter Na+,K+-ATPase durchgeführt, in der einzelne Cysteine in vermutlichen Reporter-Positionen im Bereich extrazellulär orientierter Schleifen eingebracht werden. Nach Fluoreszenzmarkierung mit TMRM bildete die Mutante N790C einen molekularen Sensorkomplex und reagierte auf K+-Zugabe und Spannungssprünge mit Änderungen in der Fluoreszenzintensität, welche durch Zugabe des spezifischen Na+,K+-ATPase Inhibitors Ouabain gehemmt werden konnten. Die in der vorliegenden Arbeit vorgestellten Ergebnisse erlauben - in situ unter physiologischen Bedingungen - erstmalig Einblicke in die molekularen Details der Konformationsänderungen der Na+,K+-ATPase. Bakteriorhodopsin: Spannungsklemme-Experimente an heterolog exprimiertem Bakteriorhodopsin ergaben Einblicke in die Regulation des Protonenpumpens durch das elektrochemische Membranpotential. Messungen am Wildtyp und den Mutanten D96N, D96G, F171C, F219L und der "Tripel"-Mutante BRD96G,F171C,F219L zeigten, dass das Protonenpumpen von Bakteriorhodopsin maßgeblich durch die Lebensdauer und Spannungsabhängigkeit des M-Intermediats geregelt wird und resultierten in einem Modell für die Erklärung effizienten, vektoriellen Transports auf der Grundlage fein abgestimmter Konformationsänderungen. Proteorhodopsin: Mit Hilfe zeitaufgelöster UV/VIS- und FT-IR-spektroskopischen Messungen, sowie Photostrom-Messungen an künstlichen Lipidmembranen und spannungsgeklemmten Xenopus-Oozyten - die Proteorhodopsin heterolog exprimierten - konnte gezeigt werden, dass Proteorhodopsin als eine pH-abhängige einwärts- oder auswärtsgerichtete Protonenpumpe fungieren kann. Dieses Verhalten steht im Gegensatz zu Bakteriorhodopsin, für das nur unidirektionaler Transport nachgewiesen werden konnte.