Open Access

Sebastian Gathmann

• Einleitung: Das Auftreten von Restenosen ist bei ca. 50% eine relevante Spätkomplikation bei der chirurgischen oder interventionellen Therapie von Gefäßverengungen und Gefäßverschlüssen. Intimahyperplasie (IH) und ungünstiges Gefäßremodeling (GR) stellen dabei wichtige pathogenetische Mechanismen dar, die von multiplen Faktoren beeinflusst werden. Bis heute ist es nicht gelungen, eine adäquate Therapie zur Verhinderung von Restenosen zu finden. Innerhalb der ersten 72 Stunden nach Gefäßwandverletzung wird die Entstehung der IH maßgeblich durch das Mitogen basic Fibroblast Growth Factor (bFGF) gesteuert. Photodynamische Therapie (PDT), ein Verfahren bei dem durch Lichtbestrahlung eines photosensiblen Farbstoffs Cytotoxizität und Veränderungen der extrazellulären Matrix (ECM) induziert werden, führt zur Hemmung von IH durch Inhibierung von glatten Muskelzellen (SMC) und zu einer Inaktivierung matrix-assoziierten bFGFs in-vitro. Ziel dieser Studie ist es, die Proliferation von SMC und ihre bFGF Proteinexpression nach PDT von isolierter, endothelialer ECM in-vitro zu untersuchen, um so Rückschlüsse auf den Mechanismus des Remodeling nach PDT zu ziehen. Material und Methohen: Nach einer Standardtechnik wurde in 6-Well Zellkulturplatten endotheliale ECM hergestellt. Die ECM wurde mit dem Photosensitizer Chloraluminium sulfoniertes Phthalocyanin (CASPc) inkubiert und mit rotem Licht aus einem Diodenlaser (100 J/cm², 100 mW/cm², l=675 nm) bestrahlt. Anschließend wurden SMC auf der ECM kultiviert. Nach 24, 48 bzw. 72 Stunden wurde die Zellproliferation durchflußzytometrisch festgestellt und die intrazelluläre Proteinexpression mit einem bFGF-ELISA bestimmt. Zum Vergleich wurde der Versuch mit unbehandelter ECM (KO), nur Laser-behandelter ECM (LO), nur CASPc-behandelter ECM sowie mit Zellkulturplatten ohne Matrix (PL) durchgeführt. Die Ergebnisse sind als Mittelwert ± SD in Bezug zu unbehandelter ECM (KO) angegeben. Der statistische Vergleich zwischen den einzelnen Gruppen erfolgte mit einem univariaten ANOVA. Ergebnisse: Die Proliferation der SMC war bei PDT und PL gegenüber KO zu allen Zeitpunkten signifikant gehemmt. LO und DT zeigten keine Unterschiede im Proliferationsverhalten im Vergleich zu KO. Die Konzentration von zell-assoziiertem bFGF war nach 24 Stunden bei PDT gegenüber KO signifikant erhöht. Nach 48 und 72 Stunden zeigte lediglich PL gegenüber KO noch eine signifikant erhöhte bFGF-Proteinexpression. Bei LO war im Vergleich zu KO kein Unterschied feststellbar, während bei DT nach 24 Stunden eine signifikante Erhöhung der bFGF-Proteinexpression vorhanden war. Schlussfolgerung: PDT von isolierter ECM führt zu einer Proliferationshemmung von SMC in-vitro. Dass die Proliferation der SMC nach PDT abnimmt ist für die Repopulation der Gefäßwand in-vivo günstig, scheint PDT doch die IH-verursachenden SMC zu hemmen. Die intrazelluläre bFGF-Proteinmenge ist bei PDT gegenüber KO vorübergehend erhöht. Dies könnte für eine Hemmung des Proteinausschlusses und der autokrinen Stimulation sprechen. Dass der intrazelluläre bFGF-Gehalt jedoch lediglich kurz nach PDT beeinflusst wurde, lässt vermuten, dass intrazelluläres bFGF für die anhaltende Proliferationsveränderungen der SMC nur eine untergeordnete Rolle spielt.
• Introduction: The development of restenosis is the main problem after invasive vascular interventions for the treatment of stenotic lesions. Intimal hyperplasia (IH) and unfavorable remodeling play crucial roles in the pathogenesis and are mediated by multiple factors. Up to date, there is no effective means of preventing restenosis. In the first 72h after injury of the vascular wall basic Fibroblast Growth Factor (bFGF) plays a key role for the development of IH. Photodynamic therapy (PDT), a strategy utilizing a combination of light and a photosensitive dye, causes cytotoxicity and alters the extracellular matrix (ECM). PDT prevents the formation of IH by inhibition of smooth muscle cell (SMC) proliferation, and inactivates matrix-associated bFGF in vitro. The aim of this study is to analyse SMC proliferation and bFGF expression after PDT of isolated, endothelial ECM in-vitro to draw conclusions on the mechanism underlying the remodeling after PDT. Materials and Methods: EC-derived ECM was prepared in 6-well plates in standardized technique. The ECM was incubated with the photosensitising dye chloroaluminum sulfonated phthalocyanine (CASPc) and illuminated with red light, emitted by a diode laser (l=675nm, 100mW/cm2; fluence 100J/cm2) and SMC were plated on the ECM. After 24, 48 and 72h the proliferation was quantified by means of fluorescence-labelled cell counting device and the intracellular bFGF-expression was measured with a bFGF-ELISA. Control specimens included untreated ECM (KO), ECM-free plates (PL), ECM exposed to light only (LO) and ECM exposed to CASPc only (DT). The resulting data are expressed as mean ± SD normalized on untreated ECM (KO). Statistical analyses were performed using a one-way ANOVA. Results: SMC proliferation on PDT and PL was compared to KO significantly decreased at all times as compared to KO. LO and DT did not show any differences in proliferation compared with KO. The amount of intracellular bFGF was increased on PDT after 24h. After 48h and 72h only PL showed a significantly increased bFGF-expression compared with KO. LO did not show any differences in bFGF-expression compared to KO and only on DT after 24h the amount of intracellular bFGF was increased. Conclusion: PDT of isolated ECM inhibits the proliferation of SMC. This decreased SMC proliferation may be favourable for the repopulation of the vascular wall in-vivo, because PDT seams to inhibit SMC, the effector cells responsible for IH. The bFGF-expression after PDT is temporarily increased. This may suggest that the secretion of bFGF and the autocrine stimulation of SMC is inhibited. Because the bFGF-expression is influenced only shortly after PDT, the intracellular bFGF-expression may not play a dominant role for the constant inhibition of the SMC proliferation.