Open Access

Annette Gans

• Fettsäuren haben vielfältige Funktionen im Organismus. Sie sind der wichtigste Energieträger des menschlichen Körpers. Fettsäuren sind Bestandteil menschlicher Membranen und Ausgangspunkt für die Biosynthese biologisch aktiver Substanzen. Der Abbau der Fettsäuren und deren energetische Verwertung geschieht im Mitochondrium, dem Ort der ß-Oxidation. Hierfür werden die Fettsäuren mit Hilfe des aus 3 Enzymen bestehenden Carnitin- Palmitoyltransferase-Systems aus dem Cytosol in das Mitochondrium transportiert. Dazu werden langkettige Fettsäuren durch die Acyl-CoA-Synthetase aktiviert und - an Carnitin gebunden - in das Innere der Mitochondrien geschleust. Die Carnitin-Palmitoyltransferase 1 (CPT 1) ist an der Innenseite der äußeren Mitochondrienmembran gebunden und katalysiert die Kopplung von L-Carnitin an die aktivierte Fettsäure unter Freisetzung von Coenzym A. Das so enstandene Acyl-Carnitin passiert mit Hilfe der Carnitin- Acylcarnitin-Translokase (CAC) die innere Mitochondrienmembran. An der Innenseite der mitochondrialen Innenmembran überträgt die Carnitin-Palmitoyltransferase 2 (CPT 2) den Fettsäurerest des Acyl-Carnitins auf Coenzym A, wobei Acyl-CoA und freies Carnitin entsteht. Nun schließt sich der Abbau der Fettsäuren, die ß-Oxidation an. Ziel dieser Arbeit war die Untersuchung der Carnitin-Palmitoyltransferase 1 in Entzündungszuständen und die Klärung der Frage, ob Stickstoffmonoxid (NO) einen Einfluss auf die Regulation der CPT 1 hat. Darüberhinaus wurde die Wirkung von PPAR-a (peroxisome proliferator-activated receptor-a) auf die induzierbare NO-Synthase (iNOS) und damit die Generierung von NO untersucht. Die Experimente wurden an Ratten-Mesangiumzellen durchgeführt. Interleukin 1ß stimuliert die Expression der CPT 1 auf mRNA und Protein-Ebene. In Kombination mit Palmitat und Carnitin konnte die Expression der CPT 1 signifikant gesteigert werden. Es konnte gezeigt werden, dass NO ein potenter Stimulator der Carnitin-Palmitoyltransferase 1 ist. Mesangiumzellen, die mit NO und IL-1ß kombiniert stimuliert wurden, zeigten bereits nach 2 Stunden eine Reduktion der Expression auf das Niveau der unstimulierten Kontrolle. IL-1ß und L-NG-Monomethyl- Arginin (L-NMMA), ein spezifischer Inhibitor der induzierbaren NO-Synthase erhöhen die CPT-1 Expression. In einem Tiermodell des hämorrhagischen Schocks wurde die CPT 1 mRNA Expression signifikant reprimiert, die Gabe eines iNOS-Inhibitors konnte diese Herunterregulierung wieder aufheben. Stickstoffmonoxid spielt eine sehr wichtige Rolle bei Entzündungsreaktionen. Die induzierbare NO-Synthase ist das verantwortliche Enzym für die Produktion von großen Mengen NO. Die NO-Synthase (NOS) katalysiert die Umsetzung von L-Arginin unter Sauerstoffverbrauch in Citrullin unter Entstehung von NO. Der Mechanismus , der für einen verzögerten Beginn der Transkription von vier Stunden mit darauf folgender mehr als 24-stündiger immenser mRNA Synthese. nach einer Zytokinstimulation verantwortlich ist, ist noch nicht verstanden. Der Untersuchung dieser verzögerten und anhaltenden iNOS Expression lag die Hypothese zugrunde, dass die Zytokin-induzierte iNOS Transkription zuerst durch NFkB und C/EBP Transkriptionsfaktoren ausgelöst und anschließend durch andere Mediatoren verlängert und verstärkt wird. Zur Identifizierung möglicher regulatorischer Elemente wurden 4,5 kb der 5' flankierenden Region des iNOS Promotors aufwärts des Transkriptionsstarts kloniert. Mittels Analyse der DNase 1 hypersensitiven Bereiche der 5'Region des iNOS Gens konnten zwei hypersensitive Stellen identifiziert werden (DHS1: 1300bp; DHS2: 3000bp). Beide Stellen enthalten putative PPAR-Bindestellen. Zur weiteren Untersuchung wurde die Wirkung des PPAR-a auf die iNOS analysiert. Dabei konnte gezeigt werden, dass der PPAR-a Agonist Wy 14643 in Kombination mit IL-1ß in der Lage ist sowohl Aktivität, Protein als auch die mRNA der iNOS zu steigern. Transfektionsexperimente mit deletierten und mutierten iNOS Promotorfragmenten zeigten, dass DHS1 das für die Stimulation verantwortliche DNA Fragment enthält. Mittels Elektrophoretic-Mobility-Shift-Assay konnte gezeigt werden, dass der PPAR-a Agonist Wy 14643 die Bindung des PPA-Rezeptors an DHS1 verstärkt.
• Fatty acids have diverse functions in the organism. They are the most important source of energy of the human body. Fatty acids are components of human membranes and they initiate the biosynthase of biologically active substances. The decomposition of fatty acids and their energetic utilization takes place in the mitochondrium, the place of ß-oxidation. For this process the fatty acids are transported from the cytosol into the mitochondrium with the help of the carnitin Carnitine-palmitoyltransferase (CPT) system. During this process the long-chained fatty acids are activated by acyl-CoA-Synthetase and - linked to carnitine - transported into the inner mitochondrial membrane. Carnitine-palmitoyltransferase 1 (CPT 1) is linked to the outer mitochondrial membrane and catalyses the attachment of L-carnitine to the activated fatty acid while setting free the Coencime A. The new acylcarnitine molecule is transported into the mitochondria by the acylcarnitine translocase (CAC) in exchange for carnitine. Carnitine-palmitoyltransferase 2 (CPT 2) transfers the rest of the fatty acids of the acylcarnitine onto the CoA generating free carnitine. After that the ß-oxidation follows. The aim of this work was to investigate the Canitine-palmitoyltransferase 1 on inflammatory situations and to answer the question, if nitric oxide (NO) influences the regulation of CPT 1. Furthermore, the effect of PPAR-a (peroxisome proliferatoractivated receptor-a) on the inducible NO-synthase (iNOS) was investigated and with this the formation of NO. The experiments were done with mesangial cells of rats. Interleukin 1ß stimulates the expression of CPT 1 on the mRNA and protein level. Palmitate and carnitine together can significantly increase the expression of CPT 1. The results have shown that NO is an potent stimulator of Carnitinpalmitoyltransferase 1. Mesangial cells which had been stimulated with NO and IL-1ß showed a reduction of the expression of CPT 1 on (unstimulated) controll niveau already after 2 hours. IL-1ß and L-NG-Monomethyl-Arginine (L-NMMA), a specific inhibitor of the inducible NO-synthase, increase the CPT 1 expression. For in vivo relevance I made experiments in an animal modell of haemorrhagic shock, where the CPT 1 mRNA expression was significantly repressed. The addition of an iNOS-inhibitor could reverse this downregulation. Nitric oxide plays a very important role in inflammatory reactions. The inducible NO-synthase is the encime responsible for the production of great amounts of NO. The NO-synthase (NOS) catalyses the change of L-arginine into citrulline using oxygen and generating NO. We still do not understand the mechanism that is responsible for a four-hour delay of the beginning of the transcription followed by an immense twentyfour-hour lasting mRNA synthesis and after a cytocin stimulation. The investigation of this delayed and permanent iNOS expression was based on the assumption that at first the cytokin induced iNOS transcription is triggered off by NFkB and C/EBP transcriptional factors and then being extended and enhanced by other mediators. To identify possible regulatory DNA elements, 4,5 kb of the 5'flanking region of the iNOS promoter has been cloned alongside the start of the transcription in an upwardly direction. By analysing of the the Dnase 1-hypersensitive areas of the 5'region of the iNOS gene two hypersensitive parts could be identified (DHS1: 1300 bp; DHS2: 3000 bp). Both regions contain putative binding sites for the peroxisome proliferator-activated receptor (PPAR). For further investigation the effect of different PPAR-a agonists on iNOS expression were analysed. It was possible to prove that the PPAR-a agonist Wy 14643 in combination with IL-1ß is able to increase its activity, protein and, as well, the mRNA of iNOS. Transfectional experiments with deleted or mutated iNOS promotor fragments showed that DHS1 contains the DNA fragment responsible for the stimulation. Using electrophoretic mobility shift assay proved that the PPAR-a agonist Wy 14643 enhances the link of the PPA-Receptor onto DHS1.