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Gabriela Schäfer

• In dieser Arbeit wurden zwei Systeme der biologischen Energiewandlung mit verschiedenen spektroskopischen Methoden untersucht und es wurden neue Erkenntnisse über die Funktion und Aktivierung der Proteine Proteorhodopsin und RuBisCO gewonnen. Zusätzlich konnte eine neue methodische Herangehensweise zur Untersuchung von Carboxylierungsreaktionen etabliert werden. Dieser Ansatz bietet in Zukunft breite Anwendungsmöglichkeiten zur Studie dieser biologisch so bedeutenden Reaktionsklasse. Mit Hilfe der Infrarotspektroskopie und vor allem durch den Einsatz von Tieftemperaturmessungen konnte der bisher kontrovers diskutierte Photozyklus von Proteorhodopsin (PR) eingehend charakterisiert werden. Jenseits des gut verstandenen aktiven Transports bei pH 9,0 wurde vor allem der pH 5,1 Photozyklus untersucht. Erstmals konnte auch in Infrarotspektren das M-Intermediat bei pH 5,1 nachgewiesen werden. Dieses Intermediat ist von entscheidender Bedeutung für den aktiven Transport über die Zellmembran und seine Existenz wurde bisher vielfach angezweifelt. Zudem konnte Glu-108 als ein möglicher Protonenakzeptor des Photozyklus bei pH 5,1 identifiziert werden. Durch einen pH-Indikator ließ sich der Nachweis erbringen, dass auch im sauren pH-Bereich Protonen freigesetzt werden. Damit steht fest, dass ein aktiver Protonentransport bei pH 5,1 möglich ist. Zusammen mit Informationen zu protonierbaren Aminosäureseitenketten (vornehmlich Asp und Glu) lässt sich zudem mit Einschränkungen die These unterstützen, dass PR ober- und unterhalb des pKa-Werts von Asp-97 in verschiedene Richtungen Protonen pumpt. Damit ergibt sich ein differenziertes Bild für den pH-abhängigen Photozyklus von PR mit drei pH-Bereichen (pH 9,0, 8,5 bis 5,5 und 5,1) in denen PR unterschiedliche Protonentransportwege zeigt. Als weiteres biologischen System wurde RuBisCO genauer untersucht. Im Fokus der Arbeit war dabei die Aktivierung durch die Bildung eines Lysin-Carbamats im aktiven Zentrum. Obwohl RuBisCO das am häufigsten vorkommende Enzym unseres Planeten ist, in der Kohlenstofffixierung eine bedeutende Rolle spielt und obwohl mehrere Dutzend Kristallstrukturen existieren, gibt es noch immer genügend offene Fragen zur Aktivierung. Mit Hilfe eines Käfig-CO2 konnte die Carbamatbildung im Enzym direkt verfolgt und der Einfluss von Magnesiumionen auf die Aktivierung beobachtet werden. Damit ließ sich ganz klar ausschließen, dass Magnesium bereits für die Carbamatbildung erforderlich ist. Die Koordination von Mg2+ ist erst für die Endiol-Bildung im weiteren Reaktionszyklus essentiell. Zusätzlich wurde gezeigt, dass Azid eine Inhibierung des Enzyms durch die Konkurrenz mit CO2 um die Bindungsstelle auslöst, allerdings verdrängt CO2 das Azidion im Laufe der Zeit. Mit den Ergebnissen für RuBisCO konnte klar gezeigt werden, dass die Kombination aus Käfig-CO2 und Rapid-Scan IR-Spektroskopie ein völlig neues Feld für die Untersuchung von Carboxylierungsreaktionen eröffnet. Gerade die offenen Fragen zu Biotin bindenden Carboxylasen bieten ein breites Anwendungsgebiet für diese Methodik.
• In this work two enzymatic systems, which are part of the engergy generating pathway of our ecosystem, were investigated using spectroscopic techniques. New insights into the function of Proteorhodopsin and the activation process of Ribulose-1,5-bisphosphate-carboxylase/oxygenase have been gained. In addition, a new approach for studying carboxylation reactions could be established and will be applyable for a broad range of problems. The first part of this work concerns low-temperature IR-Studies of the PR photocycle at different pH-values. Whereas the pH 9,0 photocycle ist well understood, the low pH photocycle is still controversly discussed and was therefore analyzed in detail. For the first time, the M-intermediate at low pH could be identified in IR difference spectra at pH 5,0. This intermediate is crucial for the active proton transport over the cell membrane and its existence is still disputed. Furthermore, Glu-108 has been identified as a possible substitute for the proton acceptor Asp-97 at low pH. An intrinsic pH-sensor proved that there is a proton release in the M-intermediate at pH 5,0. In combination with the observation of two Asp or Glu involved in the photocycle, an active proton transport becomes likely. The position of the probable candidates for the involved Asp/Glu residuen furthers the proposal of a bidirectional proton pumping above and below the pKa-value of Asp-97. The conclusion from the IR measurements hint at a tripartite function of PR depending on the pH. For pH 9,0, pH 5,5 to 8,5 and pH 5,1 a different behavior for the proton transport could be observed. The second part of this work focused on the creation of a new approach for the study of carboxylation reactions and its application on RuBisCO. The activation of this enzyme is poorly understood, despite the fact that RuBisCO is the most abundant enzyme on the planet. It catalyzes the first step in the carbon dioxide fixation und has been crystallized from various organisms. Nevertheless, the carbamate formation with an active side lysine as first step in its catalytic circle is still not fully understood. The activation process could be directly observed, using a caged carbon dioxide in combination with rapid-scan IR spectroscopy. The results indicate that Mg2+ is not a necessary part of the carbamate formation, although it is later needed for the substrate binding. In addition, it became apparent, that azide (isoelectric to CO2) is able to block the active side, but it can slowly be replaced by CO2. These findings promote our understanding of RuBisCO and prove that the combination of caged-CO2 with IR spectrocopy presents a succesful approach to the study of carboxylation reactions. In the future it can be applied to studies on the protein family of biotin binding carboxylases.