Open Access

Susanne Mükusch

• Glioblastoma is the most common and most aggressive type of brain tumor in adults. In contrast to epithelial cancers, glioblastomas do not metastasize. While the major treatment challenge in epithelial cancers is not the primary tumor but metastasis, glioblastoma patients die of the primary tumor. However, there is a common theme which underlies the malignant properties of progressed epithelial cancers and glioblastoma: invasion from the primary tumor into the surrounding tissue. In the case of epithelial cancers this is the first and necessary step to metastasis, whereas invasion leads inevitably to tumor recurrence after resection in the case of glioblastoma, causing it to be incurable. A cellular program which has been described in detail to promote the invasive phenotype in epithelial tumors, is the epithelial-mesenchymal-transition (EMT). Differentiated neural cells are not epithelial, thus, strictly speaking, EMT does not occur in glioblastoma. However, the traits acquired in the process of EMT, especially invasiveness and stemness, are highly relevant to glioblastoma. One of the key transcription factors known to induce EMT in epithelial cancers is ZEB1, which has been described only marginally in the central nervous system so far. Here, I investigate the expression and function of ZEB1 in glioblastoma and during human fetal neural development. ZEB1 mRNA was significantly upregulated in all histological types of glioma, including glioblastoma, when compared to normal brain. There was no correlation between ZEB1 mRNA levels and tumor grade. Immunohistochemical staining of glioma samples demonstrated that ZEB1 was highly expressed in the great majority of tumor cells. In the developing human brain, intense staining for ZEB1 could be observed in the ventricular and subventricular zone, where stem- and progenitor cells reside. ZEB1 positive cells included cells stained with stem- and progenitor markers like PAX6, GFAP and Nestin. In contrast, ZEB1 was never found in early neuronal cells as identified by TUBB3 staining. To gain insight into ZEB1 function I generated a human fetal neural stem cell line and a glioblastoma cell line with ZEB1 knockdown, which were compared with their respective control cell lines. First, I found that ZEB1 does not regulate the micro RNA 200 family in either cell line, which has been described as an essential ZEB1 target in epithelial cancers. Second, regulated target genes were identified with a genome wide microarray. The third approach was to directly identify genomic binding sites of ZEB1 by chromatin immunoprecipitation sequencing (ChIP-seq). All three approaches showed that the ZEB1 transcriptional program is surprisingly similar in the neural stem cell line and the glioblastoma cell line. In contrast, it bears only little resemblance to the program described in epithelial cancers. The most interesting, previously unrecognized ZEB1 target gene identified in this study is integrin b1. It was regulated after ZEB1 knockdown detected by microarray analysis, and has a ZEB1 binding site in its promoter region detected by ChIP-seq. Finally, I addressed the question whether ZEB1 influences tumor growth and invasiveness in a glioblastoma model. After intracranial xenotransplantation in mice, ZEB1 knockdown glioblastoma cells formed significantly smaller and less invasive tumors than control glioblastoma cells. This study demonstrates that ZEB1 is widely expressed in glioma and relevant for glioblastoma growth and invasion. In contrast to what is known about ZEB1 function in epithelial cancers, ZEB1 is not associated with glioma progression, but instead seems to be an early and necessary event in tumorigenesis. Also with regard to ZEB1 target genes, ZEB1 functions differently in glioblastoma than in epithelial cancers. The two most important ZEB1 targets in epithelial cancers are E-cadherin and the miR-200 family members. Both are not relevant to ZEB1 function in glioblastoma. Interestingly, while the ZEB1 transcriptional program is different from the one described in epithelial cancers, it is highly similar in glioblastoma cells and fetal neural stem cells. This suggests that an embryonic pathway restricted to stem- and progenitor cells during development is reactivated in glioblastoma. Previously known ZEB1 target genes were tissue specific and therefore seemed unlikely to mediate ZEB1 function in the central nervous system. However, the newly identified ZEB1 target gene integrin b1 is well known to play pivotal roles in both glioblastoma tumorigenesis and invasion as well as in neural stem cells. Additionally, integrin b1 is widely expressed and seems a likely ZEB1 target in other organs than the brain. Taken together, I demonstrate that ZEB1 is a new regulator of glioblastoma growth and invasion. The transcriptional program of ZEB1 differs from the one in epithelial cancers but is strikingly similar to the one in neural stem cells. The newly identified ZEB1 target gene integrin b1 is likely to mediate crucial ZEB1 functios. Thus, this study identifies ZEB1 as a yet unrecognized player in glioblastoma and neural development. Furthermore, it sets the stage for more research which will help to deepen our understanding of ZEB1 function in the central nervous system and beyond.
• Glioblastoma multiforme, auch kurz Glioblastom genannt, ist der häufigste und aggressivste Hirntumor bei Erwachsenen. Wie auch andere Hirntumore unterscheiden sich Glioblastome sehr von der Gruppe der weit häufiger auftretenden epithelialen Tumore, sogenannter Karzinome. Karzinome umfassen die häufigsten Krebsarten wie zum Beispiel Brust-, Prostata-, Darm- und Lungenkrebs. Einer der wichtigsten Unterschiede zwischen Karzinomen und Glioblastomen ist die Metastasierung: Während Karzinome vor allem durch die Bildung von Metastasen voranschreiten und schließlich den Tod des Patienten herbeiführen, metastasieren Glioblastome nicht. Sie verbleiben im Gehirn und schädigen die Patienten durch Zerstörung des Gehirngewebes, sodass diese nach einer medialen Überlebenszeit von nur zwölf Monaten nach der initialen Diagnose versterben. Obwohl Glioblastome nicht metastasieren, haben sie dennoch eines mit malignen Karzinomen gemeinsam: Die Infiltration einzelner Tumorzellen in das gesunde Gewebe. Während bei Karzinomen diese Infiltration den ersten Schritt zur Metastasierung darstellt, ist bei Glioblastomen die Infiltration selbst die therapeutische Herausforderung. Durch diese Streuung von Tumorzellen innerhalb des Gehirns ist eine vollständige Resektion des Tumors unmöglich. Dies führt dazu, dass der Tumor stets wiederkehrt und der Patient unausweichlich an den Folgen verstirbt. Die Infiltration in das umliegende Gewebe wurde bei Karzinomen ausführlich erforscht und ein zelluläres Programm identifiziert, dass dabei die treibende Kraft ist: Epitheliale Mesenchymale Transition (EMT). Unter EMT versteht man die phänotypische Veränderung von einer Zelle mit epithelialen Eigenschaften zu einer Zelle mit mesenchymalen Eigenschaften. Epitheliale Eigenschaften beinhalten, dass die Zelle stationär ist, an anderen Zellen über Zell-Zell-Verbindungen verankert ist und eine Polarität aufweist,das heißt, dass bestimmte Proteine sich entweder auf der apikalen oder basalen Seite der Zelle befinden. Dahingegen beinhalten mesenchymale Eigenschaften, dass die Zelle mobil ist, keine Zell-Zell-Verbindungen aufweist und auch nicht länger polar ist. Diese phänotypischen Veränderungen der EMT werden von einer Reihe von Transkriptionsfaktoren gesteuert, die epitheliale Genexpression unterbinden und mesenchymale Genexpression fördern. Neben altbekannten Vertretern dieser Transkriptionsfaktoren, wie zum Beispiel Twist und Snail, wurde auch ZEB1 als ein EMT induzierender Transkriptionsfaktor erkannt, der ausreichend ist um EMT in Karzinomzelllinien herbeizuführen. In Tumormodellen wurde gezeigt, dass ZEB1 nicht nur für die Invasivität von Karzinomen notwendig ist, sondern auch für das Tumorwachstum. Die wichtigsten identifizierten Zielgene von ZEB1 sind dabei epitheliales Cadherin (E-Cadherin), ein Bestandteil von Zellzellverbindungen, und eine Gruppe von micro RNAs, der miR-200 Familie. Durch die Repression der miR-200 Familie, die ihrerseits wieder die Expression vielfältiger Zielgene reprimiert, fördert ZEB1 indirekt die Expression der miR-200 Zielgene. Diese indirekt regulierten Gene umfassen Stammzellgene, wie zum Beispiel BMI1 und SOX2, oder Komponenten des Notch Signalwegs, deren Rollen nicht auf EMT beschränkt sind. Eine EMT im eigentlichen Sinne findet im Glioblastom nicht statt, da neurale Zellen im allgemeinen und damit auch die Ausgangszellen des Glioblastoms keine epithelialen Eigenschaften aufweisen. Dennoch sind die mit einer EMT einhergehenden phänotypischen Veränderungen, insbesondere die Fähigkeit zur Migration und Invasion in umliegendes Gewebe, von hoher Relevanz für die Erkrankung Glioblastom. Zusätzlich berichten einige wenige Veröffentlichungen, dass ZEB1 während der murinen neuralen Entwicklung in hohem Maße von Stamm- und Progenitorzellen exprimiert wird. Auch in anderen Geweben, zum Beispiel Muskel und Keratinozyten wurde ZEB1 Expression mit unreifen Zellen in Verbindung gebracht. Über die Expression oder Funktion von ZEB1 im fötalen oder adulten humanen zentralen Nervensystem oder Gehirntumoren ist nichts bekannt. Zusammen mit der allgemein bekannten Beobachtung, dass in Tumoren häufig in der embryonalen Entwicklung aktive Signalwege reaktiviert werden, ergab sich die Fragestellung meiner Arbeit: Spielt ZEB1 eine Rolle in Glioblastomen und der humanen neuralen Entwicklung und wenn ja, welche? Welche Unterschiede oder Gemeinsamkeiten weisen die Funktionen von ZEB1 in beiden Fällen auf?...