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Kyriaki Glynou

• Plants are colonized by a large diversity of fungi, some residing on the surface and others penetrating the plant tissues, the latter referred to as fungal endophytes (endon Gr., within; phyton, plant; de Bary 1879). Despite the saprotrophic potential of fungal endophytes, they are not found to cause visible disease symptoms to the host. Plants are colonized simultaneously by various fungal species, which form rich and diverse endophytic assemblages. Although it is hypothesized that fungal endophytes contribute to the fitness of their hosts and to the functioning of ecosystems, the ecological function of fungal endophytic assemblages remains cryptic. The aims of this doctoral thesis are to gain insight to the ecological functions of root fungal endophytes, by deciphering their roles in ecosystems based on their natural occurrence and the structure of their assemblages. The thesis focuses on studying the diversity and structure of the endophytic mycobiome within roots of two annual and widespread plant hosts Microthlapsi perfoliatum and M. erraticum (Brassicaceae) in several locations across northern Mediterranean and central Europe. The thesis is composed by six Chapters, with a primary focus on Chapter 1, 2 and 3. Chapter 1 (Glynou et al., 2016) aimed at characterizing the diversity of fungal endophytes in roots at a continental scale and at assessing the factors affecting the structure of endophytic assemblages with the use of cultivation-based methods. For that, root samples were collected from 52 plant populations, along with a collection of soil, bioclimatic, geographic and host data. Cultivation of surface-sterilized root samples on culture media and isolation of fungal colonies in pure culture generated 1,998 fungal colonies. Grouping of sequences into Operational Taxonomic Units (OTUs), based on the 97% similarity of the isolates’ rDNA Internal Transcribed Spacer (ITS) sequence, generated in total 296 OTUs, representing taxa mostly within the phylum Ascomycota with a minor representation of Basidiomycota. Endophytic assemblages were mostly correlated with variation in bioclimatic conditions. Interestingly, despite the large diversity revealed, the assemblages were dominated by only six OTUs related to the orders Hypocreales, Pleosporales and Helotiales, which had a widespread distribution across populations but with some following patterns of ecological preferences. Chapter 2 aimed at characterizing the uncultivable fraction of the root fungal endophytic diversity, which was not possible to capture in Chapter 1. High-throughput sequencing via the Illumina Miseq platform was implemented in 43 of the 52 original populations and mostly in the same root samples. In comparison with the cultivation-based approach, the HTS managed to cover the overall diversity within samples. It revealed a large non-cultivated endophytic diversity but the same cultivable fungi dominated assemblages. Moreover, the endophytic diversity was grouped mostly within fungal orders with demonstrated ability to grow in culture and taxonomically related groups were found to have divergent ecological preferences. The genetic identity of the most abundant OTUs was further investigated in Chapter 3 (Glynou et al., 2017), aiming to unravel genotypic variability, which was possibly overlooked due to the use of lTS, as a universal genetic marker, and could explain their high abundance and widespread distribution. Multi-locus gene sequencing and AFLP profiling for the five most abundant OTUs suggested a low within-OTU genetic variability and show that these fungi have ubiquitous distribution and are not limited by environmental conditions within the ecological ranges of the study. A selection of endophytes frequently isolated in Chapter 1 was functionally characterized in Chapter 4 (Kia et al., 2017) based on the isolates’ traits and interactions with plants. In Chapter 5 (Cheikh-Ali et al., 2015) fungal cultures of Exophiala sp. with differential colony structure where investigated for their production of secondary metabolites. Moreover, Chapter 6 (Maciá-Vicente et al., 2016) comprises the description of the new species Exophiala radicis based on morphological and molecular characteristics. Compilation of all results shows that the fungal endophytic diversity in roots of Microthlaspi spp. is high but few widespread OTUs dominate the assemblages, and have unlimited dispersal ability. These fungi seem also to have a wide niche breadth and are not affected by environmental filtering. The findings indicate that the local environment but also processes of competitive exclusion determine the structure of endophytic assemblages. In addition, the fungal endophytes associated with Microthlapsi spp. likely have saprotrophic activity however the interactions with plants are likely context-dependent. Further research is needed to assess the biotic interactions among endophytes and their effect on the structure of fungal endophytic assemblages. Ultimately, the findings of this thesis are useful to shed light on the processes underlying the structure of endophytic assemblages. They also upraise the need to describe diversity by combining genetic, metabolic and physiological data, in order to disentangle the elusive ecological roles of the endophytic mycobiome.
• Pflanzen sind von einer großen Vielfalt von Pilzen besiedelt, von denen einige auf der Oberfläche und andere im Pflanzeninneren leben. Die letzteren werden Endophyten genannt, basierend auf ihrer Fähigkeit, das Innere des pflanzlichen Gewebes zu besiedeln (endon Gr., innerhalb; Phyton, Pflanze; de Bary 1879). Endophyten stellen eine vielfältige und allgegenwärtige Gruppe von Pilzen dar. Trotz des saprotrophen und pathogenen Potenzials von Endophyten verursachen sie keine sichtbaren Krankheitssymptome an Pflanzen, jedoch ist ihre Interaktionen mit Pflanzen noch nicht richtig verstanden. Eine große Vielfalt von endophytischen Pilzen wurde anhand kultivierungsbasierter Methoden dokumentiert. Bei diesen Pilzen handelt es sich meist um verschiedene Arten innerhalb der Abteilung Ascomycota. Basidiomycota sind unter den Endophyten seltener vertreten und werden häufig in holzigen Pflanzen gefunden. Es ist auch bekannt, dass die Vielfalt von endophytischen Pilzen zwischen verschiedenen Pflanzengeweben variiert und von deren Organanatomie und -chemie abhängt. Allerdings ist die Beschreibung der gesamten endophytischen Pilzvielfalt durch die Unkultivierbarkeit vieler Pilzarten eingeschränkt. Die Implementierung der Hochdurchsatz-Sequenzierung hat gezeigt, dass die Pilzvielfalt viel größer ist als bisher angenommen. Auch scheint es, dass das Mykobiom der Pflanzen eine Quelle unerforschter Vielfalt ist. Es wurde gezeigt, dass viele verschiedene Pilzendophyten eine Pflanze gleichzeitig kolonisieren. Sie bilden artenreiche und vielfältige endophytische Gesellschaften, aber es ist noch unklar welche ökologischen Faktoren prägen die Zusammensetzung und auf welche Weise. Mehrere Studien zeigen, dass das pflanzenassoziierte Mykobiom von verschiedenen ökologischen Faktoren bestimmt wird, wie räumliche Variablen, Wirtsgenotyp und bioklimatische Gegebenheiten. Allerdings lassen neue Studien vermuten, dass auch stochastische Prozesse, die sich auf die Ausbreitungsbeschränkungen und die historische Kontingenz beziehen, die Artenzusammensetzung beeinflussen können. Diese Diskrepanz wird durch die Schwierigkeit erhöht, das Verbreitungsgebiet von Pilzen zu definieren. Es wird vermutet, dass Pilze, die zur Gruppe der Mikroorganismen gehören, aufgrund ihrer mikroskopischen Größe und zahlreiche Sporen eine ubiquitäre Verbreitung erreichen und nur durch Filterungsprozesse in der Umwelt begrenzt sind. Doch jüngste Ergebnisse weisen auf eine hohe endemische Verbreitung von Mikroorganismen hin. Wegen der großen Vielfalt an Pilzendophyten ist es schwierig, die Interaktionsmuster mit Pflanzen und ihre ökologischen Funktionen aufzuklären. Untersuchungen über die Auswirkungen einzelner Endophyten auf Pflanzen unter Stressbedingungen haben gezeigt, dass sie positive Wirkungen auf die Pflanzen haben und diese vor Umweltbelastung schützen. Mehrere Studien berichten jedoch über schädliche Wirkungen von Endophyten auf Pflanzen. Es wird daher vermutet, dass diese Interaktionen einem ausgeglichenen Antagonismus zwischen Endophyten und Pflanzen unterliegen, was bei Änderung der ökologischen Bedingungen zu negativen Auswirkungen auf Seite der Pflanzen oder der Endophyten führen kann. Darüber hinaus sind Pilzendophyten wahrscheinlich wichtig für das Ökosystem, da sie die Zusammensetzung der unter- und oberirdischen Mikrobiom bestimmen. Zusätzlich tragen sie wahrscheinlich eine entscheidende Rolle bei zum Nährstofftransport im Boden und entsprechend auch an der Ökosystemfunktion, jedoch sind die Zusammenhänge noch unklar. Das Ziel dieser Dissertation ist einen Einblick in die ökologischen Funktionen von endophytischen Pilzen der Wurzel anhand ihres natürlichen Vorkommens und ihrer Artenzusammensetzung zu geben. Die Arbeit konzentriert sich auf das Studium der Vielfalt und der Struktur des endophytischen Mykobioms innerhalb der Wurzeln von den zwei einjährigen und weitverbreiteten Pflanzen Microthlapsi perfoliatum und M. erraticum. Die Wurzelproben wurden innerhalb einer Studie erhoben, welche im Frühjahr und Sommer 2013 im nördlichen Mittelmeerraum und Mitteleuropa durchgeführt wurde und sich über sieben Länder erstreckt. Die Pflanzen sind der Familie der Brassicaceae zugeordnet und gehörten früher beide zu der Art M. perfoliatum, vor kurzem wurden die Arten jedoch getrennt. Diese Pflanzenarten sind weit verbreitet, daher eignen sie sich sehr gut für ökologische Studien da sie ein breites Spektrum an ökologischen Bedingungen abdecken. Darüber hinaus sind diese Pflanzen gut dazu geeignet, Symbiosen mit Endophyten in Abwesenheit von mykorrhizalen Symbiosen zu untersuchen. In dieser Promotion wird ausschließlich auf das endophytische Mykobiom der Wurzeln eingegangen, denn obwohl die Wurzel ein lebenswichtiges Organ für die Ernährung von Pflanzen darstellt, ist das mit den Wurzeln assoziierte Mykobiom im Vergleich zum Blatt-Mykobiom wenig untersucht. ...