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Kauê Machado Costa

• Inhibition of midbrain dopamine (DA) neurons codes for negative reward prediction errors, and causally affects conditioning learning. DA neurons located in the ventral tegmental area (VTA) display two-fold longer rebound delays from hyperpolarizing inhibition in comparison to those in the substantia nigra (SN). This difference has been linked to the slow inactivation of Kv4.3-mediated A-type currents (IA). One known suppressor of Kv4.3 inactivation is a splice variant of potassium channel interacting protein 4 (KChIP4), KChIP4a, which has a unique potassium channel inactivation suppressor domain (KISD) that is coded within exon 3 of the KChIP4 gene. Previous ex vivo experiments from our lab showed that the constitutive knockout of KChIP4 (KChIP4 KO) removes the slow inactivation of IA in VTA DA neurons, with marginal effects on SN DA neurons. KChIP4 KO also increased firing pauses in response to phasic hyperpolarization in these neurons. Here I show, using extracellular recordings combined with juxtacellular labeling in anesthetized mice, that KChIP4 KO also selectively changes the number and duration spontaneous firing pauses by VTA DA neurons in vivo. Pauses were quantified with two different statistical methods, including one developed in house. No other firing parameter was affected, including mean frequency and bursting, and the activity of SN DA neurons was untouched, suggesting that KChIP4 gene products have a highly specific effect on VTA DA neuron responses to inhibitory input. Following up on this result, I developed a new mouse line (KChIP4 Ex3d) where the KISD-coding exon 3 of KChIP4 is selectively excised by cre-recombinase expressed under the dopamine transporter (DAT) promoter, therefore disrupting the expression of KChIP4a only in midbrain DA neurons. I show that these mice have a highly selective behavioral phenotype, displaying a drastic acceleration in extinction learning, but no changes in acquisition learning, in comparison to control littermates. Computational fitting of the behavioral data with a modified Rescorla-Wagner model confirmed that this phenotype is congruent with a selective increase in learning from negative prediction errors. KChIP4 Ex3d also had normal open field exploration, novel object preference, hole board exploration and spontaneous alternation in a plus maze, indicating that exploratory drive, responses to novelty, anxiety, locomotion and working memory were not affected by the genetic manipulation. Furthermore semi-quantitative IHC revealed that KChIP4 Ex3d mice have increased Kv4.3 expression in TH+ neurons, suggesting that the absence of KChIP4a increases the binding of other KChIP variants, which known to increase surface expression of Kv4 channels. Furthermore, in the course of my experimental study I identified that the most used mouse line where cre-recombinase is expressed under the DAT promoter (DAT-cre KI) has a different behavioral phenotype during conditioning in relation to WT littermate controls. These animals displayed increased responding during the initial trials of acquisition and delayed response latency extinction, consistent with an increase in motivation, which is in line with a decrease in DAT function. I propose a working model where the disruption of KChIP4a expression in DA neurons leads to an increase in binding of other KChIP variants to Kv4.3 subunits, promoting their increased surface expression and increasing IA current density; this then increases firing pauses in response to synaptic inhibition, which in behaving animals translates to an increase in negative prediction error-based learning.
• Die Inhibierung von dopaminergen (DA) Mittelhirn-Neuronen kodiert einen negativen Belohnungserwartungsfehler und beeinflusst das konditionelle Lernen. DA Neuronen in ventralen Tegmentalen Regionen (VTA) zeigen im Vergleich zu denen in der Substantia Nigra (SN) zweifach längere Rebound-Verzögerungen nach Hyperpolarisierungsinhibition. Dieser Unterschied wurde mit der langsamen Inaktivierung von Kv4.3-vermittelten A-Typ-Strömen (IA) in Verbindung gebracht. Ein bekannter Suppressor der Kv4.3-Inaktivierung ist die Spleißvariante des Kaliumkanal-Wechselwirkungsproteins 4 (KChIP4), KChIP4a, das eine einzigartige Kaliumkanalinaktivierungs-Suppressordomäne (KISD) aufweist, die durch das Exons 3 des KChIP4-Gens (KCNIP4) kodiert ist. Vorangegangene Ex-vivo-Experimente aus unserem Labor zeigten, dass das konstitutive Knockout von KChIP4 (KChIP4 KO) die langsame Inaktivierung von IA in DA-Neuronen der VTA aufhebt mit marginalen Auswirkungen auf SN-DA-Neuronen. KChIP4 KO erhöhte auch die Aktivitätspausen als Reaktion auf phasische Hyperpolarisation in diesen Neuronen. Hier zeige ich unter Verwendung extrazellulärer Aufnahmen, kombiniert mit einer juxtazellulären Markierung bei anästhesierten Mäusen, dass KChIP4 KO auch selektiv die Anzahl und Dauer spontaner Aktivitätspausen durch VTA DA-Neuronen in vivo verändert. Die Pausen wurden mit zwei verschiedenen statistischen Methoden quantifiziert, darunter eine die in unseren Labor etabliert wurde. Kein anderer Aktivitätsparameter wird beeinflußt, einschließlich der Durchschnittsfrequenz und der schnellen phasischen Entladungen (sog. Bursts). Auch die Aktivität der SN DA-Neuronen bleibt unangetastet, was darauf hindeutet, daß KChIP4-Genprodukte einen spezifischen Effekt auf VTA-DA-Neuron haben, welche für den inhibitorischen Input verantwortlich sind. Im Anschluss an diese Ergebnisse charakterisierte ich eine neue Mauslinie (KChIP4 Ex3d), in der das KISD-kodierende Exon 3 von KChIP4 selektiv durch eine Cre-Rekombinase unter Kontrolle des Dopamin-Transporter (DAT)-Promotors herausgeschnitten wurde. Somit wurde das Exon 3 nur in dopaminergen Mittelhirn Neuronen eliminiert. Ich zeigte, dass dieses Mausmodell einen hochselektiven Verhaltensphänotyp aufweist, der sich in einer drastischen und selektiven Beschleunigung des Extinktionslernen zeigt. Der zeitliche Verlauf der Verhaltensdaten wurde erfolgreich durch ein modifiziertes Rescorla-Wagner-Modell beschrieben, was die Aussage bestärkt, dass dieser Phänotyp durch einen selektiven Anstieg des Lernens in Folge negativer Vorhersagefehler verursacht wird. KChIP4 Ex3d Mäuse zeigen dagegen eine normale Offenfeld Exploration, sowie Präferenz für neuartige Objekte, und unverändertes Verhalten im Lochplattentest und beim spontanen Wechsel in einem Plus-Labyrinth-Test. Dies deutet darauf hin, dass sowohl die explorative Motivation, wie auch die Reaktionen auf Neuheit und Angstzustände, Fortbewegung sowie Arbeitsgedächtnis durch die genetische Manipulation nicht beeinflusst wurden. Darüber hinaus zeigte die semi-quantitative immunohistologische Experimente, dass KChIP4 Ex3d-Mäuse eine erhöhte Kv4.3-Expression in TH+-Neuronen aufweisen, was darauf hindeutet, dass die Abwesenheit von KChIP4a die Bindung anderer KChIP-Varianten erhöht, von denen bekannt ist, dass sie die Oberflächenexpression von Kv4-Kanälen erhöhen. Außerdem konnte im Rahmen dieser experimentellen Studie festgestellt werden, dass die am häufigsten verwendete Mauslinie, bei der die Cre-Rekombinase unter dem DAT-Promotor exprimiert wird (DAT-cre KI), einen veränderten Verhaltensphänotyp bei der Konditionierung in Vergleich zu Wildtyp-Geschwisterkontrollen aufweist. Diese Tiere zeigen verstärkte Reaktionen während der anfänglichen Versuche des Erwerblernens und eine Verzögerung in des Latenz der Extinktion. Diese Beobachtungen stimmen mit der Zunahme der Motivation überein, die wiederum durch die Reduktion des DAT Funktion im cre-Modell verursacht sein könnte. Ich schlage zusammenfassend ein Arbeitsmodell vor, bei dem die Störung der KChIP4a-Expression in DA-Neuronen zu einer Erhöhung der Bindung anderer KChIP-Varianten an Kv4.3-Untereinheiten führt, was eine erhöhte Oberflächenexpression fördert und die IA-Stromdichte erhöht. Dadurch erhören sich die Aktivitätspausen als Reaktion auf synaptische Hemmung, welche selektiv das Lernen durch negative Vorhersagefehler verstärkt.