Lokalisation der Aktivierung des S1P₁-Signalweges unter physiologischen und entzündlichen Bedingungen im ZNS adulter Mäuse

  • Die Multiple Sklerose (MS) ist die häufigste nicht-traumatische, autoimmun-vermittelte Erkrankung des zentralen Nervensystems (ZNS), welche vor allem bei jüngeren Patienten mit Invalidisierung und anhaltenden neurologischen Defiziten einhergehen kann. Im Rahmen eines optimalen Therapiekonzepts wurden deshalb immer neuere und potentere Medikamente eingeführt. Mit den Sphingosin-1-Phosphat-Rezeptor-1 (S1P1) -Agonisten Fingolimod und Siponimod sind seit mehreren Jahren Medikamente auf dem Markt deren Wirksamkeit bewiesen, jedoch die genauen Wirkprinzipien noch nicht vollends verstanden sind. Angenommen wurde bisher eine Lymphozytendepletion aufgrund einer Hemmung der Lymphozyteninfiltation ins ZNS über den ubiquitär exprimierten, G-protein gekoppelten S1P1-Rezeptor. Neben Wirksamkeiten im Bereich des Immunsystems spielt der S1P1-Rezeptor und sein natürliches Substrat, das S1P, in vielen essenziellen Bereichen eine entscheidende Rolle, unter anderem in der Ausbildung und Reifung des vaskulären Systems in der Embryogenese. Die genaue Untersuchung des S1P1-Signalwegs in-vivo gestaltete sich deshalb erschwert, da S1P1-Knock-Out-Mäuse einen letalen Phänotyp ausbilden. Jedoch deuten immer mehr Untersuchungen auch auf eine direkte S1P1-Rezeptor-vermittelte Wirksamkeit von Fingolimod auf Zellen des ZNS hin, somit eine Wirkung über die bisher bekannte Lymphozytenaffektion hinaus. Eine genaue Darstellung der im ZNS-beteiligten Zellen und ihrer S1P1-Aktivität gelang bisher auf zellulärer Ebene nicht. Mit dem in dieser Arbeit genutzten Mausmodell der genmodifizierten S1P1-Signaling-Maus sollte erstmals eine lokoregionale und zelluläre Untersuchung der am S1P1-Signalweg beteiligten Zellen im Rahmen von physiologischen und experimentellen autoimmunen Enzephalomyelitis (EAE)-Bedingungen im ZNS erfolgen. Hierbei entspricht die EAE weitgehend einem tierexperimentellen Korrelat der menschlichen MS. Bei Aktivierung eines S1P1-Rezeptors bei der S1P1-Signaling-Maus erfolgt durch eine gekoppelte Signalkaskade eine konsekutive Expression eines Histonproteins, welches an ein grün-fluoreszierendes Protein gekoppelt ist. Es resultiert eine grüne Fluoreszenz des Zellkerns der betroffenen Zelle. Bei der Kontroll-Maus findet sich keine Kopplung zwischen Rezeptor und im Zellkern befindlicher Proteine. Hierbei konnte mit Hilfe von Immunhistochemie sowie der quantitativen Methode der Durchflusszytometrie ein S1P1-Signaling in peripheren Organen wie beispielweise der im Rahmen der MS bedeutsamen Milz nachgewiesen werden. Dadurch eröffnen sich Einblicke in Migrationsverhalten und Zusammensetzung der Lymphozyten-Subtypen und deren S1P1-Signaling im Rahmen von physiologischen Bedingungen und unter EAE-Bedingungen. Die Darstellung des S1P1-Signalings im ZNS, als Hauptmanifestationsort der MS, gelang unter Zuhilfenahme der EAE mit dem genmodifizierten Mausmodell jedoch nicht. Da sich keine Unterschiede in der GFP-Expression zwischen der Signaling-Maus und der heterozygoten Kontroll-Maus zeigen, sind keinerlei Rückschlüsse auf ein echtes S1P1-Signaling möglich. Es zeigen sich zwar deutliche Expressionsunterschiede des GFP im Vergleich erkrankter und gesunder Versuchstiere, Rückschlüsse auf eine echte S1P1-Aktivität konnten jedoch nicht getroffen werden. Zusammenfassend eignet sich das hier genutzte Mausmodell der genmodifizierten S1P1-Maus zur Untersuchung peripherer Organe und ihrem S1P1-Signaling, z.B. zur Untersuchung kardiovaskulärer Fragestellungen oder zur dezidierteren Veranschaulichung peripher lymphatischer Prozesse. Zur Untersuchung ZNS-eigener Zellen sowie zur Beantwortung der Frage, ob und wie sie über den S1P1-Rezeptor agieren, bedarf es jedoch noch der Entwicklung eines geeigneteren Tiermodells. Die bereits erprobte Möglichkeit der Biolumineszenz zeigte in vorherigen Untersuchungen zwar eine S1P1-Aktivität in-vivo, jedoch sind hier keinerlei Untersuchungen auf zellulärer Basis möglich, sodass mit dem aktuellen Stand der Forschung ein direkter Nachweis der S1P1-Aktivität auf zellulärer Ebene im ZNS nicht möglich ist.
  • Multiple sclerosis is the most common non-traumatic, autoimmune disease of the central nervous system (CNS) in young adults leading to early invalidation and persistent neurological deficits. Recently, multiple novel drugs were developed in order to provide an improved treatment concept for these patients. One of the most promising types of treatment are sphingosine-1-phosphate-receptor-agonists (S1P1) like fingolimod and siponimod. The efficacy of these drugs has previously been shown, while definitive cellular mechanisms are widely unclear. The main principal is considered to be a depletion of lymphocytes in the CNS, based on an impairment of lymphocyte invasion from blood vessels into the CNS. Presumably, the migration of lymphocytes into the CNS is blocked due to the ubiquitously expressed g-protein coupled S1P1-receptor. In addition to the receptor’s relevance and its agent sphingosine-1-phosphate (S1P) in immunology, it also plays an essential role in the development and maturation of the vascular system during embryogenesis. Thus, S1P1-knockout-mice show a lethal phenotype, making in-vivo-investigations of the S1P1 signaling pathway challenging. Otherwise, there is emerging evidence suggesting a direct influence of fingolimod on cells of the CNS. The depiction of the involved cells in the CNS on cellular basis was not yet performed. In this study we used a transgenic S1P1 signaling mouse, which allows a regional demonstration of S1P1 signaling under physiological and experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) - conditions in the CNS of adult mice in theory. The activation of S1P1 leads to an expression of nuclear GFP-bound proteins and therefore to a nuclear green fluorescence of the effected cell. Using immunohistochemistry and the more quantitative method of flow cytometry we were able to visualize and measure S1P1 signaling in peripheral organs such as the spleen. Thus, we generated more insights into the migration patterns and the composition of lymphocyte-subtypes under physiological and EAE-conditions. While a visualization was successful in peripheral organs, the S1P1 signaling pathways in the CNS could not be depicted by this model. While comparing the results of the signaling and the control mice there were no differences in the S1P1 expression patterns under healthy and pathological conditions between those groups. Even though there were differences in the GFP expression between healthy and EAE-mice within the experimental groups, we could not find any validations for real S1P1 associated changes in the CNS. In conclusion, this study shows that the S1P1 signaling mouse can be used to depict S1P1 signaling in peripheral organs e.g. for investigations with a particular question regarding the cardiovascular system or lymphocytic processes. In demonstrating the S1P1 related mechanisms and the involved CNS cells, the transgenic S1P1 signaling mouse model was not successful and an appropriate mouse model is still missing. A mouse model with bioluminescence imaging of the S1P1 signaling mechanisms was already approved in vivo, but it does not allow any studies on a cellular level. With the current state of research there are no suitable in-vivo models for further investigations of the S1P1 signaling of CNS cells.

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Metadaten
Author:Irina SalzmannGND
URN:urn:nbn:de:hebis:30:3-691174
DOI:https://doi.org/10.21248/gups.69117
Place of publication:Frankfurt am Main
Referee:Waltraud PfeilschifterORCiDGND, Andreas WeigertORCiDGND
Document Type:Doctoral Thesis
Language:German
Date of Publication (online):2022/09/06
Year of first Publication:2022
Publishing Institution:Universitätsbibliothek Johann Christian Senckenberg
Granting Institution:Johann Wolfgang Goethe-Universität
Date of final exam:2022/08/03
Release Date:2022/09/06
Page Number:118
HeBIS-PPN:498929256
Institutes:Medizin / Medizin
Dewey Decimal Classification:6 Technik, Medizin, angewandte Wissenschaften / 61 Medizin und Gesundheit / 610 Medizin und Gesundheit
Sammlungen:Universitätspublikationen
Licence (German):License LogoDeutsches Urheberrecht