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Mutationen im CLN3 Gen verursachen die neurodegenerative Erkrankung juvenile neuronale Zeroidlipofuszinose (JNCL). Bei dieser Erkrankung sind die Autophagie, der lysosomale pH Wert und der mitochondriale Metabolismus beeinträchtigt. Störungen dieser Prozesse führen zu einer erhöhten Verletzlichkeit neuronaler Zellen gegenüber alters- und umweltbedingten Schäden, einer Anhäufung von Autophagosomen und lysosomalem Speichermaterial, Zelltod und Neurodegeneration. Um die JNCL zu erforschen bedienen wir uns eines Zellmodels aus der Maus, welches die häufigste krankheitsauslösende CLN3 Mutation im Menschen, die Deletion der Exons 7 und 8, nachbildet. Die aus dem Kleinhirn dieser Mäuse stammenden cerebellaren Körnerstammzellen werden als CbCln3Δex7/8/Δex7/8 Zellen, solche aus wild-typ Mäusen als CbCln3+/+ Zellen bezeichnet. Die JNCL ist nicht heilbar und die Entwicklung von Wirkstoffen steht noch am Anfang. Die vorliegende Arbeit befasst sich mit der Durchführung eines Hochdursatzscreenings um Wirkstoffe zu identifizieren, welche eine Anhäufung von Autophagosomen in CbCln3Δex7/8/Δex7/8 Zellen verhindern können. Unter 1750 verschiedenen untersuchten Wirkstoffen konnten wir 28 aktive „Hits“ identifizieren und stellten fest, dass Kalziumkanalblocker, Östrogene und HMG-CoA-Reduktase Inhibitoren gehäuft vertreten waren. Eine sorgfältige Untersuchung die möglichen Interaktionen der aktiven Wirkstoffe mit zellulären Signalwegen und die Analyse ihrer Dosis-Wirkungskurven unterstützte uns bei der Auswahl von Verapamil, Nicardipin und Fluspirilen zur näheren Untersuchung. Diese Wirkstoffe sind Kalziumkanalblocker und Fluspirilen blockt auch D2 Dopaminrezeptoren. Außerdem untersuchten und quantifizierten wir mitochondriale Phänotypen in CbCln3Δex7/8/Δex7/8 Zellen. Unsere Untersuchungen ergaben, dass Mitochondrien in CbCln3Δex7/8/Δex7/8 Zellen einer signifikanten Hyperfusion unterliegen und ein schwächeres Membranpotenzial aufweisen. Weiterhin fanden wir eine Verringerung der maximalen der mitochondrialen Elektronentransportkapazität und eine verringerte Aktivität des Enzyms Zitratsynthase, welches die Effizienz des Zitratzyklus bestimmt. Fluspirilen, Verapamil und, in geringerem Ausmaß, Nicardipin, verbesserten einige krankheitsbedingte lysosomale und mitochondriale Phänotypen. Des Weiteren konnten Verapamil und Nicardipin, nicht aber Fluspirilen, den erhöhten zellulären Kalziumspiegel in CbCln3Δex7/8/Δex7/8 Zellen absenken. Erniedrigungen im Kalziumgehalt können durch die Inhibition der kalziumabhängigen Protease Calpain 1 zu einer Induktion der Autophagie führen. Wir untersuchten, ob eine chemische Inhibition der Calpain 1-Protease die Anzahl der Autophagosomen in CbCln3Δex7/8/Δex7/8 Zellen senkt, und stellten fest, dass dies nicht der Fall ist. Eine Inhibition von Calpain 1 führte lediglich zu einem Anstieg der Zahl zellulärer Autophagosomen. Als Nächstes untersuchten wir die Auswirkung der Wirkstoffbehandlung auf den Autophagiefluss. Verapamil und Nicardipin hatten keinen Einfluss auf den Autophagiefluss in der getesteten Konzentration in CbCln3Δex7/8/Δex7/8 Zellen während Fluspirilen die Autophagie induzierte. Gleichzeitig stellten wir fest, dass hohe Dosen von Nicardipin und Verapamil teilweise vor einem Verlust des lysosomalen pH-Werts durch eine Behandlung mit Bafilomycin A1 schützen konnten. Da Fluspirilen auch ein Dopaminrezeptorblocker ist, untersuchten wir die Auswirkung einer erhöhten Dosis von Dopamin auf die Zahl der Autophagosomen. Wir fanden, dass eine mittlere Dosierung von Dopamin einen Trend zu einer leichten Verringerung von Autophagosomen in CbCln3Δex7/8/Δex7/8 Zellen zur Folge hat. Wir vermuten, dass die Kalziumkanalblocker Verapamil und Nicardipin und der Dopaminrezeptorblocker Fluspirilen unterschiedliche zelluläre Signalwege benutzen, aber letztendlich um ähnliche Botenstoffe verwenden, um die Funktion der Lysosomen in CbCln3Δex7/8/Δex7/8 Zellen zu verbessern. Die Verringerung des intrazellulären Kalziumgehalts durch Verapamil und Nicardipin führt zu einer Aktivierung von Adenylatzyklasen, welche eine Erhöhung des intrazellulären cAMP Spiegels herbeiführen. Fluspirilen inhibiert Dopaminrezeptoren vom Typ D2 (D2DR), was zu einer selektiven Aktivierung von Dopaminrezeptoren des Typs D5 (D5DR) führen könnte. Im Gegensatz zu D2 führen D5D Rezeptoren zu einer Aktivierung von Adenylatzyklasen und einer Erhöhung des cAMP Spiegels. cAMP aktiviert die Protein Kinase A (PKA), welche durch eine Proteinphosphorylierung von lysosomalen Chloridkanälen und Protonenpumpen die lysosomale Aktivität erhöht. Dies führt zu einer Verbesserung des Abbaus von Autophagosomen und lysosomalem Speichermaterial und zu einer verbesserten Zellgesundheit in CbCln3Δex7/8/Δex7/8 Zellen. Eine Verbesserung der lysosomalen Funktion in der JNCL kann einen wirksamen Therapieansatz ergeben. Wir hoffen, dass die hier vorgestellten Methoden und Ergebnisse einen ersten Schritt in diese Richtung darstellen.

Alterations in the autophagosomal–lysosomal pathway are a major pathophysiological feature of CLN3 disease, which is the most common form of childhood-onset neurodegeneration. Accumulating autofluorescent lysosomal storage material in CLN3 disease, consisting of dolichols, lipids, biometals, and a protein that normally resides in the mitochondria, subunit c of the mitochondrial ATPase, provides evidence that autophagosomal–lysosomal turnover of cellular components is disrupted upon loss of CLN3 protein function. Using a murine neuronal cell model of the disease, which accurately mimics the major gene defect and the hallmark features of CLN3 disease, we conducted an unbiased search for modifiers of autophagy, extending previous work by further optimizing a GFP-LC3 based assay and performing a high-content screen on a library of ~2000 bioactive compounds. Here we corroborate our earlier screening results and identify expanded, independent sets of autophagy modifiers that increase or decrease the accumulation of autophagosomes in the CLN3 disease cells, highlighting several pathways of interest, including the regulation of calcium signaling, microtubule dynamics, and the mevalonate pathway. Follow-up analysis on fluspirilene, nicardipine, and verapamil, in particular, confirmed activity in reducing GFP-LC3 vesicle burden, while also demonstrating activity in normalizing lysosomal positioning and, for verapamil, in promoting storage material clearance in CLN3 disease neuronal cells. This study demonstrates the potential for cell-based screening studies to identify candidate molecules and pathways for further work to understand CLN3 disease pathogenesis and in drug development efforts.