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Von Juni 1990 bis Februar 1991 wurde bei 9 Patienten eine immunszintigraphische Untersuchung mit dem Technetium-99m markierten, intakten, murinen, monoklonalen Anti-CEA-Antikörper BW 431/26 (Behring-Werke, Marburg) im Rahmen einer Phase-I-III-Studie durchgeführt. Die vorliegenden Ergebnisse zeigen, daß die Immunszintigraphie potentiell ein diagnostisch leistungsfähiges Verfahren ist, dem als Prinzip eine bildgebende Darstellung der spezifischen Interaktion radioaktiv markierter, monoklonaler Antikörper mit tumorzellständigen Antigenen zugrunde liegt (Baum 1989). Nach Dokumentation der Anamnese, der Ergebnisse anderer bildgebender Verfahren - und soweit erfolgt - von Operationsbefunden und Histologie, erfolgte eine Auswertung der Kinetik des Tc-99m markierten Antikörpers im Blut sowie eine Ganzkörperuntersuchung, getrennt nach anatomischen Regionen und Organen sowie einzelnen Tumorlokalisationen, wozu die Immunszintigraphie auch mit anderen bildgebenden Verfahren (Sonographie, CT, Endoskopie, Röntgen, Szintigraphie) verglichen wurde. Mögliche Indikationen zur Immunszintigraphie mit dem monoklonalen Antikörper BW 431/26 sind demnach: • Staging des Blasenkarzinoms zum Ausschluß extravesikaler Tumormanifestationen • Primärtumorsuche von unbekannten, CEA-exprimierenden Primärtumoren, die konventionell nicht auffindbar/darstellbar sind • Diagnostik von Lebermetastasen • Diagnostik von Lokalrezidiven bei vesikalen und rektosigmoidalen Karzinomen • Diagnostik von Lymphknotenmetastasen abdominell und thorakal • Diagnostik von extrahepatischen Läsionen bei Patienten mit bekannter Lebermetastasierung. Die kinetischen Eigenschaften des Tc-99m markierten monoklonalen Anti-CEAAntikörpers BW431/26, seine Verteilung und Anreicherung in den verschiedenen Organen und in CEA-exprimierenden Tumoren, die gute Verträglichkeit bei insgesamt geringer Strahlenbelastung, lassen die Immunszintigraphie als geeignet zum patientengerechten Staging von CEA-exprimierenden Tumoren erscheinen. Dieses Verfahren ermöglicht als Ganzkörperuntersuchung auch eine gute Übersicht über das Tumorgeschehen. Um allerdings wiederholte Untersuchungen im Rahmen der Nachsorge durchführen zu können, wird künftig die klinische Erforschung humaner Antimaus-Antikörper-Reaktionen und deren immunologischen Verhaltens nach erneuter Applikation des murinen Antikörpers erforderlich sein.

Ziel dieser Arbeit war die Identifizierung und Charakterisierung neuer potenter 5-LO-Inhibitoren unter Verwendung sowohl computergestützter als auch experimenteller Methoden. Ausgangspunkt war ein ligandenbasiertes virtuelles Screening unter Verwendung der ladungsbasierten Deskriptoren Charge3D und TripleCharge3D. Hierbei konnten zwei neue direkte 5-LO-Inhibitoren identifiziert werden. Jede dieser beiden Substanzen diente als Startpunkt weiterer virtueller Screenings mit dem Ziel, die Potenz der Substanzen zu verbessern bzw. eine SAR der Substanzklasse zu erhalten. Dabei zeigte sich für die Klasse der Thiazolinone, dass eine hohe Toleranz gegenüber unterschiedlichen Substituenten am Grundgerüst bezüglich der Auswirkung auf die Aktivität vorliegt: insbesondere werden relativ große Substituenten toleriert. Des Weiteren scheint der 2-Phenylsubstituent für die 5-LO-inhibitorische Aktivität essentiell zu sein, da Derivate, die einen Heterozyklus an dieser Position aufweisen, inaktiv sind. Eines der aktivsten Derivate dieser Klasse, C06 (Substanz 12), konnte weiter molekular-pharmakologisch charakterisiert werden. Die Substanz zeigt keine offensichtlichen zytotoxischen Effekte, ist unabhängig vom Stimulus der 5-LO-Aktivierung und zeigt nanomolare inhibitorische Aktivität sowohl in intakten PMNL (IC50-Wert 0,65 ;M) als auch in PMNL-Homogenaten (IC50-Wert 0,66 ;M) sowie in zellfreiem PMNL-S100 (IC50-Wert 0,26 ;M) und am gereinigten Enzym (IC50-Wert 0,3 ;M). C06 ist selektiv für die 5-LO, da andere arachidonsäurebindende Proteine (PPARs, cPLA2 und 12- und 15-LO) nicht beeinflusst werden. Auch Nager-5-LO (aus der Ratte und der Maus) wird inhibiert mit IC50-Werten im nanomolaren Bereich. Allerdings zeigte sich die Substanz inaktiv in einem menschlichen Vollblutassay in Gegenwart von Serum. C06 scheint nicht an die für die Interaktion der 5-LO mit der Membran verantwortliche C2-ähnliche Domäne der 5-LO zu binden. Ebenso hat der Membranbestandteil Phosphatidylcholin keinen bzw. nur geringen Einfluss auf das inhibitorische Potential von C06. Aktivitätstests mit steigender Substratkonzentration deuten auf einen allosterischen Bindemodus von C06 hin. Diese experimentellen Daten flossen in die Identifizierung des putativen Bindemodus an der 5-LO ein. Hierzu wurde zunächst ein Homologie-Modell der 5-LO unter Verwendung der kürzlich neu veröffentlichten Daten der Röntgenkristallstruktur der Kaninchen-15-LO (PDB-Code: 2p0m [Choi et al., 2008]) erstellt. Durch eine Bindetaschenvorhersage mit dem Programm PocketPicker und einer pseudorezptorbasierten Auswahl der potentiellen Bindetasche mit anschliessendem Liganden-Docking konnten zwei Bindebereiche postuliert werden, beide an einer Oberflächenbindetasche der 5-LO ausserhalb des aktiven Zentrums. Dies ist im Einklang mit der SAR der Substanzklasse, die zeigt, dass relativ große Substituenten toleriert werden. Erste Mutationsstudien deuten darauf hin, dass die Bindung von C06 in einer Bindetasche um die Aminosäure Y558 erfolgt. In der zweiten postulierten Bindetasche konnten zwei Aminosäuren identifiziert werden, die für die Aktivität der 5-LO essentiell sind: Mutationen von F169 und F177 zu Alanin führten zu einer abgeschwächten Produktivität der 5-LO (12% bzw. 32% der Aktivität der wt-5-LO) sowie zu einem veränderten Produktspektrum. Bei der zweiten Klasse der 5-LO-Inhibitoren, die in der ersten virtuellen Screeningrunde mit den Deskriptoren Charge3D und TripleCharge3D identifiziert werden konnten, handelt es sich um Pyridin-Imidazole. In einem dreistufigen virtuellen Screening konnte die Potenz dieser Substanzklasse von 10 ;M (Substanz 10) in PMNL-S100 auf 0,3 ;M (Substanz 80) verbessert werden. Bei einer der aktivsten Substanzen aus der zweiten Screeningrunde, B02 (Substanz 68), die weiter charakterisiert wurde, handelt es sich um einen direkten 5-LO-Inhibitor mit nanomolarer inhibitorischer Aktivität, der an die C2-ähnliche Domäne bindet. Es wurde ein Bindemodus durch Bindetaschenvorhersage, pseudorezeptorbasierte Bindetaschenlokalisierung und Liganden-Docking postuliert. Ein Problem dieser Substanzklasse ist jedoch ihre Zytotoxizität. Im letzten Teil dieser Arbeit wurde durch ein Protein-Protein-Docking eine mögliche Konformation eines Dimers der 5-LO modelliert. Die postulierten Modelle zeigen bevorzugt eine Konformation, bei der beide Untereinheiten des Dimers eine „head-to-tail“-Orientierung einnehmen. Diese Dimer-Modelle können als Startpunkt genutzt werden, um Modulatoren der Protein-Protein-Interaktion als neuartige Inhibitoren der 5-LO zu entwerfen.

We developed the Pharmacophore Alignment Search Tool (PhAST), a text-based technique for rapid hit and lead structure searching in large compound databases. For each molecule, a two-dimensional graph of potential pharmacophoric points (PPPs) is created, which has an identical topology as the original molecule with implicit hydrogen atoms. Each vertex is coloured by a symbol representing the corresponding PPP. The vertices of the graph are canonically labelled. The symbols associated with the vertices are combined to a so-called PhAST-Sequence beginning with the vertex with the lowest canonical label. Due to the canonical labelling the created PhAST-Sequence is characteristic for each molecule. For similarity assessment, PhAST-Sequences are compared using the sequence identity in their global pairwise alignment. The alignment score lies between 0 (no similarity) and 1 (identical PhAST-Sequences). In order to use global pairwise sequence alignment, a score matrix for pharmacophoric symbols was developed and gap penalties were optimized. PhAST performed comparably and sometimes superior to other similarity search tools (CATS2D, MOE pharmacophore quadruples) in retrospective virtual screenings using the COBRA collection of drugs and lead structures. Most importantly, the PhAST alignment technique allows for the computation of significance estimates that help prioritize a virtual hit list.