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Das Hepatitis C Virus (HCV) ist Auslöser einer oftmals chronisch verlaufenden Leberentzündung mit einem erhöhten Risiko für die Entwicklung einer Leberzirrhose und deren Folgen. Die weltweite Prävalenz der Hepatitis C beträgt ca. 3%; allein in Deutschland treten jährlich mehr als 5000 Neuinfektionen auf. Das HCV lässt sich aufgrund phylogenetischer Untersuchungen in mindestens 6 Genotypen und jeweils mehrere Subtypen einteilen, wobei der HCV Subtyp 1b in Europa am häufigsten vorkommt. Die Hepatitis C Forschung wurde lange Zeit durch das Fehlen eines geeigneten Zellkulturmodells erschwert. Mit der Etablierung eines stabil replizierenden Zellkulturmodells in humanen Hepatomazellen 1999 durch Lohmann et al. wurden erstmals molekularbiologische Untersuchungen in grossem Umfang möglich. Die seither existierenden Zellkulturmodelle haben jedoch den Nachteil, dass nicht definiert ist, wie sich das Isolat, aus dem das Replikon geschaffen wurde, klinisch verhält. Unter einer Interferon-basierten Therapie sprechen manche Patienten mit einer dauerhaften Negativierung der HCV RNA Konzentration an (sustained responder, SR), während bei anderen sowohl während als auch nach Therapieende weiterhin HCV RNA im Blut nachweisbar ist (non-responder, NR), obwohl beide Patienten mit demselben Subtyp von HCV infiziert sind und dieselbe Therapie erhalten. Die Ursachen für dieses unterschiedliche Therapieansprechen sind basierend auf Mutationsstudien von HCV Isolaten von Patienten mit unterschiedlichem Therapieansprechen zumindest teilweise genomisch bedingt. Daher wurden in der vorliegenden Arbeit zwei Konsensusklone zur Einbringung in ein replikatives Zellkulturmodell aus HCV Subtyp 1b Isolaten geschaffen, deren klinisches Verhalten unter Therapie klar charakterisiert ist. Dazu wurde Serum von je einem Patienten herangezogen, der unter definierten Studienbedingungen als SR oder NR bekannt war. Aus den Sera wurde die Virus-RNA extrahiert und mit Hilfe eines eigens dafür entwickelten RT-PCR-Protokolls und anschließender Klonierung in E. coli vervielfältigt. Um zufällige Mutationen und seltene Quasispezies auszuschließen, wurde dann nach vollständiger Sequenzierung von jeweils vier Einzelklonen mittels gezielter Mutagenese und Umklonierung eine Konsensussequenz geschaffen, die einen Durchschnitt der am häufigsten vorkommenden Quasispezies darstellt. Diese Konsensusklone wurden in einen Vektor zur Herstellung von RNA Transkripten eingefügt, so dass die Transkripte direkt zur Einbringung als Replikons in Zellkulturen genutzt werden können. Mit diesen klinisch charakterisierten Isolaten kann nun erstmals nach Unterschieden geforscht werden, die ursächlich für Therapieerfolg oder –misserfolg sein könnten. So können eventuell neue Therapieformen gefunden oder bereits vor Beginn einer Therapie eine Aussage zur Prognose getroffen werden.
Infections with the hepatitis B virus (HBV) or the hepatitis C virus (HCV) lead to complications like the development of cirrhosis or hepatocellular carcinoma. These complications end up in 887,000 and 500,000 deaths per year, respectively. Since the development of new direct acting antiviral agents for HCV in the past years a complete cure of an HCV infection can be achieved in the majority of the patients. In contrast, a complete cure of a chronic HBV infection still remains a challenging problem as current treatment regimens mainly suppress the viral replication and cccDNA as well as integrated DNA still persist in these patients. Several viral and host factors were described to impair the efficacy of treatment regimens or influence the course of the infection. Therefore, in this work viral factors as well as host factors were investigated in HBeAg negative chronic HBV infected patients and in chronic HCV infected patients. In the present study, it was demonstrated that mutations and/or deletions in the HBV basal core promoter (BCP), the precore and the preS domain occur in a genotype-specifc pattern in HBeAg negative HBV infected patients. While the BCP double mutation A1762T/G1764A was found with the highest prevalence in genotype E infected patients, the precore mutation G1896A occurred mostly in genotype B infected patients. Variants in the preS domain could be detected with the highest frequency in patients infected with genotype C. In patients, who had to start an antiviral therapy during the course of the disease, mutations in the precore region could be detected with a higher frequency in the samples right before treatment start in comparison to the baseline sample.
While different HBV genotypes and preS mutations were not associated with HBV-DNA serum levels, precore mutations as well as BCP mutations were significantly associated with HBV-DNA levels. Furthermore, precore mutations showed lower and preS mutations higher HBsAg levels. The HBsAg serum levels varied significantly among the different genotypes. Since HBsAg levels < 1000 IU/ml have been described as a prognostic marker in several studies, the prevalence of patients with HBsAg < 1000 IU/ml was analyzed among the genotypes A - E. While most of the patients infected with HBV genotype B had HBsAg < 1000 IU/ml, only a few patients infected HBV genotype E and A had HBsAg < 1000 IU/ml.
Furthermore, HBV genotype A genomes derived from patients harboring a) A1762T/ G1764A (BCP), b) G1896A/G1899A (precore), c) 15 aa deletion in preS1, d) no mutation (reference genome) were cloned and analyzed in vitro. An enhanced expression but reduced secretion of viral genomes was found in the preS-deletion- and the precore-variant. No differences in the HBsAg production and secretion were observed in the cloned precore- or BCP-variant, while the preS-deletion-variant was characterized with an elevated HBsAg release.
Regarding the secretion of viral and subviral particles, a genotype-specifc pattern of the L/M/SHBs ratio was detected in the serum of patients infected with genotypes A - E. This pattern did not change in the serum of patients, who started antiviral treatment. Secreted HBsAg containing particles displayed a higher density as well as a higher filaments/spheres ratio in genotypes B and D compared to genotypes A, C and E. Population-based and deep sequencing revealed large deletions in the preS domain or preS2 start codon mutations in a certain number of the viral genomes. Theoretically, these mutations/deletions should influence the molecular weight of the expressed protein or abolish the expression of the protein at all. In contrast, LHBs/MHBs were detectable and appeared at the same molecular weight in these patient samples in comparison to patient samples without these mutations. Furthermore, in the in vitro analyses comparing the reference genome and the preS1-deletion genome, it was shown that the deletion indeed influenced the molecular weight of LHBs. Therefore, HBsAg might be expressed from a genetically different source than the released viral genomes, meaning the integrated DNA.
Additionally, in the present study the prevalence of resistance associated substitutions (RASs) in the viral genes NS3, NS5A and NS5B of chronic HCV infected patients was analyzed in correlation to single nucleotide polymorphisms (SNPs) in the interferon-λ4 (IFNL4) gene of the infected patients. No significant correlation was found between IFNL4 SNPs and RASs within NS3/NS5B in the present cohort. In contrast, the frequently detected NS5A RAS Y93H could be significantly associated with beneficial IFNL4 SNPs and a high baseline viral load in HCV genotype 1-infected patients.
Taken together, the present study demonstrated that viral genome mutations as well as the morphology of secreted particles occur in a genotype-dependent pattern in HBeAg negative HBV infected patients with no need of antiviral therapy. As the amount of serum qHBsAg levels varied among the different genotypes, the HBsAg cut-off < 1000 IU/ml should be adapted individually among the various genotypes. Because the composition of the secreted subviral particles varied between the different genotypes, a genotype-specific immune-response might be induced in these patients. Additionally, the results of the present study indicate that in HBeAg negative HBV infected patients with mutations or deletions in the preS domain MHBs and LHBs might be expressed from the integrated DNA and therefore from a genetically different source than the released viral genomes.
Aside from that, the finding of a significant association of the NS5A RAS Y93H with beneficial IFNL4 SNPs in chronic HCV infected patients may explain a lack of a correlation or an inverse correlation of treatment response with the IFNL4 genotype in some NS5A inhibitor-containing IFN-free regimens.
Ziel der Studie: Die akute alkoholinduzierte Fettleber stellt das erste Stadium alkoholischer Leberer-krankungen dar. Bereits eine akute Alkoholintoxikation führt zu einer signifikanten Ak-kumulation von Fett in den Hepatozyten. Trotz verbesserter serologischer und bildge-bender Diagnoseverfahren ist die Leberbiopsie nach wie vor der Goldstandard zur Di-agnose einer Fettleber. Mögliche Komplikationen als invasives Verfahren, Stichproben-fehler sowie eine geringe Sensitivität im Bereich geringgradiger Verfettung sind die größten Nachteile der Leberbiopsie. Ziel dieser Studie war es, mit Hilfe der 1H-Magnetresonzspektroskopie eine akute alkoholinduzierte Fettleber zu diagnostizieren und quantitativ zu beurteilen. Um die Korrelation zwischen spektroskopisch gemesse-nem Leberfettgehalt und histologischer, biochemischer sowie laborchemischer Analyse zu bestimmen, wurde eine alkoholinduzierte Fettleber im Tiermodell verwendet.
Methodik: In 20 Lewis-Ratten wurde eine alkoholische Fettleber mittels gastraler Ethanol-Applikation induziert; 10 Ratten dienten als Kontrolle. Der intrahepatische Fettgehalt wurde mittels 1H-MRS (3.0 T) als prozentuales Verhältnis zwischen Lipid- und Was-ser-Peak berechnet. Fettgehalt sowie Triglyceride wurden nach Entnahme der Leber histologisch und biochemisch (nach FOLCH) bestimmt. Um spezifische Leberenzyme zu untersuchen, wurde Blut aus dem orbitalen Venenplexus entnommen.
Ergebnisse: In allen 20 Tieren konnte nach Ethanolapplikation eine Leberverfettung mittels 1H-MRS nachgewiesen werden. Histologisch zeigten 16 Tiere eine Fettleber. Ebenso zeigte sich nach Ethanolgabe und folgender biochemischer Analyse im Durschnitt eine Erhö-hung des Triglyceridgehalts, welcher einer Leberverfettung entsprach. Es fanden sich statistisch signifikante Korrelationen zwischen der histologisch bestimmten intrahepati-schen Verfettung und dem spektroskopisch gemessenen Fettgehalt (Pearson-Korrelationskoeffizient r = 0.90, p < 0.01) sowie zwischen der biochemischen Analyse nach FOLCH und 1H-MRS (r = 0.97, p < 0.01). Ebenso zeigte sich eine positive signifi-kante Korrelation zwischen spektroskopisch gemessener Leberverfettung und den Le-berparametern AST (r = 0.91, p < 0.05) und ALT (r = 0.84, p < 0.05).
Schlussfolgerung: Es konnte gezeigt werden, dass bereits geringgradige intrahepatische Verfettungen prä-zise quantitativ mittels 3.0 T-Protonen-MR-Spektroskopie darstellbar sind. Somit kann die Methode – bei Beachtung geeigneter Grenzwerte histologischer Messungen – als verlässliche diagnostische Alternative in Betracht gezogen werden. Bereits 48 Stunden nach Alkoholintoxikation ist mittels 1H-MRS eine exakte Differenzierung gesunder und pathologischer Lebern möglich – entscheidend vor allem im Rahmen einer Prätrans-plantationsdiagnostik bei Verdacht auf eine akute Fettleber. Darüber hinaus ist die 1H-MRS anderen bildgebenden Verfahren wie Ultraschall, CT und MRT in der genauen Quantifizierung intrahepatischen Fettgehalts überlegen. Der Einsatz erscheint auch in der Diagnostik und Verlaufskontrolle alkoholischer Lebererkrankungen in Zukunft sinnvoll. Kommende Untersuchung sollten an einem größeren Probandenkollektiv durchgeführt werden, um den Stellewert der 1H-MRS zu unterstreichen.
Das Hepatitis C-Virus verfügt vermutlich ähnlich wie andere Viren über die Fähigkeit die Interferon-basierte Immunantwort des Wirtes zu antagonisieren. In diesem Zusammenhang wurde in vitro die Hemmung der Interferon-induzierten doppel-strang-RNA-aktivierten Proteinkinase (PKR) durch spezifische Interaktion mit einer die Interferon-Sensitivität determinierenden Region (ISDR) umfassenden PKR-bindenden Domäne des HCV-NS5A-Proteins und einer Phosphorylierungs-Homologiedomäne (PePHD) des HCV-E2-Proteins beschrieben. Während die klinische Bedeutung von Mutationen im Bereich der ISDR/PKR-bindenden Domäne des HCV-NS5A-Proteins bei Patienten mit einer HCV-Genotyp-1-Infektion gut untersucht war, fehlten klinische Daten zu Patienten mit einer HCV-Genotyp-3a-Infektion, sowohl für das HCV-NS5A- als auch für das HCV-E2-Protein. Daher wurden in der vorliegenden Arbeit 33 Patienten, die mit dem HCV-Genotyp 3a infiziert waren und eine Therapie mit Interferon-alfa mit und ohne Ribavirin über insgesamt 48 Wochen erhielten, untersucht. Es erfolgte eine Sequenzierung der HCV-Isolate der 33 Patienten aus Serumproben vor Beginn der antiviralen Therapie im karboxyterminalen Bereich des E2- und NS5A-Gens, der jeweils die vermuteten PKR-Interaktionsstellen umfasst. Die Analyse der Sequenzen zeigte weder eine Korrelation von einzelnen Mutationen noch der Anzahl der Mutationen im Bereich der PePHD des E2-Proteins, der gesamten sequenzierten Region des E2-Proteins, der ISDR bzw. der PKR-bindenden Domäne des NS5A-Proteins und der gesamten sequenzierten Region des NS5A-Proteins mit dem virologischen Ansprechen auf die Interferon-alfa-basierte Therapie. Auch in phylogenetischen und konformationellen Analysen der HCV-Sequenzen des E2- und NS5A-Proteins der 33 Patienten konnte kein Zusammenhang von Sequenzmustern bzw. Mustern der Sekundärstruktur mit dem virologischen Therapieansprechen nachgewiesen werden. Eine Korrelation einer vermehrten Anzahl von Mutationen in den genannten Bereichen des E2- bzw. NS5A-Proteins mit einer niedrigeren HCV RNA-Konzentration vor Therapiebeginn erreichte keine statistische Signifikanz. Aufgrund der hohen virologischen Ansprechraten von über 80 % unter der gegenwärtigen Standardtherapie mit PEG-Interferon-alfa und Ribavirin erscheint das Vorhandensein von genomischen Mutationen der HCV-Proteine in Korrelation mit dem Therapieansprechen bei Patienten mit einer HCV-Genotyp-3a-Infektion insgesamt unwahrscheinlich zu sein. Darüber hinaus sind vermutlich neben den teilweise in der vorliegenden Arbeit untersuchten virologischen Parametern auch wirtsspezifische Mechanismen für die Sensitivität gegenüber der Interferon-basierten Therapie von Bedeutung.