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The heat stress (hs) response is universal to all organisms. As the cell senses increase in temperature, heat stress transcription factors (Hsfs) are activated to upregulate the expression of a number of genes encoding heat stress proteins (Hsp) which act as molecular chaperones to protect cells against heat damages. In higher plants, the phenomenon seems to be unusually complex both at the level of Hsfs and Hsps (e.g., 21 Hsf encoding genes in Arabidopsis and at least 17 in tomato). Upon prolonged hs, another characteristic property of plant cells is the assembly of large cytosolic aggregates called heat stress granules (HSG), which are composed of Hsps, HsfA2, RNA and RNA-binding proteins. The present work was aimed to understand plant hs response using tomato as a model system. To study the function of tomato Hsfs in their native system, we generated transgenic tomato lines altered in expression of HsfA1, HsfA2, and HsfB1. Tomato plants with 10-fold overexpression of HsfA1 (OE plants) were characterised by integration of a single HsfA1 expression cassette, whereas the plants harbouring a tandem inverted repeat (IR) of the cassette showed cosuppression of HsfA1 (CS plants). The lack of HsfA1 expression in CS plants results from posttranscriptional gene silencing connected with the formation of small interfering RNA (siRNA). Under normal growth conditions, major developmental features were similar for wild-type (WT), OE and CS plants. However, in contrast to the former two, CS plants and fruits were extremely sensitive to elevated temperature because hs-induced synthesis of major chaperones and Hsfs was strongly reduced or lacking. Despite the complexity of the plant Hsf family, the function of tomato HsfA1 is unique as master regulator of induced thermotolerance. On the other hand, maintenance of essential chaperones in CS plants during seed development suggests involvement of other Hsfs and/or transcription factor(s). HsfB1 and HsfA2 transgenic tomato plants, unaffected in thermotolerance, further supported the function of HsfA1 as the major factor regulating hs-inducible genes. Hs87 independent phenotypes of plants with altered expression of HsfB1 indicates developmental role of this Hsf. Using transient reporter assays with mesophyll protoplasts from WT tomato, we demonstrated that plasmids encoding Hsfs A1, A2 and A3 were well expressed which could function as activators for reporter gene expression. However, in protoplasts derived from CS plants, plasmids encoding HsfA2 and HsfA3 were normally expressed but even higher amounts of HsfA1 expression plasmids were completely silenced. Therefore, silencing of HsfA1 in CS plants was also reproduced in its mesophyll protoplasts. Lacking thermotolerance in CS protoplasts could be restored after transformation with expression plasmids encoding functionally equivalent HsfA2 or HsfA3 resulting in (i) expression of chaperones, (ii) survival of the cells at otherwise lethal temperature, (iii) thermoprotection of firefly luciferase, and (iv) assembly of heat stress granules (HSGs). The strong silencing caused by an IR in CS plants opened the possibility of a broad use of RNAi for gene knock-down also in the transient system of mesophyll protoplasts. Using this technology, we attempted to dissect essential components of thermotolerance and HSG assembly. We demonstrated the previously reported function of chaperones such as Hsp70 and Hsp101, and could discriminate the in vivo chaperone functions of different isoforms of Hsp20 and Hsp70 proteins. Hsp17-CI, Hsp70 (hs-inducible isoforms), and Hsp101 are absolutely essential chaperones for thermotolerance in plants. Furthermore, the results also show that despite Hsp17-CI and -CII being major components of HSG complexes, they are dispensable for assembly of these complexes. Based on these results, it is proposed that in the transient protoplast system an approach with gene-specific IRs can be used to discriminate functions of closely related isoforms among protein-families and to dissect complex protein networks.
Die Chloroplastenbewegung ist eine der wichtigsten Anpassungen, die Pflanzen entwickelt haben, um eine effiziente Ausbeute an Lichtquanten für die Photosynthese zu gewährleisten. Auch wenn der genaue Mechanismus und die Signalwege, die diesen Prozess vermitteln, noch nicht vollständig verstanden sind, konnten einige an der Chloroplastenbewegung beteiligte Proteine (phot1, phot2, chup1, Aktin, Profilin) in den letzten Jahren identifiziert werden. Chup1, das an der äußeren Chloroplastenmembran verankerte Protein, wird als putativer Linker zwischen den Chloroplasten und dem Aktin-Zytoskelett gesehen. Durch die Interaktion mit Profilaktin reguliert chup1 die Aktin-Polymerisierung und somit auch die Chloroplastenbewegung. Die Analyse der intra- und intermolekularen Interaktionen von chup1, die in dieser Studie ermittelt wurden, deutet auf eine Homodimerisierung von chup1 durch die Coiled coil Domäne sowie auf eine Assoziation des N- mit dem C-terminalen Leuzin- Zipper hin. Neben diesen Interaktionen konnte für einen der vier putativen Interaktionspartner von chup1, der wall associated kinase 3, eine mögliche Funktion bei der Vermeidungsbewegung der Chloroplasten gezeigt werden. In Anbetracht dieser Interaktion und der postulierten Phosphorylierungsstellen in chup1, könnte eine Regulierung von chup1 durch Phosphorylierung erfolgen. Um die Funktionen von chup1 und phot2 besser zu verstehen, wurden die Pflanzen mit knock-out in diesen Gene genauer charakterisiert und die T-DNA Insertionslinien von chup1 und phot2 zeigen keine Reduzierung in der photosynthetischen Aktivität. Im Gegensatz dazu, bedingt der knock out von beiden Genen eine deutliche Verminderung der photosynthetischen Leistung. Infolge der fehlenden Chloroplastenbewegung im chup1phot2 Doppel knock out führt das möglicherweise zu einem verringerten Schutz der Photosynthese. Dies bestätigt weiter die Verbindung zwischen der durch phot2 induzierten Signalkaskade und der Aktin-Polymerisierung, die durch chup1 reguliert wird. Um den Einfluss von chup1, phot1 und phot2 auf die transkriptionelle Regulierung nach BL zu analysieren, wurde das globale Expressionsmuster nach BL-Behandlung untersucht. Bei der Analyse der Mutanten-Pflanzen mit einem Defekt in der Chloroplastenbewegung (chup1, phot1, phot2) konnte keine Beeinflussung der Regulierung der Genexpression in BL-gesteuerten Signalkaskaden durch diese Proteine beobachtet werden. Die Regulierung der Expression geschieht eher auf posttranskriptioneller Ebene und wird mit Hilfe von microRNA gesteuert.
Die Kichererbse (C. arietinum L.) ist eine der ältesten kultivierten Leguminosen und stellt eine Nahrungsgrundlage in vielen Ländern mit semiaridem Klima dar. Seit einigen Jahren unterstützen molekulare Marker sowohl die Züchtungsforschung als auch die Genomanalyse dieser Pflanze, so daß bereits eine genetische Karte des Kichererbsengenoms erstellt werden konnte. Da repetitive Komponenten einen Großteil des Genoms ausmachen können, ist ihre Charakterisierung zum Verständnis der Organisation des Kichererbsengenoms unerläßlich. Insgesamt konnten sieben repetitive Sequenzfamilien aus C. arietinum isoliert und identifiziert werden, von denen einige direkt in der Genomanalyse bzw. für taxonomische Fragen Anwendung fanden. Außerdem wurde ein universelles Primerpaar zur schnellen Detektion von DNA-Transposons entwickelt und verwendet. 1. Die beiden Satellitenelemente CaSat1 und CaSat2 sowie das Ty3-gypsy-ähnliche Retrotransposon CaRep stellen vermutlich die abundantesten Familien repetitiver Sequenz dar. Die beiden AT-reichen Satelliten bestehen aus 162-167 bzw. 100 Bp langen, hintereinander (,,head-to-tail") angeordneten Monomeren. CaSat2 ist ein dominanter Bestandteil des pericentrischen Heterochromatins, während CaSat1 hauptsächlich in der Nachbarschaft der 18S-5.8S-25S rDNA-Loci lokalisiert ist. Eine Verwandtschaft von CaSat1 zu IGS-Sequenzen ist nicht auszuschließen. Eine vollständige Kopie des dispersen Retroelements CaRep, das im pericentrischen Heterochromatin konzentriert ist, jedoch den zentralen Bereich von CaSat2 ausspart, konnte rekonstruiert werden. Das Element ist 11.4 Kbp lang und hat relativ lange, flankierende LTRs von je 3.3 Kbp. Alle drei hochrepetitiven Elemente sind spezifisch für die Gattung Cicer. Die genomische Organisation von CaRep wurde offenbar während der Evolution der annuellen Cicer-Spezies mehrfach rearrangiert. 2. Da die beiden Satelliten CaSat1 und CaSat2 in allen untersuchten Spezies der Gattung Cicer (außer C. cuneatum) vorhanden sind, lassen sich ihre Abundanz und Organisation zur Klärung taxonomischer Fragen verwenden. Die Ergebnisse unterstützen die Außenseiterrolle von C. cuneatum innerhalb der annuellen Cicer- Spezies und damit Thesen zu einem separaten Ursprung dieser Annuellen sowie die Forderung nach der taxonomischen Trennung von der Sektion Monocicer. Auch unterstützen und ergänzen die Ergebnisse über die Satellitenelemente bereits vorliegende molekulare Daten, Karyotypisierungen sowie Kreuzbarkeitsdaten und bestätigen die Gruppierung von C. chorassanicum sowie der ersten Kreuzungsgruppe. 3. Das hochabundante Retrotransposon CaRep kann für eine S-SAP (,,sequence-specific amplified polymorphisms")-ähnliche Markertechnik verwendet werden und liefert polymorphe molekulare Marker, die sich in die genetische Karte integrieren lassen. Die damit detektierten Polymorphismen werden vermutlich durch Variabilität innerhalb der LTR-Sequenzen erzeugt. Ein Teil der so generierten Marker ist mit den Resistenzgenloci gegen Fusarium oxysporum f.sp. ciceri gekoppelt. Die Hybridisierung bestätigt, daß durch die Marker tatsächlich Loci des Retrotransposons auf der genetischen Karte lokalisiert werden. 4. Unabhängig davon konnten durch PCR-Ansätze die drei mittelrepetitiven, dispersen Retrotransposonfamilien CaDis, CaTy und CaLin identifiziert werden. Von den beiden LTR-Retrotransposons CaDis und CaTy gehört letztere Familie zur Ty1-copia- Untergruppe, CaLin repräsentiert ein non-LTR-Element der LINE-Klasse. Alle drei Familien sind weniger abundant als CaRep und in den distalen Bereichen einiger oder aller Heterochromatinblöcke bzw. in den angrenzenden euchromatischen Regionen zu finden. Im Gegensatz zu den hochabundanten Familien kommen homologe Sequenzen der drei Familien auch außerhalb der Gattung Cicer vor und deuten auf eine evolutiv frühe Anwesenheit innerhalb der Fabaceen hin. Die sehr heterogenen Sequenzen von CaLin sind vermutlich sehr ursprünglich und haben während der Evolution der Annuellen keine großen Rearrangements erfahren. CaDis-Sequenzen werden in vielen Geweben transkribiert, jedoch ist unklar, ob dies auf eine Aktivität des Elements hinweist oder auf das Durchlesen benachbarter Gene zurückzuführen ist. 5. Um auch transposable Elemente der Klasse II (DNA-Transposons) nachweisen zu können, wurde ein degeneriertes Primerpaar aus dem Bereich der Transposase abgeleitet, mit dessen Hilfe pflanzliche En/Spm-Elemente in über 30 Pflanzenarten aus 20 Gattungen, darunter auch wichtigen Kulturpflanzen wie Zuckerrübe, Weizen und Erbse nachgewiesen werden können. Dieser Ansatz stellt einen Ausgangspunkt für die Charakterisierung solcher Elemente in beliebigen Pflanzengenomen und ihre Verwendung bei der Genomanalyse sowie zur Genidentifikation und -isolation dar. 6. Die niedrig- bis mittelrepetitive, disperse En/Spm-Familie aus C. arietinum (CaEn/Spm) umfaßt drei Subfamilien und ist auf mindestens sechs Chromosomen im distalen Teil der Heterochromatinblöcke angrenzend an euchromatische Bereiche lokalisiert. Die hier vorgelegten Befunde umfassen die erste chromosomale Lokalisation eines DNA-Transposons in Pflanzen durch FISH. Die genomische Organisation homologer Sequenzen in anderen Cicer-Spezies deutet möglicherweise auf transposable Aktivität während der Evolution der Annuellen hin. CaEn/Spm- ähnliche Elemente scheinen bereits in einem Vorgänger von C. arietinum und nahe verwandten Leguminosen vorhanden gewesen zu sein. Durch die vorliegenden Daten war es möglich, ein vorläufiges Modell der Verteilung repetitiver Sequenzen auf den acht Kichererbsenchromosomen zu entwerfen, das für die weitere Genomanalyse von C. arietinum genutzt werden kann. Obwohl vermutlich nur ein Teil aller repetitiven Komponenten dieses Genoms charakterisiert wurde, deutet sich - im Gegensatz zu Pflanzen mit vergleichbarer Genomgröße - durch die Konzentration repetitiver Sequenzen im pericentrischen Heterochromatin eine Ähnlichkeit zur Chromosomen- organisation in Arabidopsis thaliana an.
Drought and salt stress are the major constraint to increase yield in chickpea (Cicer arietinum). Improving drought and high-salinity tolerance is therefore of outmost importance for breeding. However, the complexity of these traits allowed only marginal progress. A solution to the current stagnation is expected from innovative molecular tools such as transcriptome analyses providing insight into stress-related gene activity, which combined with molecular markers and expression (e)QTL mapping, may accelerate knowledge-based breeding. SuperSAGE, an improved version of the serial analysis of gene expression (SAGE) technique, generating genome-wide, high-quality transcription profiles from any eukaryote, has been employed in the present study. The method produces 26bp long fragments (26bp tags) from defined positions in cDNAs, providing sufficient sequence information to unambiguously characterize the mRNAs. Further, SuperSAGE tags may be immediately used to produce microarrays and probes for real-time-PCR, thereby overcoming the lack of genomic tools in non-model organisms.