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Reliable communication in the central nervous system requires the precise control of the duration and the intensity of neurotransmitter action at specific molecular targets. After their release at the synapse, neurotransmitters activate pre- and/or postsynaptic receptors. To terminate synaptic transmission, neurotransmitters are in turn inactivated by either enzymatic degradation or active uptake into neuronal and/or glial cells by neurotransmitter transporters. In the present study, two types of membrane proteins involved in transcellular signal transduction were investigated, the P2X receptors, which are ATP-gated ion channels and the glutamate transporters of the EAAT family. The first part of this study is concerned with the targeting and anchoring of P2X receptors at specific locations. P2X receptors play a role of fast excitatory neurotransmission to extracellular ATP in both the peripheral and central nervous system. For several ligand-gated ion channel, like glycine receptors or nicotinic acetylcholine receptors, it is known that specific binding proteins exist, which are involved in receptor trafficking and anchoring of the receptors at appropriate sites on the synapse. Within the P2X family, amino acid homology is scattered over the protein sequence excepted of the cytoplasmic C-terminal tails, which do not share significant sequence similarity, indicating that they might provide peculiar properties to the respective receptor isoforms. Using GST fusion proteins containing the C terminal end of the P2X2A, P2X5 and P2X7 subunits as baits, ßIII tubulin was identified by MALDI-TOF mass spectrometry as a direct interacting partner of P2X2A. ßIII tubulin did not interact with P2X5 nor with P2X7. The tubulin binding motif of P2X2A could be confined to a 42 amino acid long region ranging from amino acid 371 to 412 of the complete P2X2A subunit. This domain, which includes a total of six serine residues and twelve proline residues, interestingly overlaps to a significant extent with a 69 amino acid long sequence, which is lacking in P2X2B, a splice variant of P2X2A. P2X2B receptors are known to desensitize - significantly faster than P2X2A receptors. The interaction of the P2X2A receptor with ßIII tubulin may contribute to receptor desensitization as well as tethering of the P2X2A receptor at specialized regions of the cell. In a second part of this work, the oligomeric state of two distantly related glutamate transporters, the human glial glutamate transporter hEAAT2, and the glutamate transporter ecgltP of E.coli was determined. Excitatory amino acid transporters (EAATs) buffer and remove synaptically released L-glutamate and maintain its concentration below neurotoxic levels. Mammalian glutamate transporter subunits are known to form homomultimers, but controversial numbers of subunits per transporter complex have been reported, ranging from 2-5. Both hEAAT2 and ecgltP proteins expressed at high levels in Xenopus laevis oocytes, from which they were purified in a [35S]methionine-labeled form under nondenaturing conditions by metal affinity chromatography. Blue native PAGE analysis revealed that both the hEAAT2 and ecgltP transporters exist exclusively as homogenous populations of homotrimers in Xenopus oocytes. The trimeric structure was corroborated by chemical crosslinking. Also, ecgltP purified as a recombinant protein from its natural host E.coli migrated as a trimeric protein on blue native PAGE gels. The conservation of the quaternary structure from prokaryotes to mammals assigns an important functional role to the trimeric structure. Glutamate transporters are known to exhibit a dual mode of operation by functioning both as glutamate Na+/K+/H+ co-transporters and as anion channels. It is intriguing to speculate that the EAAT monomer is responsible for the secondary active transport of glutamate, whereas a barrel-like arrangement of the three subunits forms a central anion pore mediating anion conductivity.

Die Beschäftigung mit Muskarinrezeptoren reicht bis in das vergangene Jahrhundert zurück als, in Folge der verschiedenen Wirkungen des Neurotransmitters Acetylcholin, einerseits Nikotin- und andererseits Muskarinrezeptoren sowie deren Subtypen entdeckt und charakterisiert werden konnten. Aufgrund der weiten Verbreitung von Muskarinrezeptoren innerhalb des zentralen und peripheren Nervensystems sowie in entsprechend innervierten Organen sind diese nach wie vor als Target für bestimmte klinische Indikationen von großem Interesse. Besonders im Bereich der chronisch obstruktiven Atemwegserkrankungen (COPD) sind Bronchodilatoren Mittel der Wahl. Obwohl die derzeitige Behandlungsstrategie im wesentlichen auf dem Einsatz des unselektiven muskarinischen Antagonisten Ipratropiumbromid, allein oder in Kombination mit einem kurzwirksamen b2-Sympathomimetikum, beruht, ist ihr Einsatz aufgrund der dabei auftretenden unerwünschten Nebenwirkungen limitiert. Neben M3- Rezeptoren findet man in der menschlichen Lunge auch präsynaptische M2- Rezeptoren, deren Blockade zu einem Anstieg der Acetylcholinfreisetzung führt. Demzufolge würde die Entwicklung eines hochselektiven und/oder langwirksamen muskarinischen M3-Rezeptorantagonisten einen großen Fortschritt für die Behandlung von Patienten mit COPD und auch Asthma bedeuten. Untersuchung der Stereoisomere des Glycopyrroniumbromids und der entsprechenden tertiären Analoga: Im Rahmen der vorliegenden Arbeit wurden sowohl die vier reinen Stereoisomere des Glycopyrroniumbromids als auch die entsprechenden vier tertiären Analoga untersucht. Bislang wird das Diastereomerengemisch (RS/SR), das als RobinulÒ im Handel ist, vorwiegend als Antisialagogum in der Prämedikation der Narkose oder als Spasmolytikum therapeutisch eingesetzt. Die molekulare Struktur des Glycopyrroniumbromids weist zwei Chiralitätszentren auf, woraus sich vier stereoisomere Verbindungen ergeben. Die pharmakologische Untersuchung sowohl der quartären als auch der korrespondierenden tertiären Isomere in den funktionellen Standardmodellen, Kaninchen-Vas-deferens für M1-Rezeptoren, linker Vorhof des Meerschweinchenherzens für M2-Rezeptoren und die Längsmuskulatur des Meerschweinchenileum für M3-Rezeptoren, ergab, dass sich alle Verbindungen an den untersuchten Muskarinrezeptorsubtypen als potente Antagonisten verhielten. Ihre Rezeptorselektivität war jedoch relativ gering, wobei im Allgemeinen die niedrigste Affinität zum M2-Rezeptor beobachtet wurde. Innerhalb der Stereoisomeren zeigten die (R/R')- und (S/R')-konfigurierten Verbindungen den stärksten, die (S/S')-konfigurierten Isomere hingegen den geringsten antagonistischen Effekt. Diese Ergebnisse konnten durch Radioligand- Bindungsstudien bestätigt werden. Bemerkenswert war jedoch, dass insbesondere am M3-Rezeptor eine extrem langsame Dissoziation der Substanzen vom Rezeptor festgestellt wurde. Verbunden mit der hohen Affinität und der in Bindungsstudien ermittelten Dissoziationshalbwertszeit von 120 min könnte das quartäre (R/R')-konfigurierte Stereoisomer des Glycopyrroniumbromids eine geeignete Alternative zur Behandlung der COPD darstellen: Die lange Halbwertszeit sollte eine Einmalgabe pro Tag erlauben und somit die Patientencompliance erhöhen, die hohe Affinität eine geringe Dosierung ermöglichen und die kinetische Selektivität' sowie die quartäre Struktur könnten zur Minimierung unerwünschter Nebenwirkungen führen. Aufgrund dieser Vorteile wurde die Substanz patentiert und der pharmazeutischen Industrie für weiterführende Untersuchungen zur Verfügung gestellt. Untersuchungen an der Längsmuskulatur des Meerschweinchenileum in Hinblick auf die Verteilung von P2-Rezeptoren: Aufgrund der Pionierarbeit, die Ende der 70er Jahre von Burnstock und seinen Mitarbeitern geleistet wurde, wandelte sich das Bild von ATP als einer Energiequelle der Zelle zu einem Neurotransmitter ubiquitären Vorkommens mit entsprechenden Zielstrukturen, den P2-Rezeptoren. Inzwischen ist allgemein anerkannt, dass zwischen metabotropen P2Y-Rezeptoren und ionotropen P2X- Rezeptoren unterschieden werden kann. Mit Hilfe von Klonierungstechniken konnte diese Klassifizierung validiert und außerdem eine Vielzahl unterschiedlicher Subtypen identifiziert werden. Bis heute wurden sieben P2X- (P2X1-7) und sechs P2Y- Rezeptorsubtypen (P2Y1, P2Y2, P2Y4, P2Y6, P2Y11, P2Y12) kloniert und pharmakologisch charakterisiert. Sie gelten unumstritten als Vertreter der P2-Rezeptorfamilie. Heute besteht eine der größten Herausforderungen auf diesem sich explosionsartig expandierendem Gebiet darin, die geklonten P2-Rezeptoren mit den verschiedenen physiologischen Antworten, die durch native P2-Rezeptoren vermittelt werden, in Einklang zu bringen. Da die Längsmuskulatur des Meerschweinchenileum ein bekanntes Modell, z.B. für Untersuchungen an Muskarinrezeptoren, darstellt, war das Ziel der vorliegenden Arbeit, dieses Modell in Bezug auf die Verteilung von P2-Rezeptoren hin zu untersuchen. Neben Agonisten, die eine Präferenz für entweder ionotrope (a,b-meATP) oder metabotrope (ADPbS) P2-Rezeptoren aufweisen, wurden im wesentlichen eine Reihe gut untersuchter Antagonisten mit zum Teil hoher Affinität für einen Rezeptorsubtyp für die funktionellen Untersuchungen verwendet. Die neuronale Lokalisation des P2X-Rezeptors konnte durch die komplette Aufhebung der durch a,b-meATP-vermittelten Kontraktionen nach Zugabe von TTX charakterisiert werden. Die ebenfalls fast vollständige Hemmung der Kontraktion nach Einsatz von Atropin wies auf einen indirekten, durch Acetylcholin vermittelten Effekt hin. Aufgrund dieser Beobachtungen wurden sämtliche Versuche mit P2-Antagonisten unter Zusatz von 70 µM Physostigmin in der Nährlösung durchgeführt. Die eingesetzten Antagonisten Suramin, NF023 und NF279 erwiesen sich als kompetitive Antagonisten, während PPADS neben der Rechtsverschiebung einen Maximumabfall der Agonistenkurven bewirkte. Ein Vergleich der funktionell ermittelten pA2-Werte mit den Wirkstärken an rekombinanten P2-Rezeptoren von Ratte und Mensch lässt vermuten, dass es sich hierbei um einen P2X3- Rezeptorsubtyp handelt, der über die Freisetzung von Acetylcholin eine Kontraktion der glatten Muskulatur über einen indirekten Mechanismus auslöst. Da sich P2X-Rezeptoruntereinheiten neben homomeren auch zu heteromeren, funktionell aktiven Kanälen vereinen können, könnte es sich bei dem vorliegenden soma-dendritischen P2X-Rezeptor aber auch um ein Heteromer handeln, bei dem der P2X3-Rezeptor den Phänotyp bestimmt. Solange noch keine eindeutige Identifizierung dieses Rezeptors speziesspezifisch auf molekularer Ebene erfolgt ist, sollte man deshalb die Bezeichnung P2X3(-ähnlicher)-Rezeptor verwenden. Es konnte gezeigt werden, dass eine Stimulation des präsynaptischen P2X3(- ähnlichen)-Rezeptors zur Ausschüttung von Acetylcholin führt, das wiederum postsynaptisch einen kontraktionsvermittelnden Muskarinrezeptor aktiviert. Um zu beweisen, dass es sich dabei um denselben Muskarinrezeptorsubtyp handelt, der bereits auf direktem Weg durch APE oder mittels EFS als M3-Rezeptor charakterisiert werden konnte, wurden die Affinitäten muskarinischer Antagonisten als Kriterien herangezogen. Die erhaltenen Korrelationen wiesen eindeutig darauf hin, dass dieser postsynaptisch im GPI lokalisierte Muskarinrezeptor dem nativen und rekombinanten, kontraktionsvermittelnden M3-Rezeptorsubtyp entspricht. Durch Zugabe von ADPbS konnten im GPI Kontraktionen ausgelöst werden, die allerdings mit TTX und Atropin nur zum Teil gehemmt wurden. Diese Beobachtungen führten zu der Erkenntnis, dass postsynaptisch P2Y-Rezeptoren lokalisiert sind. Ihre Subtypcharakterisierung erfolgte unter Zusatz von 0.3 µM Atropin in der Nährlösung, um den Einfluss der neuronalen P2X3-Rezeptoren zu unterbinden. Suramin, NF023 und NF279 zeigten wiederum einen kompetitiven Antagonismus gegen ADPbS, während PPADS auch hier eine Rechtsverschiebung mit Maximumdepression der Agonistenkurve hervorrief. Ein erneuter Vergleich mit beschriebenen Affinitätswerten von rekombinanten P2- Rezeptoren ließ den Schluss zu, dass der im GPI postsynaptisch gefundene P2Y- Rezeptor Eigenschaften des P2Y1-Rezeptorsubtyps aufweist. Eine Bestätigung dafür gaben außerdem die P2Y1-selektiven Bisphosphate A3P5P und MRS2179, obgleich sie geringere pIC50-Werte aufzeigten als in der Literatur beschrieben. Mit der Charakterisierung des neuronalen P2X3-Rezeptors und des postsynaptischen P2Y1-Rezeptors ist das GPI ein bisher einzigartiges funktionelles pharmakologisches Modell, in dem beide P2-Rezeptorsubtypen durch Einsatz des jeweiligen Agonisten, a,b-meATP oder ADPbS, pharmakologisch isoliert werden können. Charakterisierung von P2-Rezeptoren in der Längsmuskulatur des Rattenileum: Eine im Vergleich zum GPI gänzlich andere Situation zeigte sich im RI. Die getesteten P2-Agonisten ADPbS, a,b-meATP, a,b-meADP und ATPgS erzeugten Kontraktionen im untersuchten Gewebe, wobei sich a,b-meATP als effektivster Agonist erwies. Im Unterschied zum GPI führte eine wiederholte Gabe von a,b- meATP allerdings nicht zu einer Desensibilisierung des Rezeptors. Die durch Zugabe von TTX und Atropin erreichte Kontraktionshemmung lässt auf das Vorhandensein von sowohl prä- als auch postsynaptischen P2X-Rezeptoren schließen. Eine Trennung der durch diese Rezeptoren hervorgerufenen Effekte war im funktionellen Experiment jedoch nicht durchführbar. Keinerlei Effekt zeigte allerdings der Zusatz von TTX und Atropin auf die durch ADPbS ausgelösten Kontraktionen. Suramin, NF023 und PPADS erwiesen sich als sehr schwache Antagonisten an diesem Präparat. Auffällig war hingegen, dass die durch den Antagonisten verschobenen Kurven jeweils steiler und im Maximum höher waren als die Kontroll-Agonistenkurve. Man kann also hier nur spekulieren, dass durch die Antagonisten zunächst ein relaxationsvermittelnder Rezeptor geblockt wurde und in Folge nur noch der Effekt des kontraktionsvermittelnden Rezeptors sichtbar war. Obwohl Gewebe der Ratte häufig als funktionelle Modelle in der experimentellen Pharmakologie eingesetzt werden, konnten auf Grund fehlender subtypselektiver Agonisten und Antagonisten die kontraktionsvermittelnden P2-Rezeptorsubtypen im RI nicht identifiziert werden. Des weiteren zeigt ein Vergleich mit dem GPI, dass bedeutende Unterschiede bei der Verwendung gleichen Gewebes zweier verschiedener Spezies existieren können, die bei der vergleichenden Betrachtung von Affinitätswerten von Agonisten und Antagonisten zur Charakterisierung von Rezeptorsubtypen beachtet werden müssen.

GPCRs and ligand-gated ion channels mediate a great variety of physiological effects within the human brain and periphery. The search for selective ligands at these target sites as pharmacological tools or new drug candidates is of great interest. With increasing knowledge of the great diversity of some receptor families, compounds formerly considered to be selective, turned out to be non-selective with regard to recently identified subtypes, splice variants or additional receptor subunits. This work provides SAR studies by means of radioligand binding experiments at serotonergic h5-HT3A and h5-HT4(b) receptors, histamine hH1 receptors and muscarinic hM1-5 receptors. ...

The results presented here strongly indicate that ubiquitination of the recombinant human alpha1 GlyR at the plasma membrane of Xenopus oocytes is involved in receptor internalisation and degradation. Ubiquitination of the human alpha1 GlyR has been demonstrated by radio-iodination of plasma membrane-boundalpha1 GlyRs, whose subunits differed in molecular weight by additional 7, 14 or 21 kDa, corresponding to the molecular weights of one, two and three conjugated ubiquitin molecules, respectively, and by co-isolation of the non-tagged human alpha1 GlyR through hexahistidyl-tagged ubiquitin. Ubiquitin conjugated GlyRs where prominent at the plasma membrane, but could be hardly detected in total cell homogenates, indicating that ubiquitination takes place exclusively at the plasma membrane. Ubiquitination of the alpha1 GlyR at the plasma membrane was no longer detectable when the ten lysine residues of the cytoplasmic loop between transmembrane segments M3 and M4 were replaced by arginines. Despite this proteolytic cleavage continued to take place at the same extent as with the wild type alpha1 GlyR, suggesting that removal of GlyRs from the plasma membrane and routing to lysosomes for degradation were not dependent on ubiquitination. Also replacing a tyrosine in position 339, which was speculated to be part of an additional endocytosis motif, did not lead to a significant reduction of cleavage of the GlyR alpha1 subunits. However, a mutant lacking both, ubiquitination sites and 339Y, was significantly less processed. These results may suggest that the GlyR alpha1 subunit harbors at least two endocytosis motifs, which may act independently to regulate the density of alpha1 GlyR. Apparently, each of the two signals may be capable of compensating entirely the loss of the other. Part two of this Dissertation demonstrates that the correct topology of the glycine receptor alpha1 subunit depends critically on six positively charged residues within a basic cluster, RFRRKRR, located in the large cytoplasmic loop following the C-terminal end of M3. Neutralization of one or more charges of this cluster, but not of other charged residues in the M3-M4 loop, led to an aberrant translocation into the endoplasmic reticulum lumen of the M3-M4 loop. However, when two of the three basic charges located in the ectodomain linking M2 and M3 were neutralized, in addition to two charges of the basic cluster, endoplasmic reticulum disposition of the M3-M4 loop was prevented. We conclude that a high density of basic residues C-terminal to M3 is required to compensate for the presence of positively charged residues in the M2-M3 ectodomain, which otherwise impair correct membrane integration of the M3 segment. Part three of this Dissertation describes my contribution (blue native PAGE analysis of metabolically labeled alpha7 and 5HT3A receptors and the examination of the glycosylation state of metabolically labeled alpha7 subunits) to a work on the limited assembly capacity of Xenopus oocytes for nicotinic alpha7 subunits. While 5HT3A subunits combined efficiently to pentamers, alpha7 subunits existed in various assembly states including trimers, tetramers, pentamers, and aggregates. Only alpha7 subunits that completed the assembly process to homopentamers acquired complex-type carbohydrates and appeared at the cell surface. We conclude that Xenopus oocytes have a limited capacity to guide the assembly of alpha7 subunits, but not 5HT3A subunits to homopentamers. Accordingly, ER retention of imperfectly assembled alpha7 subunits rather than inefficient routing of fully assembled alpha7 receptors to the cell surface limits surface expression levels of alpha7 nicotinic acetylcholine receptors. Part four of this Dissertation describes my contribution (the biochemical analysis of the human P2X2 and P2X6 subtypes) to studies on the quaternary structure of P2X receptors. Armaz Aschrafi, the main author of the paper showed that subsequent to isolation under non-denaturing conditions from Xenopus oocytes the His-rP2X2 protein migrated on blue native PAGE predominantly in an aggregated form. The only discrete protein band detectable could be assigned to homotrimers of the His-rP2X2 subunit. Because of the exceptional assembly-behaviour of the rP2X2 protein compared to the rP2X1, rP2X3, rP2X4 and rP2X5 proteins, its human orthologue was investigated in the same manner. In contrast to rP2X2 subunits, hP2X2 subunits migrated under virtually identical conditions in a single defined assembly state, which could be clearly assigned to a trimer. P2X6 subunits represent the sole P2X subtype that is unable to form functional homomeric receptors in Xenopus oocytes. The blue native PAGE analysis of metabolically labeled hP2X6 receptors and the examination of the glycosylation state revealed that hP2X6 subunits form tetramers and aggregates that are not exported to the plasma membrane of Xenopus oocytes.