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Membranproteine der renalen Bürstensaumzellen spielen eine wichtige Rolle beim Transport von organischen Kationen in der Niere. Mit der ersten Klonierung eines Transporters für organische Kationen wurden die Grundlagen für eine Aufklärung der Transportvorgänge auf molekularer Ebene gelegt. Der Transportmechanismus und die physiologische Funktion des in den Plasmamembranen von Niere und Gehirn exprimierten Transporters für organische Kationen 2 (OCT2) werden zur Zeit -- teilweise kontrovers -- diskutiert. In dieser Dissertation wurde der aus der Rattenniere klonierte elektrogene Transporter für organische Kationen rOCT2 nach heterologer Expression in Oozyten des Krallenfrosches Xenopus laevis mit elektrophysiologischen Methoden charakterisiert. Zur Anwendung kam neben der konventionellen Zwei­Elektroden­Spannungsklemme vor allem die ''giant patch clamp"­Technik. Als neue Methode speziell für Transstimulationsexperimente bei geklemmtem Membranpotenzial wurde die amperometrische Spannungsklemme entwickelt, mit der ein Ausstrom von Dopamin aus vorinkubierten Oozyten mittels Oxidation an einer Carbonfaser­Elektrode bei gleichzeitiger Aufzeichnung des elektrischen Transmembranstromes gemessen werden kann. Die Kontrolle der physiologischen Salzlösungen beiderseits der Membran in ''patch clamp"­ Experimenten erlaubte eine leichte Unterscheidung wechselwirkender Substanzen in Substrate wie: Cholin, Dopamin, Tetramethylammonium und Tetraethylammonium und Hemmstoffe wie: Chinin und Tetrabutylammonium (TBA). Anhand von substratinduzierten elektrischen Ausströmen konnten erstmalig für einen Transporter für organische Kationen apparente Substrataffinitäten von der zytoplasmatischen Seite bestimmt werden. Sie liegen in derselben Größenordnung wie zuvor auf der extrazellulären Seite bestimmte Affinitäten. Der schon früher vorgeschlagene elektrogene Ausstrom von Substrat auch gegen ein negatives Membranpotenzial wurde damit bestätigt. Es wurde eine Hemmung rOCT2­vermittelter Ströme durch Schwermetalle und durch Isobutylmethylxanthin gefunden. Die zytoplasmatische Zugabe der Inhibitoren TBA und Chinin hemmte sowohl substratinduzierte Einwärts­ als auch Auswärtsströme. Die Inhibierung der Auswärtsströme erfolgte dabei kompetitiv. Von der extrazellulären Seite aus hemmte Chinin im Gegensatz zu TBA Einwärtsströme nichtkompetitiv, was auf eine Transinhibierung nach einer unspezifischen Membranpassage des Chinins hindeutet. Die Analyse von Strom­Spannungskennlinien zeigte, dass die maximalen Transportraten und apparenten Affinitäten der Substrate spannungsabhängig sind. Umkehrpotenziale, die in Anwesenheit von Substrat beiderseits der Membran gemessen wurden, lagen bei den durch die Nernstgleichung vorhergesagten Werten. Dieses Ergebnis identifiziert das elektrochemische Potenzial als treibende Kraft für den Transport von organischen Kationen bei neutralem pH und schließt die Existenz eines elektroneutralen Organische­Kationen/Protonen­Austauschmodus aus. Die rOCT2­spezifische Leitfähigkeit war bei sättigenden Konzentrationen von organischen Kationen beiderseits der Membran im Vergleich zu halbsättigenden reduziert. Diese Beobachtung ist mit einem zyklischen Transportmodell erklärbar, bei dem der Transporter nach erfolgtem Transport eines organischen Kations entweder als leerer Transporter oder mit einem auf der anderen Seite gebundenen Kation in seine Ausgangstellung zurückkehren kann, wobei die Translokation der Bindungsdomäne jeweils mit einer Konformationsänderung des Transporters einhergeht. Der Austausch von organischen Kationen erfolgt dabei elektroneutral. Einen weiteren Beleg für einen elektroneutralen Austauschmodus für organische Kationen liefern amperometrische Messungen an reversibel mit Dopamin beladbaren Oozyten. Es konnte ein rOCT2­vermittelter, durch Chinin hemmbarer Dopaminausstrom gemessen werden, der in Abhängigkeit des Membranpotenzials durch extrazelluläres Cholin entweder transstimulierbar oder transinhibierbar war. Die im Rahmen dieser Dissertation durchgeführten Untersuchungen belegen, dass rOCT2 als basolateral lokalisierter Transporter hervorragend dazu geeignet ist, mit der vom elektrochemischen Potenzial getriebenen Substrataufnahme in die Bürstensaumzellen den ersten Schritt der Sekretion von organischen Kationen durch die Niere zu leisten. Die Ergebnisse zeigen weiterhin, dass rOCT2 bei einem ausreichenden Konzentrationsgradienten von Cholin bei der physiologisch bedeutsamen Reabsorption von Cholin beteiligt sein könnte, indem dieses gegen das negative Membranpotenzial, womöglich im Austausch gegen ein anderes organisches Kation, transportiert wird. Zeitaufgelöste Messungen mit Substrat­ oder Spannungssprüngen sowie Bindungs­ und Transportstudien nach gezielter Mutagenese könnten zukünftig einer weiteren Aufklärung des Transportmechanismus dienen. Einige die Charakterisierung von rOCT2 in ''inside out"­Patchen betreffende Ergebnisse dieser Dissertation wurden bereits im Journal of Biological Chemistry veröffentlicht und auf internationalen Konferenzen präsentiert. Andere Ergebnisse sind Teil einer vom American Journal of Physiology zur Veröffentlichung angenommenen Arbeit und eine weitere Veröffentlichung ist in Vorbereitung.

CFTR ist ein Chloridkanal, der bei der rezessiven Erbkrankheit Mukoviszidose defekt ist. Es ist bekannt, dass CFTR durch Proteinkinasen aktiviert und seine Aktivität durch Nukleotide reguliert wird. Die Regulation von CFTR wurde unter zwei verschiedenen Gesichtspunkten untersucht. Zum einen wurden Experimente durchgeführt, die Aufschluss über die Beteiligung der Nukleotidbindedomänen beim Öffnen und Schließen des Kanals und über die Notwendigkeit einer ATP-Hydrolyse geben sollten. Zum anderen wurde untersucht, ob neben der durch Proteinkinasen vermittelten Aktivierung von CFTR ein alternativer Prozess existiert. Hierbei wurde ein Regulationsmechanismus entdeckt, der eine Proteinkinase-unabhängige Aktivierung von CFTR durch Phosphatidylinositolphosphate ermöglicht. Humaner CFTR wurde in Oozyten des Krallenfrosches Xenopus laevis heterolog exprimiert und mit der Patch-Clamp-Methode untersucht. Stationäre und zeitaufgelöste Ströme des CFTR-Wildtyps wurden mit mutierten CFTR-Kanälen verglichen. Das Lysin im Walker AMotiv ist an der Koordinierung des γ-Phosphats von MgATP bei der Hydrolyse beteiligt, so dass Walker A-Mutationen die ATP-Bindung und –Hydrolyse von ATPasen beeinflussen. In dieser Arbeit wurden Walker A-Mutanten untersucht, die eine Substitution des konservierten Lysins innerhalb der Walker A-Sequenz der NBD1 (K464A) oder beider Nukleotidbindedomänen (K464A/K1250A) aufwiesen. Da die Öffnungsgeschwindigkeit der Mutante K464A kaum einen Unterschied zu der des Wildtyps aufzeigte, die Mutante K1250A jedoch das Öffnen stark verlangsamte, wurde gefolgert, dass keine Hydrolyse von ATP an der NBD1 für die Öffnung nötig ist. Während Wildtyp-Kanäle auf eine gleichzeitige Applikation von ATP und AMP-PNP, einem nichthydrolysierbaren ATP-Analogon, mit einem verlängerten Offenhalten der Kanäle („locked open“–Effekt) reagierten, das sich in einem langsamen Schließen der Kanäle äußerte, konnte bei K464A-Mutanten dieser Effekt nicht beobachtet werden. Außerdem erfolgte das Schließen der Doppelmutante K464A/K1250A im Vergleich zur Einzelmutante K1250A nach MgATP-Entzug schneller. Daraus wurde geschlossen, dass die NBD1 auf das durch die NBD2 vermittelte Offenhalten des Kanals, möglicherweise durch eine direkte Interaktion, regulierend einwirkt, bevor letztere den Kanal wieder schließt. Da auch ein Öffnen und Schließen des CFTR-Kanals unter Mg2+-freien Bedingungen zu beobachten war, unter denen keine ATP-Hydrolyse erfolgen kann, konnte die Notwendigkeit einer ATP-Hydrolyse bezüglich des Kanalgatings ausgeschlossen werden. Ein Einwirken der NBD1 auf das Offenhalten der Kanäle durch die NBD2 war unter nicht-hydrolytischen Bedingungen anhand des Vergleichs der Schließkinetiken von WT und Mutante K464A nicht feststellbar, so dass eine direkte Interaktion beider Nukleotidbindedomänen wahrscheinlich ausgeschlossen werden kann. Im zweiten Teil dieser Arbeit wurde der Effekt des Phospholipids Phosphatidylinositol-4,5-bisphosphat (PIP2) auf CFTR-Kanäle untersucht. Die Applikation von PIP2 und MgATP zu unphosphorylierten CFTR-Kanälen zeigte einen deutlichen Stromanstieg, der einem Chloridstrom entsprach. Einzelkanaluntersuchungen ergaben, dass durch PKA induzierte Kanäle und Einzelkanäle, die durch PIP2 aktiviert wurden, dieselbe Leitfähigkeit von ~5 pS besaßen. Somit konnte eine PIP2-induzierte Aktivität endogener Chloridkanäle ausgeschlossen und ein Einfluss des Phospholipids auf CFTR-Chloridkanäle bewiesen werden, der zudem ATP-abhängig war. Neben PIP2, welches den stärksten Effekt auf die CFTR-Aktivität zeigte, konnten auch Phosphatidylinositol (PI) und Phosphatidylinositol-4-monophosphat (PIP), sowie Arachidonsäure unphosphorylierte CFTR-Kanäle aktivieren. Damit wurde gezeigt, dass der Effekt des Signalanstiegs durch Phosphatidylinositole abhängig von der Struktur des Moleküls war, also von der Anzahl der Phosphatgruppen am Inositolring und der Fettsäurezusammensetzung des Phospholipids. Experimente, die unter Mg 2+-freien Bedingungen durchgeführt wurden, so dass eine Phosphorylierungsreaktion durch Kinasen ausgeschlossen werden konnte, zeigten dennoch eine PIP2-vermittelte Aktivierung von unphosphorylierten CFTR-Kanälen. Auch eine Substitution des nicht-hydrolysierbaren ATP-Analogons AMP-PNP anstelle von ATP erlaubte die Öffnung unphosphorylierter CFTR-Kanäle. Mit diesen beiden Ergebnissen wurde gezeigt, dass eine PIP2-vermittelte Aktivierung von unphosphorylierten CFTR-Kanälen unabhängig von einer Proteinphosphorylierung ist. Physiologisch betrachtet könnte man sich vorstellen, dass über die Aktivierung von Lipidkinasen die Synthese von PIP2 über PI und PIP stimuliert wird, so dass das Phospholipid, wie für viele Ionenkanäle und Transporter gezeigt, eine direkte Interaktion mit dem Protein eingeht. Eine ATP-abhängige Synthese von PIP2 in Makropatches an Xenopus-Oozyten durch endogene Lipidkinasen könnte eine mögliche Erklärung für den gezeigten ATP-abhängigen Anstieg des CFTR-Signals sein. In dieser Arbeit wurde bei CFTR-Kanälen zum ersten Mal ein alternativer Regulationsmechanismus über Phosphatidylinositolphosphate identifiziert, der Proteinkinaseunabhängig ist und der möglicherweise über eine direkte Interaktion zwischen dem Phospholipid und dem Protein vermittelt wird.