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Mitochondrien, Organellen der oxidativen Phosphorylierung, sind in vielfältiger Weise an Alterungsprozessen in unterschiedlichen Modellorganismen beteiligt. Viele Mechanismen und Faktoren, die das Altern beeinflussen, scheinen konserviert zu sein. In dem in dieser Arbeit untersuchten Ascomyzeten Podospora anserina treten z. B. altersabhängige Reorganisationen der mtDNA auf, die zu einem Verlust lebensnotwendiger Gene führen können. In Menschen wurden ebenfalls Umstrukturierungen des mitochondrialen Genoms in unterschiedlichen Geweben mit fortschreitendem Alter beschrieben. Umgekehrt treten manche Faktoren, die die Lebensspanne beeinflussen, nur in einigen Modellsystemen auf. Hierzu gehört z. B. die Induktion der alternativen Oxidase in vielen langlebigen P. anserina-Mutanten. Diese Modifikation in der Atmungskette kann in S. cerevisiae und Säugern nicht beobachtet werden, da diesen Organismen eine alternative terminale Oxidase der oxidativen Phosphorylierung fehlt. Der Fragestellung, wie die Atmungskette im Falle der exklusiven PaAOX-abhängigen Respiration in der unsterblichen Mutante ex1 hinsichtlich der Zusammensetzung und kinetischer Eigenschaften des Elektronentransports charakterisiert ist, wurde in der vorliegenden Arbeit nachgegangen. Über die funktionalen Eigenschaften der Mitochondrien hinaus ist auch die Morphologie dieser Organellen altersabhängiger Änderungen unterworfen. Hinsichtlich der Gestalt der Mitochondrien in verschiedenen Altersstadien ist nur sehr wenig bekannt. Bisher steht nur fest, dass der P. anserina-Wildstamm „S“ im mittelalten Stadium filamentöse Mitochondrien aufweist. Ob und in welchem Ausmaß es zu Veränderungen der mitochondrialen Morphologie während des Alterns im Wildstamm „s“ und der Mutante grisea kommt, wurde im Rahmen der vorliegenden Arbeit analysiert. In der vorliegenden Arbeit wurde darüber hinaus PaDnm1 als putativer mitochondrialer Teilungsfaktor charakterisiert. Insbesondere die Modulation der PaDnm1-Expression durch Überexpression bzw. Deletion soll zeigen, welchen Einfluss PaDnm1 auf die mitochondriale Morphologie und andere phänotypische Parameter wie z. B. die Lebensspanne hat. Die in dieser Arbeit durchgeführten Untersuchungen führten zu folgenden Ergebnissen: 1. Im Wildstamm „s“ wurde im Gegensatz zu ex1 durch enzymkinetische Analysen eine starke Interaktion der Komplexe I und III nachgewiesen. Ein Großteil der Komplexe I und III ist im Wildstamm „s“ in Form von Superkomplexen organisiert. In der Mutante ex1 liegen die Komplexe I und III dagegen hauptsächlich frei vor. Die spezifische Aktivität der Cytochrom-c-Reduktase ist in ex1 niedriger als im Wildstamm „s“. 2. Seneszente Isolate des Wildstammes „s“ und der PaDnm1::ble-Mutante weisen im Gegensatz zur Mutante grisea eine starke Freisetzung von Wasserstoffperoxid auf. 3. Juvenile und mittelalte Wildstamm „s“-Isolate enthalten überwiegend kurze, filamentöse Mitochondrien, die entlang der Hyphenachse im Cytoplasma orientiert sind. Im seneszenten Stadium kommt es zu einer starken mitochondrialen Fragmentierung. Der Übergang von einer filamentösen zu einer sphärischen Morphologie dieser Organellen tritt auch in Mutante grisea auf. In ex1-Hyphen sind hauptsächlich filamentöse Mitochondrien enthalten. Initiale Analysen zur mitochondrialen Feinstruktur zeigen, dass in Wildstamm „s“ und Mutante grisea eine lamellenartige Cristaestruktur erkennbar ist. In der Mutante ex1 hingegen erscheinen die Cristae ungeordneter und weniger zahlreich. 4. Die Mitochondrienfragmentierung im seneszenten Wildstamm „s“ korreliert mit einer Induktion der Transkription von PaDnm1. In Mutante grisea ist die PaDnm1-Transkriptmenge während des Alterns konstant, obwohl sich die mitochondriale Morphologie wie im Wildstamm „s“ verändert. Überexpression von PaDnm1 führt zur Mitochondrienfragmentierung während die gezielte Deletion dieses Gens eine starke Elongation der Mitochondrien zur Folge hat. PaDnm1 ist somit das erste in einem filamentösen Pilz charakterisierte Gen der mitochondrialen Teilungsmaschinerie. 5. PaDnm1::ble-Isolate zeigen im seneszenten Stadium mitochondriale Fragmentierung wie Wildstamm „s“ und Mutante grisea. Das mitochondriale Genom von PaDnm1::ble ist stabilisiert, d. h. die Bildung der seneszenzfördernden plDNA wird unterdrückt. Die mittlere Lebensspanne der PaDnm1::ble-Mutante ist deutlich (> Faktor 10) gegenüber der des Wild-stammes „s“ erhöht. Bemerkenswerterweise zeigt PaDnm1::ble im Gegensatz zu anderen langlebigen P. anserina-Mutanten nach der Sporenkeimung keine physiologischen Defekte: Wuchsrate, männliche und weibliche Fertilität, Myzelmorphologie und Mitochondrien-segregation während der Ascosporengenese sind nicht eingeschränkt. Allerdings weist PaDnm1::ble eine erhöhte Empfindlichkeit gegenüber Ammoniumazetat auf. Dies äußert sich in einer Inhibierung der Sporenkeimung und einer Verringerung der Wuchsrate bei Anzucht der Mutante auf AmAc-haltigem Medium.

Die Grundlage dieser Arbeit bilden Befunde über den Kupfer-Metabolismus des Ascomyceten Podospora anserina. In der Kupfermangel-Mutante grisea ist der Transkriptionsfaktor GRISEA inaktiv, welcher die Aktivität der hochaffinen Kupfer(I)-Permease PaCTR3 kontrolliert. Der Kupfer-Mangel aller Zellkompartimente führt zu pleiotropen Effekten und zu einer moderaten Verlängerung der mittleren Lebensspanne (60%). Um Effekte des Kupfermangels, die positiven bzw. negativen Einfluß auf die Lebensspanne zeigen, voneinander zu trennen, erschien es vielversprechend, den Kupfermangel auf ein Kompartiment der Zelle zu beschränken. In Hefe komplexiert COX17 Kupfer und gibt es im mitochondrialen Intermembranraum an SCO1 und COX11 (Assemblierungsfaktoren der Cytochrom-c-Oxidase) weiter. Zur Aufschlüsselung Kupfer-abhängiger Stoffwechsel-Wege wurde in dieser Arbeit eine PaCox17-Nullmutante konstruiert und charakterisiert. Die PaCox17::ble-Deletionsmutante ist durch AOX-Respiration, hohe Aktivität der Cu/Zn-SOD und ein stabilisiertes Chondriom charakterisiert. Eine vergleichende Analyse von Mutante und Wild-Stamm führte zu folgenden Ergebnissen: 1. Die Disruption des PaCOX17-Weges verhindert die Assemblierung der COX beinahe völlig. COX-Respiration kann nur in sehr geringem Umfang nachgewiesen werden. 2. Der Ausfall der COX induziert die alternative Oxidase und führt zu AOX-Respiration. 3. Die Atmungsrate der Mutante PaCOX17::ble ist, aufgrund der AOX-Respiration, gegenüber dem Wild-Stamm annähernd verdreifacht. 4. Weiterhin zeigen PaCox17::ble-Stämme ein stabilisiertes mitochondriales Genom, normalerweise wird weder plDNA amplifiziert noch wird beta-senDNA gebildet. 5. Der Kupfer-Spiegel des Zytoplasmas ist gegenüber Wild-Stämmen stark erhöht. 6. PaCox17::ble-Stämme sind durch konstant starke Expression der Cu/Zn-SOD charakterisiert. Die Mn-SOD spielt eine untergeordnete Rolle. 7. Die beschriebenen Effekte führen zu einer enormen Verlängerung der mittleren Lebensspanne (1250% des Wild-Stammes). Neben der Isolation und Charakterisierung der Mutante PaCox17::ble wurde PaSco1 isoliert und initial charakterisiert. PaSco1 liegt in P. anserina wahrscheinlich in einer Kopie vor. Es kodiert das Kupferbindeprotein PaSCO1, welches Kupfer vermutlich von PaCOX17 übernimmt und an die Untereinheit 2 der COX weitergibt. In dieser Arbeit wurden Teilaspekte des Kupfermetabolismus von P. anserina untersucht. Von besonderem Interesse waren Zusammenhänge zwischen Kupfer-Metabolismus und mitochondrialen Funktionen. Einen weiteren Schwerpunkt bildeten entwicklungsbiologische Prozesse, der Alterungsprozess war von übergeordneter Bedeutung. Es konnte gezeigt werden, daß Störungen der Kupfer-Homöostase die Respiration, den zellulären oxidativen Stress, die Stabilität des Chondrioms und diverse Entwicklungsprozesse, wie beispielsweise Fortpflanzung und Alterung des Hyphenpilzes beeinflussen.

Die im Rahmen dieser Arbeit durchgeführten Untersuchungen führten zu folgenden Ergebnissen: 1. In-silico Analysen von putativen Apoptose-Faktoren im Genom von P. anserina Es konnten mehrere Gene, die in einer Apoptose-Maschinerie involviert sein könnten, im Genom von P. anserina identifiziert werden. Diese Homologen wurden in zwei Ka-tegorien unterteilt: (i) die nicht-mitochondrialen Proteine PaMCA1, PaMCA2 und PaPARP und (ii) die Homologen des Apoptose-induzierenden Faktors AIF. 2. Einfluss der Metacaspase-Aktivität auf programmierte Zelltodprozesse Mithilfe von Aktivitätsmessungen konnte eine Arginin-spezifische Aktivität der Meta-caspasen nachgewiesen werden. Diese Metacaspase-Aktivität nimmt in seneszenten Kulturen und nach H2O2-Behandlung signifikant zu. Diese Ergebnisse unterstützen die Hypothese eines programmierten, ROS-induzierten Zelltods im letzten Entwicklungs-stadium des Alternsmodell P. anserina. 3. Die Rolle von AIF-Homologen in der Entwicklung von P. anserina GFP-Fusionsproteine identifizierten eine mitochondriale Lokalisation der AIF-Homologen PaAIF2, PaAMID2 und PaPRG3. Desweiteren konnte eine altersabhängige PaAIF2-Translokation von den Mitochondrien zum Zellkern gezeigt werden, ähnlich der Apoptose-induzierenden Translokation von humanem AIF. Die Deletion von PaAif2 und PaAmid2 führte zu einer signifikanten Resistenz gegenüber oxidativem Stress und zu einer Verlängerung der Lebensspanne. Diese Befunde weisen auf einen ROS-induzierten, AIF-vermittelten Zelltod hin, der an der Lebensspannen-Kontrolle von P. anserina beteiligt ist. 4. Die Funktion des Proteins PaCYPD bei Seneszenz und programmiertem Zelltod Membranpotential-Messungen konnten einen Rückgang des mitochondrialen Memb-ranpotentials von 21 % bei den PaCYPD-Überexpressionsstämmen nachweisen. Durch die Behandlung mit dem spezifischen PaCYPD-Inhibitor CSA konnte das Membranpo-tential wieder normalisiert werden. Zusammen mit dem detektierten Verlust von 7 Zusammenfassung 125 Cytochrom c in den Mitochondrien der Überexpressionsstämme wird durch diese Studi-en die Vermutung einer PaCYPD-abhängigen Öffnung der mPTP untermauert. Die Pa-PaCypD-Deletion führte zu einer signifikanten Resistenz gegenüber mitochondrial-abhängigem, oxidativem Stress und gegenüber verschiedenen Apoptose-Induktoren. Die Überexpression von PaCypD hingegen führte zu einem beschleunigten Alterungspro-zess (Präseneszenz), einem verschlechterten Resistenzverhalten gegenüber Stress- und Apoptose-Induktoren und zu einer massiven Verkürzung der Lebensspanne. Die Le-bensspanne konnte aber durch die Behandlung mit CSA wieder auf Wildtyp-Niveau verbessert werden. Dies weist auf einen PaCYPD-vermittelte Zelltod hin. Interessan-terweise konnte durch das Wachstum auf CSA-haltigem Medium auch die Lebensspanne des Wildtyps verlängert werden. Um die hier nachgewiesene, lebensver-längernde Wirkung von CSA zu verifizieren, könnte diese Studie leicht auf andere Modellorganismen übertragen werden.

Ziel dieser Dissertation war es, die biologische Rolle der Autophagie für die Entwicklung, Alterung und mitochondriale Qualitätskontrolle in dem Ascomyceten Podospora anserina zu untersuchen. Folgende Ergebnisse wurden dabei erzielt: 1. Der Verlust einer funktionalen Autophagie-Maschinerie ist in P. anserina mit einem Defekt der Sporen-Entwicklung bzw. -Keimung charakterisiert. 2. Es konnten drei Methoden zur Untersuchung der Autophagie in P. anserina etabliert werden: 1) Die Verwendung eines Gfp::PaAtg8-Stamms ermöglicht die Fluoreszenzmikroskopische Bestimmung der Autophagosomen-Anzahl; 2) Die phänotypische Charakterisierung des PaAtg1-Deletionsstamms unter verschiedenen Stressbedingungen (z. B. Stickstoffmangel, Rapamycin) liefert Hinweise auf eine mögliche Autophagie-abhängige Stressadaption; 3) Die Verwendung des „GFPcleavage assays“ ermöglicht einen quantitativen Nachweis genereller und selektiver Autophagie (hier: Mitophagie). 3. In zwei voneinander unabhängigen Experimenten wurde ein altersabhängiger Anstieg der Autophagie für P. anserina demonstriert: Das Autophagie-Niveau nimmt in gealterten P. anserina-Kulturen zu. Gleichzeitig resultiert der Verlust der Autophagie in ∆PaAtg1 in eine reduzierte Lebensspanne. Unter Stressbedingungen (hier: Stickstoffmangel) wird dieser positive Einfluss der Autophagie auf die Lebensspanne im Wildtyp sogar noch verstärkt. 4. Der unerwartet „gesunde“ Phänotyp der PaSod3-Deletionsmutante ist abhängig von einer funktionalen Autophagie-Maschinerie. Der Mitophagie wurde eine besondere Rolle als Kompensationsmechanismus für den Verlust von PaSOD3 zugeteilt, da das Mitophagie-Niveau in dieser Mutante erhöht ist. Am Beispiel dieser Mutante, für die ein erhöhter Superoxid-Ausstoß nachgewiesen wurde, konnte eine Dosis-abhängige Wirkung von ROS in P. anserina identifiziert werden. Eine geringe zelluläre ROSMenge verursacht eine mitohormetische Reaktion, die eine Induktion der Mitophagie zur Folge hat und sich positiv auf den Organismus auswirkt. Übersteigt die zelluläre ROS-Dosis einen kritischen Punkt, kommt es zur Induktion des autophagischen Zelltods und damit zum vorzeitigen Tod des Individuums. 5. Der Verlust der PaCLPXP-Protease führt zu Beeinträchtigungen in der Funktion und Zusammensetzung der mitochondrialen Atmungskette. Dieses Defizit im Energiemetabolismus wird über eine Induktion der AOX, vor allem aber über eine ZUSAMMENFASSUNG 127 gesteigerte Autophagie kompensiert. Die deutlich verlängerte Lebensspanne der verschiedenen PaClpXP-Deletionsmutanten (∆PaClpX, ∆PaClpP und ∆PaClpXP) ist abhängig von einer funktionalen Autophagie-Maschinerie. Interessanterweise konnte keine kompensatorische Funktion der Autophagie oder Mitophagie für den Verlust der mitochondrialen i-AAA-Protease PaIAP in P. anserina nachgewiesen werden. Autophagie/Mitophagie stellt einen übergeordneten Qualitätskontrollmechanismus in P. anserina dar, der den Organismus sehr effektiv vor zellulären Schäden und Dysfunktionen bewahrt und einen positiven Einfluss auf die Alterung, Entwicklung und Energieversorgung einnimmt.

Der Pilz Podospora anserina ist seit mehr als fünf Jahrzehnten ein wichtiger Modellorganismus für die Alternsforschung. Insbesondere die Mitochondrien, essentielle eukaryotische Zellorganellen – wegen ihrer Funktion im Energiestoffwechsel häufig auch als „zelluläre Kraftwerke“ bezeichnet, sind Schlüsselfaktoren für den Alterungsprozess dieses Organismus. Im Rahmen einer vorangegangenen Diplomarbeit wurde daher der Einfluss der mitochondrialen CLPXP-Protease, einem bisher noch wenig erforschten Bestandteil der Proteinqualitätskontrolle in Mitochondrien, auf die Alterung von P. anserina untersucht. Mitochondriale CLPXP-Proteasen sind, wie auch ihre bakteriellen Pendants, aus zwei verschiedenen Untereinheiten aufgebaut: der Protease-Komponente CLPP und der Chaperon-Komponente CLPX. Die Deletion des Gens PaClpP, kodierend für CLPP in P. anserina, führte zu einer überraschenden Verlängerung der gesunden Lebensspanne der Mutante. Darüber hinaus war es möglich, den pilzlichen PaClpP-Deletionsstamm durch Einbringen von CLPP des Menschen zu komplementieren. Dies beweist, dass die Proteasen CLPP des Menschen und von P. anserina funktionell homolog sind. Dadurch eröffnete sich die Perspektive, diesen einfachen Modellorganismus für die Gewinnung potenziell auf den Menschen übertragbarer Erkenntnisse einzusetzen. Bedeutenderweise ist die menschliche CLPXP-Protease wahrscheinlich involviert in die Entstehung verschiedener Krankheiten, darunter das Perrault-Syndrom sowie einige Krebsarten. Die zugrundeliegenden Mechanismen sind jedoch noch weitestgehend unverstanden. Ziel des in dieser Dissertation beschriebenen Forschungsprojektes war daher die Gewinnung genauerer Einsichten in die molekulare Funktion und die daraus folgende biologische Rolle der mitochondrialen CLPXP-Protease von P. anserina. Der wohl wichtigste Punkt für das detaillierte Verständnis einer Protease ist die Kenntnis ihres Substratspektrums, d. h. der von ihr abgebauten Proteine. Tatsächlich wurde aber bis heute noch in keinem eukaryotischen Organismus eine umfassende Analyse der Substrate einer mitochondrialen CLPXP-Protease vorgenommen. Um diese Wissenslücke zu füllen, wurde in der vorliegenden Arbeit eine ursprünglich in Bakterien entwickelte Verfahrensweise, der sogenannte CLPP „Substrat-trapping Assay“, in P. anserina implementiert. Dafür mussten zunächst die notwendigen handwerklichen Voraussetzungen für den Assay geschaffen werden, insbesondere die effiziente Affinitätsaufreinigung von Proteinen aus isolierten Mitochondrien – einer bisher in P. anserina noch nicht angewandten Technik. Unter Verwendung verschiedener neu hergestellter Varianten der menschlichen Protease-Komponente CLPP, darunter einer proteolytisch inaktiven Variante zum „Einfangen“ von Substraten, konnte der CLPP „Substrat-trapping Assay“ in P. anserina erfolgreich durchgeführt werden. Insgesamt wurden, in Kooperation mit der Arbeitsgruppe von Julian D. Langer (Max-Planck-Institut für Biophysik; Durchführung von massenspektrometrischen Analysen) nahezu 70 spezifische Proteine erstmalig als potenzielle Substrate oder Interaktionspartner einer mitochondrialen CLPXP-Protease identifiziert. Bei einem Großteil dieser Proteine handelt es sich um Enzyme und Komponenten verschiedener Stoffwechselwege – vor allem um solche, die eine zentrale Rolle im mitochondrialen Energiestoffwechsel spielen. Die Ergebnisse der vorliegenden Arbeit legen somit folgende Arbeitsthese als Schlussfazit und gleichzeitig Ausganspunkt für zukünftige Untersuchungen nahe: Die hauptsächliche molekulare Funktion der mitochondrialen CLPXP-Protease in P. anserina ist die Degradation von Stoffwechselenzymen und ihre biologische Rolle demnach die Kontrolle und Aufrechterhaltung des mitochondrialen und zellulären Energiestoffwechsels. Insgesamt ist die auf Grundlage des CLPP „Substrat-trapping Assay“ in P. anserina anzunehmende Rolle der mitochondrialen CLPXP-Protease als regulatorische Komponente des mitochondrialen Energiestoffwechsels erstaunlich gut mit Beobachtungen in anderen eukaryotischen Organismen, gerade bezüglich der Relevanz der CLPXP-Protease des Menschen für diverse Krankheiten, zu vereinbaren. Somit erscheint es überaus sinnvoll und vielversprechend, dass in dieser Doktorarbeit erstellte und bisher beispiellose Kompendium potenzieller in vivo Substrate und Interaktionspartner dieser Protease auch als Referenz für zukünftige Untersuchungen außerhalb von P. anserina anzuwenden.