Refine
Year of publication
Document Type
- Doctoral Thesis (20)
Has Fulltext
- yes (20)
Is part of the Bibliography
- no (20)
Keywords
- Schmerz (3)
- Schmerzforschung (2)
- CNGA3 (1)
- CNGB1 (1)
- Cyclo-GMP (1)
- FTY720 (1)
- G alpha q (1)
- GPCR (1)
- HIF (1)
- Hinterhorn <Rückenmark> (1)
Institute
- Pharmazie (15)
- Biochemie und Chemie (3)
- Biochemie, Chemie und Pharmazie (1)
- Extern (1)
Die Arachidonsäurekaskade spielt bei Entzündungsprozessen und der Schmerzentstehung eine wichtige Rolle. Deren primäre Produkte, die Leukotriene und die Prostaglandine, sind entzündungsfördernde Mediatoren und nehmen Einfluss auf den Entzündungs-auflösendenprozess und sind bei einer Dysregulation für diverse Erkrankungen wie z.B. Asthma bronchiale und allergische Rhinitis mitverantwortlich. Die Kaskade gliedert sich mit ihren beiden Hauptenzymen, Cyclooxygenase und 5-Lipoxygenase (5-LO), in zwei Wege auf. Beide Enzyme sind außerdem in der Lage entzündungsauflösenden Mediatoren zu bilden. Die Mediatoren wie z.B. Lipoxin können im Zellstoffwechsel einerseits über die Lipoxygenase-Route, oder andererseits wie „aspirin-triggered“-Lipoxin von der durch geeignete Wirkstoffe acetylierten Cyclooxygenase-2 (COX-2) katalysiert werden. Diese Mediatoren werden benötigt, um (chronische) Entzündungen und beschädigtes Gewebe zurück zur Homöostase zu führen.
Die Pharmakotherapie chronisch entzündlicher Erkrankungen mit guter Wirksamkeit und verträglichem Profil bei Langzeiteinnahme stellt jedoch eine Herausforderung dar. Die Therapie verzögern oft, z. B bei Einnahme von nicht-steroidalen Antirheumatika (NSAR), die Entzündungsauflösung, da die Bildung von entzündungshemmenden und entzündungs-auflösenden Lipidmediatoren gehemmt werden. Die gezielte Modulation und Einflussnahme auf die Arachidonsäurekaskade an einem der beiden Enzyme, stellt daher einen guten Ansatz für eine verbesserte Therapiemöglichkeit von (chronischen) entzündlichen Krankheiten dar. Diese Arbeit beschäftigt sich mit der Synthese von Modulatoren und Inhibitoren der Arachidonsäurekaskade. Zum einen befasst sie sich mit der Entwicklung von irreversiblen COX-2-acetylierenden Substanzen als neues anti-entzündliches und entzündungsauflösendes Prinzip. Zum anderen mit der Untersuchung der Struktur-Wirkungsbeziehung (SAR) von 2-Aminothiazolen als direkte 5-LO-Inhibitoren ausgehend von SKI-II, welches zuvor als Leitstruktur zur Entwicklung von 5-LO-Inhibitoren entdeckt wurde.
Als Leitstrukturen für die irreversiblen COX-2-acetylierenden Substanzen wurden bekannte COX-2 selektive Substanzen ausgewählt sowie vereinzelte nicht-selektive NSAR. Es wurden an der COX-2 Kristallstruktur Docking-Studien durchgeführt, um die geeignetsten Positionen für die Einführung einer (labilen) Acetylgruppe zu identifizieren. Aufgrund dieser Studien wurden drei Positionen ausgewählt zur Derivatisierung. Es wurden daraufhin zahlreiche Derivate synthetisiert von Celecoxib, Valdecoxib, Rofecoxib, Etericoxib, als Vertreter der (COX-2) selektive Inhibitoren, sowie von Acetylsalicylsäure, Diclofenac und Nimesulid-Analoga als Vertreter der nicht-selektiven NSARs. Zusätzlich wurden Derivate synthetisiert mit Michael-Akzeptoren als kovalente bindende Komponente. Alle synthetisierten Substanzen wurden sukzessiv auf ihre COX inhibitorischen Eigenschaften hin untersucht und auf COX-2 Selektivitäten überprüft. Weiterhin wurden von allen Derivaten Auswaschungs-Studien durchgeführt als Vorversuche welche Derivate eine irreversible COX-2-Inhibition hervorrufen. In den Vorversuchen zeigte die Verbindung ST-1650 am deutlichsten eine COX-2-Selektivität sowie eine starke irreversible Inhibition der COX-2. Die Verbindung ST-1650 wurde weiterhin auf indirekte Hinweise zur Entstehung von heilungsfördernden Mediatoren untersucht anhand von: M1-Macrophagen Polarisation und einem Schmerzmodell, dem Zymosan-Überempfindlichkeit Pfotenmodell. Im Makrophagen-Modell konnte ST-1650 keine Phänotypverschiebung hinzu entzündungsauflösenden M2-Makrophagen bewirken, sowie in den Schmerzmodellen leider keine schnellere Schmerzauflösung als die Kontrollgruppe. Ob diese Effekte durch mangelnde oder zu geringer Entstehung von entzündungshemmenden Mediatoren zurückzuführen ist, ist noch unklar.
Für die SAR der 2-Aminothiazole als direkte 5-LO-Inhibitoren wurden über 60 Verbindungen synthetisiert und untersucht. Zu Beginn erfolgte eine Optimierung der Grundstruktur als 5-LO-Inhibitor. Es wurden die Einflüsse der Substituenten des Thiazolsrings und des Aminolinkers auf die 5-LO-Aktivität ermittelt, um die SAR initialer Arbeiten zu vertiefen. Nach der SAR-Untersuchung im intakten Zellsystem konnten durch Kombination bevorzugter Strukturelemente die zwei Verbindungen ST-1853 und ST-1906, als neue potente 5-LO-Inhibitoren entwickelt werden, die sich als nicht-toxisch herausstellten. Diese beiden 5-LO-Inhibitoren wirken um einen Faktor 10 potenter und sind weniger toxisch verglichen mit der Leitstruktur SKI-II. ST-1853 wurde innerhalb der Arachidonsäurekaskade auch auf Off-targets getestet, deren Aktivitäten sie erst bei 100-fach höherer Konzentration beeinflusst, sowie in humanem Vollblut, wo sie sich ihre 10-fach bessere Wirksamkeit im Vergleich zu SKI-II bestätigte. Darüber hinaus erwies sich ST-1853 bei den ersten Überprüfungen seiner Stabilität unter physiologischen Bedingungen wie bei der in vitro Metabolisierung durch Rattenlebermikrosomen als ausreichend stabil und daher zur weiteren Charakterisierung gut geeignet.
Synthese und Struktur-Wirkungsbeziehungen neuer rezeptorselektiver Dopamin-D 2- und -D 3-Liganden
(2003)
Dopaminrezeptoren gehören zur Familie der G-Protein-gekoppelten Rezeptoren, der bisher größten Rezeptorklasse. Seit der Identifizierung der zuvor unbekannten Rezeptorsubtypen D3-D5 in den Jahren 1990 und 1991 hat die Erforschung des dopaminergen Systems neuen Anschub erhalten, der maßgeblich auf das spezifische Vorkommen jeweiliger Subrezeptoren in diskreten Hirnarealen zurückzuführen ist. Während dopaminerge Neuronen an neurologischen und psychiatrischen Störungen wie Morbus Parkinson, Schizophrenie und Drogenmißbrauch bzw. -abhängigkeit seit geraumer Zeit in einen ursächlichen Zusammenhang gebracht werden, begründen die unterschiedlichen Charakteristika der Rezeptorsubtypen hinsichtlich Lokalisation, Aminosäuresequenz und pharmakologischem Verhalten die Hoffnung, mit subrezeptorselektiven Wirkstoffen neue therapeutische Ansätze verwirklichen zu können, die eine Reduktion der gravierenden, mit bisherigen Therapiekonzepten korrelierten Nebenwirkungen erlauben. In der vorliegenden Arbeit wurden, ausgehend von den D2- und D3-rezeptorbevorzugenden Wirkstoffen ST 177, L-741,626, ST 314, NAN190, ST 198 und BP 897, gezielte Modifikationen an unterschiedlichen Molekülteilen unternommen, um ihre jeweils charakteristischen pharmakologischen Eigenschaften stärker zu profilieren.
Mit der Identifizierung des Histamin-H3-Rezeptorsubtyps im Jahr 1983 begann eine umfangreiche Erforschung seiner Bedeutung und die Suche nach spezifischen Liganden. Die genaue Sequenzaufklärung und Klonierung des humanen Histamin-H3-Rezeptors (hH3R) erst 16 Jahre später ermöglichte eine detaillierte Aufklärung molekularer Vorgänge, deren Auswirkungen auf physiologische und pathophysiologische Prozesse sowie die Entwicklung selektiver hH3R-Liganden. Es zeigte sich, dass der Rezeptor nicht nur die zentrale und periphere Histaminkonzentration im Körper reguliert, sondern auch die Ausschüttung weiterer Neurotransmitter moduliert und damit Einfluss auf zahlreiche neurologische Prozesse nimmt. Diese Erkenntnis macht ihn zu einer wichtigen Zielstruktur bei der Erforschung neuer Therapieansätze verschiedener Erkrankungen des zentralen Nervensystems wie Demenz, Schizophrenie, Narkolepsie, Epilepsie, Adipositas oder neuropatischer Schmerz. Obwohl bereits mehrere Liganden bekannt sind, die diesen Rezeptor adressieren, stellt die Entdeckung alternativer Leitstrukturen und neuer Strukturklassen ein wichtiges Ziel für die Entwicklung potentieller Wirkstoffe dar. Auch das Defizit an bildgebenden Liganden und deren stetig wachsende Nachfrage für eine effiziente Wirkstoffentwicklung und eine detaillierte Rezeptoraufklärung machen den Bedarf an neuen hochselektiven hH3R-Liganden deutlich. Ausgehend von der im eigenen Arbeitskreis etablierten antagonistisch/invers agonistisch selektiv wirkenden 1-(3-Phenoxypropyl)piperidin-hH3R-Leitstruktur wurden zunächst rechtsseitige Strukturerweiterungen in para-Position des zentralen Phenylringes durchgeführt (Abb. 4.1). Hauptbestandteile dieser Substituenten waren basische Strukturelemente oder Heterozyklen mit starker Wasserstoffbrücken-Akzeptorfunktion...
More than 70 years ago, the effects of extracellular adenosine 5'-triphosphate (ATP), a newly identified and purified biomolecule at that time (Fiske and Subbarow, 1925; Lohmann, 1929) were observed by Drury and Szent-Györgyi (1929). Since then, many pharmacological studies were carried out with extracellular adenine nucleotides in various intact organ systems, isolated tissues, and purified cell preparations. Yet it was not until 1972 that Burnstock introduced the concept of "purinergic nerves" and suggested that ATP might fulfil the criteria generally regarded as necessary for establishing a substance as a neurotransmitter, summarised by Eccles (1964):
• synthesis and storage of transmitter in nerve terminals
Strips of guinea-pig taenia coli (GPTC) were shown to take up large amounts of tritium-labelled adenosine when incubated with tritium-labelled adenosine, adenosine 5'-monophosphate (AMP), adenosine 5'-diphosphate (ADP) and ATP. The nucleoside was rapidly converted into and retained largely as [ 3 H]-ATP (Su et al., 1971).
• release of transmitter during nerve stimulation
Spontaneous relaxation of GPTC as well as relaxations induced by nerve stimulation or nicotine, respectively, in the presence of compounds which block adrenergic and cholinergic responses were accompanied by a remarkable increase in release of tritium-labelled material from taenia coli incubated in [ 3 H]-adenosine (Su et al., 1971).
• postjunctional responses to exogenous transmitters that mimic responses to nerve stimulation
Burnstock et al. (1966) characterised ATP and ADP as the most potent inhibitory purine compounds in the gut and observed that the effects of ATP mimic more closely the inhibitory response of the taenia to non-adrenergic nerve-stimulation than to adrenergic nerve stimulation (Burnstock et al., 1970).
enzymes that inactivate the transmitter and/or uptake systems for the transmitter or its breakdown products
When ATP was added to a perfusion fluid recycled through the vasculature of the stomach, very little ATP remained, but the perfusate contained substantially increased amounts of adenosine and inosine, as well as some ADP and AMP (Burnstock et al., 1970).
• drugs that can produce parallel blocking of potentiating effects on the responses of both exogenous transmitter and nerve stimulation
Tachyphylaxis to ATP produced in the rabbit ileum resulted in a consistent depression of responses to non-adrenergic inhibitory nerve stimulation, whereas responses to adrenergic nerve stimulation remained unaffected (Burnstock et al., 1970). Lower concentrations of quinidine reduced and finally abolished relaxation of GPTC induced by noradrenaline (NA) and by adrenergic nerve stimulation. Using higher concentrations of the compound, relaxant responses of GPTC to ATP as well as to non-adrenergic inhibitory nerve stimulation were abolished (Burnstock et al., 1970). ...
Bei anhaltenden Schmerzen wird im Rückenmark zyklisches Guanosinmonophosphat (cGMP) gebildet, welches zur zentralen Sensibilisierung des nozizeptiven Systems beiträgt. In dieser Arbeit wurde untersucht, ob zyklisch Nukleotid-gesteuerte Kanäle (CNG-Kanäle) im nozizeptiven System exprimiert werden und Effektoren der cGMP-vermittelten Schmerz-verarbeitung darstellen könnten. Im Rahmen der Untersuchungen wurden insbesondere die CNG-Kanal-Untereinheiten CNGA3 und CNGB1 als potentielle cGMP-‚Targets‘ in der Schmerzverarbeitung identifiziert. Die Expression von CNGA3 wird infolge einer nozizeptiven Stimulation der Hinterpfote der Maus im Rückenmark und in den Spinalganglien hochreguliert. Mittels In situ-Hybridisierung konnte eine neuronale Lokalisation von CNGA3 in inhibitorischen Interneuronen im Hinterhorn des Rückenmarks detektiert werden, wohingegen CNGA3 in den Spinalganglien nicht-neuronal exprimiert wird. Überraschenderweise wiesen Mäuse mit einem CNGA3-Knockout (CNGA3-/--Mäuse) ein gesteigertes nozizeptives Verhalten in Modellen für inflammatorische Schmerzen auf, während ihr Verhalten in Modellen für akute und neuropathische Schmerzen normal ausfiel. Zudem entwickelten CNGA3-/--Mäuse nach intrathekaler Applikation von cGMP-Analoga oder NO-Donoren eine verstärkte Allodynie. Die CNG-Kanal-Untereinheit CNGB1 wird ebenfalls in Rückenmark und Spinalganglien exprimiert. Im Rückenmark wird die CNGB1-Expression infolge eines nozizeptiven Stimulus der Hinterpfote nicht reguliert, während in den Spinalganglien eine Hochregulation stattfindet. Mit immunhistochemischen Färbungen konnte CNGB1 in Neuronen im Hinterhorn des Rückenmarks, aber auch diffus verteilt in Laminae I bis III des Hinterhorns lokalisiert werden. Auch Mäuse mit einem CNGB1-Knockout (CNGB1-/--Mäuse) zeigten ein gesteigertes nozizeptives Verhalten in einem Modell für inflammatorische Schmerzen und entwickelten außerdem eine verstärkte Allodynie nach i.t. Injektion eines cGMP-Analogons. Diese Ergebnisse lassen vermuten, dass CNGA3 und CNGB1 als ‚Targets‘ des cGMP-vermittelten Signalweges im Rückenmark in inhibitorischer Weise zur zentralen Sensibilisierung während inflammatorischer Schmerzen beitragen. Eine spezifische pharmakologische Aktivierung von CNG-Kanälen im Rückenmark könnte potentiell eine neue Möglichkeit sein, inflammatorische Schmerzen zu hemmen.
Der G-Protein-gekoppelte Histamin-H3-Rezeptor (H3R) ist einer von vier bekannten Histamin-Rezeptorsubtypen. Die Verbreitung erstreckt sich hauptsächlich auf das ZNS, wo der Rezeptor maßgeblich an der Regulation des Schlaf-Wach-Rhythmus, der Kognition, der Aufmerksamkeit und dem Ernährungsverhalten beteiligt ist. Als Autorezeptor reguliert er die Darstellung und Freisetzung von Histamin im Gehirn und moduliert darüberhinaus als Heterorezeptor auch die Konzentration anderer wichtiger Neurotransmitter. Ein Ansatz für die Entwicklung neuer Arzneistoffe bei multifaktoriellen Erkrankungen entspringt der Hybridtheorie. In dieser Arbeit wurde der Hybridansatz durch verschiedene Varianten realisiert, bei denen die jeweiligen Pharmakophore durch Überlappung oder Aneinanderkopplung verknüpft wurden. Als Grundstruktur für das H3-Pharmakophor diente das 4-(3-Piperidin-1-ylpropoxy)-phenyl-Element, als andersartige Pharmakophore dienten neben Arzneistoffen aus der Gruppe der Neuroleptika, Antidepressiva und SSRI auch solche Pharmakophore, die das Wirkprofil von H3R-Liganden durch spezifische Eigenschaften (z. B. neuroprotektiv) ergänzen können. Bei der Kopplung der Pharmakophore lag der Fokus auf der Untersuchung von Aminvariationen. Mit Hilfe des Hybridansatzes wurden in dieser Arbeit zahlreiche neue und potente Histamin-H3-Hybridliganden entwickelt. Es wurden hohe Bindungsaffinitäten im nano- bis subnanomolare Bereich erzielt und wichtige Struktur-Wirkungsbeziehungen abgeleitet. In-vitro zeigte sich eine hohe Toleranz des H3R bezüglich der heterogenen Liganden, darunter solche mit sterisch anspruchsvollen, stark basischen und sauren Gruppen.
Im Hinterhorn des Rückenmarks werden aus der Peripherie kommende nozizeptive Reize auf zentrale Neurone umgeschaltet. Sphingosin-1-Phosphat ist ein potentieller Modulator dieser spinalen nozizeptiven Transmission. Vorarbeiten zeigten, dass die intrathekale Applikation von S1P zu einer Verringerung des nozizeptiven Verhaltens führt. Aus diesem Grund sind sowohl Enzymsysteme, welche die spinale S1P-Konzentration regulieren, als auch spezifische S1P-Rezeptoren und deren Aktivatoren und Inhibitoren potentielle ‚Targets’ und ‚Tools’ für eine suffiziente Schmerztherapie. Zur Charakterisierung der dem antinozizeptiven Effekt von S1P zugrunde liegenden Mechanismen konnte im Rahmen dieser Arbeit gezeigt werden, dass die S1P-Rezeptoren S1P1 und S1P2 in den für die Schmerzverarbeitung wichtigen äußeren Laminae I-III des dorsalen Hinterhorns des Rückenmarks exprimiert werden. S1P verringert über Aktivierung Gi-Protein-gekoppelter Rezeptoren die Hemmung der cAMP-Synthese in exzitatorischen Rückenmarksneuronen dieser Laminae, was die antinozizeptive Wirkung von S1P erklären könnte. Zur Aufklärung der Regulation der S1P-Konzentration im Rückenmark nach peripherer nozizeptiver Stimulation sollte die Aktivität S1P metabolisierender Enzyme näher betrachtet werden. Es konnte nachgewiesen werden, dass es nach peripherer nozizeptiver Stimulierung in vitro und in vivo zu einer negativen Rückkopplung durch S1P kommt, basierend auf einer anfänglichen Aktivierung beider SPHKs. Das durch SPHK-1 gebildete S1P vermittelt extrazellulär über den S1P1-Rezeptor die Hemmung der SPHK-1, während es über den S1P2-Rezeptor die SPHK-2 hemmt und dadurch zu einer Absenkung der S1P-Konzentration führt. Das durch SPHK-2 gebildete S1P hingegen wird nicht sezerniert, bedingt demnach keine Hemmung der S1P-Synthese und übt keinen direkten Einfluss auf die akute spinale Schmerzverarbeitung aus. Bei dem antinozizeptiv wirkenden S1P handelt es sich um von SPHK-1 gebildetes und anschließend sezerniertes S1P. Auch in nicht-neuronalen Zellen konnte die negative Rückkopplung detektiert werden und stellt daher einen allgemeinen regulatorischen Mechanismus dar. Des Weiteren sollte die Untersuchung von neu synthetisierten S1P-Rezeptor-Agonisten und Antagonisten weitere Grundlagen für eine neuartige, pharmakologische Schmerztherapie liefern. Vorarbeiten zeigten, dass die intraperitoneale oder intrathekale Gabe des strukturellen S1P-Analogons FTY720 das Schmerzverhalten von Tieren reduziert. Die hemmende Wirkung des FTY720 auf die Eicosanoidsynthese durch direkte Hemmung der cPLA2 kann zur Vermittlung des antinozizeptiven Effekts von FTY720 beitragen. Im Rahmen dieser Arbeit wurde gezeigt, dass FTY720-Analoga die PGE2-Synthese in vivo und in vitro hemmen können. Die strukturelle Vorraussetzung für die hemmende Wirkung dieser S1P-Rezeptor-Agonisten und -Antagonisten ist der Besitz eines basischen Zentrums und darüber hinaus die Freiheitsgrade der Substanzen eine Rolle für die Bindung an die cPLA2 spielen. Die Verwendung von FTY720-Analoga, welche keine Aktivierung der für Nebenwirkungen verantwortlichen S1P-Rezeptoren bedingen und dennoch eine Reduktion der Prostaglandin- und cAMP-Synthese vermitteln, wären viel versprechende neue Substanzen zur Behandlung chronischer Schmerzen.
The development of novel drugs targeting GPCRs is of particular interest since modulation of subfamilies of this receptor class highly influences neurotransmission in the central nervous system. This study has focused on the development of ligands for the dopamine D3 receptor. The receptor belongs to the dopamine D2-like family among the biogenic amine binding GPCRs. The dopamine D3 receptor is involved in neurological and neuropsychiatric disorders such as Parkinson’s disease, schizophrenia and drug addiction. Due to its close structural similarity to the dopamine D2 receptor subtype, it is still a challenge to identify and further optimize new leads. Therefore an in vitro screening assay, which also allows elucidating comprehensive structure-affinity relationships, is required. In this investigation the implementation and evaluation of radioligand binding assays for human dopamine D2S and dopamine D3 receptors and for the related aminergic human histamine H1 receptor stably expressed in Chinese hamster ovary (CHO) cells has been performed. Saturation binding experiments with [³H]spiperone at dopamine D2S and D3 receptors and with [³H]mepyramine at histamine H1 receptors were carried out. The determined equilibrium dissociation constant of radioligands (Kd) and the total number of specific binding sites (Bmax) of the receptor membrane preparations were in good agreement with reference data. Inhibition constants (Ki) of reference ligands obtained in radioligand competition binding experiments at dopamine hD2S, hD3 and histamine H1 receptors validated the reliability and reproducibility of the assay. In order to discriminate agonists from antagonists, a GTP shift assay has been investigated for dopamine D2S and D3 receptors. In competition binding studies at dopamine D2S receptors the high- and low affinity state in the absence of the GTP analogue Gpp(NH)p has been recognized for the agonists pramipexole and the seleno analogue 54. In the presence of Gpp(NH)p a decrease in affinity, referred to as “GTP shift”, has been revealed for agonists at dopamine D2S and D3 receptors. An effect of Gpp(NH)p on dopamine D2S receptor binding has not been observed for the antagonists ST 198 and BP 897, while a reverse “GTP shift” has been noticed at the dopamine D3 receptor. For the development of novel ligands with high affinity and selectivity for dopamine D3 receptors, investigation in refined structure-affinity relationships (SAR) of analogues of the lead BP 897 has been performed. Replacement of the naphthalen-2-carboxamide of BP 897 by aryl amide residues (1 - 4) had a clear influence on affinity binding and selectivity for dopamine D3 receptors. Introduction of the benzo[b]thiophen-2-carboxamide (1) has markedly improved binding with subnanomolar affinity and enhanced selectivity for dopamine D3 receptors. Exchanging the aryl substituted basic alkanamine residue of 1 by a 1,2,3,4-tetrahydroisoquinoline moiety (6) emphasized the benefit of the 4-(2-methoxyphenyl) piperazine residue of BP 897 regarding dopamine D2 and D3 receptor affinities. The change of particular elements of BP 897 and the rearrangement of the amide functionality resulted in inverse amide compounds with new chemical properties. Moderate affinity binding data, as obtained for the isoindol-1-carbonyl compound 11, suggest that inverse amides provide a worthwhile new lead structure with a novel structural scaffold. A hybrid approach combining privileged scaffolds of histamine H1 receptor antagonists and fragments of dopamine D3 receptor-preferring ligands, related to BP 897and analogues has been investigated. Various benzhydrylpiperazine derivatives and related structures have shown moderate to high affinities for dopamine D3 receptors with the impressive enhancement of the cinnamide substituted bamipine-related hybrid 39, exhibiting the highest affinity and selectivity for dopamine D3 receptors. Improved affinity profiles of structural modified histamine H1 receptor antagonists for dopamine D2 and D3 receptors and a refined SAR has been achieved. A SAR of derivatives of the dopamine agonist pramipexole and the related etrabamine has been studied. The propargyl substituted etrabamine derivative 61 demonstrated highest affinity and selectivity. The ligand attracts attention since neuroprotective properties have been reported for the propargyl functionality. Further development resulted in the most promising compound 64, a cinnamide derivative with 4-fluoro substitution on the phenyl ring. Subnanomolar affinity and remarkable selectivity for dopamine D3 receptors has aroused particular interest in this ligand due to its development potential as a radioligand for PET studies. Radioligand binding studies in combination with virtual screening and different classification techniques of chemoinformatic methods resulted in further elucidation of SAR. New leads with novel chemical scaffolds have been found in the bicycle[2.2.1]heptane derivative 95 and the benzhydrylidene substituted pyrrolidindione 112 and can be further optimized by chemical modifications. The outcome of the studies provides the development of various novel high affine and dopamine D3 receptor selective ligands. Modifications of lead structures or application of chemoinformatic tools in combination with radioligand competition binding assays have resulted in new leads with different chemical scaffolds. Furthermore, a comprehensive insight into structure-affinity relationships of ligands at dopamine D3 receptors has been revealed. This refined SAR is valuable to develop more affine and selective drug candidates with a designed pharmacological receptor profile.
Im Rahmen dieser Arbeit wurden Anaylsenmethoden zur Quantifizierung von Ceramiden und Prostanoiden in verschiedenen biologischen Matrices unter Verwendung von Nano-LC gekoppelt mit Tandemmassenspektrometrie entwickelt und bei diversen biologischen Fragestellungen angewendet.
Die analytische Methode zu Quantifizierung der Ceramide ermöglichte deren Bestimmung in einem Probenvolumen von 2 μL CSF. Diese neu entwickelte Methode ist die erste publizierte Nano-LC-MS/MS-Methode zur Quantifizierung der Ceramide in biologischen Proben, gleichzeitig ist es auch diejenige analytische Methode mit der höchsten Empfindlichkeit [171]. Die beschriebene Methode umfasste die Substanzen C8:0, C16:0, C18:1, C18:0, C20:0, C24:1 und C24:0 Ceramid, als interner Standard wurde C17:0 Ce-ramid verwendet. Die Probenaufarbeitung bestand in einer einfachen Proteinfällung und Verdünnung mit Methanol, die chromatografische Trennung der Analyten erfolgte mit einer RP-C8 Säule unter Verwendung eines Gradientenprogramms. Die Methode wurde anhand von FDA-Richtlinien bezüglich Linearität, Bestimmungsgrenze, Präzision, Richtigkeit und Autosampler-Stabilität validiert. Die erreichten Bestimmungsgrenzen betrugen 0,225 pg auf der Säule (2,25 pg/μL CSF) für alle Ceramide außer C24:0 Ceramid, für das der Wert von 0,75 pg auf der Säule (7,5 pg/μL CSF) ermittelt wurde. Mit der durchgeführten Validierung wurde die Zuverlässigkeit der Methode für die Quantifizierung der Ceramide in CSF gezeigt. Mit einem Standardadditionsexperiment konnte belegt werden, dass PBS als Ersatzmatrix für CSF geeignet ist und somit die Ergebnisse der Validierung mit dotierten PBS-Proben auf CSF-Proben übertragbar sind. Das entwickelte Verfahren wurde für die Quantifizierung der Analyten in murinen CSF-Proben im Rahmen eines Projekts zur Erforschung der Rolle der Ceramide bei Multipler Sklerose angewendet. Anhand der Ergebnisse wurde die Hypothese bestätigt, dass die Konzentration von C16:0 Ceramid in CSF von EAE-Mäusen erhöht ist.
Die zweite entwickelte Nano-LC-MS/MS-Methode ermöglichte die Quantifizierung der Prostanoide PGE2, PGD2, 6-keto PGF1α, PGF2α und TXB2 in einer geringen Anzahl Immunzellen. Für eine erfolgreiche Bestimmung der Analyt-Konzentrationen waren nur 5.000 T-Zellen oder 40.000 Mastzellen erforderlich. Damit ist die beschriebene Methode geeignet für die Quantifizierung in Zellen, die durch Isolation aus tierischen Geweben oder Organen erhalten werden, ohne dass das Vereinigen mehrerer Proben erforderlich ist. Durch die Messung dieser bestimmten Zellpopulationen kann, im Unterschied zur Vermessung des gesamten Organs, eine differenziertere Analyse der Lokalisation der gemessenen Analyten erfolgen. Mittels der entwickelten Methode konnten die Prostanoide PGE2, PGD2, 6-keto PGF1α, PGF2α und TXB2 quantifiziert werden. Als interner Standard stand für jedes dieser Prostanoide ein vierfach deuteriertes Strukturanalogon zur Verfügung. Die Aufarbeitung der Immunzell-Proben erfolgte durch Flüssig-Flüssig-Extraktion mit Ethylacetat, die Chromatografie wurde mit einer RP-C8-Säule und einem Gradientenprogramm durchgeführt. Eine Validierung erfolgte für die Quantifizierung in T-Lymphozyten und Mastzellen für die Parameter Linearität, Bestimmungsgrenze, Präzision, Richtigkeit, Wiederfindung, Selektivität und Stabilität. Auch ein Standardadditionsexperiment mit beiden Matrices wurde durchgeführt. Die Bestimmungsgrenzen betrugen 75 fg auf der Säule für PGE2 und PGD2 sowie 112,5 fg für 6-keto PGF1α, PGF2α und TXB2, damit zeichnet sich die Methode durch höchste Empfindlichkeit aus. Die Me-thode wurde zur Messung der Prostanoid-Konzentration in T-Zellen, die im Rahmen eines Kontaktallergie-Modells aus dem Blut von unterschiedlich behandelten Mäusen isoliert worden waren, angewendet. Es konnte kein Unterschied in den Prostanoid-Konzentrationen in den T-Zellen sensibilisierter und nicht-sensibilisierter bzw. provozierter und nicht-provozierter Mäuse festgestellt werden. Bei einer zweiten Anwendung wurden die Prostanoide in murinen Mastzellen, die nach Zymosan-Injektion in die Hinterpfote zu verschiedenen Zeitpunkten nach dem Auslösen der Entzündung aus dem entstandenen Ödem isoliert worden waren, gemessen. Zusätzlich für diese Anwendung wurden einige Leukotriene in die Methode integriert. Es wurde festgestellt, dass die Konzentrationen von PGE2, PGD2 und PGF2α in Mastzellen nach der Injektion von Zymosan-Injektion ansteigen, wobei die gemessenen Konzentrationen für PGE2 48 Stunden nach der Injektion verglichen mit denen nach 24 Stunden, bezogen auf die anderen beiden Prostaglandine, am stärksten ansteigen. Außerdem wurde mittels der für die Immunzellen entwickelten Methode die Prostanoide in murinem Urin, humanem Plasma und humaner Tränenflüssigkeit quantifiziert.
Zusammenfassend ermöglichen die entwickelten Methoden die Analyse geringer Ana-lytkonzentrationen in sehr kleinen Probenmengen und damit eine Reduktion von Versuchstierzahlen und Kosten.
