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Im Rahmen dieser Arbeit wurde die schnelle Energietransfer- (EET) und Elektronentransfer (ET)-Dynamik unterschiedlichster Quantenpunkte (QD) spektroskopisch untersucht. Die untersuchten Systeme bestanden in den meisten Fällen aus Donor-Akzeptor-Paaren, bei denen die Halbleiternanokristalle als Donor fungierten. Der Fokus lag dabei auf der gezielten Anpassung des Donors, um die optimale Funktionalität zu erreichen. Die Untersuchung der Nanokristalle erstreckte sich daher von einfachen Kernen über verschiedene Kern-Schale-Partikel bis hin zu völlig anderen Strukturen wie Nanoplatelets (NPL). Als Akzeptor wurden eine Vielzahl von Molekülen verwendet, die sich als Elektronen- und/oder Energieakzeptoren für die verschiedenen QDs eignen.
Mechanistic characterization of photoisomerization reactions in organic molecules and photoreceptors
(2023)
In dieser Arbeit wurden verschiedene Einflüsse auf die Dynamik von Photoisomerisierungen in Phytochromen und indigoiden Photoschaltern untersucht. Beide Forschungsgebiete teilen wesentliche Aspekte wie die Kontrolle durch sterische Wechselwirkungen und den starken Einfluss der Polarität oder der ionischen Umgebung.
Auf dem Gebiet der Phytochrome wurde die relative Positionierung der knotenlosen Phytochrome innerhalb der Superfamilie der Phytochrome in Bezug auf ihre Photodynamik und den Effekt von Grundzustandsheterogenität herausgearbeitet. Es wurde anhand von ultraschnellen, zeitaufgelösten Anrege-Abtast-Experimenten der einzelnen GAF-Domäne All2699g1 im Vergleich mit dem vollständigen knotenlosen Phytochrom All2699g1g2 und dem strukturell ähnlichen knotenlosen Phytochrom SynCph2 gezeigt, dass knotenlose Phytochrome in ihrer Vorwärtsdynamik eine komplexe mehrphasige Kinetik mit einem langlebigen angeregten Zustand (~100 ps) aufweisen. Die beobachtete mehrphasige Kinetik konnte einer initialen Chromophordynamik sowie einer nicht exponentiellen Reorganisation der chromophor-umgebenden Proteinmatrix zugeordnet werden. Dies steht im starken Kontrast zur im Gebiet der Phytochrome etablierten Beschreibung derartiger mehrphasiger Kinetiken mittels heterogener Grundzustände. Stattdessen wurde ein konserviertes kinetisches Muster identifiziert, welches die mehrphasige Dynamik beschreibt und in allen in dieser Arbeit untersuchten Phytochrome beobachtet wurde. Zudem konnte dieses Muster in einem Phytochrom der Gruppe I und einem Phytochrom der Gruppe III, die einen ähnlichen Pr Dunkelzustand aufweisen, gezeigt werden, was eine breite Anwendbarkeit des damit verbundenen Mechanismus vermuten lässt. Weiterhin konnte die zentrale Rolle eines konservierten Tyrosins in der Photoisomerisierung anhand von Mutationsstudien in All2699g1 herausgearbeitet werden. Diese konservierte Aminosäure muss im Rahmen der Reorganisation der Proteinmatrix vom Chromophor weggezogen werden, damit die sterische Blockade abgebaut werden kann, die die Isomerisierung des Chromophors zunächst verhindert. Da diese Bewegung von diversen Faktoren in der den Chromophor umgebenden Proteinmatrix abhängt, weist sie eine nicht exponentielle Kinetik auf, die je nach Phytochrom, der spezifischen Flexibilität und dem vorhandenen Raum in der Bindetasche unterschiedliche Lebenszeiten aufweist.
Die Rückreaktion knotenloser Phytochrome konnte ebenfalls im Rahmen dieser Arbeit charakterisiert werden, welche im Pikosekundenbereich abläuft, und damit signifikant schneller ist als die Vorwärtsreaktion. Im Gegensatz zur Vorwärtsreaktion nimmt Grundzustandsheterogenität in der Rückreaktion eine weitaus bedeutendere Rolle ein. Hier weisen die in All2699g1 vorhandenen heterogenen Grundzustandspopulationen jeweils eine eigene Kinetik ihres angeregten Zustands auf, während die homogenen Grundzustände von All2699g1g2 und SynCph2 jeweils nur einen Zerfall des angeregten Zustands zeigen. Der Ursprung dieser Heterogenität konnte im Wasserstoffbrückennetzwerk des Chromophors lokalisiert und mit dem konservierten Tyrosin und einem konservierten Serin in der PHY-Domäne verknüpft werden. Die Anwesenheit der PHY-Domäne sorgt demnach für eine Verringerung der Grundzustandsheterogenität und des vorhandenen Raums in der Bindetasche, wodurch die Effizienz der Photoreaktion optimiert wird.
Zuletzt konnte die Millisekundendynamik knotenloser Phytochrome und der Einfluss der PHY-Domäne auf diese aufgeklärt werden. Die PHY-Domäne sorgt hierbei durch den verringerten Raum in der Bindetasche dafür, dass die zunächst stattfindende thermische Relaxation des Chromophors signifikant verlangsamt wird, während spätere Änderungen im Photozyklus nur wenig beeinflusst werden.
Auf dem Gebiet der indigoiden Photoschalter konnte, anhand eines sterisch überladenen Hemithioindigo Photoschalters, der Photoisomerisierungsmechanismus des Hula-Twists beobachtet und eine starke Lösungsmittelabhängigkeit der entsprechenden Kinetik aufgezeigt werden. Aus den durchgeführten zeitaufgelösten Anrege-Abtast-Experimenten in verschiedenen Lösungsmitteln konnte ein Modell für die Photodynamik des verwendeten Hemithioindigo Photoschalters entwickelt werden. In unpolaren Lösungsmitteln muss eine hohe Barriere zur produktiven konischen Durchschneidung überwunden werden, was zu Lebenszeiten des angeregten Zustands im Nanosekundenbereich führt. Der Weg zur produktiven konischen Durchschneidung folgt dabei dem Hula-Twist Mechanismus. Dieser Pfad ist in polaren Lösungsmitteln unerreichbar, weshalb eine schnelle Relaxation über eine unproduktive konische Durchschneidung stattfindet.
Im zweiten Projekt auf dem Gebiet der indigoiden Photoschalter wurde anhand der neuartigen Klasse der Iminothioindoxyl Photoschalter ein Schwingungsenergiedonor für Schwingungsenergietransferstudien entwickelt. Das daraus entwickelte Modellsystem, bestehend aus einer künstlichen Aminosäure auf Basis des Iminothioindoxyl Photoschalters und einem daran gekoppelten Schwingungsenergiesensor, wurde charakterisiert und die primäre Photoreaktion untersucht. Es konnte gezeigt werden, dass der angeregte Zustand des Modellsystems kurzlebig ist und unter Abgabe von großen Mengen an Schwingungsenergie zerfällt, unabhängig von der Anregungswellenlänge und dem verwendeten Lösungsmittel. Somit zeigt das entwickelte System vorteilhafte Eigenschaften für Schwingungsenergietransferstudien.
Insgesamt konnten somit die Mechanismen der Photoisomerisierungsreaktionen in knotenlosen Phytochromen und indigoiden Photoschaltern aufgeklärt und daraus die Relevanz der Umgebung für derartige Reaktionen herausgearbeitet werden.
Die vorliegende Doktorarbeit beschäftigt sich mit der Untersuchung von molekularen Systemen, die aus mehreren Chromophoren bestehen und über einen Zweiphotonen-Prozess aktiviert werden können.
Die Zweiphotonen-Absorption (2PA) beschreibt die nahezu simultane Absorption zweier Photonen, deren Summe die Energie ergibt, die für den entsprechenden elektronischen Übergang nötig ist. Da für die Anregung somit zwei niederenergetische Photonen benötigt werden, kann für die 2PA Nahinfrarot-Licht (NIR-Licht) verwendet werden, welches eine geringe Phototoxizität aufweist und eine tiefe Gewebedurchdringung ermöglicht. Weiterhin wird durch die intrinsische dreidimensionale Auflösung der 2PA eine hohe Ortsauflösung der Photoaktivierung erzielt.
Photolabile Schutzgruppen (PPGs) bzw. Photocages sind chemische Verbindungen, die der vorübergehenden Maskierung der biologischen Funktion eines (Makro-)Moleküls dienen. Sie können durch Licht geeigneter Wellenlängen abgespalten werden (uncaging), wodurch die Aktivität des geschützten Substrats wiederhergestellt wird. Leider weisen viele der etablierten PPGs schlechte Zweiphotonen-Eigenschaften auf. Um die 2P-Aktivität einer PPG zu erhöhen, kann sie kovalent mit einem guten Zweiphotonen-Absorber verknüpft werden, der bei Bestrahlung das Licht über einen Zweiphotonen-Prozess absorbiert und anschließend mittels Energietransfer auf die photolabile Schutzgruppe überträgt. Dies führt schließlich zur Uncaging-Reaktion.
Im Zuge von Projekt I dieser Dissertation wurde eine solche molekulare Dyade für verbessertes Zweiphotonen-Uncaging bestehend aus einem Rhodamin-Fluorophor als Zweiphotonen-Absorber und einem Rotlicht-absorbierenden BODIPY als photolabile Schutzgruppe hergestellt und charakterisiert. Die Zweiphotonen-Aktivität des Fluorophors wurde mittels TPEF-Messungen (two-photon excited fluorescence) untersucht. Anschließend wurde das Rhodamin an einen 3,5-Distyryl-substituierten BODIPY-Photocage gekuppelt. Der Energietransfer innerhalb dieser Dyade wurde mithilfe von transienter Ultrakurzzeit-Spektroskopie und quantenmechanischen Berechnungen untersucht. Die Freisetzung der Abgangsgruppe para-Nitroanilin (PNA) bei Belichtung der Dyade konnte sowohl nach Einphotonen-Anregung des Rhodamins als auch des BODIPYs mithilfe von UV/vis-Absorptionsmessungen qualitativ nachgewiesen werden.
Da die Uncaging-Reaktion allerdings nicht besonders effektiv war, wurde für die Weiterführung des Projekts ein neuer BODIPY Photocage, der eine verbesserte Photolyse-Effizienz und eine höhere Photostabilität aufwies, verwendet und erneut an einen Rhodamin-Fluorophor geknüpft. Anhand dieser optimierten Dyade konnte die Einphotonen-Photolyse quantifiziert, d.h. eine Uncaging-Quantenausbeute für die Freisetzung von PNA bestimmt werden. Weiterhin wurde beobachtet, dass die Photolyse der Dyade mit einer deutlichen Änderung ihrer Fluoreszenzeigenschaften einherging. Dies ermöglichte einen Nachweis des Zweiphotonen-Uncagings mithilfe eines Fluoreszenzmikroskops. Die Dyaden-Moleküle wurden zur Immobilisierung in Liposomen eingeschlossen und unter dem konfokalen Fluoreszenzmikroskop belichtet. Sowohl nach Einphotonen- als auch nach Zweiphotonen-Anregung der Rhodamin-Einheit konnte die gewünschte Fluoreszenzänderung beobachtet und somit das Uncaging bestätigt werden.
In Projekt II der Dissertation wurde ein photoaktivierbarer Fluorophor (PAF) hergestellt. PAFs liegen in ihrer geschützten Form dunkel vor. Durch die Aktivierung mit Licht können sie Fluoreszenzsignale emittieren. Sie liefern somit ein direktes Feedback über die Lichtverteilung und –intensität innerhalb einer Probe und werden somit unter anderem für die Charakterisierung und Optimierung von Belichtungsapparaturen verwendet. Besonders wünschenswert ist hierbei eine Fluoreszenzaktivierung mit sichtbarem Licht bzw. mit NIR-Licht über einen Zweiphotonen-Prozess.
Im Zuge der Arbeit wurde ein Rhodamin-Derivat synthetisiert, das durch die Anbringung eines DEACM450-Photocages in seine nichtemittierende Form gezwungen wurde. Bei Bestrahlung mit 455 nm konnte die Abspaltung der Cumarin-Schutzgruppe und der damit verbundene Anstieg der Rhodamin-Fluoreszenz beobachtet und eine Uncaging-Quantenausbeute bestimmt werden. Für die Untersuchung der Zweiphotonen-Photolyse wurde der geschützte Fluorophor in einem Hydrogel immobilisiert und unter dem konfokalen Fluoreszenzmikroskop betrachtet werden. Anschließend wurden Fluoreszenzbilder vor und nach Photoanregung von bestimmten Regionen des Hydrogels aufgenommen. Durch das Uncaging der Probe konnten helle, definierte Muster geschrieben und ausgelesen werden. Die Photoaktivierung führte dabei sowohl über die Einphotonen-Anregung mit blauem Licht (488 nm) als auch über die Zweiphotonen-Anregung mit NIR-Licht (920 nm) zur Generierung von stabilen, gleichmäßigen Fluoreszenzmustern mit hohem Kontrast.
Molekulare Werkzeuge können in der Wissenschaft unter anderem dazu verwendet werden, biochemische Prozesse gezielt zu untersuchen, um sie somit besser zu verstehen. Dabei handelt es sich zum Beispiel, um kleine chemische Moleküle, die gezielt für ihr Anwendungsgebiet konzipiert worden sind. Mit Ihnen lassen sich z.B. Interaktionen zwischen (Makro-)Molekülen regulieren, chemische Gleichgewichte lokal verändern oder auch Botenstoffe zielgerichtet freisetzen. Die Effekte dieser temporären Einwirkung auf verschiedenste biologische Systeme können hilfreiche Erkenntnisse struktureller, funktioneller oder systematischer Art für die entsprechenden Forschungsgebiete liefern.
Um die interdisziplinären Problemstellungen zielgerichtet mit den entsprechend zugeschnittenen Werkzeugen zu adressieren, ist es dabei jedoch absolut notwendig, dass ein umfassendes und über die Grenzen der jeweiligen Fachgebiete hinaus gehendes Verständnis der jeweiligen Fragestellungen entwickelt wird.
Viele der bisher bekannten Werkzeuge benötigen für ihren Einsatz bis heute noch relativ harsche Reaktionsbedingungen, haben ein eingeschränktes Anwendungsfeld oder lassen sich nicht ausreichend Zeit- & Ortsaufgelöst „aktivieren“. Die Möglichkeit Licht als externes Trigger-Signal zu verwenden, um die entsprechenden molekularen Werkzeuge zu aktivieren (oder auch zu deaktivieren), überwindet genau diese Defizite und bringt neben der hohen zeitlichen und räumlichen Auflösung noch viele weitere Vorteile mit sich. Im Rahmen meiner Doktorarbeit ist es mir gelungen gemeinsam mit meinen Kooperationspartnern neue lichtaktivierbare molekulare Werkzeuge von Grund auf zu designen, zu synthetisieren, sie auf ihre photochemischen Eigenschaften zu untersuchen und sie anzuwenden. Durch die interdisziplinäre Zusammenarbeit mit Doktoranden aus der Organischen, Theoretischen und Physikalischen Chemie, konnte ein umfassendes Bild dieser neuen Substanzklassen aufgezeigt werden. Die verschiedenen Arten lichtaktivierbarer Werkzeuge sollen im Verlauf dieser Arbeit genauer herausgearbeitet werden. Generell kann man in drei grundlegenden Klassen von lichtaktivierbaren Werkzeugen unterscheiden: 1. irreversibel photolabile Schutzgruppen, 2. photoaktivierbare Label und 3. reversibel lichtschaltbare Photoschalter.
Auf dem Gebiet der photolabilen Schutzgruppen, auch photoaktivierbare Schutzgruppen oder Photocages genannt, ist es uns gelungen eine neue Spezies von Molekülen zu identifizieren, die dazu in der Lage sind, nach photochemischer Anregung eine spezifische Bindung innerhalb ihres molekularen Gerüsts zu spalten. Möglich gemacht wurde dies, indem wir den sog. „uncaging Prozess ganz neu gedacht“ haben und mit der Unterstützung von Theorie und Spektroskopie unsere Ergebnisse in einer Struktur-Aktivitäts-Beziehungs-Studie (SAR) festhalten konnten. Aus einer Substanzbibliothek von diversen theoretisch berechneten Kandidaten, wurden die vielversprechendsten Verbindungen anschließend synthetisiert und photochemisch charakterisiert. Nach initialen Untersuchungen und den daraus hervorgehenden Erkenntnissen, wurden weitere molekulare Struktur auf die Optimierungen der photochemischen Eigenschaften hin theoretisch berechnet und anschließend im Labor realisiert. Daraus resultierend entwickelten wir einen Photocage, der mit einer hohen Quantenausbeute mit Licht von über 450 nm photolysierbar ist und ebenfalls dazu in der Lage ist Neurotransmitter wie z.B. Glutamat zielgerichtet und lichtaktiviert freizusetzen. Eine weitere Struktur-Aktivitäts-Beziehungs-Studie wurde im Rahmen dieser Arbeit mit dem Isatin-Gerüst als potentiell neue photolabile Schutzgruppe durchgeführt.
Ebenfalls konnten in einer dritten Studie auf dem Gebiet der photolabilen Schutzgruppen Untersuchungen am Coumarin-Grundgerüst zeigen, dass eine systematische Einschränkung der Relaxationspfade im Molekül eine Verbesserung der photochemischen Eigenschaften mit sich bringen kann.
Photoaktivierbare Label werden in den verschiedensten Bereichen der Wissenschaft angewendet. Meist erlauben jedoch die chemischen Moleküle nur eine begrenzte „Beobachtungszeit“ der biochemischen Prozesse aufgrund der effizienten und damit schnellen Relaxationspfade zurück in den Grundzustand. Zu Beginn der durchgeführten Untersuchungen, bestand unsere Idee darin, die selektive Prä-IR-Anregung mit Hilfe eines UV/vis-Pulses (entsprechend der VIPER-Spektrokopie) in ein langlebiges Triplett-Signal eines geeigneten Chromophors zu überführen, welches anschließend für die Beobachtung vergleichsweise lang-lebiger biochemischer Prozesse verwendet werden könnte. Aus dieser Idee heraus entwickelten wir einen Chromophor, der neben einer Absorption im sichtbaren Bereich des elektromagnetischen Spektrums, zusätzlich eine IR-adressierbare funktionelle Gruppe, sowie die Eigenschaft, ein effizientes Inter-System-Crossing (ISC) nach photochemischer Anregung durchzuführen, besaß. Zu unserem Erstaunen zeigte dieses Derivat jedoch nach erfolgreicher Synthese nicht das erwartete Verhalten. Ein weiteres Beispiel für die hochgradige Komplexität der Photochemie.
Mit Hilfe von theoretischen und spektroskopischen Methoden konnten dennoch viele hilfreiche Erkenntnisse aus dieser Studie für zukünftige Untersuchungen aufgedeckt werden.
Ebenso war es während meiner Promotion eines der Ziele, den Schaltprozess des sog. Fulgid-Photoschalters genauer zu untersuchen und somit besser zu verstehen. Hierbei handelt es sich um ein ausgesprochen beständiges, photochemisch reversibel schaltbares Molekül, auch wenn dies vielleicht auf den ersten Blick ein Widerspruch in sich zu sein scheint. Es gelang uns diesen Photoschalter, genauer gesagt seine Photo-Isomere, auf dem Gebiet der chemischen Aktinometrie zu etablieren.
Dafür waren zahlreiche Messungen diverser Reaktivitäten (photochemische Reaktions-Quantenausbeuten) in verschiedenste Wellenlängenbereiche vom Nah-UV-Bereich bis hin zur 700 nm Grenze erforderlich. Außerdem wurden alle Werte mit der Referenzmessung einer Photodiode bzw. je nach Wellenlängenbereich auch mit der klassischen Ferri-Oxalat-Aktinometrie verglichen. Im Anschluss daran fokussierte ich mich weiter auf die einzelnen Photo-Isomere und ihre einzigartige chemische Struktur. Mit Hilfe der chiralen HPLC gelang es uns die einzelnen Photo-Isomere voneinander zu isolieren und diese mit verschiedensten photochemischen und theoretischen Methoden „genauer unter die Lupe“ zu nehmen. Die aus dieser Studie gewonnenen Erkenntnisse bereiten den Weg für diverse, zukünftige spektroskopische Anwendungen dieses Photoschalters.
Experiments on Vibrational Energy Transfer (VET) in proteins contribute to our understanding of fundamental biological processes such as allostery, dissipation of excess energy, and possibly enzymatic catalysis. While these processes have been studied for a long time, many questions remain unanswered. The aim of this work was to expand the application of existing spectroscopic techniques to investigate VET, seeking tailored solutions for the diversity of proteins and amino acid environments. Additionally, new target proteins were to be established to broaden the spectrum of VET experiments towards the role of VET and low-frequency protein modes (LFMs).
To test their suitability as VET sensors, the non-canonical amino acids (ncAAs) Azidoalanine (N3Ala), azido-L-Homoalanine (Aha), p-azido-Phenylalanine (N3Phe), p-cyano-Phenylalanine (CNPhe), and 4-cyano-Tryptophan (CNTrp) were coupled to the VET donor β-(1-azulenyl)-L-Alanine (AzAla) in dipeptides. Their spectral properties were compared using FTIR and VET spectra in H2O, dimethyl sulfoxide, and tetrahydrofuran.
The solvent strongly influences the measured VET signals, which can be explained by the direct interaction of the solvent with the dipeptides. Additionally, the peak time within the subgroups of azide and nitrile sensors increased with the size of the side chain, indicating the dependence between peak time and the distance between VET donor and sensor. When incorporated into a protein, solvent interactions are less dominant. Therefore, Aha, N3Phe, and CNPhe were additionally incorporated at two different positions in the PDZ protein domain and investigated. Due to Fermi resonances, signals from azide sensors are challenging to predict, unlike those of the nitrile sensors.
Overall, the experiments showed that nitrile groups can serve well as VET sensors, as their lower extinction coefficient is compensated for by a narrower bandwidth. This expands the number of potential target proteins, and sensor incorporation can be less disruptive at various protein locations.
Since the VET donor AzAla can inject the energy of a photon into a protein as vibrational energy at a specific location, it can also be used for the targeted excitation of LFMs. If these modes are involved in an enzymatic reaction, a direct influence on activity is expected. This hypothesis has long existed but has not been definitively verified. Some studies have found evidence for the involvement of LFMs in formate dehydrogenase (FDH) catalysis. Therefore, FDH was chosen for the investigation of LFMs in enzymes. This specific system additionally allows the use of a natural VET sensor: it forms a stable complex with NAD+ and N3-, an excellent IR marker. Thus, it provided the opportunity to test low-molecular-weight non-covalent ligands as VET sensors.
After ensuring sufficient AzAla supply through the internal establishment of an enzymatic synthesis, AzAla could be incorporated at various positions in FDH. Despite spectral overlap between free and bound N3-, the latter could be identified by its narrower FWHM. For some variants, no binding could be observed. Circular dichroism spectra showed that these variants structurally deviate slightly from other variants and the wild type (WT). VET could be observed over 22 Å from two regions of the protein to the N3- bound in the active center, at protein concentrations of below 2 mM. Unbound N3- did not generate signals, allowing it to be added in excess ensuring the saturation of the protein in VET experiments.
The activity of FDH WT and four AzAla mutants was investigated under substrate saturation without and with AzAla excitation. In these experiments, a slight reduction in activity under illumination was observed, even for the WT, who is not expected to interact with the excitation light. So far, a difference in sample temperature cannot be excluded as the cause for this decline.
The presented experiments with FDH illustrate the potential of low-molecular-weight ligands as VET sensors, with N3- being particularly attractive due to its simple structure (preventing Fermi resonances) and its high extinction coefficient. Its use can add many metalloproteins as potential targets for VET experiments and allows investigation without a VET sensor ncAA. Additionally, initial experiments were conducted to measure light-dependent FDH activity. By specifically exciting protein LFMs, this project could contribute in the future to answering longstanding questions about the extraordinary catalytic efficiency of enzymes.
Die Verwendung von photolabilen Schutzgruppen zur nicht-invasiven Kontrolle von Systemen birgt ein großes Potential für verschiedenste Anwendungsgebiete, die von der Erforschung und Regulation biologischer Prozesse, über den Einsatz in medizinischer Therapie bis hin zur Verwendung als molekulare Datenspeicher reichen. Für diese Umsetzung benötigt es allerdings eine breite Auswahl an entsprechenden PPGs und das Wissen über ihre Reaktionsmechanismen. Im Allgemeinen lässt sich die Konzeptionierung von PPGs in drei Prozesse einteilen, beginnend bei dem Design und der Synthese einer neuen PPG. Bei diesem Schritt liegt der Fokus auf ein oder zwei besonderen Eigenschaften, wie beispielsweise einer Absorptionswellenlänge in einem bestimmten Spektralbereich oder einer hohen Uncaging-Quantenausbeute. Im zweiten Schritt folgt die Untersuchung der PPG bezüglich spektroskopischer und mechanistischer Eigenschaften und ggf. anschließender Optimierung auf synthetischer Ebene. Die so gewonnenen Informationen sind dann hilfreich bei dem letzten Schritt, bei dem es um den Einsatz der PPG in einem entsprechenden System geht. Hierbei müssen die verwendeten PPGs genau auf das Zielsystem abgestimmt sein, dazu zählen verschiedenste Parameter wie Anregungswellenlänge, Extinktionskoeffizient, Art und Struktur der Photoprodukte sowie Uncaging-Effizienz und Geschwindigkeit.
In der vorliegenden Arbeit wurde über die drei vorgestellten Projekte mittels spektroskopischer Methoden zu allen drei genannten Stadien zur Konzeptionierung von PPGs ein Beitrag geleistet. Dazu zählt die Entwicklung der CBT-basierten PPGs, die Untersuchung der Struktur-Wirkungsbeziehung von (DMA)(2)F-PPGs und die Etablierung einer wellenlängenselektiven An-/Aus-Funktionalität eines Antibiotikums. In enger interdisziplinärer Zusammenarbeit zwischen theoretischen, synthetischen und biologischen Teilgebieten konnte jedes Projekt innerhalb der jeweiligen Entwicklungsstufe erfolgreich abgeschlossen werden.
Mithilfe des relativ neuen Ansatzes, bei dem durch quantenmechanische Berechnungen der vertikalen Anregungsenergie von der kationischen Spezies einer PPG-Grundstruktur eine Aussage über ihre Qualität postuliert werden kann, konnte ausgehend von der Fluoren-Grundstruktur eine neue Klasse von PPGs gefunden werden. Dabei erwies sich die CBT-Struktur mit den Schwefelatomen an der para-Position als besonders geeignet. Insbesondere konnte die Grundstruktur durch die (OMePh)2-Substitution, welche in einer signifikanten bathochromen Verschiebung des Absorptionsmaximums resultierte, optimiert werden. Die Untersuchung der Ultrakurzzeit-Dynamik beider p-CBT Strukturen gab Aufschluss über die unterschiedlichen photochemischen Eigenschaften als PPG.
Für die Stoffklasse der Dimethylamino-Fluorene wurde ein wichtiger Unterschied zwischen den einfach- und zweifach-substituierten Derivaten aufgedeckt, der entscheidend für einen signifikanten Uncaging-Effizienzunterschied ist. Dabei stellt sich die Stabilität des symmetrisch-substituierten Fluorenyl-Kations als der wichtigste Faktor bezüglich der Uncaging-Quantenausbeuten heraus. Beide Schutzgruppen sind in der Lage photoinduziert eine AG freizusetzen, wobei der Reaktionsmechanismus über die kationische Spezies (DMA)(2)F + abläuft. Der Unterschied hierbei liegt in der Lebensdauer der beiden Kationen, die im Falle der symmetrischen PPG stark lösungsmittelabhängig ist und bis zu mehreren Stunden betragen kann, was bis dato das langlebigste Kation dieser Molekülklasse darstellt. Für die zukünftige Optimierung dieser PPG-Klasse ist die Erkenntnis über die Gründe für die Stabilität des Kations von großem Vorteil. Der stabilisierende Faktor ist zum einen die zweite Dimethylamino-Gruppe der symmetrischen Verbindung, welche durch die Erweiterung der Mesomerie zur besseren Verteilung der positiven Ladung im Molekül führt. Zum anderen spielt das Lösungsmittel eine entscheidende Rolle. Dabei bieten protische, polare Medien eine zusätzliche Stabilisierung, die notwendig für die Langlebigkeit des Kations ist. Die Lebensdauer des Kations war zudem durch eine zweite Bestrahlungswellenlänge kontrollierbar. Ausgehend vom Kation konnte eine reversible Nebenreaktion in protischen Lösungsmitteln identifiziert werden, die einen Austausch der AG durch das Lösungsmittel darstellt.
Zusätzlich konnte die kleine Stoffklasse der bisher bekannten Photobasen durch die Verbindung (DMA)2F-OH erweitert werden. Genauer betrachtet handelt es sich dabei um eine photoinduzierte Hydroxidfreisetzung, wodurch je nach eingesetzter Konzentration ein pH-Sprung von bis zu drei Einheiten erreicht werden konnte. Dabei stellt sich die Lebensdauer des pH-Sprungs als ein entscheidender Parameter für Photobasen dar, welcher sich für die hier untersuchte Verbindung aufgrund der besonderen Stabilität des entsprechenden Kations, im Vergleich zu einigen der bereits bekannten Verbindungen, als besonders langlebig herausgestellt hat. Ein weiterer Vorteil des Einsatzes von (DMA)2F-OH als Photobase ist die Möglichkeit den pH-Sprung durch zwei verschiedene Wellenlängen sowohl zeitlich als auch örtlich zu kontrollieren, indem die Verbindung zwischen den zwei Spezies (DMA)2F-OH und (DMA)2F + geschaltet werden kann.
Im Hinblick auf die Anwendungen von PPGs zur verbesserten zeitlichen und örtlichen Kontrolle biologischer Zielsysteme ist im Rahmen dieser Arbeit das Prinzip vom wellenlängenselektiven Uncaging zweier PPGs an einem Molekül (two-PPG-one-molecule, TPOM) etabliert worden. Das Zielmolekül war hier das Antibiotikum Puromycin, welches durch seine Fähigkeit an das Ribosom zu binden, die Proteinbiosynthese inhibieren kann. Dabei wurden zwei verschiedene PPGs gefunden, die sowohl aufeinander als auch auf das Biomolekül selbst abgestimmt sind. Im Ausgangszustand sind beide PPGs am Puromycin angebracht, wodurch es in seiner biologischen Wirkung inaktiv ist. Befindet sich das doppelt geschützte Puromycin in der ROI, so kann es durch die Bestrahlung mit einer bestimmten Wellenlänge infolge des ersten Uncaging-Schritts aktiviert werden. Da biologische Systeme nicht statisch sind, können aktivierte Moleküle stets von der gewünschten ROI nach außen gelangen, wodurch der Anspruch der räumlichen Kontrolle nicht erfüllt wird. In diesem Fall kann durch die TPOM-Umsetzung die zweite Bestrahlungswellenlänge auf den entsprechenden Bereich angewendet werden, wodurch das Uncaging der zweiten PPG initiiert und folglich das Puromycin deaktiviert wird. Des Weiteren konnte gezeigt werden, dass die Deaktivierungswellenlänge auch in der Lage ist beide PPGs zu entfernen, wodurch eine vollständige Inaktivierung des Puromycins außerhalb der ROI garantiert werden kann.
Ist die Proteinbiosynthese längerfristig blockiert, führt das schließlich zum Zelltod. Ein großes Anwendungsgebiet dieses Antibiotikums sind die Neurowissenschaften. Aufgrund der Tatsache, dass Puromycin keine Unterscheidung zwischen eukaryotischen und prokaryotischen Zellen macht, findet es keine Anwendung in der Medizin. Eine zeitliche und örtliche Kontrolle seiner Wirkung könnte den Anwendungsbereich dieses Antibiotikums evtl. ausweiten. Das wohl naheliegendste wäre der Einsatz bei Tumorzellen, deren Behandlung durch Zytostatika auf den gesamten Körper wirken und dadurch viele schwere Nebenwirkungen verursachen.
Wie bereits weiter oben beschrieben muss für jedes Biomolekül und das entsprechende Wirkzentrum die Auswahl des passenden PPG-Paares einzeln abgestimmt werden. Dennoch lässt sich anhand des hier etablierten Systems ein Konzept für die erfolgreiche Umsetzung zukünftiger TPOM-Systeme an anderen biomolekularen Wirkstoffen zusammenfassend formulieren.
* Der erste Schritt sollte die Betrachtung des Wirkzentrums des zu modifizierenden Biomoleküls sein: Welche funktionelle Gruppe bzw. Gruppen sind entscheidend für die Bindetasche oder –stelle? Dieser Bereich des Biomoleküls soll im Zuge des Uncagings entweder blockiert oder abgespalten werden. In der unmittelbaren Nähe muss die PPG1 angebracht werden.
* Bei der Wahl von PPG1 ist das wichtigste Kriterium, dass das Biomolekül mit enthaltener Schutzgruppe in seiner Wirkung unbeeinträchtigt bleibt. Dies schränkt die Auswahl beträchtlich ein. Eine mögliche Umsetzung wäre die Anbringung einer Nitro-Gruppe falls vorhanden an einen Benzolring, welcher sich im Fall eines großen Biomoleküls in der Nähe der wichtigen funktionellen Stelle befindet.
* Die zweite PPG (PPG2), deren photoinduzierte Abspaltung zur Aktivierung des Wirkstoffs führen soll, kann strukturell frei gewählt werden. Das Auswahlkriterium hierbei ist das Absorptionsspektrum. Hierbei sollte das Absorptionsmaximum rotverschoben zur PPG1 sein, um eine unerwünschte Abspaltung zu vermeiden. Außerdem darf keine signifikante Absorption von PPG2 bei der Uncaging-Wellenlänge von PPG1 vorhanden sein.
* Beide PPGs sollten eine ähnliche Uncaging-Quantenausbeute vorweisen, um im Deaktivierungsschritt der doppelt geschützten Verbindung durch das höher energetische Licht keine Bevorzugung einer einzelnen Schutzgruppe zu riskieren.
Anhand der erarbeiteten Herangehensweise können weitere Wirkstoffe oder Biomoleküle hin zu einer An- / Aus-Funktionalität modifiziert werden. Mit der Umsetzung des TPOM-Konzepts kann eine Verbesserung der örtlichen und zeitlichen Kontrolle der Aktivität eines Antibiotikums erreicht werden. Für die Anwendung in biologischer Umgebung ist diese präzische Kontrolle essentiell, um unerwünschte Nebenwirkungen angesundem Gewebe zu verhindern.
In the last twenty years, there has been splendid progress in energy conversion technologies to have sustainable energy sources. For example, solar cells contribute significantly to energy production as the sun is an enormous source for renewable energy. Currently, the most common commercialized photovoltaic devices are silicon-based. The scientists' main targets are high efficiency, low cost, environmentally friendly, and easy to synthesize new semiconductor materials to replace silicon. Furthermore, understanding the photophysical properties of these materials is very important for designing high efficient photoconversion systems.
This thesis investigates the photophysics of lead-based wide-bandgap perovskites with different dimensionality (2D, 3D) and how they can be optimized for optoelectronic applications. In chapter 1, we present the background and progress in perovskite research. The basic concepts of semiconductor and spectroscopic methods of the applied techniques in this work are discussed in chapter 2.
In the first project (chapter 3.1), we used our time-resolved techniques to study the ultrafast dynamics of energy transfer from the inorganic to the organic layer in a series of three lead-based mixed-halide 2D perovskites containing benzyl ammonium (BA), 1-naphthyl methyl ammonium (NMA), and 1-pyrene methyl ammonium (PMA) thin films.
In the second project (chapter 3.2), we used time-resolved spectroscopic techniques to study the effect of adding 5% of Cs on the dynamics of a mixed-cation wide bandgap bromide-based 3D perovskite.
In another side project (chapter 4), we present the photophysics properties of newly synthesized new Schiff bases containing indole moieties using piperidine as an organic base catalyst and Au@TiO2 as a heterogeneous catalyst. Finally, the results of this work are summarized in Chapter 5 with an outlook and a discussion of open questions for further research.
The most versatile tool for visualizing endogenous RNA is molecular beacons (MBs). MBs are modified oligonucleotides that consist of a stem-loop structure equipped with a fluorophore and a quencher at the opposite ends. They only give a fluorescent signal when hybridized to the target RNA. Here we present our recent efforts to enhance the spatiotemporal resolution of RNA visualization by refining MBs.
We first asked if we could refine MBs to visualize defined subcellular populations of RNA in living neurons. To achieve this, we utilize visible light-activatable Q-dye MBs to allow only a subcellular fraction to be activated. Here, the fluorophore at the 5’-end was linked to a second quencher via a photolabile coumarin protecting group. Therefore, the MB only gives a fluorescent signal, when activated with visible light and hybridized to the target. This architecture allowed local activation of a hybridized subpopulation in a defined area of the cell. Knowing the exact origin of the activated RNA, we were able to increase the available monitoring time for neuronal mRNA from several minutes (literature known MBs) to more than 14 hours.
We next asked if it would be possible to gain spatiotemporal control over where the MB hybridization events occur. Therefore, we developed photo-tethered MBs where two phosphates in the loop backbone are covalently linked to each other via two photocages. This prevents the MB from hybridization to the target RNA. Only when light is applied, the photo-tethers are cleaved, and the inherent hybridization function of the MB is activated. This architecture allowed us to control the hybridization of photo-tethered MBs in primary cultured neurons.
Im Rahmen dieser vorliegenden Thesis wurden verschiedene photosensitive Systeme anhand statischer und zeitaufgelöster optischer Spektroskopiemethoden charakterisiert. Das Hauptaugenmerk dieser Arbeit lag in der Entwicklung und Untersuchung neuer Quantenpunkt-basierter Hybridsysteme. Es war möglich die optischen Eigenschaften der Quantenpunkte über Optimierung der Syntheseschritte zu variieren und so auf geplante Projekte anzupassen.
Im Projekt „Quantenpunkte als Zwei-Photonen Antenne“ sollten die hohen Zwei-Photonen Einfangquerschnitte von Quantenpunkten ausgenutzt werden um in Kombination mit einer photolabilen Schutzgruppe, ein Uncaging im NIR-Bereich zu realisieren. Es wurden ZnSe/ZnS Partikel synthetisiert, die eine starke Emission im Bereich der Absorption der Schutzgruppe zeigen. Anhand von zeitaufgelösten transienten Absorptionsexperimenten mit einer Anregungswellenlänge bei 775 nm wurde eine Zwei-Photonen Absorption der Partikel nachgewiesen. Jedoch wurden starke Emissionsbeiträge aus Fallenzuständen und eine geringe Stabilität beobachtet. Die Synthese von CdS/ZnS Quantenpunkten lieferte stabile Partikel mit geringer trap state Emission. Diese Partikel wurden in einem Modellhybridsystem als Energiedonoren eingesetzt. Als Akzeptor wurde der Farbstoff Cumarin343 gewählt. In statischen Absorptions- und Emissionsmessungen, zeitkorrelierten Einzelphotonenmessungen sowie in fs-zeitaufgelösten transiente Absorptionsmessungen konnte ein ultraschneller Energietransfer nach Ein-Photonen Anregung des Hybridsystems beobachtet werden. Über TPiF Messungen wurde die Zwei-Photonen Absorption der Quantenpunkte detektiert. Ein Energietransfer nach Zwei-Photonen Anregung der Quantenpunkte wurde beobachtet. Schließlich wurde ein Hybridsystem aus CdS/ZnS und der photolabilen Schutzgruppe Az-NDBF (Synthese im AK Heckel, Goethe Universität, Frankfurt a. M.) untersucht. Auch in diesem System wurde ein Energietransfer von Quantenpunkt auf die Schutzgruppe nach Ein- und Zwei-Photonen Anregung beobachtet. Anhand von TA Experimenten wurde eine Zeitkonstante von <100 ps für den Energietransfer nach Ein-Photonen Anregung ermittelt. Es konnte anhand der vorgestellten Resultate gezeigt werden, dass sich Quantenpunkte, aufgrund der guten Anpassung ihrer optischen Eigenschaften generell sehr gut als Antennen für organische Verbindungen eigenen.
Des Weiteren wurde ein Hybridsystem aus CdSe/ZnS Quantenpunkten und einer Dyade (Verbindung eines DTE Photoschalters und BODIPY Derivats), entworfen und charakterisiert. Ein ultraschneller EET von BODIPY auf den geschlossenen DTE Schalter wurde in vorangegangenen Studien beobachtet. Dieser EET führte zur Löschung der BODIPY-Emission. Sobald der Photoschalter im offenen Zustand vorliegt, findet aufgrund des fehlenden spektralen Überlapps kein EET statt und es wird die BODIPY-Emission detektiert. Die Erweiterung der Dyade um einen Quantenpunkt zeigte nach Anregung des Quantenpunkts dessen Fluoreszenzlöschung. Da die Emissionsbande der Quantenpunkte im Absorptionsbereich des BODIPY Farbstoffes liegt, konnte über statische und zeitaufgelöste Experimente ein ultraschneller EET von CdS/ZnS auf den Farbstoff ermittelt werden. Dies führte zu der Erweiterung des Anregungsspektrums des BODIPY Farbstoffs. Die Kopplung der Dyade an die Quantenpunktoberfläche lieferte eine Verbindung mit dem breiten Anregungsspekrum des Quantenpunkts und der schaltbaren Fluoreszenz der Dyade.
Das Hybridsystem aus CdSe Quantenpunkten und PDI zeigte vom Verhältnis der Quantenpunkte zu gekoppelten PDI Molekülen abhängige Fluoreszenzsignale. In TA Experimenten wurde ein ultraschneller EET ermittelt. Für hohe PDI Konzentrationen wurde ein weiterer EET von höher angeregten Elektronen auf das PDI identifiziert. Neben der EET Charakterisierung konnte ein zusätzlicher Prozess innerhalb des Hybridsystems mit hoher PDI Konzentration beobachtet werden. Auf den EET von Quantenpunkt auf PDI folgt ein ET aus dem Valenzband des Quantenpunkts in das HOMO des PDI*. In vorangegangene Arbeiten zu Hybridsystemen aus CdSe/ZnS und PDI wurde kein ET beobachtet. In dem beschriebenen Projekt konnte der Einfluss einer passivierenden Schale auf die elektronischen Eigenschaften von CdSe Quantenpunkten gezeigt werden.
Im letzten Teil dieser Thesis wurde die spektroskopische Charakterisierung einer NVOC und zweier NDBF Schutzgruppen beschrieben. Es konnten anhand statischer Absorptionsmessungen eine Freisetzungsquantenausbeute für NVOC-Adenin von 1,1 % ermittelt werden. Die Charakterisierung der Schutzgruppen mit einer NDBF Grundstruktur (DMA-NDBF und Az-NDBF) ergab eine Abhängigkeit der Freisetzungs- und Fluoreszenzausbeute von der Polarität des Lösungsmittels. In polarer Umgebung reduzierten sich die Quantenausbeuten deutlich...
In dieser Arbeit wird sowohl das Potenzial von molekularen Photoschaltern als lichtempfindliche Komponenten für photopharmakologische Anwendungen als auch das von künstlichen RNA-Aptameren als regulatorische Schalteinheiten für die Entwicklung von funktionellen Riboschaltern untersucht. Verschiedene wesentliche Aspekte beider Anwendungs-felder wurden eingehend einzeln untersucht und die beiden Schaltsysteme schließlich durch das Design eines synthetischen RNA-Aptamers kombiniert, dessen Ligandbindung durch licht-induzierte Isomerisierung seines Photoschalterliganden reguliert werden kann.
Molekulare Photoschalter wie Azobenzole und Spiropyrane haben sich als vielversprechende photochemische Werkzeuge erwiesen, um lichtgesteuert reversible und biochemisch nutzbare Effekte erzeugen. Spiropyrane bergen aufgrund der drastischen Veränderungen ihrer molekularen Eigenschaften infolge der Photoisomerisierung zum Merocyanin (MC) ein enormes Anwendungs-potenzial. Von den hier untersuchten wasserlöslichen Pyridin- (Py-) und Nitro-BIPS-Derivaten zeigt insbesondere die Py-BIPS-Verbindung 2 ein außerordentlich vielseitiges Verhalten. Im Vergleich zu anderen Vertretern dieser Photoschalterklasse wird ein deutlich höherer MC-Anteil von etwa 50% thermisch innerhalb von wenigen Minuten akkumuliert. Durch lichtinduzierten Ringschluss zum reinen Spiropyran (SP) und thermische Wiederherstellung des Gleichgewichts, kann diese hohe Schaltamplitude über mehrere Zyklen ohne signifikante Zersetzung beibehalten werden. Der Einsatz von schädlichem UV-Licht kann somit vermieden werden, was zusätzlich sehr vorteilhaft für einen möglichen Einsatz in einem biochemischen Kontext ist.
Verbindung 2 weist zudem mehrere Protonierungsstellen auf, die ihr in Abhängigkeit des pH-Wertes faszinierende photosaure Eigenschaften verleihen. Das einfach protonierte HMC Isomer ermöglicht eine lichtstimulierte reversible Kontrolle des pH-Wertes in einem Bereich von etwa 4,5 bis 7,5, mit möglichen pH-Sprüngen von bis zu 1,5 Einheiten. Durch transiente Absorptionsstudien wurde ein Mechanismus für die Protonenfreisetzung nachgewiesen, der lediglich auf der Veränderung des pKs-Wertes der N-protischen Position infolge des lichtinduzierten Ringschlusses beruht. Im Gegensatz dazu wird das phenolische Proton des doppelt protonierten HMCH Isomers innerhalb von 1-2 Pikosekunden nach Anregung aus dem angeregten Zustand an das Lösemittel übertragen. Durch eingehende Ultrakurzzeitmessungen der Freisetzung des phenolischen Protons, konnten die protonierten Spezies der Py- und Nitro-Merocyanine als Superphotosäuren etabliert werden. Sie können somit als ultraschnelle Auslöser für protonenvermittelte Prozesse eingesetzt werden, die zu den fundamentalsten Reaktionen in der Natur gehören.
Was potenzielle pharmakologische Zielsysteme betrifft, so dürfte RNA eine große Zukunft bevorstehen, da sie einfach zu synthetisieren ist und Zugang zu verschiedenen Ebenen zellulärer Regulationsmechanismen bietet. Insbesondere RNA-Aptamere, die in der Lage sind, niedermolekulare Liganden mit außergewöhnlich hoher Affinität und Spezifität zu binden, sind für die Entwicklung von künstlichen Riboschaltern hoch interessant. Während künstliche Aptamere für beliebige Liganden durch einen in vitro Selektionsprozess generiert werden können, ist nicht zur Gänze geklärt warum nur wenige von ihnen als aktive in vivo Riboschalter funktionieren. Die vorliegenden Ergebnisse zeigen die Bedeutung der konformationellen Aptamerdynamik während der Ligandenbindung für das Regulationspotential. Die Mg2+-abhängigen Bindungsstudien des hochfunktionellen Tetrazyklin (TC) -Aptamers zeigen, dass zweiwertige Kationen nicht nur für die korrekte Vorfaltung des Aptamers wichtig sind, sondern auch an der Ligandenbindung und RNA-Strukturanpassung selbst beteiligt sein können. Nach der Assoziation von TC an die Bindungstasche pflanzt sich eine Konformationsanpassung zur entfernten Dreifachhelixregion fort, wo Mg2+ zusätzlich für die Ausbildung endgültig gebundenen Zustandes benötigt wird.
Neben dem Einfluss von Mg2+, zeigen zeitaufgelöste Ligandenbindungsstudien von drei Ciprofloxacin (CFX) -Aptameren eine klare Korrelation zwischen der Kinetik des Struktur-anpassungsschrittes der RNA an den Liganden und dem beobachteten Regulationspotenzial in parallel durchgeführten in vivo Assays. Es wird geschlussfolgert, dass eine beschleunigte und irreversible RNA-Anpassung auf eine Konformationsänderung hindeutet, die ausgeprägt genug ist, um eine Aktivität als Riboschalter zu ermöglichen. Diese Erkenntnisse werden durch die berichteten Ligandenbindungskinetiken von anderen künstlichen Aptameren und auch von natürlichen Riboschaltern bestätigt und sollten weitreichende Implikationen für die Optimierung von Selektionsprotokollen für funktionelle Aptamere haben.
Schließlich wird ein lichtempfindliches RNA-Aptamer vorgestellt, dessen Ligand auf dem Antibiotikum Chloramphenicol (Cm) basiert, welches synthetisch mit einem Azobenzolfragment versehen wurde (azoCm). Durch systematische Optimierung von in vitro Selektionsprotokollen und die erfolgreiche Implementierung eines Belichtungsschrittes zur Isomerisierung des Liganden konnten Aptamere erhalten werden, die spezifisch an die trans-Form von azoCm binden. Bindungsaffinitätsstudien bestätigen diese Selektivität und durch Zirkulardichroismusstudien konnte zudem eine lichtinduzierte reversible Dissoziation des von cis-azoCm gezeigt werden. Damit wird hier eine erfolgreiche Entwicklungsstrategie für lichtabhängige RNA-Aptamer – Ligandsysteme dargelegt, welche wiederum fundamental neuartige Ansätze für die Erschließung lichtstimulierter biologischer Regulationswege zugänglich machen.