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Die Fluoreszenz der organischen Verbindung ''Pigment Yellow 101'' wurde mittels zeitaufgelöster Anreg-Abtast-Spektroskopie im sichtbaren Spektralbereich untersucht. P.Y. 101 und ein Derivat mit zusätzlichen Methylgruppen an den Azin-Kohlenstoffatomen, wurden mit zwei Derivaten verglichen, die keine Hydroxygruppen tragen und nicht fluoreszieren. Es konnte gezeigt werden, dass die Fluoreszenz bei diesen Verbindungen eine intrinsische Eigenschaft ist, die von der Reihenfolge der angeregten Zustände bestimmt wird. Bei Derivaten mit Hydroxygruppe entspricht der niedrigste angeregte Zustand einem pp*-Übergang, welcher hauptsächlich durch Fluoreszenz zurück in den Grundzustand gelangt. Bei den Verbindungen ohne Hydroxygruppe fehlt die stabilisierende Wasserstoffbrücke, die zur Absenkung des entsprechenden Zustands führt, so dass bei diesen Derivaten der unterste angeregte Zustand einem np*-Übergang entspricht, der optisch verboten ist und somit nicht direkt populiert wird. Bei der Anregung wird ein höher angeregter Zustand bevölkert, der in den niedrigsten angeregten Zustand relaxiert, welcher über eine konische Durchschneidung schnell und strahlungsfrei erreicht werden kann. Der niedrigste angeregte Zustand schneidet seinerseits den Grundzustand, so dass auch die Repopulierung des Ausgangszustands schnell, effizient und strahlungslos abläuft. Eine ganz andere Art der Photochemie wird bei Azobenzol (AB) und AB-Derivaten beobachtet. Durch Isomerisierung um die N-N-Doppelbindung wird ein Photoprodukt gebildet, das cis-Isomer. Die Quantenausbeute der Isomerisierung ist dabei abhängig davon, welcher elektronische Übergang angeregt wurde. Substituenten am AB üben unterschiedlichen Einfluss auf die elektronischen Eigenschaften aus: Elektronegative Gruppen in meta-Position zur Diazobrücke verändern die Lage der Absorptionsbanden kaum, ebensowenig die Rate der thermischen Rückisomerisierung und auch die Dynamik nach Photoanregung zeigt keine signifikanten Unterschiede in Abhängigkeit vom Substituenten und kann in Analogie an unsubstituiertes AB interpretiert werden. Nach Anregung des np*-Übergangs zerfällt der angeregte Zustand biexponentiell. Die Anregung des pp*-Übergangs, dem optisch erlaubten Übergang, führt zur Population des zweiten angeregten Zustands. Entlang einer konischen Durchschneidung wird schnell und effizient der erste angeregte Zustand populiert. Dieser Prozess zeigt sich bei den zeitaufgelösten Messungen in einer schnellen Zerfallszeit, die nur wenige hundert Femtosekunden beträgt. Die nun folgenden Prozesse finden im ersten angeregten Zustand statt und sind vergleichbar mit den Prozessen nach np*-Anregung. Der Hauptunterschied zwischen den beiden Dynamiken im S1-Zustand ist die Ausgangsgeometrie, mit der die Moleküle diesen Zustand populieren (Franck-Condon-Bereich bei direkter Anregung, bzw. eine große Bandbreite an Geometrien nach dem S2-S1-Übergang), sowie die Schwingungsenergie die das System jeweils besitzt. Auch nach ursprünglicher S2-Anregung können zwei Zerfallszeiten dem ersten angeregten Zustand zugeordnet werden, die analog der direkten Population als Geometrieänderung in Richtung des Potentialminimums und Isomerisierung bzw. Rückkehr in den Grundzustand interpretiert werden und in der Größenordnung von einer bzw. fünf Pikosekunden liegen. Die Modifizierung von Peptiden mit Azobenzol stellt einen Weg dar, zeitlich synchronisiert, eine Störung in der Struktur zu induzieren. Dieses Konzept wurde bereits erfolgreich zur Untersuchung der Faltung zyklischer Peptide eingesetzt. Modifizierte Kollagenstränge sind eine Erweiterung dieses Prinzips, da sie eine Möglichkeit darstellen, die Tertiärstruktur eines Peptids zu adressieren. Für das vorliegende Azokollagen konnte gezeigt werden, dass die gewählte Aminosäuresequenz auch nach Anbringen der Azobenzolklammer zu gefaltetem Kollagen führt, welches thermodynamisch stabil ist. Der Schmelzpunkt der Tripelhelix liegt unter den gewählten Bedingungen bei 55°C. Die Isomerisierung des Azobenzols induziert eine Störung der Tertiärstruktur, die zur teilweisen Entfaltung der Tripelhelix führt, was ein reversibler Prozess ist. Eine vollständige Entfaltung findet erst bei Temperaturen oberhalb des Schmelzpunkts statt. Zeitaufgelöste Messungen im sichtbaren Spektralbereich zeigten, dass die Schalterdynamik durch Anbringung an das Peptid nicht signifikant im Vergleich zum reinen AB-Schalter verändert wird.
Ribonukleinsäure (ribonucleic acid, RNA) wirkt bei der Proteinbiosynthese nicht nur als Informationsüberträger, sondern kann auch beispielsweise durch sogenannten Riboschalter (auch Riboswitches) regulatorische Funktionen übernehmen. Riboschalter sind komplett aus RNA aufgebaut und man kann sie sich als molekulare Schalter vorstellen, die die Genexpression kontrollieren. Konzeptionell besteht ein Riboswitch aus zwei Untereinheiten, dem Aptamer und der Expressionsplattform. Das Aptamer bindet, üblicherweise sehr spezifisch, kleine organische Moleküle, aber auch Ionen. Diese Ligandenbindung induziert Änderungen in der Struktur des Riboswitches, welche wiederum die Expressionsplattform beeinflussen. Je nach Riboswitch ermöglicht oder verhindert dies schließlich die Genexpression. Die vorliegende Doktorarbeit beschäftigt sich mit der Entwicklung und Etablierung von Methoden der optischen Spektroskopie zur Aufklärung von RNA-Dynamiken und -Strukturen im Allgemeinen und der Erforschung von Aptamerbindungsmechanismen im Besonderen.
Eine der dazu verwendetet Methoden ist die FTIR-Spektroskopie. Hierfür wurden zunächst kritische Parameter wie verschiedenste Messeinstellungen oder die Probenpräparation ausgiebig an RNA-Modellsträngen getestet. Dabei war es möglich, eine kleine Spektrenbibliothek als internen Standard aufzubauen. Gleichzeitig konnte gezeigt werden, dass kleinere RNA-Oligonukleotide (< ca. 20 Nukleobasen) gut mittels FTIR-Methoden untersucht werden können. Anschließend wurde eine statische Bindungsstudie am adenosin- sowie am guanosinbindenden Aptamer vorgenommen.
Die zweite hier vorgestellte Methode zur Untersuchung von RNA-Molekülen ist die Fluoreszenzspektroskopie. Im Gegensatz zur FTIR-Spektroskopie ist dazu allerdings eine Modifizierung der RNA durch ein Fluoreszenzlabel nötig. Deshalb beschäftigt sich der Hauptteil dieser Doktorarbeit mit der Charakterisierung und der Anwendung des quasi bifunktionellen RNA-Markers (auch RNA-Labels) Çmf. So wurden zunächst die photophysikalischen und photochemischen Eigenschaften des Markers untersucht. Dabei konnte gezeigt werden, dass Çmf sich als lokale Sonde eignet, da es empfindlich auf Änderungen der Mikroumgebung in Lösung reagiert. Durch direkten Vergleich der optischen Eigenschaften von Çmf mit den entsprechenden Eigenschaften des Spinlabels Çm war es möglich, den starken Fluoreszenzlöschungseffekt (sog. quenching) des Çm aufzuklären. So kann davon ausgegangen werden, dass die Fluoreszenz des Çm durch eine sehr schnelle interne Konversion (IC) in einen dunklen Dublettzustand (D1) gelöscht wird.
Im nächsten Schritt wurde Çmf in RNA-Modellstränge eingebaut, um den Einfluss der RNA auf die Photochemie des Markers zu untersuchen. Dabei konnte gezeigt werden, dass sich dessen Fluoreszenzsignal abhängig von den direkten Nachbarbasen sowie abhängig vom Hybridisierungszustand signifikant ändert. Gleichzeitig konnte keine deutliche Veränderung der Stabilität der Modellstränge festgestellt werden. So konnte also nachgewiesen werden, dass sich Çmf sehr gut als lokale Sonde in RNA eignet. Im Speziellen wurde aus den Ergebnissen geschlossen, dass der Fluorophor für Ligandenbindungsstudien herangezogen werden kann.
Deshalb wurde Çmf schließlich an mehreren verschiedenen Stellen in das neomycinbindende Aptamer (N1) eingebaut, um dessen Bindungskinetik zu untersuchen. Mittels Stopped-Flow-Messungen war es möglich, die Bindungsdynamik des Aptamers zu beobachten. Anhand dieser transienten Daten konnte ein Zweischrittbindungsmodell abgeleitet werden. Dabei bindet Neomycin zunächst unspezifisch an das weitgehend vorgeformte Aptamer. Anschließend kommt es durch die Ausbildung von Wasserstoffbrücken zu einer spezifischen Bindung des Liganden am Aptamer.
Im dritten Teil dieser Arbeit geht es ebenfalls um die Entwicklung und Etablierung eines spektroskopischen Werkzeuges. Dabei stehen allerdings Rhodopsine im Mittelpunkt der Aufmerksamkeit. Hierbei handelt es sich um Membrantransportproteine, die nach optischer Anregung einen sehr schnellen Photozyklus mit mehreren Intermediaten durchlaufen. Es ist möglich, diese Intermediate dank transienter Absorptionsmessungen mit sehr guter zeitlicher und spektraler Auflösung zu beobachten. Allerdings besteht der Bedarf, diese Intermediate statisch zu präparieren, um sie näher charakterisieren und mit anderen Methoden, wie z.B. der Festkörper-NMR, vergleichen zu können.
Ein spektroskopisches Werkzeug zum Präparieren von frühen Photointermediaten ist kryogenes Einfangen (sog. Cryotrapping) dieser Intermediate. Im Rahmen dieser Arbeit wurden das Cryotrapping und die anschließende statische UV/vis-Absorptionsspektroskopie der fixierten (getrappten) Zustände optimiert und an einer Reihe von Rhodopsinen (ChR2, GPR) demonstriert.