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Bacteria are true artists of survival, which rapidly adapt to environmental changes like pH shifts, temperature changes and different salinities. Upon osmotic shock, bacteria are able to counteract the loss of water by the uptake of potassium ions. In many bacteria, this is accomplished by the major K+ uptake system KtrAB. The system consists of the K+-translocating channel subunit KtrB, which forms a dimer in the membrane, and the cytoplasmic regulatory RCK subunit KtrA, which binds non-covalently to KtrB as an octameric ring. This unique architecture differs strongly from other RCK-gated K+ channels like MthK or GsuK, in which covalently tethered cytoplasmic RCK domains regulate a single tetrameric pore. As a consequence, an adapted gating mechanism is required: The activation of KtrAB depends on the binding of ATP and Mg2+ to KtrA, while ADP binding at the same site results in inactivation, mediated by conformational rearrangements. However, it is still poorly understood how the nucleotides are exchanged and how the resulting conformational changes in KtrA control gating in KtrB is still poorly understood.
Here,I present a 2.5-Å cryo-EM structure of ADP-bound, inactive KtrAB, which for the first time resolves the N termini of both KtrBs. They are located at the interface of KtrA and KtrB, forming a strong interaction network with both subunits. In combination with functional and EPR data we show that the N termini, surrounded by a lipidic environment, play a crucial role in the activation of the KtrAB system. We are proposing an allosteric network, in which an interaction of the N termini with the membrane facilitates MgATP-triggered conformational changes, leading to the active, conductive state.
Acinetobacter baumannii is a worldwide opportunistic pathogen responsible for nosocomial infections. One of the main factors contributing to multidrug resistance in A. baumannii is the upregulation of various chromosomally encoded or acquired efflux pumps, which expel toxic compounds out of the cells with high efficiency.
The resistance-nodulation-cell division (RND)-type efflux pump gene deletion strains ∆adeAB, ∆adeFG or ∆adeIJ and the major facilitator superfamily (MFS) chloramphenicol efflux pump gene deletion strain ∆craA of A. baumannii ATCC 19606 were created and a differential gene expression study was conducted via RT-qPCR. The expression of efflux pump genes adeB, adeG, adeJ, craA, and the outer membrane protein ompA were examined in the absence and presence of chloramphenicol. No significant up- or downregulation of these genes for any of these deletion strains in comparision to the wild-type strain in absence of the drug chloramphenicol.
In contrast, craA was significantly up-regulated in A. baumannii exposed to chloramphenicol, emphasizing the importance of CraA in chloramphenicol resistance. CraA is widely present in clinical isolates of A. baumannii. It is homologous to the well-studied multiple-drug efflux transporter MdfA from Escherichia coli (61% similarity), but surprisingly reported to be acting as a specific chloramphenicol transporter of A. baumannii (Roca et al., 2009).
The drug susceptibility assay done with A. baumannii ATCC 19606 ΔcraA showed that CraA could confer resistance towards phenicols (chloramphenicol, thiamphenicol, and florfenicol), which was in line with the previous report. CraA was heterologously overproduced in E. coli BW25113 ∆emrE∆mdfA and its substrate specificity was determined by drug susceptibility assays and whole cell fluorescent dye uptake experiments. We observed that the substrate specificity of craA overexpressed in E. coli was more diverse and resembling that of the E. coli MdfA homolog. Apart from resistance towards phenicols (chloramphenicol, thiamphenicol, and florfenicol), CraA also confer resistance towards monovalent cationic drugs (benzalkonium, TPP+, and ethidium), long dicationic drugs (dequalinium and chlorhexidine), fluoroquinolones (norfloxacin and ciprofoxacin) and anticancer drugs (mitomycin C). We showed that CraA is a drug/H+ antiporter by ACMA quenching in inverted CraA or CraA variant containing membrane vesicles.
To address the molecular determinants for multidrug binding and transport, 45 mostly single Ala-substitution variants of CraA were created. These include substitution variants for membrane-embedded proton-titratable residues (E38, D46, and E338) and residues predicted to be important for binding and transport of drug, as inferred from docking experiments on basis of a MdfA-derived CraA model. The combined results indicated a high degree of functional similarities between MdfA and CraA. The conserved titratable residues E26 and D34 (E38 and D46 in CraA) are important for transport in both these homologs. The CraA variant E38A is inactive against all tested drugs, but D46A is only inactive for some drugs, suggesting that only E38 is involved in H+-transport.
Another focus of this thesis is the three tetracycline transporters of A. baumannii strain AYE, TetA, TetG and TetA(A). Susceptibility assays involving tetracycline, minocycline, doxycycline and the last-resort antibiotic tigecycline were conducted on E. coli BW25113 ∆emrE∆mdfA overexpressing these transporters. TetA(A) was excluded from further study due to toxicity of the cells caused by protein overexpression. Both TetA and TetG confer resistance against tetracycline, minocycline and doxycycline. Although tigecycline was reported not to be recognized by tetracycline efflux pumps, we surprisingly found that TetA is able to transport tigecycline. The role of TetA in tigecycline efflux in A. baumannii was confirmed by conducting tigecycline susceptibility assays on A. baumannii.
We speculate that TetA embedded in the inner membrane acts in cooperation with RND-type tripartite systems that span the inner and outer membrane to extrude tigecycline from the periplasm across the outer membrane. A. baumannii ATCC 19606 ∆adeAB were indeed sensitive to tigecycline in comparison to wild-type strain. Deletion of adeIJ also leads to sensitivity to tigecycline, but less so compared to the DadeAB phenotype, while A. baumannii ATCC 19606 ∆adeFG did not show any difference compared to wild-type strain in tigecycline susceptibility. Differential gene expression analysis of the RND efflux pumps (adeB, adeG and adeJ) and tetA of A. baumannii strain AYE showed that the expression of tetA expression is significantly upregulated when tigecycline is present in the growth medium.
We conclude that craA encodes a broad-spectrum efflux pump rather than a specific chloramphenicol transporter. In A. baumannii, the synergistic effects with the outer membrane and/or the presence of other transporters could result in the discrepancy observed. Thus, the possibility of CraA in conferring multidrug resistance should not be overlooked, especially when it is up-regulated under antibiotic stress conditions.
Specialized transporter proteins facilitate controlled uptake and extrusion of molecules across biological membranes that would otherwise be impermeable to them. The superfamily of solute carriers (SLC) comprises the second largest group of membrane proteins in humans, acting on a variety of small polar and non-polar molecules and ions. Because of their central role in metabolism, malfunctioning of these proteins often is pathogenic. The interest in SLC transporters as drug targets – as well as for drug delivery – has therefore increased in the past years. For many SLC subfamilies, however, structural and functional information remains scarce to date.
The here presented data provides important insights into different aspects of the transport mechanism of the SLC23 and SLC26 protein families. Importantly, we show that SLC23 nucleobase transporters, in contrast to what was been previously reported, work as uniporters rather than as proton-coupled symporters. In order to do so, we developed the first and only in vitro transport assay for the SLC23 family, which enables investigation of protein function in a defined environment. Moreover, we provide a hypothesis on the role of the extremely conserved negative charged substrate binding site residue found not only in the SLC23, but also SLC4 and SLC26 families. Based on a detailed analysis of binding and transport we conclude that this conserved negative charged has a relevance for protein stability rather than for substrate binding, which explains its conservation for all three protein families that otherwise differ in their substrate specificities and modes of transport. Lastly, we investigated the relevance of oligomerization for the SLC23 and SLC26 families, highlighting the importance of the STAS domain for forming active dimers in the SLC26 anion transporter family.
1. Das Wachstum und die Fähigkeit zur Butyratproduktion von E. callanderi KIST612 wurde in geschlossenen Batch-Kulturen mit den Substraten Glukose, Methanol, Formiat, H2 + CO2 und CO untersucht. E. callanderi KIST612 zeigte sich nur bei Wachstum auf 20 mM Glukose oder 20 mM Methanol in der Lage, Butyrat in größeren Mengen (3,7 – 4,3 mM) zu produzieren. Das Hauptprodukt bei allen untersuchten Wachstumssubstraten war jedoch Acetat.
2. In bioinformatischen Analysen des Genoms von E. callanderi KIST612 konnte nur eine A1AO-ATP-Synthase gefunden werden, welche eine V-typ c-Untereinheit bestehend aus 4 TMH‘s mit nur einer Na+-Bindestelle aufweist. Diese konnte aus gewaschenen Membranen von E. callanderi durch Saccharose-Dichtegradientenzentrifugation, Anionenaustausch-Chromatographie (DEAE) sowie einer Größenausschluss-Chromatographie (Superose 6) bis zur apparenten Homogenität gereinigt werden. Nach Produktion einzelner Untereinheiten (A, B, C, D, E, F und H) in E. coli und Generierung von Antikörpern, konnten alle Untereinheiten (A, B, C, D, E, F, H, a sowie c) in der gereinigten Enzympräparation immunologisch oder mittels „Peptide-Mass-Fingerprinting“ nachgewiesen werden. Es konnte somit erstmals eine A1AO-ATP-Synthase aus einem mesophilen Organismus ohne Verlust von Untereinheiten gereinigt werden.
3. Der Gesamtkomplex wies unter nativen Bedingungen eine molekulare Masse von ca. 670 kDa auf. In elektronenmikroskopischen Aufnahmen zeigte sich anhand der hantelförmigen Strukturen, dass die A1AO-ATP-Synthase als intakter Gesamtkomplex gereinigt werden konnte.
4. Die gereinigte A1AO-ATP-Synthase wurde zunächst anhand ihrer ATP-Hydrolyse-Aktivität biochemisch charakterisiert. Die ATP-Hydrolyse-Aktivität hatte ein pH-Optimum von 7 – 7,5 und ein Temperaturoptimum bei 37 °C. Durch Messung der ATPase-Aktivität in Abhängigkeit von verschiedenen Mengen an Na+ konnte die vorhergesagte Na+-Abhängigkeit des Enzyms nachgewiesen werden. Zudem zeigten Hemmstoffexperimente mit DCCD, dass dieser Inhibitor mit Na+ um die gemeinsame Bindestelle in der c-Untereinheit konkurriert. Dies bestätigte nochmals, dass das Enzym funktionell gekoppelt gereinigt werden konnte.
5. Zur weiteren Untersuchung der Ionenspezifität wurde der an die ATP-Hydrolyse gekoppelte Ionentransport durch Rekonstitution des Enzyms in Liposomen und anschließender Messung des Na+- oder H+-Transports gemessen. In den Proteoliposomen konnte mit Hilfe von 22Na+ gezeigt werden, dass das Enzym Natriumionen translozieren kann. Während in Anwesenheit des Natriumionophors ETH 2120 kein 22Na+-Transport beobachtet werden konnte, führte die Anwesenheit des Protonophors TCS zu einer geringfügigen Stimulation der 22Na+-Translokation. Insgesamt konnte ein primärer Na+-Transport nachgewiesen werden, welcher von der A1AO-ATP-Synthase aus E. callanderi katalysiert wird.
6. Durch Rekonstitution der A1AO-ATP-Synthase aus E. callanderi in Liposomen konnte erstmals biochemisch nachgewiesen werden, dass ein solches Enzym trotz seiner V-Typ c-Untereinheit in der Lage ist, ATP zu synthetisieren. Durch die Zugabe von Ionophoren (ETH 2120 und TCS) konnte der elektrochemische Ionengradient aufgehoben werden, wodurch keine ATP-Synthese beobachtet werden konnte. Der erstmalige Nachweis der ATP-Synthese wurde bei einem ΔµNa+ von 270 mV erbracht.
7. Die ATP-Synthese zeigte sich ebenfalls abhängig von der Na+-Konzentration. Der KM-Wert lag bei 1,1 ± 0,4 mM und war vergleichbar mit dem für die ATP-Hydrolyse ermittelten Wert. Ebenso konnte für die ATP-Synthese-Richtung gezeigt werden, dass DCCD mit Na+ um die gemeinsame Bindestelle in der c-Untereinheit konkurriert.
8. Um den biochemischen Nachweis zu erbringen, dass die A1AO-ATP-Synthase auch unter physiologisch relevanten Potentialen zur ATP-Synthese befähigt ist, wurde der energetische Schwellenwert der ATP-Synthese bestimmt. Dieser betrug 87 mV als Triebkraft für ΔpNa, 94 mV als Triebkraft für Δψ und 90 mV als Triebkraft für ΔµNa+. Erstaunlicherweise konnte die ATP-Synthese der A1AO-ATP-Synthase aus E. callanderi KIST612 sowohl durch Δψ als auch ΔpNa angetrieben werden. Unterschiedliche Kombinationen von Δψ und ΔpNa führten zu dem gleichen energetischen Schwellenwert; Δψ und ΔpNa waren im Enzym aus E. callanderi KIST612 äquivalente Triebkräfte.
9. Der energetische Schwellenwert der A1AO-ATP-Synthase aus E. callanderi KIST612 wurde mit dem der F1FO-ATP-Synthasen aus A. woodii, E. coli und P. modestum verglichen. Dazu wurden die Enzyme im ATP-Synthase-defizienten E. coli-Stamm DK8 produziert und anschließend durch Ni2+-NTA-Affinitätschromatographie gereinigt. Nach Einbau der Enzyme in Liposomen waren alle Enzyme in der Lage, ATP als Reaktion auf ΔµNa+ (A. woodii und P. modestum) oder ΔµH+ (E. coli) zu synthetisieren. Im Vergleich zum Enzym aus E. callanderi zeigten sich zwei auffällige Unterschiede. Erstens war keine der F1FO-ATP-Synthasen in der Lage, ΔpNa/ΔpH als alleinige Triebkraft zu nutzen. Während die ATP-Synthese in den Enzymen aus E. coli und P. modestum nur durch ΔµH+ bzw. ΔµNa+ angetrieben werden konnte, konnte das Enzym aus A. woodii zusätzlich auch durch Δψ als einzige Triebkraft angetrieben werden.
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Diese Arbeit ist ein detaillierter Bericht über die Forschungsaktivitäten, die ich während meiner Promotion am Max-Planck-Institut für Biophysik durchgeführt habe. Mit dem Aufkommen der direkten Elektronendetektoren erlebte die Transmissionselektronenmikroskopie von gefrorenen hydratisierten Proben (Kryo-EM) einen epochalen Wandel, die sogenannte “Auflösungsrevolution”. Ab den 2010er Jahren ermöglichte die Kommerzialisierung der ersten direkten Detektoren die Erforschung biologischer Phänomene in beispiellosem Detail und machte Kryo-EM zu einer der leistungsstärksten (und gefragtesten) Forschungsmethoden in den Biowissenschaften. Meine Forschung konzentrierte sich auf die Verwendung der Elektronen-Kryotomographie, um zwei herausfordernde Ziele zu erreichen. Das erste bestand darin, die Denaturierung von Proteinen an der Luft-Wasser-Grenzfläche zu untersuchen, und das zweite die molekulare Landschaft eines lichtempfindlichen Chloroplastenvorläufers, des Etioplasten, zu beschreiben. Um die Relevanz, Herausforderungen und Auswirkungen meiner Arbeit zu vermitteln, habe ich diese Arbeit in drei Kapitel unterteilt.
Kapitel eins enthält eine Einführung in die Transmission-Elektronenmikroskopie.
Nach einer kurzen Zusammenfassung der historischen Meilensteine in der Disziplin beschreibe ich die wesentlichen Komponenten des TEM und deren Funktionsweise. Hier lege ich besonderen Wert auf die Struktur elektromagnetischer Linsensysteme, wie sie den Weg der Elektronen beim Durchlaufen der Säule beeinflussen und wie Bilder entstehen. Der hardwarebezogene Teil der Einführung wird durch eine vereinfachte Beschreibung der Elektronendetektoren abgeschlossen, in der ich die revolutionären Aspekte der direkten Elektronendetektoren, mit der Struktur und Funktion von CCD-Detektoren (Charge Coupled Device detector) vergleiche. Als nächstes konzentriere ich mich auf die theoretischen Prinzipien der Bilderzeugung. Um die Hauptphänomene im Zusammenhang mit der Bildqualität in TEM hervorzuheben, stelle ich grundlegende Konzepte wie den Einfluss von Elektronenenergie und optischen Aberrationen vor, gefolgt von einer ausführlicheren Beschreibung des Ursprungs von Kontrast und Rauschen. Der Unterabschnitt schließt mit einigen Überlegungen darüber, wie - und vor allem wie effizient - Detektoren kontinuierliche Elektronenwellen in diskrete Bereiche (Pixel) abtasten. Der folgende Unterabschnitt ist der Erfassung und Verarbeitung tomografischer Daten gewidmet. Hier gebe ich eine vereinfachte Beschreibung, wie Kippserien mit dem Mikroskop erfasst werden und wie die Rohdaten zu einer dreidimensionalen Darstellung der Probe verarbeitet werden. Der Einfluss der Neigungsgeometrie und der Dosisverteilung auf die Rekonstruktionsqualität wird ebenfalls diskutiert. Der zweite Teil des Unterabschnitts befasst sich mit der Strukturbestimmung durch Subtomogramm-Mittelung und der Errechnung der Auflösung von Kryo-EM-Rekonstruktion. Zuletzt schließe ich das Kapitel mit einer Beschreibung der Vorbereitung biologischer Proben für die Kryo-EM-Bildgebung mit einigen abschließenden Bemerkungen zur Dynamik und den Grenzen der Vitrifizierung ab.
Kapitel zwei folgt dem Thema der Kryo-Präparation biologischer Proben mit der Untersuchung der Denaturierung von Proteinen an der Luft-Wasser-Grenzfläche.
Im Einführungsabschnitt skizziere ich die wichtigsten Aspekte dieses Phänomens. Frühe Experimente zum Verhalten von Proteinen in Lösung zeigten ihre Neigung, aus der Lösung zu ihrer Grenzfläche mit der Atmosphäre zu diffundieren. Hier bilden sie meist unlösliche Schichten denaturierter Fibrillen Es wurde vorgeschlagen, dass die Korrelation zwischen Proteindenaturierung und Kontakt mit der Grenzfläche auf einen allmählichen Entfaltungsprozess zurückzuführen ist, bei dem Tausende von Wechselwirkungen pro Sekunde zu einer immer größeren strukturellen Schädigung führen würden. Ein direkter Beweis für diesen Mechanismus wurde jedoch nie dokumentiert. Um einen tieferen Einblick in die Dynamik an der Luft-Wasser-Grenzfläche zu erhalten, sammelte ich Kryotomogramme vitrifizierter Präparate der Fettsäuresynthase (FAS, Fatty Acid Synthase) aus Hefe. Im ersten Unterabschnitt der Ergebnisse beschreibe ich, wie die biochemische und Negativkontrastierung-TEM-Analyse von FAS-Fraktionen zeigte, dass der Komplex während des gesamten Reinigungsverfahrens intakt und katalytisch aktiv blieb. Nach der Vitrifizierung ergab die Einzelpartikelanalyse jedoch, dass 90% aller Komplexe stark beschädigt waren. Die tomographische Rekonstruktion derselben Proben zeigte, dass alle FAS-Komplexe an die Luft-Wasser-Grenzfläche gebunden waren. Die Seite des Moleküls, die der Grenzfläche ausgesetzt war, schien abgeflacht zu sein, während die Seite, in der wässrigen Phase, ihre native Struktur beibehielt. Die Mittelung der Subtomogramme bestätigte, dass eine Seite von fast 90% der Partikel stark beschädigt war. Durch den Vergleich der Ausrichtung dieser beschädigten Seite mit der Position eines Rechenmodells der Luft-Wasser-Grenzfläche konnte ich nachweisen, dass sie perfekt übereinstimmen, was den ersten direkten Beweis dafür liefert, dass die Wechselwirkung mit der Luft-Wasser-Grenzfläche die lokale Denaturierung großer Proteinkomplexe herbeiführt.
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Resistant microbes are a growing concern. It was estimated that about 33,000 of people die because of the infections caused by multidrug resistant bacteria each year in Europe (ECDC, 2018, https://www.ecdc.europa.eu/). Bacteria can acquire resistance against toxic compounds via different mechanisms and intrinsic active efflux is one of the first mechanisms deployed by bacterial cells. The membrane-localized efflux pumps catalysing this reaction, extract toxic compounds from the interior of the cell and transport these to the outside, thereby maintaining sub-lethal toxin levels in the cytoplasm, periplasm and membranes. Gram-negative three-component efflux pumps, analysed in this study, are composed of an inner membrane protein, a member of the Resistance-Nodulation cell Division (RND) superfamily, an Outer Membrane Factor (OMF) protein and a Membrane Fusion Protein (MFP) that connects the two afore mentioned components into an active efflux pump. The pumps described in this work, AcrAB-TolC and EmrAB-TolC, are drug efflux pumps belonging to the RND and MFS superfamilies, respectively, while CusCBA is an efflux pump that belongs to the RND heavy metal efflux family. Another efflux pump that was used as a model for the design of an in vitro assay for the silver ion transport studies, CopA, belongs to the P-type ATPase superfamily. All pumps analysed in this study are part of the resistance system of Escherichia coli, which is a highly clinically relevant pathogen.
In order to examine the AcrAB-TolC, CopA and CusA efflux pumps, the individual components were separately produced in E. coli, purified to monodispersity and reconstituted in large unilamellar vesicles, LUVs. Means for the optimized production and adequate conditions for efficient reconstitution were presented in this study. The activity of AcrB in LUVs was detected using fluorescence quenching of the dye 8-hydroxy-1,3,6 pyrenetrisulfonate (pyranine), which is incorporated inside the proteoliposomes and is sensitive to the pH changes in its surrounding. The inactive AcrB variant with a substitution in the proton relay network, D407N, showed no activity in proteoliposomes, which correlates with the measurements done in empty liposomes. When AcrA was co-reconstituted with AcrB D407N proteoliposomes it did not restore protein activity. To test the assembly of the AcrAB-TolC pump out of its single components, an in vitro assay was established where the complex assembly was tested with AcrAB- and TolC-containing liposomes. These experiments showed putative AcrAB-TolC formation in the presence or absence of a pump substrate, taurocholate, as well as in the presence of the pump inhibitor, MBX3132. The assembly appeared stable over time and results were invariant in the presence or absence of a pH gradient across the AcrAB-containing membrane.
After determination of the ATPase activity of the P-type ATPase, CopA, in detergent micelles, the protein was reconstituted in LUVs. Quenching of the Ag+-sensitive dye Phen Green SK (PGSK), present on the inside of the CopA-containing proteoliposomes, was observed in presence of ATP and Ag+. Under the same conditions, but in absence of Ag+-ions, quenching was reduced by 80 % after 300 seconds. No PGSK-quenching was observed in control liposomes in the presence of ATP and Ag+. The additional presence of sodium azide led to minimal reduction of the PGSK-quenching as expected since sodium azide is not an inhibitor of P-type ATPases, but the quenching rate was similar to that of the same experimental condition with control liposomes.
The RND superfamily member CusA, as part of the tripartite CusCBA efflux pump, has been proposed to sequester Ag+ or Cu+ from either the cytoplasmic or periplasmic side of the inner membrane. The periplasmic transport of silver ions was implied from an in vitro assay where the quenching of a pH sensitive dye, 9-amino-6-chloro-2-methoxyacridine (ACMA), indicates acidification of the lumen of the proteoliposomes containing CusA when an inwardly directed pH was imposed. The same experiment with the CusA D405N variant, which was previously reported to be an inactive variant, also led to ACMA quenching, although at a slightly lower rate. Under application of an inwardly directed pH and a (negative inside), CusA-containing proteoliposomes showed a strong quenching of the incorporated PGSK dye, suggesting strong Ag+ influx.
The Major Facilitator Superfamily-(MFS-) type EmrAB-TolC pump has an analogous structural setup as the RND-type AcrAB-TolC pump. To examine the efflux of one of its substrates, carbonyl - cyanide m-chlorophenylhydrazone (CCCP), a plate-based susceptibility assay was used. The presence of the EmrAB-TolC pump confers lower susceptibility levels towards CCCP in E. coli, compared to cells not expressing the pump or cells expressing only the MFS component, indicating that EmrAB-TolC extrudes CCCP.
The work done in this study opens up a path towards investigation of drug and metal resistance in vitro. The methodologies to obtain proteoliposomal samples of multicomponent efflux pumps and subsequent measurements of drug/metal ion and H+ fluxes, as well as the determination of pump assembly are crucial for the future research on pump catalysis and transport kinetics. The in vivo drug-plate assays done in this work provide initial insights for future investigations of the drug susceptibility of E. coli expressing the MFS-type tripartite efflux pumps.