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Hypertonie stellt in der westlichen Welt die Haupttodesursache dar, obwohl sie im Hinblick auf die pharmakologischen Therapieoptionen gut behandelbar ist. Hauptursächlich ist hierfür eine, vor allem durch eine Non-Adhärenz (u.a. bedingt durch den asymptomatischen Charakter) und in selteneren Fällen eine aufgrund einer therapieresistente Hypertonie (TRH) verursachte, unzureichende Blutdruckkontrolle. Eine Möglichkeit zur Überprüfung der Therapietreue in der antihypertensiven Therapie ist der qualitative Nachweis der Arzneistoffe im Blut oder Urin. Unklar ist, inwiefern die Substanzen in einer biologischen Probe innerhalb des Dosierungsintervalls oder darüber hinaus nachweisbar sind und es zu einer Falschbeurteilung kommen kann.
Daher wurde eine quantitative chromatographisch-tandem-massenspektrometrische Methode für das Therapeutische Drug Monitoring von blutdrucksenkenden Arzneistoffen entwickelt und analytisch vollständig validiert. Bei 38 Patienten mit überwachter Medikamenteneinnahme wurde die Aussagekraft der Methode hinsichtlich der Bestätigung einer Adhärenz zunächst mittels zweier Wirkstoffkonzentrationen im Serum (Tal- und Spitzenspiegel) überprüft. Zur Bewertung der Konzentrationen wurden zwei Konzepte evaluiert. Einerseits wurde die untere Grenze des therapeutischen Referenzbereiches (TRR, Literaturdaten) und andererseits die mittels Rechenmodell (Daten pharmakokinetischer Studien) individuell ermittelte, dosisbezogene Arzneimittelkonzentration (DRC) evaluiert. In einem zweiten Studienansatz wurde diese neue quantitative Methode an einem Kollektiv von 36 ambulanten Patienten (ohne überwachte Medikamenteneinnahme) angewendet und zur Überprüfung der Aussagekraft mit Ergebnissen des etablierten Urinscreenings verglichen.
Die gemessenen Wirkstoffkonzentrationen von Atenolol (64 bis 564 ng/ml), Bisoprolol (2,5 bis 53 ng/ml), Metoprolol (5,8 bis 110 ng/ml), Nebivolol (0,32 bis 3,4 ng/ml), Hydrochlorothiazid (15 bis 606 ng/ml), Furosemid (22 ng/ml), Torasemid (17 bis 1829 ng/ml), Canrenon (25 bis 221 ng/ml), Amlodipin (2,4 bis 35 ng/ml), Lercanidipin (0,24 bis 21 ng/ml), Candesartan (6,0 bis 268 ng/ml), Telmisartan (22 bis 375 ng/ml) und Valsartan (115 bis 7962 ng/ml) haben gezeigt, dass die quantitative Analyse von Antihypertensiva in Serumproben und deren Auswertung auf Basis der individuell berechneten unteren DRC in der Beurteilung einer Adhärenz vielversprechend ist.
Die Auswertung auf Basis der unteren Grenze des TRR signalisierte bei den stationären Patienten (überwachte Einnahme) innerhalb der Substanzklasse der Diuretika (ohne Torasemid) bei 16,7 %, der β-Blocker bei 29,4 %, der Calciumkanal-Blocker bei 14,8 % und der AT1-Antagonisten bei 25 % fälschlicherweise eine Non-Adhärenz.
Die rein qualitative Urinanalyse zeigte im Falle der β-Blocker Atenolol, Bisoprolol und des Diuretikums HCT aufgrund einer hohen Bioverfügbarkeit, einer langen Halbwertszeit oder einer überwiegend renalen Ausscheidung der Muttersubstanz ein Nachweisfenster über das Dosierungsintervall hinaus, was bedingt, dass einige Patienten fälschlicherweise als adhärent gewertet wurden. Ein anderes Problem zeigte sich bei einigen Patienten, die mit dem AT1-Antagonist Candesartan oder dem Calciumkanal-Blocker Lercanidipin behandelt wurden und die als non-adhärent eingestuft wurden. Eine geringe Bioverfügbarkeit, eine hohe Metabolisierungsrate oder geringe renale Ausscheidung der unveränderten Arzneistoffe lies auf eine mangelhafte Nachweisbarkeit innerhalb des Dosierungsintervalls und damit auf eine eingeschränkte Beurteilbarkeit schließen.
Aus den Untersuchungen ergibt sich, dass es bei Anwendung qualitativer Nachweismethoden aufgrund besonderer Pharmakokinetiken einzelner antihypertensiver Wirkstoffe zur Fehleinschätzung der Adhärenz kommen kann. Die neu entwickelte Methodik in Form einer quantitativen Serumanalyse ist unter Verwendung patientenindividueller Bewertungskriterien bei dieser Fragestellung überlegen.
Die schlechte Prognose des Plattenepithelkarzinoms der Kopf-Hals-Region zeigt die Notwendigkeit, neue Therapieverfahren zu erforschen und die vorhandenen Behandlungsmodalitäten zu optimieren und miteinander bzw. mit neuen Therapieverfahren zu kombinieren. Die intraarterielle Chemotherapie als Chemoperfusion bildet im Rahmen der Optimierung der vorhandenen ein Therapieverfahren, das eine hohe lokale Effektivität bei Kopf-Halstumoren aufweist. Die Chemoembolisation als eine weitere Optimierung der intraarteriellen Chemotherapie ist eine innovative und vielversprechende Methode. Hauptgegenstand dieser Untersuchung war es, mit Hilfe der Mikrodialyse als einem wenig invasiven Instrument zur dynamischen Messung der extrazellulären Gewebekonzentrations-Zeitverläufe die Konzentration von Cisplatin und seinem Antidot Natriumthiosulfat bei unterschiedlichen Applikationswegen (Cisplatin intraarteriell und Natriumthiosulfat intravenös) in Abhängigkeit von der Applikationsverfahren, d.h. Chemoperfusion versus Chemoembolisation, zu bestimmen. Die im Blutkreislauf gemessenen Konzentrationen wurden dem gegenübergestellt. Ziel war die Optimierung der systemischen Abschirmung des lokal wirksamen Cisplatin bei der höchstmöglichen lokalen Cisplatin-Konzentration. Es wurden zwei Patientengruppen untersucht. Die Patientenaufnahme in die Studie erfolgte konsekutiv. Die erste Gruppe bestand aus 10 Patienten, die zweite Gruppe aus 6 Patienten. Die histologisch gesicherten Plattenepithelkarzinome waren, mit einer Ausnahme, nicht vorbehandelt. Eine Cisplatindosis von 150 mg/m² wurde für die Behandlung beider Gruppen eingesetzt. Die Applikation der neoadjuvanten Chemotherapie erfolgte superselektiv über einen transfemoralen Zugang nach angiographischer Darstellung. In der ersten Gruppe wurde eine intraarterielle Cisplatin-Chemoperfusion eingesetzt, wobei die absolute Cisplatindosis in 500ml NaCl-Lösung 0,9% aufgelöst wurde. In der zweiten wurde eine Chemoembolisationsmethode eingesetzt unter Verwendung einer wässrigen kristallinen Cisplatinsuspension, wobei die Cisplatindosis in 45-60 ml NaCl-Lösung 0,9% aufgelöst wurde. 10 s nach Beginn der Cisplatingabe wurde Natriumthiosulfat mit einer Dosis von 9 g/m² intravenös verabreicht. Nach präinterventioneller Insertion einer Mikrodialysesonde in das Tumorzentrum wurden Dialysate in 20 minütigen Intervallen gesammelt. Parallel und über einen Zeitraum wurden bei der ersten Gruppe von bis 70 Stunden und bei der zweiten Gruppe von bis zu 8 Stunden post interventionem Blutproben entnommen. Die Konzentrationen von Cisplatin und Natriumthiosulfat im Dialysat und in den Blutproben wurden unter Verwendung von HPLC analysiert. Nach Chemoembolisation war die maximale Tumorkonzentration (Cmax=180,3 ± 62,3 μmol/L) und die Fläche unter der Konzentration/Zeit-Kurve (AUC= 89,6 ± 31,3 μM·h) für Cisplatin etwa 5 mal höher als die entsprechenden Werte für die intraarterielle Chemoperfusion (Cmax=37,6 ± 8,9 μmol/L, AUC=19,8 ± 4,7 μM·h). Die maximale Cisplatinkonzentration im Plasma war Cmax=4,8 ± 0,6 μmol/L nach der Chemoperfusion und Cmax=0,9 ± 0,2 μmol/L nach der Chemoembolisation. Im Gegensatz zu den Verhältnissen zwischen Cisplatintumor- und Cisplatinplasmakonzentrationen waren die maximale Natriumthiosulfat-Konzentrationen und die AUC für Natriumthiosulfat unabhängig von der Verabreichungsmodalität signifikant höher im Plasma (Cmax=5051 ± 381 μmol/L; AUC= 5589 ± 269 μM·h) als im Tumorgewebe (Cmax=1686 ± 151 μmol/L; AUC= 2204 ± 167 μM·h). Nach der Chemoperfusion waren die durchschnittlichen Quotienten der AUC von Natriumthiosulfat zur AUC von Cisplatin im Tumor und Plasma 211 ± 75 und 984 ± 139, nach der Chemoembolisation waren die entsprechenden Werte 48,5 ± 29,5 und 42.966 ± 26.728. Die extratumoralen molaren Quotienten von Natriumthiosulfat zu Cisplatin müssen > 500 betragen, um Cisplatin zu neutralisieren. Dies wurde in beiden Darreichungsformen erreicht. Intratumoral sollte dieses Verhältnis 100 nicht übersteigen, um die tumorschädigenden Cisplatineigenschaften nicht aufzuheben. Dieses Ziel wurde nur in der Chemoembolisationsgruppe erreicht. Der pharmakokinetische Vorteil der intraarteriellen Cisplatinchemoembolisation gegenüber der intraarteriellen Chemoperfusion hat sich in der vorliegenden Studie bestätigt. Ebenso fanden sich hohe lokale Cisplatinkonzentrationen nach intraarterieller Applikation im Vergleich zu aus der Literatur bekannten Werten nach intravenöser Applikation. Die klinische Wirksamkeit im Bezug auf die Tumorantwort und die Überlebensraten soll in größeren Patientenkollektiven untersucht werden. Ferner soll die Chemoembolisation so optimiert werden, dass weniger modalitätsbedingten Nebenwirkungen auftreten.
Die Verbreitung westlicher Verhaltens- und Lebensmuster im Rahmen der Globalisierung führt zu einer dramatischen Zunahme des Typ 2 Diabetes. Eine schwerwiegende Komplikation der diabetischen Erkrankung ist die Wundheilungsstörung, deren molekulare Pathophysiologie noch weitgehend unverstanden ist. Voraussetzung für einen koordinierten Wundheilungsprozess ist die ausgewogene Interaktion wundheilungsrelevanter Faktoren, die eine Vielfalt an Signaltransduktionskaskaden induzieren und somit zu einem streng kontrollierten Heilungsprozess beitragen. Darüber hinaus scheint auch die Insulinsensitivität der Haut für den Heilungsverlauf eine essentielle Rolle zu spielen. Da die Proteinkinase B/Akt nicht nur ein zentrales Molekül der Insulin-Signaltransduktion ist, sondern als Knotenpunkt vieler Signalkaskaden im Mittelpunkt zellulärer Ereignisse steht, sollte in der vorliegenden Arbeit die Rolle und Funktion der Proteinkinase Akt in der kutanen Wundheilung untersucht werden. Sowohl in der Haut als auch im Wundgewebe konnte Akt1 als dominante Isoform identifiziert werden. Die Verletzung des Hautgewebes induzierte einen Anstieg der Akt1-Expression und -Phosphorylierung in der Epidermis akut heilender Wunden. Insbesondere die am Wundrand gelegenen Keratinozyten waren durch eine starke Expression der Akt1-Kinase gekennzeichnet. Die Phosphorylierung und somit Aktivierung der Akt1-Kinase stieg im Verlauf der Wundheilung stetig an und erreichte ihr Maximum in der Endphase des Heilungsprozesses. Begleitet wurde die Aktivierung dieser Kinase von einer Phosphorylierung des eIF4E-BP1 und einer starken VEGF-Sekretion. Dagegen konnte in diabetisch chronischem Wundgewebe weder eine Aktivierung der Akt1-Kinase noch eine Phosphorylierung des eIF4E-BP1 nachgewiesen werden, was mit einer deutlich verminderten VEGF-Sekretion einherging. Um nun zu untersuchen, ob im Prozess der Wundheilung die VEGF-Sekretion in einem funktionellen Zusammenhang zur Akt1-Aktivierung steht, wurde in vitro der Einfluss wundheilungsrelevanter Faktoren, wie EGF, einer Kombination proentzündlicher Zytokine oder Insulin auf die Aktivierung der Akt1-Kinase und VEGF-Biosynthese untersucht. Obwohl alle Faktoren sowohl eine Aktivierung der Akt1-Kinase als auch VEGF-Sekretion induzierten, wurde ausschließlich die Insulininduzierte VEGF-Biosynthese über den PI3-Kinase/Akt-Signalweg vermittelt. Die Regulation der Insulin-induzierten VEGF-Biosynthese erfolgte posttranskriptionell aus einem gleichbleibenden Pool an VEGF-mRNA über die Phosphorylierung des eIF4E-BP1. Durch die Überexpression einer konstitutiv aktiven Akt1-Mutante und die Verwendung des mTOR-Inhibitors Rapamycin konnte mTOR als Mediator der Akt1-vermittelten Phosphorylierung des eIF4E-BP1 und somit der VEGF-Biosynthese identifiziert werden. In vitro-Lokalisationsexperimente zeigten, dass eine vollständig phosphorylierte und somit aktive Akt1-Kinase nach Insulinstimulation im Zytoplasma lokalisiert ist - exakt dort, wo die Regulation der Translation stattfindet. Zusammenfassend weisen diese Ergebnisse darauf hin, dass Insulin im kutanen Heilungsverlauf die VEGF-Biosynthese posttranskriptionell über eine Akt1-vermittelte Phosphorylierung des eIF4E-BP1 induzieren kann. Eine ausbleibende Akt-Aktivierung in insulinresistenten Keratinozyten könnte somit zu einer verminderten VEGF Sekretion und folglich zu einer verzögerten Angiogenese in chronisch diabetischen Wunden beitragen.
Nitric oxide (NO) represents a short-lived mediator that pivotally drives keratinocyte movements during cutaneous wound healing. In this study, we have identified p68 DEAD box RNA helicase (p68) from a NO-induced differential keratinocyte cDNA library. Subsequently, we have analyzed regulation of p68 by wound-associated mediators in the human keratinocyte cell line HaCaT. NO, serum, growth factors and pro-inflammatory cytokines were potent inducers of p68 expression in the cells. p68 was constitutively expressed in murine skin, but rapidly down-regulated upon injury. The down-regulation appeared to be transient, as p68 protein expression increased again after the inflammatory phase of repair. However, p68 protein expression did not completely disappear during wound inflammation, as immunohistochemistry and cell fractiona tion analysis revealed a restricted localization of p68 in keratinocyte nuclei of the developing epithelium. In line, cultured human (HaCaT) and murine (PAM 212) keratinocyte cell lines showed a nuclear localization of the helicase. Moreover, confocal microscopy revealed a strong localization of p68 protein within the nucleoli of the keratinocytes. Functional analyses demonstrated that p68 strongly participates in keratinocyte proliferation and gene expression. Keratinocytes that constitutively overexpressed p68 protein were characterized by a marked increase in serum-induced proliferation and vascular endothelial growth factor (VEGF) expression, whereas down-regulation of endogenous p68 using small interfering RNA (siRNA) markedly attenuated serum-induced proliferation and VEGF expression. Altogether, our results suggest a tightly controlled expression and nucleolar localization of p68 in keratinocytes in vitro and during skin repair in vivo that functionally contributes to keratinocyte proliferation and gene expression.
Die Hippocampusformation ist eine wichtige Hirnstruktur für die Gedächtnisakquisition und -konsolidierung, insbesondere beim räumlichen Lernen spielt sie eine essentielle Rolle. Langzeitpotenzierung (LTP) gilt als das elektrophysiologische Korrelat der synaptischen Plastizität, dem langfristigen Umbau synaptischer Verbindungen, der letztlich zur Ausbildung stabiler, langanhaltender Erinnerungen führt. Signalübertragung über den cAMP/PKA/MAPK/CREB-Weg stellt den wichtigsten molekularen Mechanismus der Langzeitpotenzierung dar, CREB gilt als die zentrale Komponente und Schnittstelle dieser Übertragung. Neuronale Plastizität ist abhängig von de-novo-Pro-teinbiosynthese, an deren Regulation Veränderungen der Chromatinstruktur durch Histonmodifikationen beteiligt ist, in die der genannte Signalweg mündet.
Circadiane Rhythmen sind in den meisten Spezies in vielen verschiedenen Organen und Geweben nachgewiesen und manifestieren sich als Einflüsse auf zahlreiche Parameter des Verhaltens, so auch auf die Leistung beim Erlernen neuer Information. Ihr zentraler Taktgeber ist der Nucleus suprachiasmaticus (SCN). Melatonin ist ein wichtiges Effektorsignal des circadianen Systems und hat gleichzeitig Rückkopplungsfunktion. Seine unmittelbare Wirkung übt es über die beiden G-Protein-gekoppelten Melatonin-rezeptoren MT1 und MT2 aus. Es hat direkten Einfluss auf das Lernen und stellt damit einen Schnittpunkt zwischen Signalwegen der synaptischen Plastizität und des circadianen Systems dar.
Der Lernerfolg vieler Tierarten ist bekanntermaßen während deren subjektivem Tag höher als während der Nacht. In dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass beim räumlichen Lernen bereits ein einmaliger Stimulus ausreicht, um im Hippocampus der verwendeten C3H-Mäuse eine stabile Induktion der Phosphorylierung von CREB sowie der transkriptionsaktivierenden Histonmodifikationen H3K9ac und H3K14ac zu erzeugen. Ein einmaliger Stimulus hat also verstärkte Signaltransduktion und Protein-syntheseaktivität als Zeichen synaptischer Plastizität zur Folge. Dies geschieht nur tagsüber, nachts zeigt sich kein Effekt. Somit spiegelt sich der Phänotyp in diesen molekularen Markern wider. Anhand eines Mausmodells mit genetischem Knockout der beiden membrangebundenen Melatoninrezeptoren MT1 und MT2 (MT1/2−/−) wurde der Einfluss von Melatonin auf die molekularen Prozesse des hippocampalen Lernens näher beleuchtet. Über MT1/2−/−-Mäuse ist bekannt, dass ihr Lernerfolg in den benutzten Verhaltensversuchen zu jeder Tageszeit auf dem Niveau der C3H-Mäuse während der Nacht liegt. Zunächst zeigt sich, dass in MT1/2−/−-Mäusen die Grundrhythmen der meisten untersuchten Proteine und Histonmodifikationen verändert, teilweise phasenverschoben und abgeflacht sind. Eine Induktion von pCREB und H3K9ac und H3K14ac ist in diesen Tieren nicht mehr erreichbar und somit nach einem einmaligen Lernstimulus keine vermehrte Signalübertragung oder synaptischer Umbau nachweisbar. Auch hier besteht eine gute Korrelation mit dem Lernphänotyp. Weiterhin wurden Unterschiede im Aktivitätsmuster der beiden Mäusestämme gezeigt, MT1/2−/−-Mäuse sind abhängig von der Situation weniger oder gleich aktiv wie C3H-Tiere. Im Angstverhalten als möglichem Störfaktor besteht kein Unterschied zwischen beiden Tierstämmen.
Melatoninrezeptoren wirken über inhibitorische G-Proteine auf die Adenylatcyclase und hemmen den cAMP/CREB-Signalübertragung, was die schlechtere Lernperformance während der Nacht erklärt, wenn der Melatoninspiegel seinen natürlichen Höhepunkt erreicht. Durch Melatonin lassen sich auch tagsüber bei Mäusen und Zebrafischen LTP und räumliches Lernen unterdrücken. Jedoch lässt sich durch diese akute Wirkung von Melatonin nur ein Teil der Ergebnisse erklären, so zum Beispiel die veränderte Aktivität von PKA und PKC. Um das scheinbar paradoxe verschlechterte Lernverhalten der MT1/2−/−-Mäuse und die fehlende Induzierbarkeit von pCREB und Chromatinremodelling zu erklären, muss ein längerfristiger Effekt von Melatonin bestehen, der über dessen maximale Konzentration hinaus anhält und in seiner Abwesenheit zu verbesserter Signalübertragung führt. Hierfür ist eine Sensibilisierung der Adenylatcyclase durch prolongierte Melatoninexposition, wie sie beispielsweise in Zellen der Pars tuberalis nachgewiesen wurde, beschrieben worden. Es konnte in dieser Arbeit gezeigt werden, dass Melatonin vielfältigen Einfluss auf das hippocampale Lernen hat und dieses mit der inneren Uhr verbindet.
Berufsmusiker haben durch spezifische körperliche und psychische Belastung ein erhöhtes Risiko im Laufe ihres Lebens an einer CMD zu erkranken.
Mehrere Stunden täglich nehmen vor allem Orchestermusiker eine sitzende Zwangshaltung ein und führen immer wieder die gleichen, einseitigen Bewegungsmuster durch. Leistungsdruck und Lampenfieber können zusätzlich zu Muskelverspannungen und Bruxismus führen. Beides hat direkte oder indirekte Auswirkungen auf das CMS. Einseitige sitzende Körperhaltung und Bewegung belasten den ganzen Bewegungsapparat. Bläser und Streicher üben zusätzlich Druck auf Zähne und Kiefer aus, indem sie beim Halten und Spielen ihres Instrumentes direkten Kontakt zum CMS herstellen. Unbewusstes Pressen und Knirschen mit den Zähnen belastet Kiefer und Kiefergelenk in hohem Maße.
Leider gibt es bisher nur wenig aussagekräftige Literatur, in der der eindeutige Zusammenhang zwischen dem Spielen eines Musikinstrumentes und der Entstehung einer CMD belegt wird. Um Prävention betreiben zu können und um bestehende Beschwerden behandeln zu können, ist es dringend notwendig, das Thema „Musiker und CMD“ eingehender zu untersuchen.
Im Rahmen der vorliegenden Arbeit wurden 32 Musiker des hr-Sinfonieorchesters befragt und untersucht. Die Musiker wurden zum Vergleich in zwei Gruppen eingeteilt. Gruppe 1 bestand aus hohen Streichern wie Geigern und Bratschern. Gruppe 2 bestand aus Bläsern und allen anderen möglichen Musikern des Orchesters. Es wurden mittels Abdrucknahme Modelle von Ober- und Unterkiefer hergestellt. Durch dreidi-mensionale Zuordnung der Kiefer in angenommener Zentrik und im Vergleich dazu in maximaler Interkuspidation wurde eine Kondylenpositionsanalyse durchgeführt. Die gesamte Gruppe der Musiker wurde mit einer Gruppe bestehend aus 48 gesunden jungen Nicht-Musikern im Alter zwischen 16 und 19 Jahren verglichen. Die Messdaten dieser Kontrollgruppe stammten aus der Habilitationsschrift „CMD bei Kindern und Jugendlichen“ (2004; Kopp, S.).
Es konnte festgestellt werden, dass die Position der Kondylen in den Kiefergelenken aller Musiker im Vergleich zur zentrischen Position verändert war, während dies bei der Kontrollgruppe nicht oder nur in geringem Umfang der Fall war. Die veränderte Position des Unterkiefers und seiner Gelenkenden stand im Zusammenhang mit einer veränderten Okklusion.
Daraus kann geschlossen werden, dass das langjährige, intensive Spielen eines Musikinstrumentes Auswirkungen auf Form und Stellung der Zähne sowie die Position der Kondylen im Kiefergelenk hat.
Die Veränderung fand auf der rechten und linken Seite in gleichem Maße statt. Eine Asymmetrie war also nicht festzustellen. Zudem stellte sich heraus, dass sich die Positionsänderung der Kondylen bei beiden Musikergruppen ähnlich darstellte. Angesichts der sehr unterschiedlichen, teils asymmetrischen Körperhaltungen ist dies erstaunlich. Im Schnitt fand bei allen Musikern eine Verlagerung der Kondylen nach kranial und dorsal statt.
Anhand der Ergebnisse kann die Schlussfolgerung gezogen werden, dass das intensive Spielen eines Musikinstrumentes das kraniomandibuläre System in hohem Maße belastet und zu langfristigen Veränderungen der beteiligten Strukturen führt. Die genaue Untersuchung der Ursachen sowie eine mögliche Beeinflussung des Wachstums von Musikern schon in jungem Alter als Grundlage für eine spätere CMD-Erkrankung sollten Gegenstand weiterer Studien sein.
Die kutane Wundheilung hat die funktionelle Wiederherstellung der Gewebeintegrität nach Schädigung zum Ziel. Sie erfolgt im Sinne einer gesteuerten Kaskade von sequentiellen Ereignissen. Diese umfassen die Hämostase, die Inflammation, die Granulation, die Reepithelialisierung und das Remodeling. Die zugrundeliegenden Prozesse werden von einer Vielzahl proinflammatorischer Zytokine und Wachstumsfaktoren reguliert. Neben diesen Proteinmediatoren ist eine Beteiligung löslicher Kleinmoleküle, wie dem Stickstoffmonoxid (NO), für die Regulation der Wundheilung bekannt.
NO ist ein flüchtiges Radikal, welches enzymatisch durch die Isoformen der Stickstoffmonoxidsynthasen (NOS) aus der Aminosäure L-Arginin synthetisiert wird. NO entfaltet ein breites Spektrum physiologischer und pathophysiologischer Effekte. Dabei ist für die induzierbare NOS (iNOS) eine relevante Beteiligung an epithelialen Prozessen hinreichend dokumentiert. FRANK et al. [1998] konnten eine starke Induktion der iNOS während der kutanen Wundheilung sowie einen funktionellen Zusammenhang zu den NO-Wirkungen auf Keratinozyten zeigen, die in Verbindung mit der enzymatischen Funktion der iNOS stehen.
Eine gestörte kutane Wundheilung wurde auch für Mäuse mit Defizienz der endothelialen NOS (eNOS) beschrieben. Die Beteiligung der eNOS an der Wundheilung war bislang jedoch weitgehend unklar. Die vorliegende Arbeit hatte zum Ziel, die Expressionsmuster der eNOS im Wundheilungsverlauf in gesunden und diabetischen Mäusen aufzuzeigen.
In einem kutanen Wundheilungsmodell in Mäusen konnte die Expression von eNOS mRNA und Protein gezeigt werden. Die Expressionskinetik zeigte eine moderate Induktion der eNOS in den frühen Wundheilungsphasen. Diese ließ sich nicht mit einer endothelialen Expressionsänderung erklären, wie es Untersuchungen mit CD31 als pan-endothelialem Marker nahe legten.
Immunhistochemisch konnten Gefäßendothelien des Granulationsgewebes, Keratinozyten der Wundränder, das sich ausbildende Neo-Epithel und Haarfollikel als zusätzliche Quellen der eNOS Proteinexpression in Wunden identifiziert werden. Die eNOS Färbung zeigte sich dabei begrenzt auf die suprabasal gelegenen Keratinozyten der benannten Epithelien. Die Expression der eNOS in Keratinozyten konnte schließlich auch in kultivierten primären humanen Keratinozyten und HaCaT Keratinozyten auf mRNA-Ebene bestätigt werden.
Darüber hinaus zeigte sich ein funktioneller Zusammenhang zwischen eNOS Expression und epithelialer Proliferation: So bildeten eNOS-defiziente Mäuse deutlich reduzierte Wundrandepithelien aus, die durch eine verminderte Proliferation der Keratinozyten charakterisiert waren. Untersuchungen an diabetischen Mäusen (db/db) stützten diesen funktionellen Zusammenhang. In den Expressionskinetiken in diabetischen Tieren zeigte sich eine deutlich reduzierte Expression von eNOS mRNA und Protein vor allem in den späten Wundheilungsphasen.
In der vorliegenden Arbeit werden die zeitliche Expression der eNOS, die Detektion der eNOS in Wunden sowie deren Alteration in diabetischen Mäusen mit Bezug auf ihre funktionelle Bedeutung in der kutanen Wundheilung abschließend diskutiert.
Diabetes-assoziierte Fußulzerationen (diabetic foot ulcerations, DFU) repräsentieren eine schwerwiegende klinische Komplikation der Wundheilung. Bislang sind pharmakologische Behandlungsansätze diabetischer Wundheilungsstörung unzureichend und limitiert. Der Erkenntnismangel der zugrundeliegenden zellulären und molekularen Mechanismen gestörter Wundheilung ergänzt die unzufrieden stellende klinische Situation. In den vergangenen Jahren sind vermehrt zelluläre Wundverbände in den klinischen Fokus gerückt. Sie ermöglichen eine individuelle, dynamische Wundbehandlung und haben in den ersten klinischen Studien vielversprechende Ergebnisse gezeigt.
In der vorliegenden Arbeit ist ein zellulärer Wundverband der Firma Boehringer Ingelheim genutzt worden, um die Wundheilung in diabetischen db/db-Tieren zu analysieren. Der Wundverband (BAWD; biological active wound dressing) besteht aus humanen Keratinozyten, die auf einer Hyaluronsäure-haltigen Matrix kultiviert werden.
Nach topischer Anwendung der lebenden Wundauflage war eine Interaktion humaner Keratinozyten mit murinem Wundgewebe zu beobachten. Die gestörte diabetische Wundheilung in der db/db-Maus war nach BAWD-Behandlung in einem um 30 % verbesserten Wundverschluss und dem Aufbau qualitativ neuen Gewebes deutlich verbessert.
Aufgrund der unverändert hohen Expression von Zyto- und Chemokinen in der frühen und späten Heilungsphase wurde eine Dämpfung der Immunantwort ausgeschlossen. Vielmehr war eine BAWD-vermittelte differenzielle Immunzellverteilung festzuhalten. Zudem zeigten Whole-Genom-Sequenzanalysen eine BAWD-induzierte Expression von Genen auf, die regenerative M2-ähnliche M[Phi] charakterisieren.
Außerdem scheint die BAWD-Anwendung nach Auswertung immunhistochemischer Daten und über die signifikant erhöhte CD29-, CD44- und Sca1-mRNA-Expression die Rekrutierung heilungsfördernder MSCs zu begünstigen, denen ein potentiell anti-entzündlicher Charakter zugesprochen wird.
In dieser Arbeit konnte zudem ein neuer Regelkreis kutaner Wundheilung beschrieben werden, der auf Basis der Expression muskelspezifischer Faktoren und der transienten Ausbildung kontraktiler Elemente in der Wunde normal heilender Tiere beruht, die bislang nicht beschrieben wurden. Interessanterweise induzierte eine BAWD-Anwendung die Expression muskelspezifischer Gene und Proteine in der Wundheilung diabetischer Tiere. Möglicherweise stellt die Ausbildung kontraktiler Elemente neben der Differenzierung von Fibroblasten zu Myofibroblasten eine ergänzende Komponente für einen beschleunigten Wundverschluss dar. Diese Befunde eröffnen neue Möglichkeiten zu Verständnis und Therapie diabetischer gestörter Wundheilung im humanen Organismus.
Eine weltweite Veränderung der Lebensweise hat eine Zunahme der Anzahl adipöser Menschen und damit ein verstärktes Auftreten von Typ 2 Diabetes mellitus zur Folge. Eine häufig auftretende Komplikation dieser Erkrankung ist das diabetische Fußulkus, dessen molekularen und zellbiologischen Grundlagen weitestgehend unbekannt sind. Für einen normalen Wundheilungsverlauf ist ein Zusammenspiel vieler Wachstumsfaktoren und Zytokine essentiell. Auch die Insulinsensitivität der Haut scheint von großer Bedeutung zu sein. Die Funktionen von Insulin im Wundheilungsprozess und in der Haut sind weitestgehend unerforscht. Um ein besseres Verständnis für die Bedeutung von Insulin in der Wundheilung zu erhalten, bestand das Ziel dieser Arbeit in der Analyse eines Insulin-regulierten Enzyms in der Haut, der HMG-CoA-Reduktase, während des Heilungsprozesses normaler sowie diabetisch chronischer Wunden. Die HMG-CoA-Reduktase katalysiert den geschwindigkeitsbestimmenden Schritt im Mevalonat-Stoffwechselweg und ist somit indirekt an vielen zellulären Ereignissen beteiligt. Die Verletzung von murinem Hautgewebe führte zu einem Anstieg der HMG-CoA-Reduktase-mRNA-Expression an Tag 3 und an Tag 13 nach Verletzung. Die Lokalisation der HMG-CoA-Reduktase im Wundgewebe zeigte, dass insbesondere die am Wundrand gelegenen Keratinozyten durch eine besonders starke mRNA-Expression des Enzyms charakterisiert waren. Im Gegensatz dazu konnte im diabetischen, chronischen Wundgewebe keine Regulation der mRNA-Expression der HMG-CoA-Reduktase detektiert werden. Wundheilungsrelevante Faktoren, wie Insulin und EGF, induzierten die mRNA-Expression der HMG-CoA-Reduktase in HaCaT-Keratinozyten (in vitro). Für die Insulin-vermittelte mRNA-Induktion konnte gezeigt werden, dass der Transkriptionsfaktor SREBP2 für die Transkription des Gens essentiell war. Neben einer erhöhten Transkription der HMG-CoA-Reduktase wurde ebenfalls eine gesteigerte Enzymaktivität nach Insulin- oder EGF-Stimulation detektiert. Die Induktion der Insulin-vermittelten HMG-CoA-Reduktase-Aktivität stand in einem funktionellen Zusammenhang zur Biosynthese des angiogenen Faktors VEGF. Der Einfluss der HMG-CoA-Reduktase auf die VEGF-Biosynthese war posttranskriptionell über die Phosphorylierung des eIF4E-BP1 vermittelt. Auch im tierexperimentellen Modell (in vivo) konnte durch eine Statin-Behandlung bei Mäusen gezeigt werden, dass die Enzymaktivität der HMG-CoA-Reduktase in Keratinozyten für eine normale VEGF-Expression essentiell war. Die VEGF-Synthese wurde von der Aktivität der HMG-CoA-Reduktase in vivo, wie in vitro nach Insulin-Stimulation, posttranskriptionell beeinflusst. Die Analyse weiterer wundheilungsrelevanter Vorgänge ergab, dass eine Inhibierung der HMG-CoA-Reduktase in vivo wie in vitro eine Verringerung der Keratinozytenproliferation zur Folge hatte. Die Keratinozytenproliferation ist ein wichtiger Vorgang bei der Reepithelisierung einer Wunde. Ist das Wundareal durch Keratinozyten geschlossen, beginnt die Differenzierung der Zellen. Die Ergebnisse dieser Arbeit konnten zeigen, dass der Differenzierungsprozess von Keratinozyten in vitro mit einer Induktion der HMG-CoA Redukase Aktivität assoziiert war. Eine Hemmung der Enzymaktivität hatte eine Inhibierung der mRNA-Expression von Keratinozyten-Differenzierungsmarkern, wie Involucrin, Filaggrin und Keratin 1 zur Folge. Zusammenfassend weisen die Ergebnisse dieser Arbeit darauf hin, dass die HMG-CoA-Reduktase wichtige Prozesse, wie Wundangiogenese und Keratinozytenproliferation, im kutanen Wundheilungsverlauf beeinflusst.
Die hauptsächliche Funktion der menschlichen Talgdrüse ist die Sekretion des Sebums. Vermehrter Talgfluss in Verbindung mit gestörter Verhornung des Talgdrüsenausführungsganges kann zum Krankheitsbild der Acne vulgaris beitragen. Peroxisom-Proliferator-Aktivierte Rezeptoren (PPAR) sind im menschlichen Organismus als Mediatoren des Lipidstoffwechsels bekannt. Liganden der PPAR finden bereits klinische Anwendung. Da PPAR auch in menschlichen Sebozyten exprimiert sind und nachweislich Einfluss auf die Lipogenese nehmen, ist eine mögliche aknetherapeutische Nutzung denkbar. Aus der holokrinen Sekretionsform der Talgdrüse ergibt sich als Besonderheit, dass die Lipogenese der Sebozyten mit ihrer terminalen Differenzierung verknüpft ist und in vielen Aspekten der Apoptose, dem programmierten Zelltod ähnelt. In der vorliegenden Promotionsarbeit konnten in vitro durch Anfärbung mit dem Lipidfarbstoff Nile Red SZ95-Sebozyten in Lipogenese dargestellt werden. Des Weiteren konnte im Rahmen dieser Arbeit erstmals mittels eines gegen Histone gerichteten ELISA-Verfahrens zur Detektion von DNA-Fragmenten gezeigt werden, dass PPAR-Liganden in der Lage sind, sowohl die basale, als auch die durch den Apoptoseinduktor Staurosporin herbeigeführte Apoptose in SZ95-Sebozyten konzentrationsabhängig zu hemmen. Am stärksten war hierzu der PPAR-δ-Ligand L-165.041 in der Lage. Weiterhin konnte mittels Western Blot erstmals gezeigt werden, dass der PPAR-δ-Ligand L-165.041 in SZ95-Sebozyten über die Kinasen Akt, ERK1/2 und p38 signalisiert. Durch Inhibierung von Akt und ERK1/2 konnten die durch L-165.041 gezeigten basalen antiapoptotischen Effekte abgeschwächt werden, während sie durch Inhibierung von p38 verstärkt wurden. Koinkubation von Akt- bzw. ERK1/2-Inhibitoren und PPAR-δ-Ligand L-165.041 sensibilisierte die SZ95-Sebozyten für die durch Staurosporin induzierte Apoptose. Die Ergebnisse geben Anhalt zu der Annahme, dass PPAR-Liganden, insbesondere Liganden von PPAR-δ, einen therapeutisch günstigen Effekt auf Acne vulgaris haben könnten.
