610 Medizin und Gesundheit
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Für diese Arbeit wurden anhand zweier relativ kleiner Kollektive von 35 DAT-Patienten und 12 gesunden Non-DAT-Kontrollpersonen (Rechtshänder) 18F-FDG-PET-Bilddatensätze des Gehirns angefertigt und standardisiert mit dem halbautomatischen Regionalisierungsverfahren RegWindow hinsichtlich der Stoffwechselraten in interessierenden Hirnregionen nach HERHOLZ et al. (1990) in der Überarbeitung nach HALBER et al. (1995) für das PC-Programm RegWindow analysiert und ausgewertet. Für die Non-DAT-Kontrollgruppe läßt sich ein signifikanter Zusammenhang zwischen den mit RegWindow und Metabolischer Index ermittelten Metabolic Ratios bestätigen. Die Metabolic Ratios stimmen bezüglich den Literaturangaben der beiden Referenzstudien nach HALBER (1995) und HERHOLZ et al. (1990) sehr gut überein. Mit der Non-DAT-Kontrollgruppe ist auf einem Signifikanzniveau von P=0,95 eine direkte Proportionalität zwischen dem Alter und dem daraus resultierend erniedrigten Metabolic Ratios abzuleiten. Jeweils zehn Lebensjahre führen zu einer Minderung des Metabolic Ratios um 2 Prozent. Für das in dieser Arbeit untersuchte DAT-Gesamtkollektiv wird eine lineare Abhängigkeit des Metabolic Ratios vom MMST-Score des psychometrischen Tests mit hoher Signifikanz nachgewiesen. Die Abhängigkeit liefert eine eindeutige 1:1 Korrelation: Eine Minderung des Score-Wertes um eins hat im Mittel eine Minderung des Metabolischen Ratios um 1 Prozent zur Folge und umgekehrt. Aus den Ergebnissen dieser Arbeit läßt sich ein Cut-off-Wert von 1,075 zur Trennung des Non-DAT- vom DAT-Kollektiv berechnen. Dieser ermöglicht eine vollständige Trennung beider Kollektive bei einer Sensitivität und Spezifität von 100 Prozent. Die Ergebnisse der Stoffwechselratenanalyse bestätigen eine signifikante Stoffwechselratenminderung in drei von den vier nach HALBER (1995) und HERHOLZ et al. (1990) typischerweise betroffenen (affected) Hirnregionen. In der Reihenfolge vom höchsten zum niedrigeren Einfluß der DAT auf die Stoffwechselminderungen ergibt sich die Rangfolge Gyrus angularis, gefolgt von Gyrus temporalis inferior, Gyrus supramarginalis und Gyrus temporalis medius. Als typischerweise nicht betroffene (non-affected) Regionen konnten die Gyri praecentralis und postcentralis sowie Cuneus bestätigt werden. Als eindeutig non-affected kann zusätzlich der Thalamus klassifiziert werden. Für einige nicht klassifizierte Hirnregionen werden ebenfalls signifikante Stoffwechselratenminderungen nachgewiesen, deren Aufnahme als typischerweise betroffene Hirnareale in den Algorithmus für RegWindow zur Berechnung des Metabolic Ratios vorgeschlagen wird. Diese lauten: Lobulus parietalis inferior, Praecuneus, Hippocampus, Lobulus parietalis superior und Gyrus frontalis superior. Internationale Arbeitsgruppen (siehe Kapitel 4.4.1) konnten für diese Hirnregionen im PET Stoffwechselratenminderungen bestätigen sowie in anderen bildgebenden Diagnoseverfahren Atrophien und Perfusionsdefizite ebenfalls nachweisen. Für die Gyri angularis, temporalis inferior und medius, supramarginalis und den Lobulus parietalis inferior konnte ein unilateraler Befall mit Stoffwechselratenminderung im Anfangsstadium der DAT nachgewiesen werden.
Die vorliegende Arbeit stellt Design, Aufbau und erste experimentelle Testergebnisse einer integrierten RFQ-Driftröhrenkombination für den Einsatz im Injektorbereich einer klinischen Synchrotronanlage zur Behandlung von Tumorerkrankungen mit Ionenstrahlen vor. Das Hauptziel der Bemühungen war, eine sehr kompakte und auf die gestellten Aufgaben hoch spezialisierte Lösung zu finden, die den täglichen Anforderungen im Klinikbetrieb gerecht wird. Zuverlässigkeit, einfache Bedienbarkeit und möglichst geringe Betriebskosten standen dabei im Vordergrund und führten letztlich zu einer nur 1,40 m langen Kombination der beiden Beschleunigerkomponenten, die üblicher Weise in zwei getrennten Kavitäten mit separater Leistungsversorgung, separater Steuerung und mit deutlich mehr Platzbedarf untergebracht sind. Im Zuge der Designarbeiten wurde insbesondere das Programm PARMPRO den hier aufgetretenen aktuellen Problemstellungen angepasst. Die Berechnung der Wechselwirkung von Ionen bei raumladungsdominierten Teilchenstrahlen wurde korrigiert, das Programm um ein Transportelement zu Transformation geladener Teilchen durch eine frei wählbare Potentialverteilung erweitert und mit einem neu entwickelten Programmteil wurden die zur Fertigung notwendigen Daten generiert. Die Optimierung der Strukturparameter mit Hilfe einer externen Visual-Basic-Anwendung zum automatischen Optimieren der Strukturdaten mit Hilfe von PARMPRO war ein Schritt auf dem Wege zum endgültigen, an die Eingangsstrahldaten und an die Erfordernisse der darauffolgenden IH-Struktur angepassten Elektrodendesign. Nach den Simulationsrechnungen erfolgten Referenzmessungen an entsprechenden Modellaufbauten insbesondere mit einem computergesteuerten Störkörpermessstand, zur experimentellen Bestimmung der Spannungsverhältnisse an der jeweils zu untersuchenden Strukturvariante. Auf diesen Ergebnissen basiert das endgültig entwickelte Resonatorkonzept der RFQ-Driftröhrenkombination. Das Kapitel "Aufbau des Medizin-RFQs" behandelt die Konstruktion und die technische Umsetzung des erarbeiteten Beschleunigerkonzepts. Einzelnen Beschleunigerkomponenten wie Tank, Elektroden, Resonatorstruktur, Bunchereinheit und deren Fertigungsprozesse werden vorgestellt, Arbeitsschritte wie das Verkupfern des Tanks in der Galvanik der GSI oder das Verfahren zum Versilbern von Kontaktteilen im hauseigenen Labor werden beschrieben. Es folgt eine Diskussion des Justierkonzepts und der Maßnahmen zur Einhaltung der erforderlichen Genauigkeiten von ca. 20 mm, um die berechnete Strahlqualität zu gewährleisen. Abschließend werden die Ergebnisse erster HF-Testmessungen auf Messsenderniveau beschrieben. Hier wurden zunächst experimentell grundlegende Resonatoreigenschaften wie etwa Resonanzfrequenz, Güte und Parallelersatzwiderstand bestimmt. Danach wurde ein spezielles Störkörpermessverfahren angewandt, um den über die Montagehöhe der Driftröhre einstellbaren Spannungsbereich der Bunchereinheit zu erfassen, da die geometrischen Verhältnisse einen computergesteuerten Messstand wie er zur Untersuchung der Modellaufbauten herangezogen wurde nicht zuließen. Abschließend erfolgte ein Abstimmen der Spannungsverteilung entlang der RFQ-Elektroden. Diese experimentellen Ergebnisse belegen eindrucksvoll die Funktionsfähigkeit der RFQ-Driftröhrenkombination, so ist insbesondere die erforderliche Buncherspannung auf einer mittleren Montagehöhe der spannungsführenden Driftröhre zu erreichen, die durch die zusätzlich Driftröhrenkapazität hervorgerufene Verzerrung der Spannungsverteilung auf den Elektroden lässt sich über die höhenverschiebbaren Kurzschlussplatten gut korrigieren. Das erarbeitete Gesamtkonzept dieser neuartigen, sehr kompakten RFQ-Driftröhrenkombination ist auch für andere Anwendungsbereiche sehr attraktiv, so dass bereits ein Patent darauf angemeldet wurde. Damit ist das Ziel, eine RFQ-Driftröhrenkombination für die medizinische Beschleunigeranlage in Heidelberg aufzubauen erreicht. Strahltests und die experimentelle Bestimmung der Phasen- und Energiebreite des Ionenstrahls sind als nächstes vorgesehen.
Etablierung, Charakterisierung und Anwendung eines In-vitro-Zellkulturmodells der Blut-Hirn-Schranke
(2001)
Es wurde durch die Optimierung der Isolierung und Kultivierung von cerebralen mikrovaskulären Endothelzellen (BCEC) ein in vitro-Zellkulturmodell der Blut-Hirn-Schranke (BHS) etabliert, das bezüglich seiner Permeabilitäts-Charakteristiken spezifische und herausragende Eigenschaften aufwies. Nach Abschluss der Etablierungs- und Optimierungsphase konnten im bovinen System wiederholt und reproduzierbar transendotheliale elektrische Widerstände (transendothelial electrical resistance, TEER) von zum Teil deutlich oberhalb 1000 Ohm mal cm hoch 2 erzielt werden, und die parazelluläre Permeabilität der bovinen BCEC-Monolayer für Sucrose lag annähernd auf dem niedrigen Niveau hochimpermeabler MDCK-Epithelzell-Monolayer und der entsprechenden in vivo-Parameter. Die per se niedrige Permeabilität des in vitro-BHS-Zellkulturmodells konnte sowohl durch Erhöhung des intrazellulären cAMP-Spiegels der BCEC als auch durch Kokultur der BCEC-Monolayer mit C6-Glioma- Zellen zusätzlich deutlich verringert werden. In Kombination konnte dabei ein TEER von über 3000 Ohm mal cm hoch 2 erzielt werden, einem Wert, der deutlich über dem TEER cerebraler pialer Kapillaren in vivo (1000-2000 Ohm mal cm hoch 2) liegt und in BHS-Zellkultursystemen bisher nicht einmal annähernd erreicht wurde. Der Vergleich des im Rahmen dieser Arbeit etablierten in vitro-BHS-Modells mit gut etablierten und charakterisierten BHS-Modellen bestätigten eindeutig dessen hohe Qualität und herausragende Eigenschaften. Im Rahmen eines indirekt-Kontakt-Kokultursystems konnte in zahlreichen Experimenten eindeutig und reproduzierbar gezeigt werden, dass eine Kokultur von postkonfluenten bovinen oder humanen BCECMonolayern mit humanen Makrophagen zu einer durch deutliche Erhöhung des TEER nachweisbaren Verringerung ihrer Permeabilität führte. Die bei den BCEC durch die Makrophagen induzierte TEER-Erhöhung war mit der durch die Kokultur mit C6-Glioma-ZeIlen bewirkten vergleichbar. Eine proinflammatorische Stimulation der Makrophagen vor Beginn der Kokultur zeigte keine eindeutige Beeinflussung ihrer Wirkung auf die mit ihnen kokultivierten BCEC-Monolayer. Eine Infektion der Makrophagen mit zwei verschiedenen HIV-1-Isolaten zeigte trotz Vorhandenseins einer produktiven HIV-1-lnfektion keine Auswirkung auf die von ihnen bewirkte TEER-Erhöhung bei den kokultivierten BCEC-Monolayer, es konnten diesbezüglich keine Unterschiede zwischen uninfizierten und infizierten Makrophagen festgestellt werden. Eine Erhöhung des intrazellulären cAMP-Spiegels führte bei den mit Makrophagen kokultivierten BCECMonolayern wie bei den mit C6-Glioma-Zellen kokultivierten BCEC-Monolayern zu einer zusätzlichen Steigerung des TEER. Die Inhibition der Adenylat-Cyclase und verschiedener Protein-Kinasen (Protein-Kinasen A, C, G und MLCK) zeigte keine Auswirkung auf die von Makrophagen bewirkte TEER-Erhöhung bei den kokultivierten BCEC-Monolayern; die Aktivierung der Protein-Kinase C führte zu dem gleichen Ergebnis. Die Inhibition der Phospholipase C und der Ca2~-vermittelten Aktivierung des Calmodulins zeigte ebenfalls keine Auswirkung auf die durch die Makrophagen- beziehungsweise C6-Kokultur bewirkte TEER-Erhöhung bei den BCEC-Monolayern. Eine Beteiligung der untersuchten Signaltransduktionswege an dem von Makrophagen oder 06 ausgeübten Einfluss auf die BCEC erscheint somit unwahrscheinlich. Der Befund, dass hämatogene Makrophagen in der Lage sind, bei kultivierten BCEC BHS-spezifische Eigenschaften zu induzieren und/oder aufrechtzuerhalten, ist überaus bemerkenswert, da diese Wirkung bislang ausnahmslos Zellen neuroektodermalen Ursprungs (beispielsweise Astrocyten) sowie glialen Zelllinien zugeschrieben wurde. Hämatogene Makrophagen oder davon abgeleitete Zellen des Hirnparenchyms könnten damit ein Teil der Mikroumgebung sein, die in vivo die charakteristischen Eigenschaften von Hirnendothelzellen modulieren, beispielsweise in Form der perivaskulären Mikrogliazellen, die in engem Kontakt mit den cerebralen Blutgefäßen stehen und höchstwahrscheinlich durch aus dem Blutstrom in das Gehirn einwandernde Monocyten/Makrophagen kontinuierlich ersetzt werden. Das in vitro-BHS-Zellkulturmodell wurde weiterhin für pharmakologische Studien eingesetzt, um den Einfluss von Nanopartikeln, die als potentielle brain targeting-Trägersysteme für Arzneistoffe diskutiert werden, auf die Barriere-Eigenschaften postkonfluenter cerebraler Endothelzellen zu untersuchen. Dabei zeigte sich, dass die Zugabe verschiedener Nanopartikel-Präparationen zu postkonfluenten BCECMonolayern zu einer deutlichen und konzentrationsabhängigen Erhöhung deren Permeabilität für Elektrolyte und makromolekulare Substanzen führte.
Die Wiederherstellung der Perfusion eines ischämischen Areals, auch Reperfusion genannt, ist vorrangiges Therapieziel bei Herzinfarktpatienten. Durch Thrombolyse oder Ballondilatation eines verschlossenen Koronargefäßes erzielt, kann sie jedoch selbst zum Organschaden beitragen. Dieser so genannte Reperfusionsschaden manifestiert sich je nach vorangegangener Ischämiedauer in funktionellen oder in strukturellen Schäden. Frühere Untersuchungen haben gezeigt, dass während der Reperfusion auftretende Entzündungsreaktionen maßgeblich zu einem myokardialen Reperfusionsschaden beitragen. Diese können durch polymorphkernige Neutrophile (PMNs) hervorgerufen werden. Das erste Ziel dieser Arbeit war es, ein Tiermodell zu etablieren, das die präklinische Prüfung von neuen Therapieansätzen erlaubt, die einen PMN-induzierten Reperfusionsschaden pharmakologisch verhindern. In einem Modell des isoliert-perfundierten Rattenherzens nach Langendorff wurde durch die externe Applikation von humanen PMNs eine mögliche Beteiligung dieser Zellen an der Entstehung eines Reperfusionsschadens nach globaler no-flow-Ischämie untersucht. Hierbei wurden unterschiedliche myokardiale Funktionsparameter, das Ausmaß der Zellschädigung und die myokardiale Konzentration der proinflammatorischen Zytokine Interleukin-1ß (Il-1ß) und Tumor-Nekrose-Faktor-á (TNF-á) erfasst. Die Quantifizierung der Zellschädigung erfolgte mittels histologischer Triphenyltetrazoliumchlorid-(TTC)-Färbung. Ferner wurde aus dem koronarvenösen Effluat die Konzentration der Creatinkinase (CK) und der Lactatdehydrogenase (LDH) bestimmt. Die Reperfusion der Herzen mit PMNs führte im Vergleich zur zellfreien Reperfusion zu einer signifikanten Verschlechterung der linksventrikulären Funktion. Ferner wiesen die PMN-reperfundierten Herzen eine signifikant höhere Zytokinkonzentration auf. Dagegen führte die PMN-Reperfusion lediglich zu einer tendenziellen Erhöhung der myokardialen Zellschädigung. Unter Verwendung eines Antikörpers gegen das Adhäsionsmolekül CD11/18 auf der Zelloberfläche der PMNs wurde das Modell validiert. Hierbei verminderte die Blockade der CD11/18-vermittelten PMN-Adhäsion an das Koronarendothel sowohl die PMN-induzierte myokardiale Dysfunktion als auch die myokardiale Zytokinkonzentration in den PMN-perfundierten Herzen. Das zweite Ziel dieser Arbeit war es, erstmals die pharmakologische Wirkung des neuen eNOS-Transkriptionsverstärkers S803, auf den PMN-induzierten Reperfusionsschaden in isoliert-perfundierten Rattenherzen zu untersuchen. Um einen in diesem Therapieansatz postulierten NO-abhängigen Mechanismus zu bestätigen, erfolgte eine Bestimmung der myokardialen eNOS-Expression mittels Western-Blot- Analyse. Ferner wurde in einem zusätzlichen Modell mit isoliert-perfundierten Rattenherzen die NO-abhängige Dilatationsfähigkeit der Koronarien untersucht. Darüber hinaus diente der HMG-CoA-Reduktase-Hemmer Simvastatin, der über die Stabilisierung der eNOS-mRNA zu einer erhöhten NO-Verfügbarkeit führt, als Positivkontrolle für einen NO-abhängigen Wirkungsmechanismus. Die subchronische Gabe des eNOS-Transkriptionsverstärkers S803 führte in den isoliert-perfundierten Herzen zu einer signifikanten Besserung der PMN-induzierten linksventrikulären Dysfunktion und verminderte signifikant die myokardiale Zytokinkonzentration gegenüber den PMN-perfundierten Kontrollherzen. Ferner wurde die eNOS-Proteinexpression in den Herzen signifikant erhöht. Diese Ergebnisse deuten auf eine Verbesserung der PMN-induzierten linksventrikulären Dysfunktion über eine Erhöhung der NO-Verfügbarkeit hin. Diese Hypothese wurde durch die therapeutische Wirksamkeit von Simvastatin im Modell des PMN-reperfundierten Herzens bestätigt. Zudem führte Simvastatin zu einer signifikanten Erhöhung der eNOS-Expression. Des Weiteren war die myokardiale Dilatationsfähigkeit während der reaktiven Hyperämieantwort nach S803- und Simvastatin-Behandlung im Vergleich zu den Kontrollherzen signifikant verbessert. Durch Gabe des NOSynthasehemmers L-NAME wurde diese im Modell der reaktiven Hyperämie unter S803-Behandlung wieder aufgehoben und bestätigte ebenfalls einen NO-abhängigen Mechanismus. Die verbesserte reaktive Hyperämieantwort unter Simvastatin- Behandlung war dagegen nicht ausschließlich NO-vermittelt. S803, ein neuer eNOS-Transkriptionsverstärker, verbesserte in isoliert-perfundierten Rattenherzen sowohl einen PMN-induzierten Reperfusionsschaden als auch die reaktive Hyperämieantwort. Ferner wies die Substanz in der Vergangenheit in Arteriosklerose-Modellen in ApoE-Knock-out-Mäusen antiarteriosklerotische Wirkungen auf. S803 eröffnet somit einen neuen, vielversprechenden Therapieansatz zur Behandlung koronarer Herzkrankheiten.
Ziel dieser Arbeit ist es, eine Lücke im methodischen Spektrum neurobiologischer Methoden zu schließen. Es ist heute möglich, das Gehirn auf unterschiedlichen Ebenen zu beschreiben. Es stehen jedoch keine Methoden zur Verfügung, um die Anordnung der Zellen innerhalb eines Nukleus quantitativ zu beschreiben. Die Anzahl und die Anordnung der Zellen ist jedoch eine essentielle Voraussetzung, um die Funktion eines Nukleus zu verstehen. Das hier vorgestellte Verfahren zur Rekonstruktion eines Nukleus basiert auf Nissl-gefärbten Semidünnschnitten der Medialen Superioren Olive (MSO) der Wüstenrennmaus Meriones ungiuculatus. Diese werden mit einer Digitalkamera lichtmikroskopisch aufgenommen und bilden die Basis der Rekonstruktion. In einem ersten Schritt werden innerhalb einer Schnittebene mehrere Einzelbilder patchworkartig zu einem Image Mosaic zusammengefügt. Durch diesen Schritt ist die Auflösung innerhalb einer Schnittebene praktisch unbegrenzt. Das Verfahren beinhaltet mehrere Kontrollmechanismen und funktioniert praktisch fehlerfrei. Danach werden die Bilder farblich korrigiert und mit Methoden der Mustererkennung werden die Zellkerne extrahiert. Die Extraktion der Zellkerne steht in ihrer Qualität einer manuellen Extraktion in nichts nach. Die Zellkerne dienen als Grundlage für den Archimedes-Alignment-Algorithmus, der die Schnittserie in einen dreidimensionalen Bezug setzt, indem aufeinander folgende Schnitte aneinander ausgerichtet werden. Auch dieses Verfahren beinhaltet eine Kontrolle und funktioniert fehlerfrei. Aus diesen Daten kann dann eine Rekonstruktion erstellt werden. Diese wird weiter ausgewertet und ergibt schließlich ein dreidimensionales Abbild des untersuchten Bereichs. Sämtliche Verfahrensschritte arbeiten entweder fehlerfrei oder mit einer nur sehr geringen Fehlerrate. Somit stellt dieses Verfahren eine robuste, effiziente und universell anwendbare Möglichkeit für die umfassende Analyse der Neuronenverteilung im ZNS dar. Das Verfahren eröffnet die Möglichkeit, Nuklei dreidimensional zu untersuchen, bietet aber auch einen Ansatzpunkt um mittels histologischer Daten weiteres Datenmaterial (etwa elektrophysiologischer oder morphologische Daten) zu integrieren.
Urothelkarzinome entstehen aus dem Epithel (Urothel) der unteren Harnwege (Nierenkelche und -becken, Harnleiter und -blase, sowie proximale Harnröhre). Die Harnblase ist der bevorzugte Ort der Urothelkarzinome. Krebserregende chemische Verbindungen (Karzinogene), die im Urin konzentriert vorliegen, sind Hauptverursacher der Urothelkarzinome. Größter einzelner Risikofaktor ist das Rauchen. Urothelkarzinome alarmieren durch Mikro- oder Makrohämaturie, und werden durch zytologische Bestimmung der Urinzellen (exfoliative Urinzytologie) und durch endoskopische Untersuchung der Harnblase (Zystoskopie) diagnostiziert. Es gibt kein pathognomisches Zeichen das auf ein Urothelkarzinom hinweisen würde. Da gutdifferenzierte Urothelkarzinomzellen kaum von den normalen Urothelzellen zu unterscheiden sind, ist die falsch-negative Rate bei der Diagnose dieser G 0-1 Tumoren mit 42% besonders hoch. Bei den endoskopisch schwer zu erkennenden in situ Karzinomen, die weitgehend entdifferenziert (anaplastisch) sind, liegt die Treffsicherheit bei 94%. Keiner der bis heute vorgeschlagenen Tumormarker hat die geforderte Spezifität, Sensitivität und prognostische Aussagekraft, um für die Diagnostik des Harnblasenkarzinoms von Wert zu sein. In der vorliegenden Arbeit wurde bei der Suche nach einem geeigneten Marker für den Nachweis eines Urothelkarzinoms eine Doppelstrategie verfolgt: 1. Die Expression einiger bekannter Gene wurde mit Reverser Transkription Polymerase Kettenreaktion (RT-PCR) an einer Reihe von Urothelkarzinomen unterschiedlicher Malignitätsgrade (G1 bis G4) und an normalen Urothelien untersucht. Uroplakine, die einzigen bislang bekannten urothelspezifischen Moleküle, bildeten dabei den Schwerpunkt. Ein Uroplakin-RT-PCR Bluttest wurde entwickelt, mit dem es möglich ist, disseminierte Urothelkarzinomzellen zu entdecken, noch bevor sie Metastasen gebildet haben. Die Nachweisempfindlichkeit des Tests liegt bei einer Zelle pro ml Blut. Von den untersuchten Urothelkarzinomprimärtumoren exprimierten alle gut bis mäßig differenzierten Tumoren (G1 und G2) Uroplakin (UP), bei den wenig differenzierten und anaplastischen Tumoren (G3 und G4) war etwa die Hälfte UP-positiv. 2. Die differentielle Genexpression derselben Urothelkarzinome und Urothelien wurde mittels Differential Display RT-PCR (ddRT-PCR) dargestellt, um auch unbekannte Genprodukte zu erfassen, die an der Krebsentstehung beteiligt sein und als spezifische Marker dienen könnten. Die gebräuchliche ddRT-PCR wurde durch eine Homologiedomänen-Konsenssequenz-RT-PCR ergänzt. Es konnten einige bekannte Gene identifiziert werden, darunter das DNA-bindende und transkriptionsregulierende HMG-1 (high mobility group) Protein und das mit Metastasierung assoziierte mts-1 Produkt. Einige Sequenzen zeigten keine Übereinstimmung mit bekannten Genen und sind damit potentiell neue Krebsgenkanditaten.
Effektivität und Effizienz der hochauflösenden MRT in der Diagnostik akuter Handgelenksverletzungen
(2002)
Die konventionelle Röntgendiagnostik stellte lange Zeit das dominierende diagnostische Instrument zur Beurteilung von akuten Verletzungen des Handgelenkes und der umliegenden Strukturen dar. Da der klinische Verlauf nach Verletzungen des Handgelenkes häufig unbefriedigend und langwierig ist und nicht adäquat therapierte Verletzungen dieser Region mit einer hohen Rate an Sekundärkomplikationen einhergehen, galt es, die Diagnostik des Handgelenkes zu optimieren, da mit der konventionellen Röntgendiagnostik zum einen Frakturen übersehen, umgekehrt aber auch überdiagnostiziert werden können und zum anderen naturgemäß Bandverletzungen nicht ausreichend beurteilbar sind. Da Verletzungen des Handgelenkes meist bei berufstätigen jüngeren Menschen beobachtet werden, stellt dies ein großes ökonomisches Problem dar. Ziel dieser Arbeit war es zu untersuchen, ob durch den gezielten Einsatz der Magnetresonanztomographie in der Frühphase nach einem akuten Handgelenkstrauma, die Diagnostik verbessert werden kann, und inwieweit dies Einfluss auf die nachfolgende Therapieplanung und Therapie hat. Es gelang durch den Einsatz der MRT beim akuten Handgelenkstrauma in Fällen mit einer Diskrepanz zwischen dem unauffälligen oder unklaren konventionellen Röntgenbild und der deutlichen klinischen Symptomatik nicht nur in 10,7% der Fälle (n=6) der Nachweis einer okkulten Fraktur, sondern auch in 64,3% der Fälle (n=36) der Nachweis von Begleitverletzungen im Bereich der ligamentären Strukturen und des TFCC. In 39,3% (n=22) konnte durch die MRT der Verdacht auf eine Fraktur ausgeräumt, in weiteren 5,4% (n=3) eine Änderung bezüglich der Frakturlokalisation vorgenommen werden. Nur 11 der ursprünglich 36 konventionell radiologisch befundeten Verdachtsdiagnosen einer Fraktur konnten im MRT bestätigt werden. In 55,4% wurde die Diagnose und in 66,1% die Therapie geändert (bezugnehmend auf die Daten des ersten Radiologen, Tabelle IV-12). Den verbesserten chirurgischen Therapiemöglichkeiten insbesondere der ligamentären Verletzungen musste durch die Optimierung der MRT Rechnung getragen werden. Es gelang im Rahmen dieser Promotionsarbeit ein zeitsparendes Untersuchungsprotokoll zu erstellen, das es ermöglicht, eine optimale Diagnostik der knöchernen Strukturen des Handgelenkes sowie des Weichteilapparates in weniger als 10 Minuten Untersuchungszeit durchzuführen. T1- und T2-gewichtete STIR-Sequenzen in koronarer Schichtorientierung erwiesen sich als diagnostisch relevant. Aufgrund der verbesserten Diagnostik war es möglich, die Patienten rasch der jeweils optimalen Therapie zuzuführen. So konnten zum einen initial okkulte Frakturen und ausgeprägte Band- und Diskusverletzungen adäquat behandelt und zum anderen durch den sicheren Ausschluss von ossären Verletzungen frühzeitig lange Immobilisationszeiten vermieden werden. Dies stellte einen wesentlichen Benefit für die Patienten dar, da wiederholte Krankenhausbesuche und Röntgenaufnahmen, unnötige Immobilisationszeiten von bis zu 12 Wochen sowie inadäquate - gegebenenfalls invasive - Diagnostik (Arthrographie, Operation) vermieden werden konnten. Durch den frühzeitigen Ausschluss von Frakturen und relevanten ligamentären Läsionen mittels MRT konnte so eine Verkürzung der Arbeitsunfähigkeit in 15 Fällen erreicht werden, in 8 Fällen musste die Dauer der Arbeitsunfähigkeit aus therapeutischen Gründen verlängert werden. Dies spielt sowohl für den Arbeitnehmer als auch für den Arbeitgeber und - bei längeren Krankschreibungszeiten - für die Krankenkassen eine große Rolle. Betriebsausgaben durch Entgeltfortzahlung im Krankheitsfall können so reduziert werden. Aufgrund der wirtschaftlichen Folgen sollte nach unseren Erfahrungen in Fällen mit einem klinischen Verdacht auf eine Fraktur oder schwere Weichteilverletzungen im Bereich des Handgelenkes bei unauffälligem oder unklarem Nativröntgenbild der Einsatz der MRT unmittelbar, möglichst am Tag der Verletzung, erfolgen. Trotz der initial hohen Kosten der kernspintomographischen Untersuchung erscheint uns das Verfahren in der Akutdiagnostik von Handgelenkesverletzungen bei Diskrepanz zwischen dem unauffälligen Röntgenbild und der klinischen Symptomatik indiziert und kosteneffektiv, da durch die adäquate Therapie chronische Handgelenksinstabilitäten und Pseudarthrosen vermieden werden können und auf diese Weise eine Reduktion der Folgekosten möglich ist. Für die Zukunft werden weitere Studien notwendig sein, die die klinische Relevanz des Langzeitverlaufes der in der MRT erhobenen Befunde überprüfen.
In this study we investigated the regulation of IL-18BPa by IFN-y in the context of colon cancer and human autoimmune diseases. IL-18BPa is a naturally occuring inhibitor that counteracts IL-18 bioactivity. By enhancing IFN-y production IL-18 has been introduced as pivotal mediator of TH1 immune responses. Indeed, many IL-18 effects are mediated by IFN-y. IL-18 bioactivity is connected with the pathogenesis of different inflammatory diseases, for instance, septic shock, colitis, Crohn's disease, myasthenia gravis, multiple sclerosis, rheumatoid arthritis, atherosclerosis, and organ transplant rejection. In addition, IL-18 has tumor-suppressive properties. IFN-y induced IL-18BPa expression was shown on protein and mRNA level in different colon carcinoma cell lines, organ cultures of colonic intestinal biopsy specimens, HaCaT keratinocytes as well as rheumatoid arthritis fibroblastlike synoviocytes (RA-FLS). The IFN-y-mediated induction of IL-18BPa appears to be a more general phenomenom. The capability of IFN-y to induce IL-18BPa also has been confirmed on the promoter level by performing luciferase reporter gene studies with two IL- 18BP promoter fragments. A GAS-site proximal to the transcription start site has been identified to be relevant for IFN-y-mediated induction of these two IL18BP promoter fragments. The induction of IL-18BPa is most likely mediated by STAT-1 in DLD-1 colon carcinoma cells. Sodium butyrate inhibited IFN-y-induced IL-18BPa expression in these cells. On the basis of our observations, we postulate a negative feedback mechanism, by which IFN-y-dependent and -independent IL-18 action might be counterregulated. In this model sodium butyrate is an additional player, that may interrupt the postulated negative feedback loop. A coculture system was performed to simulate an inflammatory TH1 response. This model which is more close to the in vivo situation, confirmed upregulation of IL-18BPa by endogenously produced IFN-y. The role of IL-18BPa is manifold and depends on IL-18 function in each particular case. In autoimmune diseases, for instance, which are often characterized by a TH1 polarized immune response, IL-18BPa might counterregulate IL-18 and/or IL-18-induced IFN-y bioactivity. Important examples are Crohn's disease and rheumatoid arthritis. In CD therapeutic use of IL-18BPa may therefore restore a hypothetically disturbed IL-18/IL-18BP balance. Concerning RA, IL-18BPa expression might contribute to protective functions of IFN-y, observed in different murine models for arthritis and in rheumatoid arthritis patients. Moreover, IL-18BPa might inhibit IL-18-mediated induction of subsequent cardinal inflammatory cytokines responsible for the pathogenesis of these diseases. Indeed, the pharmaceutical industry successfully used IL-18BP as therapeutic agent in a murine model of RA and in phase I clinical trials. On the contrary, in the context of carcinogenesis IFN-y- mediated IL-18BPa expression might be disadvantageous. By counterregulating the IL-18 arm of immune defenses against tumors, IL-18BP may have the potential to promote carcinogenesis. Our hypothesis is underlined by the observation that sodium butyrate, known to be protective in colon cancer, inhibited IFN-y-induced IL-18BPa expression. In parallel, IL-18-induced IFN-y is also responsible for iNOS induction. iNOS-derived NO provides a second possible way for inhibition of IFN-y-dependent and -independent tumor suppressive effects of IL-18. Finally, IFN-y-induced IL-18BPa expression was confirmed on the promoter level. This induction on the promoter level was associated with STAT-1 binding to the GAS element proximal to the start of transcription. It is tempting to speculate that blockage of the cytokine cascade upstream of IL-1 and TNF- a on the level of IL-18 may be of therapeutic benefit. Our data reflect the relationship between inflammation and cancer, in that inflammatory cells and cytokines found in tumors are likely to contribute to tumor growth, progression, and immunosuppression than they are to mount an effective host antitumour response.
In dieser klinischen Studie wurden 10 normalgewichtige und 10 übergewichtige Patienten mit Diabetes mellitus 2 und einer unbehandelten diabetischen Polyneuropathie über vier Wochen mit a-Liponsäure 1200 mg/die per os behandelt. Vor und nach der Therapie wurde ein intravenöser Glucosebelastungstest bei jedem Patienten durchgeführt und die ermittelten Glucose-, Insulin-, Pyruvat- und Lactatspiegel mit einer Kontrollgruppe (10 normalgewichtige und 10 übergewichtige normoglykämische Kontrollpersonen) verglichen. Die SI und SG Werte wurden mit Hilfe der Minimalmodeling Technik ermittelt. In dieser Studie wurden folgende Ergebnisse erzielt: 1. Die SI- und SG-Werte waren bei der normalgewichtigen Kontrollgruppe höher als bei den übergewichtigen Kontrollpersonen. 2. Die SI und SG waren bei beiden diabetischen Gruppen verglichen mit den Kontrollgruppen vermindert. 3. Die SI-Verminderung in beiden diabetischen Gruppen deutet auf eine primäre Insulinresistenz hin, die für die Entwicklung der Erkrankung entscheidend ist. 4. Bei den Kontrollgruppen waren die Nüchternpyruvatspiegel bei den Über-gewichtigen höher als bei den Normalgewichtigen, wobei die Steigerung der Lactat- und Pyruvatspiegel und damit die errechnete AUC für Pyruvat und Lactat unter dem Glucosebelastungstest keine signifikanten Unterschiede in beiden Gruppen zeigte. 5. Die Nüchternlactatspiegel waren sowohl bei normal- als auch bei übergewichtigen Patienten mit Diabetes mellitus 2, verglichen mit der jeweiligen Kontrollgruppe, deutlich erhöht. Die Nüchternpyruvatspiegel waren bei übergewichtigen Diabetikern jedoch deutlich höher als bei normalgewichtigen Diabetikern. 6. Die deutlich erhöhten Lactat- und Pyruvatspiegel im Nüchternzustand bei diabetischen Patienten weisen auf eine beeinträchtigte basale Glucoseoxidation hin. 7. Unter intravenöser Glucosebelastung stiegen die Pyruvatspiegel stärker als die Lactatspiegel an und waren vor allem bei übergewichtigen Diabetikern deutlich erhöht. Dieser starke Anstieg belegt die verminderte Glucoseoxidation bei Diabetikern. 8. Die vierwöchige a-Liponsäuretherapie verbessert signifikant die SG sowohl bei normalgewichtigen- (** P<0.01) als auch bei übergewichtigen Diabetikern (* P<0.05). Der Therapieeffekt von a-Liponsäure auf die SI war bei normalgewichtigen Patienten deutlich höher als bei übergewichtigen Patienten. Der SG- und SI-Effekt auf die Glucose-Wiederaufbaurate war nach der Therapie verbessert. 9. Bei normalgewichtigen Patienten führte eine vierwöchige a-Liponsäuretherapie zu einer verbesserten Glucoseverstoffwechselung. Der weniger ausgeprägte Therapieeffekt von a-Liponsäure bei übergewichtigen Diabetikern mag wohl auf der Schwere der Stoffwechselentgleisung in dieser Patientengruppe beruhen. 10. a-Liponsäure führte zu einer deutlichen Abnahme der AUC für Pyruvat und Lactat in beiden Gruppen. Dieses Ergebnis deutet darauf hin, dass a-Liponsäure wahrscheinlich über eine Stimulation auf dem Niveau des Pyruvat-Dehydrogenasekomplexes wirkt. a.Liponsäure scheint also sowohl im Nüchternzustand als auch unter Glucosebelastung die Glucoseoxidation bzw. den Pyruvatmetabolismus zu verbessern. Bei Patienten mit Diabetes mellitus 2 ist die Glucoseabbaurate durch eine verminderte aerobe und anaerobe Glucoseoxidation gehemmt. Grund dafür ist wahrscheinlich eine PDH Aktivitätsabnahme. Die ständige Hyperglycämie führt zu einer Zunahme der Pyruvat- und Lactatkonzentration und einer Abnahme der SI und SG. Die orale Einnahme von a-Liponsäure beschleunigt anscheinend den intrazellulären Glucosemetabolismus durch Stimulation der PDH und erhöht das intrazelluläre Redox- potential. Es kommt dadurch wahrscheinlich zu einer Verbesserung der Energiegewinnung aus Phosphaten und mobilisiert den Glucosetransporter, wodurch sich der Glucosetransport in die Muskelgewebe verbessert. Damit führt a-Liponsäure zu einer verbesserten Glucoseutilisation bei Patienten mit Diabetes mellitus 2.
Die Osseointegration in der dentalen Implantologie wurde anhand einer Literaturübersicht dargestellt und ausgewertet. Die Literaturübersicht beinhaltet Verlaufsstudien, in vitro und in vivo Studien, die ultrastrukturelle, biomechanische und biochemische Untersuchungen und deren Resultate aufzeigen. Im 1. Kapitel wurden die Kriterien zur Beurteilung des Implantaterfolges dargestellt. Es lässt sich feststellen, dass nicht nur ein Implantatverlust als Misserfolg zu bewerten ist, sondern auch klinische und röntgenologische Erfolgskriterien eine Rolle spielen. Die Mobilität, der Knochenabbau, Entzündungsreaktionen, Schädigungen von anatomischen Strukturen und die Funktionstüchtigkeit des Implantates werden mitbewertet. Im 2. Kapitel wurden die Voraussetzungen für die Erzielung der Osseointegration aufgezeigt. Zu diesen gehören die Physiologie der Knochenheilung, die Implantatwerkstoffe, das operative Vorgehen und die Einheilungsphase. Der Vorgang der Knochenheilung, speziell der primären Frakturheilung, wird der Implantateinheilung gleichgesetzt. Dies bedeutet, dass ein ausreichender belastungsfreier Zeitraum für die Implantateinheilung einzuhalten ist. Bei den Implantatwerkstoffen wurden die Metalle und die Keramiken verglichen. Der Implantatwerkstoff der Wahl ist aufgrund seiner mechanischen und biokompatiblen Eigenschaften das Titan. Andere Materialien, wie z.B. Tantal und Hydroxylapatit, haben sich als problematisch erwiesen. Beim operativen Vorgehen haben sich die Aspekte der atraumatischen, aseptischen und standardisierten Operationsbedingungen als vorteilhaft erwiesen. Der Einfluss der Knochenqualität und des Implantatdesigns auf die erreichbare Primärstabilität wurde dargestellt. Bei der Einheilphase wurde eine Übersicht über die bis dato gültigen Einheilzeiten gegeben. Die Vorgänge während der Implantateinheilung wurden unter Bezug auf die ultrastrukturellen Aspekte dargestellt. Der Einfluss von osteogenetischen Faktoren wurde speziell aufgezeigt. Die Implantateinheilung ist als komplexer Vorgang zu verstehen, bei dem die Wechselwirkung der verschiedenen Faktoren eine wichtige Rolle spielt. Die Morphologie des Interface wurde anhand von Studien diskutiert. Unterschiede in der Morphologie sind in Abhängigkeit von den Implantatwerkstoffen, der Remodelingphase und den verschiedenen Versuchstieren zu finden. Im 3. Kapitel wurden die Voraussetzungen für den Erhalt der Osseointegration besprochen. Zu diesen gehören die Knochenbelastung, die Konstruktionsprinzipien dentaler Implantate, die prothetischen Konzepte und Implantat-Systembeispiele. Bei der Knochenbelastung wurden die Aspekte der okklusalen Überbelastung, der axialen bzw. nicht-axialen Krafteinleitung, Zahn-Implantat- und rein implantat-getragene Rekonstruktionen und materialabhängige Faktoren der Suprakonstruktion berücksichtigt. Hierbei stellte sich heraus, dass Überbelastungen vermieden werden sollten. Die Art der Krafteinleitung sowie die Verbindung von Implantaten mit der natürlichen Bezahnung haben keinen negativen Einfluss auf die Osseointegration. Rekonstruktionen auf Kuststoffbasis werden als problematisch dargestellt. Bei den Konstruktionsprinzipien wurden die Bereiche des enossalen Teils, die Implantatdimension, die Implantatform, der Durchtritt durch die Weichgewebe und die Position der Implantatoberkante dargestellt. Die Unterschiede in den Konstruktionsprinzipien der dentalen Implantate sind heutzutage gering und sind in der Strukturierung der Oberflächen, der Positionierung der Implantatoberkante und im Durchtritt durch die Weichgewebe zu finden. Die Bedeutung der Weichgewebsmanschette beim Osseointegrationsvorgang wurde hervorgehoben. Die Vorteile von konischen Schraubenimplantaten im Vergleich zu Zylinderimplantaten werden aufgezeigt. Ein wurde ein Überblick über die etablierten Okklusionskonzepte und prothetischen Konzepte gegeben. Eine Abhängigkeit von der Ausgangssituation im natürlichen Restgebiss wurde festgestellt, so dass das Konzept sich nach dieser richten muss. Bei den Systembeispielen wurden sechs Implantattypen dargestellt: das Brånemark-System, das Astra-System, das Ankylos-System, das Frialit 2, das ITI- und das 3i-System. Im 4. Kapitel wurden weitere Einflüsse auf die Osseointegration diskutiert. Dazu gehören die Knochenqualität, die Regenerationsfähigkeit des Knochens, neue OP-Verfahren, "neue" Oberflächen und deren Wirkung auf die zelluläre Umgebung, die fraktionierte Lasteinleitung und die Früh- und Sofortbelastung. Die Beurteilung der Knochensituation, d.h. das Erkennen von Veränderungen, die Evaluation der Knochendichte und die Regenerationsfähigkeit des Knochens wurden als prächirurgische Aspekte besprochen. Neue Op-Verfahren wie die Knochen -kondensation und -verdrängung wurden als Möglichkeit vorgestellt, die eine Implantatversorgung auch in schwierigen anatomischen Verhältnissen erlaubt. Der Einfluss der Implantatoberfläche auf den Knochen-Implantatkontakt, die Verankerungsfestigkeit und die Zellaktivität wurde dargestellt. Bei den Implantatoberflächen ist erkennbar, dass eine Vergrößerung der Gesamtoberfläche durch Mikro und -Makrostruktur angestrebt wird. Eine optimale Primärstabilität durch einen besseren Verzahnungseffekt wird dadurch möglich. Die Prinzipien der fraktionierten Lasteinleitung und des progressive bone loadings, sowie die Früh- und Sofortbelastung wurden vorgestellt. Eine Verkürzung der Einheilphase und somit eine Frühbelastung ist unter optimierten Bedingungen möglich. Ein sich anschließendes Knochentraining verbessert die vorgefundene Knochensituation und somit die Prognose der Implantattherapie. Zusammenfassend lässt sich feststellen, dass eine Osseointegration unter Einhaltung von standardisierten Operationsbedingungen mit jedem der hier vorgestellten Implantattypen erzielbar ist. Beim Erhalt der Osseointegration spielen die Unterschiede bei den Implantattypen und die Belastung über die prothetische Versorgung eine wichtige Rolle.
Die Dissertationsarbeit mit dem Titel "Aufhebung der peripheren Immuntoleranz durch Kopplung eines Melanomantigens mit immunogenen Fremdproteinen" befasst sich mit der Weiterentwicklung einer effektiven Melanomvakzine im tierexperimentellen Modell im Hinblick auf die spätere klinische Anwendung im Patienten. Als Antigen wurde das in Melanomzellen und in Melanozyten natürlicherweise exprimierte Protein TRP2 verwendet. Dieses Antigen kann bei Mäusen und Menschen von zellulären Komponenten des Immunsystems erkannt werden. Durch die Fusion des wenig immunogenen Selbstantigens mTRP2 mit dem immunogenen Fusionspartner EGFP gelang es bei C57BL/6 Mäusen, die körpereigene Toleranz gegen Selbstantigene zu umgehen und so eine antigenspezifische Immunantwort zu induzieren. In den mit der cDNA von EGFPmTRP2aa30-519 immunisierten Mäusen konnte eine vitiligoartige Felldepigmentierung nachgewiesen werden, die nach Immunisierung mit der cDNA von mTRP2 nicht beobachtet wurde. In diesen Tieren ließen sich auch im Elispot TRP2-spezifische T-Zellen nachweisen. Tiere, die mit Ad-EGFPmTRP2aa30-519 immunisiert wurden waren gegen das Wachstum von transplantierten Melanomzellen geschützt. Eine Immunantwort und ein Tumorschutz konnte jedoch nur induziert werden, wenn eine direkte Fusion zwischen dem Selbstantigen TRP2 und dem immunogenen Fusionspartner EGFP besteht. In Versuchen mit knockout Mäusen und Depletionsexperimenten konnte gezeigt werden, das CD4+ T-Zellen eine entscheidende Rolle in der Primingphase CD8+T-Zellen von die Induktion von antigenspezifischen CD8+T-Zellen spielen. In weiteren Experimenten nach Immunisierung mit dem Fusionskonstrukten EGFPmTRP2aa30-188, EGFPmTRP2aa30-179 und EGFPmTRP2aa180-188 konnte gezeigt werden, dass das Peptidepitop mTRP2 aa180-188 für die Induktion einer Felldepigmentierung und für eine effektive Abwehr von transplantierten Melanomzellen vorhanden sein muss. Um den Einfluss von kompetitiven MHC-Klasse I bindenden Peptidepitopen auf die Induktion einer Immunantwort zu untersuchen wurden Mäuse mit dem Fusionskonstrukt ß-Galaktosidase-mTRP2aa180-188 immunisiert. In diesen Mäusen konnte eine vtiligoartige Felldepigmentierung der beschossenen Bauchhaut und im Elispot-Test gleichzeitig TRP2 und ß-gal spezifische T-Zellen nachgewiesen werden. Im Gegensatz zu Arbeiten anderer Arbeitsgruppen scheint in diesem System keine kompetitive Hemmung zwischen dem ß-gal und dem TRP2 Peptid zu bestehen. Um den Einfluss der Kopplung auf die intrazelluläre Lokalisation zu charakterisieren wurden Fusionskonstrukte bestehend aus EGFP und mTRP2 mit unterschiedlichen Lokalisationssequenzen generiert, DCEK-Zellen stabil transfiziert und die intrazelluläre Lokalisation mit konfokaler Mikroskopie bestimmt. Nach Immunsisierung von Mäusen mit diesen Fusionskonstrukten konnte gezeigt werde, das die intrazelluläre Lokalisation keinen Einfluss auf die Entstehung einer Immunantwort hat. Für die spätere Anwendung der Kopplung in klinischen Studien wurde ein Fusionskonstrukt bestehend aus mTRP2 und dem gut charakterisiertem Antigen des humanen Cytomegalovirus pp65 generiert. Nach Gene-Gun Immunisierung von C57BL/6 Mäusen mit pp65mTRP2 zeigte sich ähnlich wie bei EGFPmTRP2 eine vitiligoartige Felldepigmentierung. Im Elispot-Test ließen sich TRP2 spezifische T-Zellen nachweisen. Das Ergebnis bestätigt die Annahme, dass auch pp65 zur Verstärkung einer antigenspezifischen Immunantwort gegen ein wenig immunogenes Selbstantigen in der Lage ist.
Mitogen activated protein kinases (MAPKs) are found in all eukaryotic cells and represent crucial elements in the signal transduction from the plasma membrane to the nucleus. Although a broad variety of extracellular stimuli activate MAPKs, they evoke very distinct cellular responses. The amplitude and duration of MAPK activation determine signal identity and ultimately cell fate. A tight and finely tuned regulation is therefore critical for a specific cellular response. The role and the regulation of extracellular signal-regulated kinase 5 (ERK5), a MAPK with a large and unique C-terminal tail, were studied in different cellular systems. The study highlights two aspects of ERK5 regulation: control of the phosphorylation state and regulated protein stability. In analogy to other MAPKs ERK5 is activated by dual phosphorylation of threonine and tyrosine residues in its activation motif. A first part of the study concentrates on whether and how the protein tyrosine phosphatase PTP-SL is involved in the downregulation of the ERK5 signal. The direct interaction of both proteins is shown to result in mutual modulation of their enzymatic activities. PTP-SL is a substrate of ERK5 and, independent of its phosphorylation, binding to the kinase enhances its catalytic phosphatase activity. On the other hand, interaction with PTP-SL does not only downregulate enzymatic ERK5 activity but also effectively impedes its translocation to the nucleus. The second part of this study focuses on the interaction of ERK5 with c-Abl and its oncogenic variants Bcr/Abl and v-Abl. In this study these tyrosine kinases are demonstrated to regulate ERK5 by two mechanisms: first, by induction of kinase activity and secondly, by stabilisation of the ERK5 protein. Stabilisation involves the direct interaction of unique ERK5 domains with Abl kinases and is independent of MAPK cascade activation. The level of ERK5 and its intrinsic basal activity – rather than its activation – are essential for v-Abl-induced transformation as well as for survival of Bcr/Abl-positive leukaemia cells. Stabilisation of ERK5 thus contributes to cell survival and should therefore be considered as an additional aspect in therapy of chronic myeloid leukaemia. Taken together, the results obtained in this study demonstrate that diverse pathways regulate ERK5 signalling by affecting kinase activity, localisation and protein stability. While the phosphatase PTP-SL is involved in negative regulation of ERK5, Abl kinases potently activate ERK5 and increase its half-life. Protein stabilisation thus is presented as a novel mechanism in the regulation of MAPKs.
MHC Klasse I Moleküle liegen im Endoplasmatischen Reticulum (ER) als Dimer bestehend aus einer schweren Kette mit Transmembrandomäne und einem 12 kDa-Protein, dem ß2-Mikroglobulin vor. Nach der Beladung des MHC-Klasse I-Moleküls mit einem antigenen Peptid, welche vorwiegend im Cytosol durch proteasomalen Abbau generiert und durch den Transportkomplex TAP ins ER transloziert werden, findet der Transport des MHC-Peptid-Komplexes zur Zelloberfläche statt. Dort wird das Antigen cytotoxischen T-Zellen präsentiert. An der Assemblierung und Reifung von MHC-Klasse I-Molekülen sind verschiedene Chaperone beteiligt. Eine wichtige Rolle beim Peptidbeladungsprozess von MHC-Klasse I-Molekülen spielt Tapasin. Dabei handelt es sich um ein 48 kDa, MHC-codiertes Typ I Transmembran-Glycoprotein aus der Immunglobulinsuperfamilie. Es verbrückt den TAP-Komplex mit MHC-Klasse I-Molekülen, hält unbeladene MHC-Klasse I-Moleküle im ER zurück und führt eine Qualitätskontrolle des gebundenen Peptids durch. Bei dieser Peptideditierung werden Peptide wieder selektiv aus der MHC-Bindungstasche entfernt, wenn sie mit einer niedrigen Affinität gebunden sind. Dadurch wird sichergestellt, dass keine leeren oder suboptimal beladenen MHC-Peptid-Komplexe an die Zelloberfläche gelangen. In der vorliegenden Arbeit wurde ein System etabliert, mit dem der Einfluss von Tapasin auf die Peptidbeladung von MHC-Klasse I-Molekülen in vitro untersucht werden kann. Dazu wurde ein Verfahren zur heterologen Expression und Reinigung von funktionalem, löslichem Tapasin aus E. coli-Zellen aufgestellt. Weiterhin wurden ß2m und die schwere Kette von HLA-B*2705 heterolog in E. coli-Zellen exprimiert, isoliert und zusammen mit einem Reporterpeptid zum funktionalen HLA-B*2705 renaturiert. Bei Untersuchungen der Wechselwirkung zwischen Tapasin und HLA-B*2705-Molekülen konnte mittels der Oberflächen-Plasmonen-Resonanz-Spektroskopie eine direkte Interaktion zwischen Tapasin und unbeladenem HLA-B*2705 gezeigt werden. Detailliertere Untersuchungen zur Rolle von Tapasin bei der Peptidbeladung wurden mittels einer Gelfiltration gekoppelt mit der Fluoreszenzdetektion des Reporterpeptids durchgeführt. Dabei konnte festgestellt werden, dass unbeladene MHC-Klasse I-Moleküle in Anwesenheit von Tapasin stabilisiert werden und in einer Konformation gehalten werden, die eine Assoziation mit Peptid fördert. Weiterhin wurde gezeigt, dass durch Tapasin die Assoziationsrate für die Peptidbindung erhöht ist. Somit kann in Anwesenheit von Tapasin eine größere Anzahl an Peptiden auf eine stabile und hochaffine Bindung an MHC-Klasse I-Moleküle überprüft werden. In Experimenten mit bereits beladenen MHC-Klasse I-Molekülen konnte gezeigt werden, dass der neugebildetete Komplex auch nach erfolgter Peptidassoziation durch Tapasin stabilisiert wird. Dies ist vermutlich auf eine Erniedrigung der Dissoziationsrate für das Peptid zurückzuführen. Mit dem in dieser Arbeit etablierten Untersuchungssystem ist die Grundlage zu detaillierten Studien der Rolle von Tapasin bei der Peptidbeladung von MHC-Klasse I-Molekülen geschaffen.
Bemerkenswerte Fortschritte in der rekombinanten Antikörpertechnologie und die Entwicklung unterschiedlichster Antikörperformate zur Expression in Bakterien, niederen und höheren Eukaryonten haben Antikörperderivaten vielfältige Anwendungsbereiche eröffnet. Hierzu gehört beispielsweise ihr Einsatz als experimentelle Wirkstoffe in der Tumortherapie, wo einige dieser Ansätze bereits in klinischen Studien evaluiert werden. Daneben könnten rekombinante Antikörperderivate aber auch eine zunehmend wichtige Rolle in der funktionellen Genomik spielen, beispielsweise bei der Aufklärung der Funktion medizinisch relevanter Genprodukte. So stellt der gezielte Einsatz intrazellulär exprimierter single-chain Fv Antikörperfragmente (scFvs) grundsätzlich einen viel versprechenden Ansatz zur selektiven Interferenz mit der Funktion intrazellulärer Proteine dar. Solche scFv Fragmente sind jedoch nach Expression im Zytosol aufgrund des dort vorherrschenden reduzierenden Milieus häufig inaktiv, was auf die nicht erfolgte Ausbildung intramolekularer Disulfidbrücken zurückzuführen ist, die normalerweise in den variablen Domänen von Antikörpern vorliegen. Nur wenige, bisher meist sehr aufwendig durch individuelle Analyse einzelner Moleküle identifizierte scFvs weisen eine ausreichend hohe intramolekulare Stabilität auf, um den Verlust der Disulfidbindungen kompensieren zu können und unter diesen Bedingungen aktiv zu sein. Dies steht bislang einer breiten Anwendung zytoplasmatischer scFvs entgegen. Ziel dieser Arbeit war es, ausgehend von hochdiversen scFv Antikörper-Bibliotheken ("Libraries") direkt solche selten auftretenden scFv Antikörperfragmente zu isolieren, die trotz des reduzierenden Milieus im Zytosol von Säugerzellen aktiv sind und hochspezifisch an die intrazellulären Domänen von ErbB-Rezeptoren wie dem Epidermalen Wachstumsfaktor-Rezeptor (EGFR) oder dem nahe verwandten ErbB2 Molekül binden. Diese ErbB-Rezeptoren sind in einer Reihe humaner Tumore überexprimiert. Als wichtige signalleitende Moleküle tragen sie zur malignen Transformation von Zellen bei und spielen eine wichtige Rolle in der Tumorentstehung und -progression. Sie stellen daher viel versprechende Zielstrukturen für die Entwicklung neuartiger Wirkstoffe dar. Auf der Grundlage des Yeast Two-Hybrid Systems wurde ein in vivo Assay etabliert, der das Screening von scFv Libraries nach ErbB-spezifischen scFvs unter intrazellulären Bedingungen in Hefezellen erlaubt. Während es nicht möglich war, in einer im Rahmen der vorliegenden Arbeit generierten anti-ErbB2 scFv-Library und einer mit 8 x 10 hoch 5 unabhängigen Klonen wenig diversen anti-EGFR scFv-Library intrazellullär aktive ErbBspezifische scFv Antikörper nachzuweisen, konnte eine zweite anti-EGFR scFv-Library aufgrund ihrer großen Komplexität von 2 x 10 hoch 8 nicht komplett in Hefezellen gescreent werden. Die Library wurde daher zunächst durch wenige Runden Phagen Biopanning präselektioniert, um so die Diversität der Library auf ein Maß zu reduzieren, das eine weitere Selektion in vivo durch Yeast Two-Hybrid Screening zuließ. Mit Hilfe dieser Kombination aus in vitro Präselektion und in vivo Assay gelang es, verschiedene intrazellulär aktive EGFR-spezifische scFv Fragmente aus einer anti-EGFR scFv-Library zu isolieren. Durch GST "pull-down" Experimente und Koimmunpräzipitationsexperimente konnten deren Spezifität und intrazelluläre Aktivität in Säugerzellen in vitro und in vivo verifiziert werden. Wie durch Konfokale Laserscanning Mikroskopie gezeigt wurde, kolokalisieren die isolierten scFv Antikörper mit EGFR an der Zellmembran EGFR-überexprimierender humaner Tumorzellen. Ein direkter Effekt der Expression der EGFR-spezifischen scFvs auf die Autophosphorylierung des Rezeptors und auf die Proliferation von EGFRexprimierenden Mausfibroblasten wurde jedoch nicht beobachtet. Die Ergebnisse der vorliegenden Arbeit zeigen, dass mit Hilfe des hier entwickelten Konzepts intrazellulär aktive EGFR-spezifische scFv Fragmente aus einer hochdiversen scFv-Library isoliert werden konnten. Prinzipiell sollte diese Strategie auch auf die Gewinnung intrazellulär aktiver scFv Antikörperfragmente anwendbar sein, die spezifisch an andere zytoplasmatische Zielmoleküle binden. Daneben könnten die Spezifität und intrazelluläre Aktivität der bereits isolierten EGFR-spezifischen scFv Fragmente genutzt werden, um z.B. durch Fusion mit Lokalisierungssignalen, Enzymen oder bestimmten Protein-Protein-Interaktionsdomänen die Signalleitung des EGFR gezielt zu beeinflussen. Entsprechende Ansätze werden gegenwärtig in der Arbeitsgruppe weiter verfolgt.
Die Regulation des Zellzyklus wird durch Phosphorylierung und Dephosphorylierung gesteuert. Schlüsselenzyme sind dabei die Cdk/Cyclin-Komplexe. Für den Eintritt und das Durchlaufen der Mitose von besonderer Bedeutung ist die Polo-like Kinase 1 (Plk1). Zur Aufklärung Mitose-spezifischer Signalwege wurden in dieser Arbeit neue Interaktionspartner der Plk1 gesucht. Die Bedeutung dieser Interaktionen für Zellzyklus und Mitose sollten näher charakterisiert werden. In dieser Arbeit konnte gezeigt werden, daß Plk1 direkt mit humanem Cyclin B1, der regulatorischen Untereinheit des M-phase-promoting-factors (MPF), interagiert. Dabei konnte festgestellt werden, daß Plk1 in der Lage ist, Cyclin B1 innerhalb dessen cytoplasmic retention signals (CRS) am Ser-133 zu phosphorylieren. Ferner konnte gezeigt werden, daß die Phosphorylierung der CRS in einer synergistischen Weise durch Plk1 und MAPK (Erk2) stattfindet. Vorphosphorylierung der CRS durch MAPK an Ser-126 und Ser-128 führt nicht nur zu einer 3-4 fach stärkeren Phosphorylierung durch Plk1, sondern auch zur Entstehung neuer Phosphorylierungs-Stellen für Plk1. Die hier aufgeführten Daten zeigen, daß durch synergistische Phosphorylierung der CRS, an der Plk1 beteiligt ist, der rapide nukleäre Import des Cyclin B1/Cdk1-Komplexes in der Prophase gesteuert wird. Dieser rapide Import in den Kern ist Voraussetzung für die Auflösung der Kernmembran in der Prometaphase. Damit konnte gezeigt werden, daß Plk1 dazu beiträgt, den MPF in den Kern (zu seinen Substraten) zu bringen, um früh-mitotische Ereignisse zu induzieren. Mitotische Kinasen (wie MPF, aber auch MAPK) phosphorylieren ihre Substrate oft an Ser/Thr-Pro-Motiven. Sind diese Motive phosphoryliert (pSer/Thr-Pro), so können sie von Pin1, einer Peptidyl-Prolyl-cis/trans-Isomerase isomerisiert werden. In dieser Arbeit wurde gezeigt, daß Plk1 mit Pin1 interagiert. Dabei bindet Plk1 an die Protein-Interaktionsdomäne (WW-Domäne) von Pin1, ist aber gleichzeitig in der Lage, Pin1 innerhalb seiner katalytischen Domäne (PPIase Domäne) zu phosphorylieren. Es konnte gezeigt werden, daß das Ser-65 in Pin1 eine Phosphorylierungs-Stelle für Plk1 darstellt. Da bekannt war, daß Vortäuschung einer Phosphorylierung an Ser-16 oder Ser-67 die Pin1-Aktivität hemmt, wurde ein ähnlicher Effekt für Ser-65 erwartet. Jedoch führte die Vortäuschung der Phosphorylierung an Ser-65 nicht zu einer Reduktion der PPIase-Aktivität von Pin1. In dieser Arbeit konnte erstmals gezeigt werden, daß Pin1 über das Proteasom abgebaut wird. Die Vortäuschung der Ser-65-Phosphorylierung führt zur Stabilisierung des Pin1-Proteins. Damit ist Plk1 das erste bekannte Enzym, welches Pin1 durch Phosphorylierung stabilisiert.
Antigen-präsentierende Zellen spielen eine wichtige Rolle bei der Entstehung einer Kontaktallergie. Ziel dieser Arbeit war es, frühe Mechanismen der Signaltransduktion zu identifizieren, die an der Aktivierung von Antigen-präsentierenden Zellen durch Kontaktallergene beteiligt sind. · Monocyten und dendritische Zellen wurden auf ihre Eignung als Modell für epidermale Langerhanszellen hin untersucht. Die Aktivierbarkeit von Monocyten und dendritischen Zellen konnte durch den Anstieg der Tyrosinphosphorylierung nach Stimulation mit verschiedenen Kontaktallergenen gezeigt werden. Die durch Kontaktallergene induzierte TNF-alpha-Produktion von dendritischen Zellen belegt die funktionelle Relevanz des Modellsystems. · Ausgehend von der Bedeutung von Cytokinen für die Differenzierung von myeloiden Zellen wurde untersucht, ob Kontaktallergene die mit Cytokin-Rezeptoren assozierten Signalwege des Jak/STAT-Systems aktivieren. Es konnte keine Aktivierung von STAT-Moldekülen (STAT1, 3, 4, 5, 6) durch Kontaktallergene nachgewiesen werden. Daher ist davon auszugehen, daß Kontaktallergene die üblichen Jak/STAT-Signalwege nicht direkt aktivieren, weder durch Bindung an Jak-assoziierte Cytokin-Rezeptoren noch über deren downstream-Elemente. · Die Aktivierung der MAP Kinasen ERK und p38 durch verschiedene Kontaktallergene wurde charakterisiert. MCI/MI und TNCB aktivieren ERK und p38. Nicht alle Kontaktallergene bewirken die gleichen Aktivierungsmuster. Die Phosphorylierung von ERK durch MCI/MI wurde im Vergleich zur Aktivierung von p38 als früher Mechanismus der Signaltransduktion charakterisiert. Die Beteiligung von ERK und p38 an der TNF-alpha-Induktion durch MCI/MI belegt die Relevanz dieser MAP Kinasen für die Aktivierung von dendritischen Zellen. · Weiterhin wurden eine Reihe von upstream-Elementen von ERK untersucht. Die Aktivierung von ERK durch MCI/MI und TNCB verläuft nicht über den klassischen Ras-c-Raf-MEK-ERK Signalweg. Während MEK1/2 an der Aktivierung von ERK durch MCI/MI und TNCB beteiligt ist, werden c-Raf und Ras nicht aktiviert. · Die intrazelluläre Calcium-Konzentration ist wichtig für die ERK-Aktivierung durch MCI/MI und TNCB, extrazelluläres Calcium dagegen ist nicht erforderlich. Das Modellallergen MCI/MI bewirkt die Mobilisierung von intrazellulärem Calcium. Der Anstieg von [Ca2+]i allein jedoch löst keine Aktivierung von ERK aus. Das durch MCI/MI induzierte Calcium-Signal wird nicht durch Calmodulin vermittelt. · Durch Inhibition von Proteinkinase C konnte nachgewiesen werden, daß vorwiegend klassische Calcium-abhängige Isoformen der PKC an der Aktivierung von ERK durch MCI/MI beteiligt sind. Die Translokation von cPKC-Isoformen weist auf deren Aktivierung durch MCI/MI und TNCB hin. Die Inhibition von PI3-Kinase hingegen lieferte keinen Hinweis auf Beteiligung an der Aktivierung von ERK durch MCI/MI. Mit den Ergebnissen dieser Arbeit konnte auf der Grundlage der aktuellen Literatur ein möglicher Signalweg der Aktivierung von ERK durch Kontaktallergene entwickelt werden. Auslöser der Signalmechanismen wäre die Kopplung von Haptenen an ein heterodimeres (an die tTG siehe Zahn 2002) oder heterotrimeres G-Protein. Eine wichtige Rolle bei der Signalweiterleitung spielen die Freisetzung von Calcium aus intrazellulären Speichern, klassische Isoformen der Proteinkinase C und die MAPK Kinase MEK1/2. Sowohl ERK als auch p38 sind an der Induktion der TNF-alpha-Produktion durch Kontaktallergene in dendritischen Zellen beteiligt. Damit liefert diese Arbeit einen wesentlichen Beitrag zum Verständnis der molekularen Mechanismen bei der Aktivierung von dendritischen Zellen durch Kontaktallergene.
One of the known apoptotic pathways in mammalian cells involves release of mitochondrial Cytochrome c into the cytosol. Cyt c then together with ATP or dATP induces a conformational change in the adaptator protein Apaf-1 (a homologue of the C. elegans CED4 protein) (Zou, Henzel et al. 1997), leading to its oligomerization and the recruitment of several pro-Casp-9 molecules. This protein complex assembly called "apoptosome" leads to the activation of Casp-9 which then initiates or amplifies the caspase cascade. The cell death program can be stalled at several points and we were interested in identifying new proteins inhibiting cell death downstream of Cyt c release. This thesis describes how I have screened a cDNA library derived from a pool of human breast carcinomas in a yeast-based survival screen, using the S. pombe yeast strain HC4 containing an inducible CED4 construct(James, Gschmeissner et al. 1997). The screen resulted in the identification of six proteins displaying cell death-inhibiting activity in S. pombe as well as anti-apoptotic potential in mammalian cells. Those six molecules were RoRet (Ruddy, Kronmal et al. 1997), Aven (Chau, Cheng et al. 2000), Fte-1/S3a (Kho, Wang et al. 1996), PGC2 (Padilla, Kaur et al. 2000; Goetze, Eilers et al. 2002), SAA1-2ß (Moriguchi, Terai et al. 2001) and FBP (Brockstedt, Rickers et al. 1998) of which I selected RoRet, Aven and Fte-1/S3a for further analysis. RoRet is a new anti-apoptotic molecule that can inhibit the mitochondrial pathway via its PRY-SPRY domain. RoRet does not seem to bind to Apaf-1, and does not co-localize with the activated Apaf-1/Caspase-9 complex. Aven was published to act as an anti-apoptotic protein and suggested to function via the recruitment of Bcl-XL to Apaf-1. This work shows that its C-terminal domain can bind to Apaf-1 and has a strong anti-apoptotic activity by itself. Moreover, Aven co-localizes with the activated Apaf-1/Caspase-9 complex suggesting that it is a component of the apoptosome. Furthermore, the expression of Aven is regulated in mammary glands during the pregnancy cycle. Fte-1/S3a has been already implicated in increased transformation capacity of v-Fos in fibroblasts (Kho and Zarbl 1992; Kho, Wang et al. 1996). This work shows that it has anti-apoptotic activity and can protect against Bak- and Apaf-1-induced apoptosis. It can bind directly to activated Apaf-1 at the linker domain between the WD40 repeats and the CED4-like domain, suggesting that it may protect by sequestering the activated Apaf-1 to some organelles whose nature remains to be determined. Moreover, expression studies on mRNA and protein level showed upregulation of Fte-1/S3a in colon, lung and kidney carcinoma. Hmgb1 (Flohr, Rogalla et al. 2001; Pasheva, Ugrinova et al. 2002; Stros, Ozaki et al. 2002) was identified during a survival screen performed with a NIH 3T3 mouse fibroblast cDNA library in a Bak-expressing yeast S. pombe strain. HMGB1 can protect against Bak-, UV-, FasL- and TRAIL-induced apoptosis. Significant overexpression of HMGB1 was found in breast and colon carcinoma, and elevated mRNA amounts were detected in uterus, colon and stomach carcinoma, suggesting that it may be a tumour marker (Brezniceanu et al., 2003).
Der Typ 1 Diabetes mellitus (IDDM) ist eine multifaktorielle Erkrankung deren Risiko zu 50-60% von genetischen Faktoren vermittelt werden, wobei dem HLA-System auf Chromosom 6 (IDDM1) eine Schlüsselrolle zugesprochen wird. Innerhalb dieser Genregion befinden sich die beiden solitären retroviralen "long terminal repeats" (LTRs) DQ-LTR3 und DQ-LTR13. Sie können theoretisch mit Hilfe ihrer regulatorischen Elemente die Expression benachbarter funktioneller Gene beeinflussen. Im Rahmen der Fragestellung nach einer möglichen Funktion retroviraler LTRs im Kontext des Typ 1 Diabetes mellitus ist das unmittelbar benachbarte DQB1 Gen ein Kandidatengen von besonderer Bedeutung. Im Rahmen einer Familienassoziationsstudie wurde DQ-LTR13 als potentieller genetischer Risikomarker charakterisiert und es konnte gezeigt werden, daß die Haplotypen DQ8/LTR13+ und DQ2/LTR13- signifikant häufiger transmittiert werden als bei einer zufälligen Vererbung erwartet. Gleichzeitig unterscheidet sich ihr Segregationsmuster signifikant von dem der Haplotypen DQ8/LTR13- und DQ2/LTR13+. Das Kopplungsungleichgewicht zwischen DQ-LTR3 und DQ-LTR13 ist so ausgeprägt, daß sie zwar präferentiell aber nicht ausschließlich zusammen auf einem Haplotypen vorkommen. Die Wahrscheinlichkeit einer Erkrankung an IDDM in Zusammenhang mit einem der beiden Risikohaplotypen DQ8/LTR13+ bzw DQ2/LTR13- liegt bei 76% bzw. 68%. Aufgrund dieser Ergebnisse ist DQ-LTR13 insgesamt als unabhängiger genetischer Risikomarker für Typ 1 Diabetes mellitus zu bewerten, zusätzlich zu den bekannten Risikohaplotypen DQ8 und DQ2 und unabhängig von DQ-LTR3. Im Rahmen funktioneller Analysen unter Verwendung eines Reportergen-Assays konnte nach Transfektion diverser EBV-transformierter lymphoblastoider B-Zellen für keine der beiden LTRs die Fähigkeit nachgewiesen werden, als eigenständiger Promotor auf die Expression des Reportergens Luciferase zu wirken. Diese Fähigkeit konnte auch nicht durch die Gabe von Hydrocortison bzw. ß-Estradiol induziert werden. DQ-LTR13 ist jedoch in vitro in der Lage, abhängig von transkriptioneller Orientierung und Position, über den Promotor des DQB1 Gens verstärkend auf die Expression des Luciferase-Gens zu wirken. Dieser Effekt ist darüber hinaus, bezüglich der beiden Risikoallele DQB1*0302 und DQB1*0201, differentiell ausgeprägt. Eine Verifizierung des beobachteten Effekts in vivo war im Rahmen der vorliegenden Doktorarbeit leider nicht möglich.
AML1/ETO liegt bei 12% aller Patienten mit einer AML vor. Bei der Translokation t(8;21) kommt es zur Fusion der DNA-Bindungsdomäne des Transkriptionsfaktors AML1 mit dem starken transkriptionellen Repressor ETO. Über den ETO-Anteil wird einen aktiver Korepressorkomplex rekrutiert, der zur transkriptionellen Repression AML1 relevanter Zielgene führt. Die dysregulierte Genexpression führt in AML1/ETO-transformierten Zellen möglicherweise zusätzlich zur Aktivierung anderer Signaltransduktionswege. Untersuchungen in der hämatopoetischen Zellinie TF-1 hatten diesbezüglich gezeigt, daß die Expression von AML1/ETO zu einer verlängerten STAT5-Aktivität führte. Durch ein synthetisches Phosphopeptid konnte die Proliferation AML1/ETO-transformierter Zellen, nicht aber normaler CD34+-Zellen gehemmt werden. Im Rahmen der vorliegenden Arbeit wurde PLCgamma als ein Zielmolekül des Phosphopeptids identifiziert. Weiterführende Untersuchungen hatten gezeigt, daß PLCgamma nicht zur Transformation AML1/ETOexprimierender Zellen beiträgt. Die Synthese des Phosphopeptids bereitete aufgrund der Phosphorylierung Schwierigkeiten, so daß die Untersuchungen dadurch eingeschränkt waren. Ziel war es dennoch, Peptide identifizieren zu können, die in der Lage sind die transformierenden Eigenschaften in AML1/ETO-exprimierenden Zellen spezifisch zu blockieren. Hierfür wurden zwei Selektionssysteme in einer humanen Zellinie aufgebaut, die es ermöglichen sollen ETO-inhibierende Peptide aus einer Peptid-Bibliothek identifizieren zu können. Das erste Selektionssystem basierte auf der Produktion viraler Partikel, die von einer Gal4-ETO-regulierten VSV-G-Expression abhängig ist. Unter anderem bestätigte die Kompetition von Gal4-ETO durch die Koexpression der Gal4-DNA-bindenden- Domäne, daß die drastisch verminderte Virusproduktion allein auf eine ETO-vermittelte transkriptionelle Repression des VSV-G-Hüllproteins zurückzuführen war. Für die Durchmusterung einer Peptid-Bibliothek war der Hintergrund an viralen Partikeln (1.5x10 hoch 4 TU/ml), die trotz der Gal4-ETO-Expression produziert wurden, allerdings zu hoch. Im Gegensatz dazu verfügt das zweite Selektionssystem über ein tkneo- Reporterkonstrukt, dessen Expression ebenfalls durch Gal4-ETO reguliert wird. Es wurden zwei Zellklone etabliert (#61, #157), bei welchen die ETO-vermittelte Repression des tkneo-Fusionsproteins durch Butyrat und durch die Koexpression der Gal4-DNA-bindenden- Domäne spezifisch aufgehoben werden konnte. Neben dem gewünschten Wachstumverhalten der Klone unter den verschiedenen Selektionsbedingungen (ETO "on": G418-sensitiv; GCV-resistent; ETO "off": G418-resistent; GCV-sensitiv) wurde die stabile Integration des tkneo-Reporterkonstrukts und des Gal4-ETO-Plasmids in einer semiquantitaiven PCR nachgewiesen. Es wurde zum ersten Mal ein Selektionssystem etabliert, welches den Mechanismus der AML1/ETO-vermittelten Repression eines Gens genau wider spiegelt und die Selektion ETO-inhibierender Peptide aus einer Peptid- Bibliothek unter physiologischen Bedingungen ermöglicht.
Die vorliegende Vergleichsstudie untersucht 28 schizoaffektive Patienten (ICD F25) gegenüber 38 bipolar-depressiven Patienten (ICD F31) und 43 Patienten einer orthopädisch erkrankten Kontrollgruppe. Die motivierende Fragestellung war, ob sich durch ein standardisiertes Testverfahren wie den Gießen-Test Merkmale eruieren lassen, die für die Selbst-Objekt-Beziehungen schizoaffektiver Patienten charakteristisch sind. Die soziodemografischen Daten wurden anhand eines halbstandardisierten Interviews erfasst. Der Interviewleitfaden gliedert sich in die Bereiche sozialer, beruflicher und familiärer Status, Krankheitsdaten, Fragen zu Kindheit und Familie sowie Fragen zur aktuellen sozialen Situation. Zur Erfassung der depressiven Symptomatik wurden die Patienten mit der Hamilton-Depressions-Skala zur Fremdbeurteilung überprüft. Mittels Gießen-Test wurde neben der Selbstbeurteilung (aktuelles Selbstbild, Idealbild und normatives Bild) auch die individuelle Fremdbeurteilung der primären Bezugspersonen sowie der gegengeschlechtlichen Partner der jeweiligen Patientengruppe untersucht. Fragekomplex 1: Wie sind Selbstbild und Selbstwertigkeit von schizoaffektiven und bipolar-depressiven Patienten beschaffen? Hypothese: Bei schizoaffektiven und bipolar-depressiven Patienten bestehen signifikante Unterschiede zwischen den drei Selbstbildern, wohingegen bei der Kontrollgruppe orthopädischer Patienten seltener von signifikanten Unterschieden ausgegangen wird. Die hier gewonnenen Ergebnisse zum Selbstbild zeigen, dass zwischen den drei Selbstbildern schizoaffektiver und bipolar-depressiver Patienten häufiger signifikante Unterschiede bestehen als bei der Kontrollgruppe. Hiermit konnte die Hypothese zum Fragenkomplex 1 bestätigt werden. Fragenkomplex 2: Welche Beziehung besteht zwischen dem Selbstbild der Patienten und dem Bild, das sie von ihren Eltern haben? Hypothese: Bei schizoaffektiven Patienten und bei bipolar-depressiven Patienten ist die Distanz zwischen Selbstbild und Mutterbild geringer als bei der somatischen Kontrollgruppe. Die Distanz zwischen Selbstbild und Vaterbild schizoaffektiver und bipolar-depressiver Patienten wird größer erwartet als bei der Kontrollgruppe. Ein signifikanter Unterschied zwischen schizoaffektiven und bipolar-depressiven Patienten wird nicht erwartet. Auffällig ergibt sich aus der vorliegenden Untersuchung das signifikant von der Norm abweichende depressive Selbstbild beider Gruppen in Zusammenhang mit einer ebenfalls depressiv erlebten Mutter. Des Weiteren fällt auf, dass sich die Differenz zwischen Selbstbild und Vaterbild einmal wider Erwarten signifikant zwischen Schizoaffektiven und Bipolar-Depressiven unterscheidet. Ansonsten konnten die Hypothesen zum Fragenkomplex 2 bestätigt werden. Fragenkomplex 3: Unterscheiden sich die interpersonellen Beziehungen von Patienten mit schizoaffektiver Psychose von denjenigen mit bipolar-depressiver Psychose? Hypothese: Es wird erwartet, dass in den Partnerschaften schizoaffektiver und bipolar-depressiver Patienten die Tendenz zu komplementären Beziehungsmustern im Vergleich zur Kontrollgruppe überwiegen. Signifikante Unterschiede der Selbst- und Fremdbilder von schizoaffektiven und bipolar-depressiven Patienten werden nicht erwartet. In dieser Studie weisen Partnerschaften schizoaffektiver Patienten eher auf eine Tendenz zu komplementären Beziehungsmustern hin als Partnerschaften bipolar-depressiver Patienten. Sowohl für Schizoaffektive als auch für Bipolar-Depressive findet sich bei der vorliegenden Untersuchung eine weitgehende Übereinstimmung zwischen dem Selbstbild des Patienten und dem Bild, das der Partner vom Patienten hat. Wider Erwarten gab es jedoch wenige signifikante Unterschiede zwischen Selbst- und Fremdbildern von schizoaffektiven und bipolar-depressiven Patienten. Die Hypothese zum Fragenkomplex 3 konnte dennoch zum größten Teil bestätigt werden. Die Antwort auf die Frage, ob sich für schizoaffektive Patienten charakteristische Selbst-Objekt-Beziehungsmuster heraus arbeiten lassen, muss nach der hier durchgeführten Untersuchung zunächst offen bleiben. Angesichts der prognostischen Bedeutung psychosozialer Variablen im Langzeitverlauf schizophrener und affektiver Störungen (vgl. Kröber, 1993) empfiehlt sich die Durchführung einer Mehr-Zeitpunkte-Untersuchung an einer größeren Stichprobe schizoaffektiv Erkrankter.
Die Mehrzahl der akuten B-Zell Leukämien (B-ALL) im Kindesalter kann heutzutage geheilt werden (ca. 80%). Es gibt jedoch eine Untergruppe, die sog. Hochrisiko-Leukämien, der ein anderer Pathomechanismus zu Grude liegt und für die keine effektive Therapie zur Verfügung steht. Diese Form tritt fast ausschliesslich bei Kleinkindern im ersten Lebensjahr und bei älteren Patienten als Sekundärleukämie nach Chemotherapie auf. Diese akuten Hochrisiko-Leukämien sind zu 80% mit Translokationen des MLL Gens, Chromosom 11, Bande q23, assoziiert. Die reziproke Translokation t(4;11), bei der das MLL Gen mit dem AF-4 Gen fusioniert wird, hat die Expression der zwei funktionellen Derivatproteine MLL.AF-4 und AF-4.MLL und gleichzeitig eine Dosisreduktion des nativen MLL Proteins um 50% zur Folge. Das Zusammenspiel dieser Fakoren scheint die Grundvoraussetzung für die pathologische klonale Expansion leukämischer Blasten zu sein. Aus Untersuchungen in Drosophila melanogaster und im Maussystem ist bereits bekannt, dass das Wildtyp MLL Protein eine essentielle Funktion in der Steuerung von Genexpression durch Histon- und Chromatinregulation ausübt. Daraus stellte sich als Gegenstand dieser Arbeit die Frage nach der bislang überwiegend unbekannten Wildtyp-Funktion des MLL Proteins, und inwieweit das native Expressionsmuster einer Zelle durch die MLL Dosisreduktion beeinflusst, bzw. verändert wird. Zunächst wurden die MLL Targetgene identifiziert, und zwar anhand von je zwei DNA-Microchip-Hybridisierungen mit cRNA aus den MLL+/+ und MLL-/- Fibroblasten-Zelllinien. Der Expressionsvergleich dieser Datensätze ergab insgesamt 197 differentiell exprimierte Gene, die sich in der Expressionsstärke um mind. den 2,5-fachen Wert unterscheiden. Davon wurden 136 Gene bei völliger Abwesenheit des MLL Proteins, im Vergleich zum Normalzustand der Wildtyp-Zellen, um mind. den 2,5-fachen Wert transkriptionell aktiviert, die übrigen 61 Targetgene um mind. diese Stärke transkriptionell deaktiviert. Die Entdeckung dieser transkriptionell reprimierenden Eigenschaften des MLL Proteins, von dem bislang ausschliesslich aktivierende und transkriptionsaufrechterhaltende Eigenschaften bekannt waren, ist eines der wesentlichen Ergebnisse der vorliegenden Arbeit. Ein Teil der, durch die Abwesenheit des MLL Proteins hochregulierten 136 Gene ist bereits als Tumormarker bekannt oder an folgenden onkogenen Mechanismen beteiligt: Proliferation durch Fehlsteuerung des Zellzyklus mit gesteigerter Nukleotid-Biosynthese, erhöhte Migrationsaktivität durch veränderte extrazelluläre Matrix mit der Folge von Metastasierung/Organinfiltration, erhöhter Schutz vor proteolytischem Abbau nukleärer (Onko-) Proteine, und der Generation von Spleiss-Varianten mit z.T. negativem Einfluss auf essentielle Differenzierungswege. Zu diesen, in der Summe das Krebsrisiko erhöhenden Effekten, kommt noch hinzu, dass eine Gegenregulation durch MLL induzierte Expression von Tumorsuppressoren (verschiedene Zellzyklus- Inhibitoren) fehlt. Da bei Leukämie-Zellen die MLL Proteindosis reduziert ist, liegt der Schluss nahe, den oben genannten 136 identifizierten Genen eine mögliche direkte Beteiligung an der Leukämogenese beizumessen. Die meisten der 61 Gene, die durch das MLL Protein transkriptionell aktiviert wurden, kodieren für Faktoren, die zum größten Teil in embryonale Differenzierungsprozesse involviert sind. Dabei spielt die Entwicklung von meso- und ektodermalen Geweben eine besondere Rolle. Das MLL Protein ist somit für die Organogenese von Herz, Leber, Nieren, sensorischen Organen, hämatopoietischen Zellen und ebenso für Knochen und Muskeln essentiell. Die gewonnenen Daten wurden durch verschiedene Experimente (subtraktive Klonierung und RT-PCR) verifiziert und die wenigen, bereits publizierten MLL Targetgene konnten durch diese Arbeit bestätigt werden. Neben den Targetgenen des MLL Proteins sollten auch diejenigen der beiden Derivatproteine MLL.AF-4 und AF-4.MLL identifiziert werden. MLL+/+ Zellen wurden mit den humanen Derivatkonstrukten stabil transfiziert und im Vergleich zur Leervektor-Kontrolle per DNA-Microchips analysiert. Wieder Erwarten wurden keine unterschiedlichen Transkriptionsmuster erhalten. Daraufhin wurden Komplementationsexperimente zur Eignungsüberprüfung des Testsystems durchgeführt. Es stellte sich heraus, dass das humane MLL Expressionskonstrukt die MLL-/- Zellen funktionell nicht komplementieren konnte. Dafür gibt es verschiedene Erklärungsansätze, wobei jedoch die Hypothese, dass das "transkriptionelle Gedächtnis" in den murinen embryonalen Fibroblasten (Entwicklungsstatus Tag 10,5 p.c.), bereits stabil etabliert und nur noch marginal veränderbar ist, die Wahrscheinlichste ist. Sollte sich herausstellen, dass die epigenetische Programmierung der Zellen verantwortlich für die hier erhaltenen Ergebnisse ist, hätte das einen dramatischen Einfluss auf unser Verständnis vom Leukämie-Pathomechanismus. Es würde nämlich bedeuten, dass MLL und davon abgeleitete reziproke Derivatproteine nur in einem engen Zeitfenster Einfluss auf Genexpressionsmuster haben und nach einen "hit and run" Mechanismus die Leukämie auslösen.
In der vorliegenden Arbeit wurden verschiedene Techniken entwickelt, um die Polo-Like Kinase 1 (PLK 1), eine Kinase aus der Familie der hochkonservierten Serin/Threonin-Kinasen in ihrer Funktion zu hemmen. Alle Zellen des Säugetier-Organismus benötigen für ihre Zellteilung PLK1. PLK1 wird vor allem in der G2/M-Phase des Zellzyklus exprimiert und wird in malignen Geweben, verglichen mit normalem, primärem Gewebe überexprimiert. Hier liegt ein differentieller Unterschied zwischen normalem, primärem Gewebe und malignem Tumorgewebe vor, denn in normalem Gewebe sind nur sehr niedrige PLKI -Spiegel vorhanden, so dass eine Krebstherapie, die über die Hemmung von PLKI wirkt, keine bzw. geringe Auswirkungen auf das normale gesunde Gewebe haben sollte. Insgesamt bietet sich PLKI daher als interessantes Ziel für eine molekularbiologisch basierte Krebstherapie an. Die im Rahmen dieser Arbeit angewandten Techniken waren die Antisense-Technologie und die RNA-Interferenz (mittels synthetischer small interfering RNAs [siRNAs]) und rekombinanter Plasmide zur Expression von hairpin-RNAs [shRNAs]). Antisense-Oligonukleotide (ASOs) sind schon seit ca. einem Jahrzehnt im Einsatz, um verschiedene Zellzykluselemente zu hemmen, auch bereits in verschiedenen Phasen der klinischen Prüfung, doch mit PLKI ist erstmals die Hemmung eines späten Elements der Signaltransduktionskaskade, das essentiell für die Mitose ist, gelungen. Hierbei sind die Auswirkungen auf die Zellen wesentlich stärker als bei weiter am Anfang der Signaltransduktionskaskade gelegenen Elementen, bei denen die Zelle noch die Möglichkeit hat, die Hemmung durch alternative parallele Signalwege zu umgehen. siRNAs bzw. shRNA-exprimierende Plasmide sind erstmals zum Einsatz gekommen, um in Mammalia-Zellen die Krebszellproliferation bzw. das Tumorwachstum im humanen Krebs-Xenograft-Modell durch Hemmung eines endogenen Gens zu hemmen. Bei Anwendung der RNA-lnterferenz konnte darüber hinaus ein für die Anwendung am Menschen wichtiger differentieller Unterschied zwischen primären Zellen und Krebszelllinien in vitro beobachtet werden, denn für die Hemmung der Proliferation und für die Reduktion der PLK1-mRNA und des PLK1-Proteins in primären humanen Mammaepithelzellen war eine 350-fach höhere siRNA-Konzentration nötig als in den Krebszelllinien. Die Konzentrationen, mit denen die Krebszellproliferation signifikant gehemmt werden konnte, hatten auf die primären Zellen überhaupt keine Auswirkungen, womit ein Meilenstein auf dem Weg zu einer spezifischen Krebstherapie erreicht werden konnte. Dabei konnten mit allen drei eingesetzten Techniken die PLK1-mRNA- und -Protein-Expression in vitro und die Zellproliferation in vitro gehemmt werden. Das Tumorwachstum konnte mit ASOs und mit den rekombinanten Plasmiden in vivo in Krebs-Xenograft-Modellen an Nacktmäusen erfolgreich gehemmt werden. Mit U6-Promoter-basiert exprimierten shRNAs konnten im humanen Xenograft-Modell auch die Expression der PLK1-mRNA und das PLK 1-Protein reduziert werden. Auf diese Weise kam es zu einem starken Antitumor-Effekt in vivo, der nach Behandlung mit den Expressionsplasmiden vier Wochen über das Ende der Therapie hinaus anhielt. Ausgehend von diesen Daten sollte für beide Techniken - sowohl für die Antisense-Strategie als auch für die RNA-Interferenz mit dem Target PLK1 - über Toxizitätsuntersuchungen und Ausweitung auf weitere Tumormodelle der Weg in die präklinische Phase eingeschlagen werden, um möglichst schnell die Grundlagen für einen Heilversuch oder eine klinische Studie zu schaffen.
Das Thema der vorliegenden Promotion war die Aufklärung von Neutralisationsmechanismen auf Lymphozyten und Makrophagen unterschiedlicher primärer HIV-1-Subtypen im Verlauf der Krankheitsprogression. Ausgangspunkt für die Experimente war die Tatsache, dass humane Seren von HIV-1 infizierten Patienten bereits kurz nach der Serokonversion autologe Virusisolate auf Makrophagen, nicht aber auf Lymphozyten neutralisieren können (Ruppach et al., 2000). Bei Neutralisationsexperimenten mit einem dem V3-loop des gp120 komplementären P1 -Peptids (Subtyp B), sollte der Nachweis von neutralisierenden Antikörpern im Serum erbracht werden. Weiterhin sollte gezeigt werden, inwieweit die Neutralisation auf Makrophagen durch V3-Antikörper begründet ist. Nach erfolgter Neutralisation auf Makrophagen mit und ohne P1-Peptidvorinkubation konnte gezeigt werden, dass es zu keinen Veränderungen im Neutralisationsverhalten durch Vorinkubation mit einem V3-Peptid gekommen war. Daraus ließ sich folgern, dass es nicht die V3-Antikörper sind, die eine Neutralisation auf Makrophagen hervorrufen können. Als nächstes wurde das Neutralisationsverhalten eines frühen lsolates (8 Monate nach der Infektion) und einer späten Folgeprobe (27 Monate nach der Infektion) durch autologes Serum auf Lymphozyten und auf Makrophagen verglichen. Dabei konnte gezeigt werden, dass sowohl Ursprungs- wie auch Folgeisolat auf Makrophagen eine große Neutralisationsaktivität aufweisen, die auf Lymphozyten fehlt. Um besser eingrenzen zu können, welche Antikörper bei Neutralisationsreaktionen auf Makrophagen eine Rolle spielen, wurden Neutralisationsexperimente mit Serumimmunglobulinen eines frühen Isolates durchgeführt. Als Ergebnis konnte festgehalten werden, dass autologe IgG' s auf Makrophagen eine Neutralisationsreaktion herbeiführen können. Weiterhin stellte sich die Frage, ob autologe Immunglobuline in der Lage sind, heterologe Virusisolate zu neutralisieren. Dabei zeigte sich, dass im Test unterschiedlicher Subtypen, es zu einer hohen Kreuzneutralisationsaktivität gekommen war. Zusammenfassend konnte im Verlauf der Promotion erfolgreich dargestellt werden, dass die Serumimmunglobuline für die Neutralisation auf Makrophagen verantwortlich sind und, dass diese heterologe Eigenschaften besitzen.
Die Stat-Proteine (signal transducers and activators of transcription) bilden eine Familie von 7 verschiedenen Signaltranskriptionsfaktoren, die latent im Zytoplasma vorliegen. Sie spielen eine wichtige Rolle bei der Übertragung von zytokin- und wachstumsfaktorvermittelten Signalen von der Zellmembran in den Nukleus. Die Aktivierung der Stat-Proteine ist ein transienter und streng regulierter Signaltransduktionsprozess, dessen Deregulation eine Rolle bei der Krebsentstehung spielt. In verschiedenen Tumorarten werden vor allem konstitutiv aktive Stat3- und Stat5-Proteine gefunden. Stat5 ist das Hauptsignalprotein bei der prolaktinvermittelten Signaltransduktion im Brustgewebe. Neben Stat3 und Stat1 ist vor allem Stat5A maßgeblich an der Entwicklung und Differenzierung (Laktation) des Brustgewebes beteiligt. Bei der Entstehung von Brusttumoren scheint der Prolaktin/JAK/Stat5-Signalweg ebenfalls involviert zu sein. Die Funktion, die Stat5 dabei hat, ist jedoch weitgehend ungeklärt. Eine gezielte, nur Stat5-abhängige Regulation des Zellsystems ist nur schwer zu untersuchen, da Prolaktin noch eine Reihe weiterer Signalkaskaden aktiviert. In dieser Arbeit wird daher mit Hilfe einer konstitutiv aktiven Mutante die Funktion von Stat5A in der Regulation der Proliferation, Migration, Differenzierung und Apoptose, deren Fehlregulation die Transformation zu Tumorzellen bestimmt, untersucht. Es kann gezeigt werden, dass Stat5 multiple Aufgaben in Brustkrebs- und -epithelzellen übernimmt. Einige dieser Funktionen lassen sich mit der Wirkungsweise von Prolaktin korrelieren. In Tumorzellen hat nicht nur Prolaktin, sondern auch die konstitutiv aktive Stat5A-Mutante Einfluss auf die Proliferation und den Zellzyklus. Die Überexpression dieser Mutante führt, ebenso wie die Prolaktinstimulation, zu einer Erhöhung der Proliferationsrate, die im Falle von Prolaktin Cyclin D1 vermittelt ist. Für die konstitutiv aktive Stat5A-Mutante kann keine Regulation einiger am Zellzyklus beteiligter Proteine festgestellt werden. Die Untersuchungen der Zellmobilität dienen als Marker für das Metastasierungspotential. Sowohl in Brusttumor- als auch in -epithelzellen ist die Fähigkeit zur Migration in Zellen mit konstitutiv aktivem Stat5A, oder nach Prolaktinstimulation erhöht. Für die Tumorentstehung zeichnet sich demnach folgendes Bild: Prolaktin und konstitutiv aktives Stat5A erhöhen sowohl die Proliferations- als auch die Migrationsrate von Brustkrebszellen. Zusammenfassung 2 In der nicht transformierten Brustepithelzelllinie HC11 hat die konstitutiv aktive Stat5AMutante eine andere Funktion. Sie wirkt nicht als Mitogen, wie in Tumorzelllinien, sondern ist in Differenzierungsvorgänge involviert. Die konstitutiv aktive Mutante ist in der Lage, die Signaltransduktion in vitro durch Prolaktin und Dexamethason zu ersetzen und unabhängig davon, die ß-Kaseinbildung zu induzieren. In vivo zeigt sich, dass konstitutiv aktives Stat5A in die Kontrolle der Differenzierung des alveolaren Brustepithels involviert ist. Die alveolaren Strukturen bilden sich schon im jungfräulichen Gewebe und nicht erst in trächtigen Mäusen aus. Eine Überexpression der konstitutiv aktiven Stat5A-Mutante führt in HC11 Zellen jedoch nicht nur zu einer Differenzierung der Zellen, sondern ebenfalls zu einem Anstieg der Apoptoserate. Die konstitutiv aktive Stat5A-Mutante induziert die Expression der negativen Regulatoren des JAK/Stat-Signalweges SOCS1 und SOCS3. Diese blockieren die Janus-Kinase 2, welches wiederum eine Deaktivierung von Stat3 zu Folge hat. Als potentieller molekularer Mechanismus für die Förderung der Apoptose kann eine Inhibierung der Bcl-XL-Expression gezeigt werden. Die Ergebnisse zeigen, das Stat5 unterschiedliche Funktionen sowohl bei der Proliferation und Apoptose als auch bei der Differenzierung von Brustepithelzellen hat. Die Funktion von Stat5 auf das Zellgeschehen scheint vom zellulären Kontext und bereits aktivierten Signalwegen abzuhängen.
Die Entwicklung eines Impfstoffes gegen das humane Immundefizienz Virus (HIV-1) erfordert die Aktivierung einer humoralen und zellvermittelten Immunantwort. Diese kann durch lebende attenuierte Viren oder DNA Impfstoffe am besten induziert werden. Im Mittelpunkt der Impfstoffentwicklung steht das HIV-1 Hüllglykoprotein (Env), da es den initialen Kontakt mit der CD4-positiven Zielzelle herstellt. Die hohe Mutationsrate des HIV-1 führt zu Veränderungen des Hüllproteins und erzwingt die Ableitung konservierter Bereiche der nativen, oligomeren Konformation des Proteins. Im ersten Teil dieser Arbeit wurden CD4-gp120 Fusionsproteine hergestellt, die Konformationsänderungen des Hüllglykoproteins nachahmen sollten, wie sie beim Eintritt von HIV in die Wirtszelle entstehen. Eine inhibitorische Wirkung dieser Proteine bei der Infektion von CD4-exprimierenden Zellen, sowie die Bildung neutralisierender Antikörper in immunisierten transgenen CD4+ Mäusen konnten nicht nachgewiesen werden. Der zweite Teil dieser Arbeit beschäftigt sich mit der Entstehung und Charakterisierung replikationskompetenter Viren zur Expression des oligomeren HIV-1 Hüllglykoproteins. Hierfür wurden murine Leukämie Viren (MLV) mit einer verkürzten Variante des HIV-1 Hüllglykoproteins pseudotypisiert. Sämtliche akzessorischen Gene des HIV-1 waren nicht enthalten. Die regulatorische Funktion des akzessorischen Proteins Rev wurde entweder durch die Verwendung eines Introns, durch das posttranskriptionelle Element des "woodchuck hepatitis virus" (WPRE) oder durch Benutzung eines kodonveränderten Hüllproteins ersetzt. Folglich wurden drei unterschiedliche MLV/HIV-1 Pseudotypviren konstruiert. Alle MLV/HIV-1 Pseudotypviren konnten nach Transfektion in 293 T Zellen synthetisiert werden und waren in der Lage CD4- und CXCR4-positive Zielzellen zu infizieren. Die Effizienz der zweiten Infektion war für die Proviren mit WPRE Element und synthetischen Hüllprotein reduziert, obwohl die mRNA-Synthese korrekt erfolgte und die Funktion des akzessorischen Elements Rev erfolgreich ersetzt werden konnte. Das Intron enthaltende MLV/HIV-1 pseudotypisierte Virus zeigte kaum mRNA-Produktion, folglich konnte keine zweite Infektion stattfinden. Replikationskompetente MLV/HIV-1 Pseudotypviren konnten mit keinem Konstrukt erzeugt werden, da Viruspartikel, die aus infizierten Zellen freigesetzt wurden, kaum Hüllprotein enthielten. Verschiedene Faktoren könnten hierbei eine Rolle spielen, unter anderem das zytoplasmatisch auf 7 Aminosäuren verkürzte HIV-1 Hüllglykoprotein selbst, was nur in MT-4 Zellen eine HIV-Replikation erlaubt. Folglich sind für die Herstellung replikationskompetenter MLV/HIV-1 Pseudotypviren Veränderungen am CTerminus des Hüllglykoproteins unausweichlich.
Fest ins Genom integrierte und durch Vererbung (vertikal) weitergegebene endogene Retroviren stellen ein Risiko im Rahmen einer therapeutischen Übertragung von tierischen Zellen, Geweben oder Organen auf den Menschen dar. Bei Verwendung der als Spender bevorzugten Schweine sind zwei Klassen von C-Typ-Retroviren (PERV) bekannt, die zumindest in vitro humane Zellen infizieren können. Deshalb sind eine molekulare Kenntnis und eine genetische bzw. immunologische Kontrolle dieser Viren zur Vermeidung einer potentiellen Infektion von Xenotranplantat-empfängern wünschenswert. Die Analyse einer genomischen Bibliothek des "large white"-Schweins führte zur Charakterisierung von vier nativen proviralen Vollängensequenzen, von denen drei in der Lage sind, auf humanen Zellen zu replizieren, während ein Provirus zwei Stop- Mutationen im Polymerase-Gen trägt. Die Klone PERV-A(Bac-130A12), PERVA( Bac-151B10) und PERV-A(Bac-463H12) gehören zur Klasse A, der Klon PERVB( Bac-192B9) wird der Klasse B zugeordnet. Alle vier Klone weisen hohe Homologien zu bereits beschriebenen Sequenzen (Czauderna et al., 2000; Krach et al., 2001) auf, sind mit diesen jedoch nicht identisch. Die Bestimmung der flankierenden genomischen Sequenzen ermöglicht den spezifischen Nachweis der Proviren in genomischer DNA und zeigt, daß die vom "large white"-Schwein abgeleiteten Sequenzen zur Untersuchung verschiedener Schweinerassen geeignet sind. Desweiteren konnte gezeigt werden, daß die im Klon PERV-B(Bac-192B9) beobachteten Punktmutationen in einigen der untersuchten Individuen revertiert sind. Die Untersuchung von 86 einzelnen Proben aus 5 verschiedenen Rassen zeigt eine sehr heterogene Verteilung der PERV und würde damit eine Züchtung (in Bezug auf replikationskompetente Viren) PERV-freier Schweine ermöglichen. Dies erübrigt sich aber durch die Tatsache, das Miniaturschweine des d/d-Haplotyps für die getesteten Proviren bereits negativ sind. Faßt man die vier hier und die in der Literatur beschriebenen Proviren (Czauderna et al., 2000; Krach et al., 2001) zusammen, scheinen von den etwa 30-50 Integrationsorten im porcinen Genom (LeTissier et al., 1997; Patience et al., 1997) zwischen sechs und zehn replikations-kompetente Proviren zu enthalten. Für den Fall, daß bei einer XTx Partikel freigesetzt werden, geben die Versuche mit den Pseudotypvektoren Hinweise darauf, daß eine Infektion schon nach wenigen Minuten stattfinden kann und damit auch nach einer raschen Entfernung des Organs persistieren könnte. Diese freigesetzten Partikel lassen sich aber durch Antikörper neutralisieren, so daß es möglich erscheint, Patienten sowie deren Ärzte und Kontaktpersonen zu impfen, um einer potentiellen Infektion vorzubeugen. Darüber hinaus scheinen die phylogenetisch jüngeren Viren mit der "repeat"-losen LTR die Fähigkeit verloren zu haben, xenotrop Zellen zu infizieren, da Proviren mit dieser LTR-Struktur weder aus einer 293-PERV-PK-Bibliothek isoliert werden konnten (Czauderna et al., 2000), noch konnten solche Elemente in genomischer DNA dieser Zellinie nachgewiesen werden. Mit der Untersuchung des Infektionsverhaltens von PERV und durch die Möglichkeit, in der XTx verwendete Schweine auf die Präsenz replikations-kompetenter PERV hin zu testen und die chromosomal lokalisierten Proviren eventuell durch Züchtung zu entfernen, leistet die vorliegende Arbeit einen Beitrag dazu, zukünftige Xenotransplantationen in virologischer Hinsicht sicherer zu machen.
Die Immobilisierung ist eine wichtige Ursache von Knochenverlusten. Viele Autoren haben über eine erhebliche Abnahme der Knochenmasse nach Frakturen der langen Röhrenknochen berichtet, die nicht nur die Frakturstelle, sondern auch deren Nachbarschaft betrifft. Angegeben wurden Substanzverluste von bis zu 50 % sowohl proximal als auch distal der Frakturstelle. Im Erwachsenenalter kommt es über einen Zeitraum von mehreren Jahren zu einer partiellen Wiederherstellung der Knochenmasse, die allerdings auch ausbleiben kann. Untersuchungen nach Radiusfrakturen wurden bisher qualitativ mittels nativer Röntgendiagnostik durchgeführt. Die Verlaufsbeobachtung mittels DEXA ermöglicht die quantitative Bestimmung der Knochendichte und Lokalisation der ersten, bzw. stärksten Atrophie im Handskelett. Da bisher für die Früherkennung einer Heilentgleisung im Stadium I lediglich die mehr oder weniger stark ausgeprägten klinischen Symptome einen Anhalt bieten, wäre die Feststellung eines quantitativen Schwellenwertes mit einer hohen Genauigkeit eine Bereicherung für Definition, Früherkennung und Therapiekontrolle einer Heilentgleisung, bzw. Algodystrophie. Um einen vergleichenden Bezug herstellen zu können, wird die Kenntnis des "physiologischen" Knochenmineralsalzgehaltes entsprechend der Händigkeit vorausgesetzt. Um letzteres zu eruieren soll die Studie dienen. Ferner soll ein objektives und sensitives Maß für die Beurteilung des Ausmaßes einer seitendifferenten Bemuskelung, z. B. im Gutachtenwesen, erarbeitet werden. Die primären Zielvariablen sind die Knochendichte der Hände sowie die Muskel-, Mineral- und Fettmasse der oberen Extremitäten absolut und relativ zur dominanten Seite. Anhand dieser Variablen soll das Ausmaß der "physiologischen" Gewichtung durch die Händigkeit bestimmt werden und Berücksichtigung finden bei der Beurteilung fraglicher "pathologischer" Entmineralisierung, bzw. Muskelatrophie einer Seite. Die Knochendichte und der Knochenmineralgehalt der Hand sowie die Ganzkörpergewebszusammensetzung wurden mittels DEXA (Dual X-Ray Absorptiometry) ermittelt. 114 gesunde weiße Frauen und Männer ohne Verletzungen der oberen Extremität nach der Pubertät im Alter zwischen 20 und 82 Jahren, davon 19 Links- und 95 Rechtshänder, erhielten Scans beider Hände sowie des ganzen Körpers. Durch Serien- und Doppelbestimmungen wurde die Präzision der Knochendichtemessungen kontrolliert. Es zeigte sich ein Variationskoeffizient von 0,3 % bis 0,8 % in Abhängigkeit von der ROI-Position. Das verwendete DEXA-Gerät ist also in der Lage, die Knochendichte mit hoher Präzision zu bestimmen. Wir konnten in unserer Studie signifikante Differenzen zwischen beiden Armen, bzw. Händen bei Normalpersonen nachweisen. Die prozentualen Unterschiede zwischen dominantem und nicht dominantem Arm liegen für die BMD (Knochendichte) bei insgesamt 2,7%, für die BMC (Knochenmineralgehalt) bei 7,4%, für die Muskelmasse bei 11,5% und für das Absolutgewicht (BMC + Muskelmasse + Fettmasse) beider Arme bei 8,3%. Der prozentuale Fettgehalt war dabei im dominanten Arm durchschnittlich 2,3% niedriger als im kontralateralen Arm. Kein Unterschied zwischen beiden Armen konnte beim absoluten Fettgehalt gefunden werden. Ebenfalls signifikante Abweichungen bestehen für BMD und BMC beider Hände. Der mittlere prozentuale Unterschied liegt hierbei für die BMD bei 3,8% und für die BMC bei 5,9% . Bei Linkshändern sind jedoch im Unterschied zu Rechtshändern alle Mittelwerte im nicht dominanten, rechten Arm höher als im dominanten Arm - mit Ausnahme des absoluten und prozentualen Fettgehalts, wo das Gegenteil gilt. Diese Unterschiede sind für die BMC mit 4,8 %, die Muskelmasse mit 6,7 % sowie den absoluten und prozentualen Fettgehalt mit 9,4 % und 3,2 % signifikant. Keine signifikante Differenz bei Linkshändern besteht für die BMD und das Gesamtgewicht des Armes. Die Hände betreffend zeigen Linkshänder im Gegensatz zu Rechtshändern keinerlei signifikante Abweichung. Die geschlechtsspezifischen Unterschiede betrachtend, verlieren Frauen bereits mit Eintritt in die Menopause kontinuierlich an Knochenmasse in Armen und Händen, wohingegen bei den männlichen Individuen ein Anstieg von BMD und BMC bis zum 69. Lebensjahr zu verzeichnen ist. Erst danach kommt es zu einer signifikanten Abnahme, die jedoch geringer ausgeprägt ist als bei den weiblichen Personen. Der Unterschied zwischen beiden Geschlechtern beläuft sich für die BMD der Arme auf insgesamt 17% und für die BMC auf 36%. Die Hände betreffend sind die Differenzen zwischen männlichen und weiblichen Personen etwa um ein Drittel niedriger und betragen 11% für die Knochendichte und 28% für den Knochenmineralgehalt. Postmenopausale Frauen haben im Durchschnitt in den Armen und in den Händen ca. 10% weniger Knochenmasse als premenopausale Frauen. Männliche Personen haben im dominanten Arm insgesamt 39% und im nicht dominanten Arm 42% mehr Muskelmasse als Frauen. Der Fettgehalt in beiden Armen ist bei Männern ca. 21% niedriger als bei Frauen. Die Knochendichte der Hände kann auch zur Abschätzung der systemischen Mineralisierung herangezogen werden. So besteht eine positive signifikante Korrelation zwischen der BMD der Hand einerseits und der des gesamten Körpers (r = 0,62) sowie dem T-Score whole body (r = 0,78) als Maß der systemischen Mineralisierung. Auch BMD von Hand und gleichseitigem Arm korrelieren gut miteinander (r = 0,72), ebenso die Knochendichte der Arme einerseits und die Muskelmasse (r = 0,72) des gleichseitigen Armes, das Körpergewicht (r = 0,49) und die Körpergröße (r = 0,54) andererseits. Eine negative signifikante Korrelation konnte unter anderem nachgewiesen werden zwischen der BMD der Arme und ihrem prozentualen Fettgehalt (r = -0,71). Diesen Ergebnissen zufolge ist also von einem geringen, aber signifikanten Unterschied bei der Knochendichte, dem Knochenmineralgehalt und der "body composition" (Gewebszusammensetzung) zwischen beiden Armen und Händen - mit Ausnahme des absoluten Fettgehalts - bei Rechtshändern auszugehen. Bei Linkshändern dagegen liegt keine reine Linkshändigkeit vor.
Die Verwendung von Fettemulsionen mit ausschließlich langkettigen Triglyceriden (LCT) und dadurch hohem Anteil an mehrfach ungesättigten Fettsäuren zur parenteralen Ernährung kann zu Veränderungen in der Fettsäurezusammensetzung von Phospholipiden mit entsprechenden Effekten auf die Metaboliten der Arachidonsäure und der Zellmembranen führen. Die Eliminationsgeschwindigkeit mittelkettiger Triglyceride (MCT) soll nach parenteraler Gabe schneller sein als die von langkettigen Triglyceriden. Nach Infusion gleicher Fettmengen an MCT werden niedrigere Triglyceridwerte gemessen als nach LCT-Gabe. In der vorliegenden Arbeit wurden Elimination und Stoffwechseleffekte verschiedener MCT/LCT-Mischemulsionen im Rahmen einer klinischen Prüfung der Phase 1 untersucht. Dazu wurden stoffwechselgesunden männlichen Probanden zwei neu entwickelte 20%ige Fettemulsionen der Firma Laevosan (Lipidol MCT 1/2 mit 50% und Lipidol MCT 1/3 mit 33% MCT-Anteil) in unterschiedlichen Dosierungen infundiert. Es wurden folgende Versuchsansätze verwendet: 10 g Fett als Bolus in 3 Minuten, eine Kurzinfusion von 50 g Fett in 30 Minuten, eine 12 stündige Dauerinfusion mit 0,1 g Fett/kg KG/h und eine hochdosierte Dauerinfusion über 8 Stunden mit 0,25 g Fett/kg KG/h. Die an Versuchspersonen vorgenommenen Untersuchungen wurden durch tierexperimentelle Leberperfusionen ergänzt. Die Umsatzkapazität für die beiden Fettemulsionen mit Zusatz von MCT lag im gleichen Bereich wie die Umsatzkapazität für vergleichbar zusammengesetzte Fettemulsionen. Die Halbwertszeiten für die Elimination der Triglyceride betrugen 15,1 Minuten für MCT 1/2 20% und 27,9 Minuten für MCT 1/3 20% nach Bolusapplikation von 10 g Fett. Nach Kurzinfusion von 50 g Fett lagen die Eliminationshalbwertszeiten bei 46,2 Minuten für MCT 1/2 20% und bei 54.6 Minuten für MCT 1/3 20%. Unter niedrig dosierter Dauerinfusion (0,1 g Fett/kg KG/h) wurde ein Fließgleichgewicht erreicht. Hingegen erwies sich die höhere Dosierung von 0,25 g Fett/kg KG/h als überdosiert, der stetige Anstieg der Triglyceridkonzentration während der 8stündigen Infusion zeigte an, dass mit dieser Dosierung kein Fließgleichgewicht mehr zu erreichen war. Damit war die Eliminationskapazität für die untersuchten Emulsionen bei dieser Dosierung ebenso wie bei Emulsionen mit reinem LCT-Anteil überschritten. Der Zusatz von MCT hat dementsprechend nicht zu einer Erhöhung der Umsatzkapazität für Fettemulsionen geführt. Der erhebliche Anstieg der Fettsäurekonzentrationen während und nach Applikation der Fettemulsionen ist Ausdruck der raschen Hydrolyse der Triglyceride. Die gaschromatographische Differenzierung der Fettsäurekonzentrationen im Serum ergab, dass der Anstieg der Fettsäuren insbesondere auf das Verhalten der mittelkettigen Fettsäuren zurückzuführen war. Sowohl unter hochdosierter Kurzinfusion von 50 g Fett (= 0,625 g-0,667 g Fett/kg Kg bezogen auf das durchschnittliche Probandengewicht) als auch unter hochdosierter Dauerinfusion von 0,25 g Fett/kg KG/h erfolgte dementsprechend mit beiden Fettemulsionen ein Anstieg der Konzentrationen der freien mittelkettigen Fettsäuren (Capryl- und Caprinsäure) auf außerordentlich hohe Werte, wie sie unter physiologischen Bedingungen kaum jemals gemessen werden (5,2 mmol/l mit MCT 1/3 20% und 5,5 mmol/l mit MCT 1/2 20% nach 50 g Fett, 2,4 mmol/l mit MCT 1/3 20% und 3,6 mmol/l mit MCT 1/2 20% unter 0.25 g Fett/kg KG/h). Von einigen der Probanden wurde deutliche Übelkeit als Nebenwirkung der hochdosierten Fettemulsion angegeben. Erwartungsgemäß kam es mit beiden MCT-haltigen Fettinfusionen neben einem Anstieg der Konzentration der freien Fettsäuren auch zu einer deutlichen Erhöhung der Konzentration der Ketonkörper. Der Anstieg war deutlich höher, wenn der Anteil an MCT erhöht war. Außerdem war der Ketonkörperanstieg vor allem unter den beiden hohen Dosierungen bei Verwendung der Emulsion mit dem höheren Anteil an MCT deutlich stärker ausgeprägt als bei der anderen Emulsion mit dem niedrigeren Anteil an MCT. Es wurden dabei nach Kurzinfusion von 50 g Fett Konzentrationen (berechnet als Gesamtsumme an ß-Hydroxybutyrat und Acetoacetat) von lediglich 7,7 mg/dl mit MCT 1/3 20% im Vergleich zu 11,2 mg/dl mit MCT 1/2 20% erreicht. Unter Gabe von 0,25 g Fett/kg KG/h stieg die Gesamtketonkörperkonzentration mit MCT 1/3 20% auf 8,4 mg/dl während es auch hier mit MCT 1/2 20% zu einem höheren Anstieg auf 12,1 mg/dl kam. Auch in der isoliert perfundierten Rattenleber erfolgte ein rascher Umsatz der in den Fettemulsionen enthaltenen Triglyceride. Dabei kam es zu einer extrem schnellen und vor allem nahezu vollständigen Elimination bevorzugt von mittelkettigen Fettsäuren. Dies führte zu erheblichen Anstiegen des ß-Hydroxybutyrats und Acetoacetats, mit beiden Fettemulsionen bis auf Ketonkörperkonzentrationen um 100 mg/dl. Dies entsprach prozentualen Anstiegen von 645,6-750.5 % für ß-Hydroxybutyrat und von 1099,6-1194,8 % für Acetoacetat. Die Glycerin-Konzentration blieb während der Perfusionen niedrig, dies bedeutete, dass das bei der Hydrolyse der Triglyceride gebildete freie Glycerin in der Leber rasch umgesetzt wurde. Bei einer starken Anflutung von freien mittelkettigen Fettsäuren in der Leberzelle zeigte sich, dass es neben der ß-Oxidation vor allein auch zu einer gesteigerten Lipogenese kam. Die in den geprüften Fettemulsionen enthaltenen MCT wurden ebenso wie langkettige Triglyceride rasch hydrolysiert, wie die hohe Konzentration an mittelkettigen Fettsäuren im Serum aufwies. Die Ursache für die hohe Konzentration der mittelkettigen Fettsäuren könnte sein, dass auch die durch Hydrolyse im peripheren Bereich entstandenen mittelkettigen Fettsäuren vorwiegend über die Leber eliminiert werden. Der Anteil der Leber an der Elimination und am Metabolismus der mittelkettigen Fettsäuren ist aus dem Anstieg der Ketonkörper zu erkennen. Diese Beziehung ist bei der Wertung der im Experiment mit der isoliert perfundierten Rattenleber erhobenen Ergebnisse besonders gut zu erkennen. Es konnten keine Anhaltspunkte dafür gefunden werden, dass die Ergänzung von Sojaöl durch MCT in Fettemulsionen zu einer Steigerung des Umsatzes der infundierten Triglyceride führt. Zu beachten wären allerdings die hohen Konzentrationen vor allem an freien mittelkettigen Fettsäuren, die während der Infusion von MCT-haltigen Emulsionen zu messen sind. Da für diese Messung Spezialmethoden erforderlich sind, sind derartige Bestimmungen bei Routineanwendung allerdings nicht möglich.
In der Tagesklinik der Sozialpsychiatrie der Uniklinik Frankfurt am Main wurde eine auf die Körpersprache bezogene Tanztherapie über zehn Wochen angeboten. 31 Probanden nahmen an der Studie teil. Das Alter und das Geschlecht aller Probanden, sowie die Diagnosen der Patienten waren vergleichbar. 18 von 23 Patienten waren an einer Schizophrenie erkrankt, die zur Zeit der Untersuchung nicht produktiv war. Das Durchschnittsalter der Probanden lag bei 26,03 + / - 7,42 Jahren. 16 Frauen und 15 Männer nahmen an der Untersuchung teil. Eine ausreichende Konzentrationsfähigkeit und verbale Kommunikationsfähigkeit der Probanden war gegeben. Die Probanden in den jeweiligen Gruppen kannten sich untereinander und wurden in drei Gruppen aufgeteilt. Es gab zwei Patientengruppen (9 bzw. 12 Patienten), die sich von der Tagesklinik her kannten, und eine gesunde Kontrollgruppe (10 Probanden), die sich aus Medizinstudenten zusammensetzte. Zehn Wochen dauerte die Studie. Pro Woche fand pro Gruppe je eine einstündige Tanztherapie über Körpersprache statt. Die Uhrzeit, der Tag und der Ort (Kapelle) der Untersuchung waren festgelegt. Im Verlauf der Therapie sollte die Körpersprache des gesamten Körpers besprochen und ausgeübt werden. Die Hauptthemen der Therapiestunden waren: 1.) das Gehen, 2.) die Arme, 3.) die Schultern, 4.) die Hände, 5.) der Kopf, 6.) das Becken, 7.) der Brustkorb / der Bauch, 8.) Bein- und Kniestellungen, 9.) Standmöglichkeiten, 10.) der ganze Körper. Die Tanztherapie über Körpersprache verlief nach dem folgenden Schema: 1.) Nach Ausfüllen der Befindlichkeits-Skalen (A - Version (Bf-S)) begann die Stunde mit rhythmischen Aufwärmübungen. Vorgegebene Rhythmen wurden passend zur Musik geklatscht, gestampft oder gegangen. 2.) Danach wurde über die Ausdruckskraft eines bestimmten Körperteils gesprochen. Körpersprachliche Vorschläge der Teilnehmer wurden ausgeübt und passend zur Musik tänzerisch wiederholt. 3.) Das Ausdrucksvermögen eines weiteren Körperteils, welches in der vorherigen Stunde besprochen wurde, sollte nochmals erörtert werden. (Die Wiederholung von Therapiethemen sollte den Lerneffekt steigern.) 4.) Am Ende der Stunde wurden die erarbeiteten Themen tänzerisch wiederholt. Dann wurden wieder die Befindlichkeits-Skalen (B - Version (Bf-S')) ausgefüllt. Für die körpersprachlich orientierte Tanztherapie wurden neun Musikstücke ausgesucht. Da Popmusik von 20 - 30-Jährigen gerne gehört wird und in diesem Alter oft zu dieser Musik getanzt wird, wurde sie in der Studie verwendet: Visitor (Koto), This is your life (Banderas), Only you (C., H. Project), You (Ten Sharp), Cantaloop (US 3), Queen of the night (W. Houston), All that she wants (Ace of Base), Colour of love (Snap), I will always love you (W. Houston) Das Ziel der Tanztherapie über Körpersprache ist, innerhalb der psychiatrischen Rehabilitation psychisch Kranker ein unterstützendes Medium zu schaffen, welches die soziale Reintegration dieses Klientels durch körpersprachliche Erkenntnisse erleichtert und stimmungshebend wirkt. In dieser Dissertation wurden mehrere Studien zitiert, die darauf hinweisen, daß Menschen an Selbstbewußtsein, Beliebtheit und Akzeptanz gewinnen, wenn sie eine lebendige Körpersprache beherrschen. (Rimè, 1991; Dyansky, 1973 - 74) Ein stärkeres Bewußtsein für die Ausdruckskraft des eigenen Körpers könnte demnach den Patienten rehabilitativ bei der Arbeit, bei Vorstellungsgesprächen, bei Bekanntschaften und generell im sozialen Bereich helfen. Lange Aufenthalte in der Psychiatrie, das abrupte Verlassen des Arbeitsplatzes und des sozialen Umfeldes, die durch die Schizophrenie und die Psychopharmaka bedingten Residuen und Nebenwirkungen, die sich oft motorisch und psychisch niederschlagen, begründen weitere wissenschaftlich fundierte, therapeutische Maßnahmen. Psychisch kranke Patienten leiden an depressiven Verstimmungen. Es konnte nachgewiesen werden, daß Musik- aber auch Tanztherapien die Befindlichkeit der Probanden positiv beeinflussen. Das bloße Anhören von Musik kann die Stimmung des Zuhörers heben. (Leuwer, 1982; Pieschl, 1974) Das Verwenden von beschwingter, schneller Musik in der körpersprachlich orientierten Tanztherapie sollte demnach die Befindlichkeit der Probanden positiv beeinflussen. Welchen Einfluß die Tanztherapie auf das Befinden und auf das motorische Verhalten der Probanden hat, wurde mit den "Befindlichkeits-Skalen nach ZERSSEN" und der "Checkliste Motorischer Verhaltensweisen nach SCHILLING" untersucht. Videoaufnahmen standen als objektives Anschauungsmaterial zur Verfügung. Testverfahren, wie die Varianzanalyse, die deskriptiven Statistiken, der t-Test und die Faktorenanalyse wurden verwendet. Signifikante Ergebnisse konnten im Sinne eines deskriptiven Stellenwertes interpretiert werden. Zudem wurde zwischen den Begriffen "tendenziell signifikant" (p < 0,10 > 0,05), "signifikant" (p < 0,05) und "hochsignifikant" (p < 0,01) unterschieden, um auch auf schwache Veränderungen hinweisen zu können. Die folgenden Fragen stellten sich: 1. Wirkt sich eine körpersprachlich orientierte Tanztherapie, die als geschaffenes Instrumentarium für verschiedene Gruppen gleichgehalten und angeboten wird, negativ oder positiv auf das Befinden der Probanden aus? 2. Weisen videotechnisch erfaßte, körpersprachliche Ausdrucksformen auf eine Verbesserung bzw. Harmonisierung des Ausdrucksverhaltens bei den Untersuchten hin? 3. Unterscheiden sich die Untersuchungsergebnisse der Patientengruppen von denen der gesunden Kontrollgruppe in bezug auf die Motorik und in bezug auf die erfaßte Befindlichkeit? Mit den "Befindlichkeits-Skalen nach ZERSSEN" können Befindlichkeitsveränderungen bei gesunden und kranken Probanden dargestellt werden. Sie bestehen aus zwei miteinander hoch korrelierenden Skalen mit je 28 Adjektiv-Gegensatzpaaren. Jeder Teilnehmer füllte am Anfang und am Ende der Tanztherapie diese Skalen aus, indem er pro Adjektiv entweder "trifft zu", "trifft nicht zu" oder "weder noch" ankreuzte. Diese Ergebnisse wurden so codiert, daß negativ belegte Adjektive zwei Punkte, "weder noch" einen Punkt und positive Adjektive keinen Punkt bekamen. Die Summe der Punktzahlen variiert zwischen 0 und 56. Niedrige Werte deuten auf ein gutes und hohe Werte auf ein schlechtes Befinden der Probanden hin. In ähnlichen Untersuchungen von Musik- oder Tanztherapien stellte sich heraus, daß das Befinden der Patienten innerhalb einer Therapiestunde etwas schwächer positiv wurde als bei den gesunden Probanden. (Pieschl, 1974; Hartmann, 1989; Leuwer, 1982) Erste Fragestellung: Wirkt sich eine körpersprachlich orientierte Tanztherapie negativ oder positiv auf das Befinden der Probanden aus? Die Befindlichkeit der Probanden verbesserte sich innerhalb einer körpersprachlich orientierten Tanztherapiestunde. In 25 von 30 Fällen wiesen die Mittelwerte auf positive Veränderungen der Befindlichkeit hin. In einem Fall blieb das Befinden gleich und viermal verschlechterte es sich. Ähnliche Entwicklungen ließen sich varianzanalytisch durch eine gruppenübergreifende Betrachtung der Ergebnisse pro Stundenereignis in 8 von 10 Fällen signifikant bzw. tendenziell signifikant darstellen. Nicht signifikant waren hier die Veränderungen der Befindlichkeit in der 2. Stunde. Ein solcher Trend wurde in der 10. Stunde erkannt. Am zweiten und zehnten Untersuchungstag wurden Videoaufnahmen gemacht. Die Probanden waren, entsprechend den Beobachtungen des Untersuchers, an diesen Tagen befangener. Dritte Fragestellung: Wie unterscheiden sich die Untersuchungsergebnisse der Patientengruppen von denen der gesunden Kontrollgruppe in bezug auf die Befindlichkeit? Die Befindlichkeitsveränderungen waren bei den Patienten schwächer als bei der Kontrollgruppe. Diese Ergebnisse waren bei der gesunden Kontrollgruppe groß genug, um im t-Tests in sechs Fällen signifikant zu werden. In der 2. - 6. und 10. Stunde verbesserte sich die Befindlichkeit der gesunden Gruppe signifikant (p < 0,05). Bei der zweiten Patientengruppe gab es Tendenzen für eine Verbesserung des Befindens in der 5. Stunde (p = 0,01). Dieses Ergebnis wurde in der 3. und 8. Stunde knapp verfehlt. Ein Trend zur Befindlichkeitsverbesserung ließ sich bei der ersten Patientengruppe in der 8. und 9. Stunde darstellen. Eine Verschlechterung des Befindens war bei den Patienten anhand des t-Tests nicht zu erkennen. Mit der "Checkliste Motorischer Verhaltensweisen (CMV) nach SCHILLING" sollten Veränderungen des motorischen Verhaltens bzw. der Körpersprache eines jeden Probanden, dargestellt werden. Die aus 78 Adjektiven bestehende Checkliste wurde mit Hilfe von Videoaufnahmen pro Proband zu Beginn und am Ende der zweiten und zehnten Tanztherapiestunde vom Untersucher ausgefüllt. Anhand der Erinnerungen des Untersuchers wurden in SCHILLINGS und auch in diesem Testverfahren die motorischen Veränderungen innerhalb der Therapiestunden prä- und posttherapeutisch eingeschätzt (globale Einschätzung). Beim Ausfüllen von CMV hatte man pro Adjektiv zwei Möglichkeiten zum Ankreuzen, die wie folgt kodiert wurden: "trifft zu = 1 Punkt" oder "trifft nicht zu = 0 Punkte". SCHILLING standardisierte CMV faktorenanalytisch für lernbehinderte und psychomotorisch gestörte Kinder. Da bei dieser Studie mit Erwachsenen gearbeitet wurde, mußten neue Faktoren ermittelt werden. Mittels einer Faktorenanalyse wurden die Adjektive auf acht Faktoren reduziert: "fließend, unkoordiniert, hyperkinetisch, präsent, holprig, abwesend, unbeholfen und agil". Sie dienten als Überbegriffe für die typischen motorischen Verhaltensweisen der Teilnehmer. Einige Faktoren ähnelten zufälligerweise denen von SCHILLING. In der Zukunft wäre es interessant, die "Checkliste Motorischer Verhaltensweisen" für das psychiatrische Klientel zu standardisieren, um die körpersprachlichen Effekte einer Tanztherapie routinemäßig untersuchen zu können. Zweite Fragestellung: Weisen videotechnisch erfaßte, körpersprachliche Ausdrucksformen auf eine Verbesserung bzw. Harmonisierung des Ausdrucksverhaltens bei den Untersuchten hin? Dank der Videoaufnahmen sind das motorische Verhalten der Teilnehmer und die motorischen Veränderungen dieser Studie jederzeit objektiv darstellbar. Den Patienten wurde angeboten, sich die Aufnahmen freiwillig anzusehen. Sie bekamen die Möglichkeit, das eigene motorische Verhalten einzuschätzen, daraus zu lernen und darüber zu sprechen. Viele Probanden gaben an, daß sie durch die Aufnahmen ihr motorisches Verhalten erst richtig wahrgenommen hätten und von den Anregungen der Tanztherapie profitieren würden. Mit Hilfe der Videoaufnahmen konnte der Untersucher zudem die "Checkliste Motorischer Verhaltensweisen" ausfüllen. Die motorischen Veränderungen der Probanden konnten mit der "Checkliste Motorischer Verhaltensweisen" statistisch im t-Test, in Varianzanalysen, durch Mittelwerte und mit Hilfe von Videoaufnahmen ermittelt werden. Mit fünf Ausnahmen wiesen alle Mittelwerte auf positive motorische Veränderungen hin (keine Veränderung: "präsent": 2. Patienten, Erinnerung; "agil": 2. Patienten, 1. Film; Verschlechterung: "unkoordiniert": 2. Film, 2. Patienten; "abwesend":1./2. Patienten, Erinnerung). Signifikant bzw. tendenziell signifikant waren die Ergebnisse in folgenden Fällen: Kontrollgruppe: 17 / 24; 1. Patientengruppe: 19 / 24; 2. Patientengruppe: 20 / 24. Bei der gruppenübergreifenden Varianzanalyse waren alle Ergebnisse, außer dem Faktor "hyperkinetisch" (2. Film), signifikant. Die Richtung der Veränderungen war fast immer identisch. Die Mittelwerte wiesen mit fünf Ausnahmen bei allen Gruppen auf motorische Verbesserungen hin. Dritte Fragestellung: Wie unterscheiden sich die Untersuchungsergebnisse der Patientengruppen von denen der gesunden Kontrollgruppe in bezug auf die Motorik? Anhand der deskriptiven Statistiken, der Vielzahl der signifikanten Ergebnisse des t-Tests und der Varianzanalyse war zu erkennen, daß sich die Patienten zu Beginn der Stunde schlechter und am Ende der Stunde signifikant besser bewegten als die Kontrollgruppe. Im ersten Videofilm veränderte sich die Motorik der Kontrollgruppe in 7 von 8 Fällen so stark, daß die dargestellten, motorischen Veränderungen im t-Test signifikant oder tendenziell signifikant wurden. "Fließendere, präsentere und agilere und weniger unkoordinierte, holprige, tendenziell abwesende" Bewegungen waren zu beobachten. Die Ergebnisse des zweiten Videofilms und "der Erinnerung nach" waren weniger häufig bzw. in 5 von 8 Fällen signifikant. Dies mag durch den Lerneffekt im Verlauf der Therapie bedingt sein. Im zweiten Videofilm wurde sich tendenziell "fließender, agiler, weniger unkoordiniert und signifikant weniger abwesend bzw. unbeholfen" bewegt. "Der Erinnerung nach" waren die Bewegungen tendenziell "fließender, präsenter, agiler, weniger abwesend und signifikant weniger unbeholfen". Keine signifikanten Veränderungen waren aufzuweisen beim Faktor "hyperkinetisch", mit je einer Ausnahme bei den Faktoren "unkoordiniert und präsent" und zweimal bei dem Faktor "holprig". Die Kontrollgruppe erreichte von allen Gruppen am wenigsten den signifikanten Bereich. Im t-Test veränderten sich bei der ersten Patientengruppe alle Faktorenladungen "der Erinnerung nach" stark genug, um im t-Test signifikant bzw. bei "agil" tendenziell signifikant zu werden. Dies spiegelt sich auch an der Höhe der Mittelwertdifferenzen wider. Im ersten Videofilm sind in 6 von 8 Fällen die Faktoren signifikant "präsent, agil und weniger unkoordiniert, holprig, abwesend, unbeholfen und tendenziell weniger unbeholfen." Die Faktoren "fließend und agil" verfehlen knapp den tendenziell signifikanten Bereich. Im zweiten Videofilm sind die Faktoren in 5 von 8 Fällen signifikant. Nicht signifikant wurden die Faktoren: "hyperkinetisch, abwesend und agil." Bei der zweiten Patientengruppe veränderten sich alle Faktorenladungen "der Erinnerung nach" bzw. im ersten Videofilm stark genug, um signifikant zu werden. Nur der Faktor "agil" wurde tendenziell bzw. gar nicht signifikant. Im zweiten Videofilm war eine Veränderung der Ergebnisse zu erkennen. Hier sind 5 von 8 Fällen signifikant ("fließend") bzw. tendenziell signifikant ("unkoordiniert, präsent, holprig, unbeholfen"). Nur der Faktor "fließend" erreichte eine Irrtumswahrscheinlichkeit < 0,05. Keine Veränderungen waren bei "hyperkinetischen, abwesenden und agilen" Bewegungen zu erkennen. Die Abnahme von nachweisbaren, motorischen Veränderungen im Verlauf der zehn Tanztherapiestunden kann durch Lern- und Gewöhnungseffekte bedingt sein. Die motorischen Veränderungen waren zu Beginn der Therapie am stärksten. Die Gruppen unterschieden sich voneinander bei der varianzanalytischen Untersuchung in 7 von 24 Fällen motorisch signifikant bzw. tendenziell signifikant: "fließend (2. Film), unkoordiniert (2. Film), unbeholfen (1. Film), holprig (alle Untersuchungsformen) und präsent (2. Film)". Varianzanalytisch waren Gruppenunterschiede hauptsächlich anhand des zweiten Videofilms zu beobachten. In der zweiten Videoaufnahme wurden die motorischen Veränderungen, besonders bei der zweiten Patientengruppe, weniger häufig signifikant bzw. eher tendenziell signifikant. Nicht signifikant wurden bei allen Gruppen die Faktoren "hyperkinetisch, abwesend und agil" und bei der Kontrollgruppe zusätzlich "präsent und holprig". Zudem unterschieden sich auch die Patientengruppen voneinander durch ihre kognitiven und motorischen Fähigkeiten, was sich durch die aktive Teilnahme und den Ideenreichtum der jeweiligen Gruppe bemerkbar machte. Zusammenfassend kann man sagen: 1.) Bei allen Gruppen ist ein Trend zur Verbesserung der Befindlichkeit durch die Mittelwerte zu erkennen. Varianzanalytisch läßt sich dies signifikant nachweisen. Die Gruppen reagieren mit wenigen Ausnahmen vergleichbar auf die Therapie. Die körpersprachlich orientierte Tanztherapie hat einen stärkeren, positiven, signifikanten Einfluß auf die Befindlichkeit der Gesunden als auf die Kranken. Eine deutliche, negative Beeinflussung des Befindens ist nicht signifikant darstellbar. Patienten, die an einer Schizophrenie erkranken und häufig an depressiven Verstimmungen leiden, verbessern ihr Befinden im Verlauf der körpersprachlich orientierten Tanztherapie leicht. Die Patientengruppen unterscheiden sich durch ihre kognitiven und motorischen Fähigkeiten. 2.) Die Körpersprache der Probanden verbessert sich mehrheitlich im Verlauf der körpersprachlich orientierten Tanztherapiestunde. Die signifikanten Veränderungen nehmen von der ersten zur zweiten Videoaufnahme ab. Durch Videoaufnahmen kann dies dargestellt werden. 3.) Statistisch gesehen profitieren die Patienten motorisch mehr von der Therapie als die gesunde Kontrollgruppe. Varianzanalytisch lassen sich diese Unterschiede vereinzelt nachweisen. Die Tanztherapie über Körpersprache fördert innerhalb der Therapiestunde die motorischen Fähigkeiten der Teilnehmer. Die Richtung der motorischen und emotionalen Veränderungen im Verlauf der Therapie ist bei den Gruppen gleich. Musik- und Tanztherapien haben positive Auswirkungen auf das Befinden der Probanden. Dies ließ sich durch PIESCHL (1974), LEUWER (1982) und HARTMANN (1989) in Musik- und Tanztherapien wissenschaftlich darstellen. Deshalb ist die Verwendung von Musik und Tanz in einer Therapie empfehlenswert. Die schizophrenen Kranken leiden häufig an depressiven Verstimmungen. Eine Aufhellung des Befindens innerhalb einer Therapie ist wünschenswert. Die Tanztherapie über Körpersprache beeinflußt die Befindlichkeit und die Motorik positiv. Diese Therapie sollte man weiterhin in rehabilitativen Bereichen der Psychiatrie anbieten. Inwiefern die Studienergebnisse auch außerhalb der Therapie noch nachweisbar sind, wäre in weiteren Untersuchungen zu erforschen. In einigen wissenschaftlichen Arbeiten wird daraufhingewiesen, daß die Beherrschung der Körpersprache einen nicht unterschätzbaren Einfluß auf das soziale Leben und die Kommunikation der Menschen hat. (Ekman, 1972; Feldman, 1992; Knapp, 1992; Rimé, 1991) Beobachtungen des Untersuchers zeigten, daß Patienten, die nach längerer Pause wieder an der körpersprachlich orientierten Tanztherapie teilnahmen, den neu aufgenommenen Patienten körpersprachlich gegenüber überlegen waren. Motorische Verbesserungen wurden bei der Ausübung von der körpersprachlich orientierten Tanztherapie, trotz der durch die Krankheit und die Psychopharmakatherapie bedingten psychischen und motorischen Auffälligkeiten der Patienten, beobachtet. Bewegungen wurden "fließender, präsenter, teils agiler und weniger unkoordiniert, hyperkinetisch, holprig, abwesend und unbeholfen". Ein Patient erzählte nach Ablauf der Therapie, er habe sich beim letzten Vorstellungsgespräch "körperlich selbstbewußter verhalten". In zukünftigen, körpersprachlich orientierten Studien sollten größere Untersuchungsgruppen, Langzeitstudien (Auswirkungen auf den Alltag prüfen), Fremd- und Selbstbeurteilungsverfahren verwendet werden und mit der "Checkliste Motorischer Verhaltensweisen", dem Rombergtest bzw. mit verschiedenen physiologischen wie auch psychologischen Tests weiter geforscht werden. Die Körpersprache hat einen Einfluß auf die soziale Integration und auch auf die psychiatrische Rehabilitation. Diese Effekte sollten möglichst effektiv medizinisch-therapeutisch genutzt werden. Denn der folgende Spruch, der für gesunde und kranke Menschen gilt, ist bezeichnend: "Der erste Eindruck ist entscheidend, der letzte bleibt." (Ruhleder, R., 1996, S. 68) Gerade beim Knüpfen neuer Kontakte liegt der Schwerpunkt auf dem ersten Eindruck. Hier wird entschieden, ob es überhaupt zu einem Kontakt kommt. Die Körpersprache unterstützt und erleichtert die Kommunikation. Das Erste und auch das Letzte, was man von einem Menschen wahrnimmt, ist nun einmal bewußt oder unbewußt fast immer der menschliche Körper mit seiner Ausdruckskraft und nicht die verbale Sprache.
Zur Phänomenologie der Obduktionen im Zentrum der Rechtsmedizin in Frankfurt am Main 1993 - 1995
(2003)
Das Sektionsgut des Zentrums der Rechtsmedizin in Frankfurt am Main der Jahre 1993 bis 1995 wurde anhand der entsprechenden Sektionsprotokolle und -bücher mit Hilfe eines eigens für den rechtsmedizinischen Bereich entwickelten Datenerfassungsprogrammes erfasst und ausgewertet (MÜLLER und BRATZKE, 1993). Im Untersuchungszeitraum wurden insgesamt 4115 Leichen in das Zentrum der Rechtsmedizin eingeliefert, von denen 79,5% (3271 Leichen) obduziert wurden. Bezüglich der Geschlechtsverteilung des gesamten Sektionsgutes betrug der Anteil der Männer 66% und der Frauen 34%. Sowohl bei den natürlichen Todesfällen (62,3%) als auch bei den nichtnatürlichen Todesfällen (70,5%) überwog der Anteil der Männer deutlich. Das Durchschnittsalter aller Obduzierten lag bei 50,7 Jahren. Im Auftrag der Staatsanwaltschaften Frankfurt am Main, Darmstadt mit der Zweigstelle Offenbach, Hanau und Wiesbaden wurden innerhalb der drei Jahre 2031 Leichen obduziert. In 937 Fällen fand eine Feuerbestattungssektion und in 278 Fällen eine Verwaltungssektion statt. Neun Obduktionen wurden im Auftrag einer Versicherung und 16 Obduktionen im Auftrag von Privatpersonen durchgeführt. 53 Todesfälle fielen unter die Kategorie "Sonstiges". Hierunter wurden sowohl 44 "Irrläufer", die zunächst in die Rechtsmedizin eingeliefert wurden, eigentlich aber in der Pathologie seziert werden sollten, sieben amerikanische Staatsbürger, die nach Kenntnis der Nationalität ohne Obduktion oder Besichtigung den amerikanischen Stellen überantwortet wurden, und zwei Fälle von Organteilen zusammengefaßt. 791 Leichen wurden besichtigt. In 50,7% (1660) der Fälle wurde ein nichtnatürlicher Tod, in 43,8% (1432) ein natürlicher Tod festgestellt, in 5,1% (168) blieb die Todesart auch nach der Obduktion unklar. Unter den nichtnatürlichen Todesfällen befanden sich 333 Verkehrstote, 75% waren Männer. In 35% der Fälle handelte es sich bei den Unfallopfern um Fußgänger, die durch einen Pkw, ein anderes Kfz oder ein Schienenfahrzeug erfaßt und getötet wurden. 28% der Todesfälle waren Fahrer und 11% Insassen eines Pkw. Weitere 11% kamen als Radfahrer und 9% als Motorradfahrer ums Leben. 49,5% der Verkehrsunfallopfer starben an den Folgen eines Polytraumas und bei 31% führte ein isoliertes Schädelhirntrauma zum Tode. Die Selbsttötungen stellten mit 30% (492 Fälle) die häufigste Art des nichtnatürlichen Todes dar. Der Suizid durch Erhängen bzw. Strangulation war die meist gewählte Methode (28%), gefolgt vom Tod durch "stumpfe Gewalt" bedingt Sprung aus dem Fenster oder vor einen Zug (24%). Bei 404 Todesfällen handelte es sich um einen Unglücksfall. Hier standen die sog. Drogentoten mit 239 Todesfällen deutlich im Vordergrund. Anhand der rückläufigen Tendenz der Anzahl der Drogentoten werden Chancen und Möglichkeiten einer integrativen gegenüber einer restriktiven Drogenpolitik deutlich. 80 Personen kamen bei einem Haushaltsunfall und 45 Personen, unter ihnen eine Frau, bei einem Arbeitsunfall ums Leben. In den Jahren 1993 bis 1995 wurden 243 Personen Opfer eines Tötungsdeliktes. Der Anteil von 39% Frauen entspricht dabei dem bundesweiten Durchschnitt. Die Zahl der Tötungsdelikte nahm im Untersuchungszeitraum um 15% zu, wobei der weibliche Anteil relativ konstant blieb. Der Vergleich des Sektionsgutes mit den Verstorbenen der Stadt Frankfurt am Main zeigte, daß im Betrachtungszeitraum durchschnittlich 7,2% der verstorbenen Frankfurter Bürger im Zentrum der Rechtsmedizin obduziert wurden. Die Obduktionsfrequenz lag bei den natürlichen Todesfällen bei 4,5% und bei den nichtnatürlichen Todesfällen bei 50,4%. Die vorliegenden Ergebnisse zeigen Enwicklungstendenzen und Auswirkungen bestimmter Maßnahmen in Bereichen wie Straßenverkehr und Drogenpolitik auf und können für andere epidemiologische Untersuchungen zum Vergleich herangezogen werden, ebenso kann durch systematische Sektion ein "Frühwarnsystem" etabliert werden, das zu rechtzeitigen präventiven Maßnahmen Anlass gibt.
In der vorliegenden Untersuchung wurden an 35 gynäkologischen Patientinnen die Unterschiede zwischen Desfluran und Isofluran auf das EEG-Frequenzverhalten, die SEF 95% und die somatosensorisch evozierten Potentiales des N. medianus untersucht. Dabei wurden die Einflüsse steigender Narkosegaskonzentrationen und nocizeptiver Reize sowie die Veränderungen in der Aufwachphase auf die oben genannten Parameter verglichen. Die Untersuchung wurde als prospektive und randomisierte Studie durchgeführt. Es konnte der Nachweis geführt werden, dass es keinen Anhalt für Unterschiede in der Beeinflussung der EEG-Parameter Powerspektrum und SEF 95%, sowie der somatosensorisch evozierten Potentiale zwischen Desfluran und Isofluran gibt. Dies gilt für equipotente Narkosegaskonzentrationen ebenso wie für die Unterdrückung nocizeptiver Reize. Anders stellt sich das Bild in der Aufwachphase dar. Dort führt die langsamere Eliminierung des Isofluran zu einer Aktivierung im EEG mit einer starken Ausprägung der beta-Wellen. Einen Einfluss auf klinische Befunde wie Vigilanz, Schmerzempfindung oder Entlassung aus dem Aufwachraum durch diese EEG-Veränderungen ließ sich bei den von uns untersuchten Patienten nicht nachweisen, jedoch konnte in anderen Studien eine Verbesserung der Wiederkehr kognitiver Funktionen besonders bei älteren Patienten nach Desflurannarkosen im Vergleich zu Isoflurannarkosen beobachtet werden [35]. Diese Beobachtung lässt sich durch die Veränderungen in der EEG-Frequenzanalyse mit einem Frequenzmuster wie unter Sedierung erklären.
P2X receptor subunits assemble in the ER of Xenopus oocytes to homomultimeric or heteromultimeric complexes that appear as ATP-gated cation channels at the cell surface. In this work it was intended to investigate the posttranslational modifications such as N-linked glycosylation and disulfide bond formation that is undergone by P2X1 receptors. In addition, the aim of this study was to examine the expression and the quaternary structure of selected P2X receptor isoforms in Xenopus oocytes. The investigation of the quaternary structure of the metabolically or surface labeled His-P2X2 receptor by BN-PAGE revealed that, while the protein complex is only partially assembling in oocytes, the plasma membrane form of the His-P2X2 receptor assembled into trimeric and even hexameric complex as was shown by the BN-PAGE analysis. Besides this finding, it is shown that the His-P2X5 protein that was purified from metabolically or surface labeled oocytes appeared as one single band corresponding to a trimer when analyzed by BN-PAGE. The present study signified that His-P2X6 alone does not reach a defined assembly status and possibly needs the hetero-polymerisation with other P2X subunits to assemble properly for insertion into the plasma membrane. Another finding of this study is that the P2X1 and P2X2 subunits could exist as heteromultimeric protein complexes in the plasma membrane of cells. Purification of surface expressed His-P2X2 subunit allowed the detection of co-injected P2X1 subunit and vice versa in Xenopus oocytes. Incubation with glutardialdehyde led to the cross-linking of P2X2 and P2X1 subunits to dimers and trimers. BN-PAGE analysis of the P2X2/P2X1 complex isolated under nondenaturing conditions from surface-labeled oocytes yielded one distinct band corresponding to a trimeric complex. The analysis of a C-terminally GFP tagged His-P2X1 fusion protein by confocal fluorescence microscopy revealed small clusters of the protein complexes, approximately 4-6 µm in diameter from a diffuse distribution of the protein in the plasma membranes of Xenopus oocytes. The cross-linking or BN-PAGE analysis of the fusion protein resulted in proteins that migrated quantitatively as trimers when purified in digitonin. The analysis of some chimeric constructs confirmed the results of others, which showed that desensitization can be removed from the P2X1 or P2X3 receptor by providing the N-domain from the P2X2 receptor (Werner et al., 1996) The exchange of this domain did not alter the quaternary structure of the chimeras, which showed to be present as trimers when expressed in oocytes. In addition, glycan minus mutants of His-P2X1 receptor were analyzed to examine whether carbohydrate side chains are important for P2X1 subunit assembly, surface expression, or ligand recognition. SDS-PAGE analysis of glycan minus mutants carrying Q instead of N at five individual NXT/S sequons reveals that 284N remains unused because of a proline in the 4 position. The four other sites (153Asn, 184N, 210N, and 300N) carry N-glycans, but solely 300N acquires complex-type carbohydrates. Like parent P2X1 receptor, glycan minus mutants migrate as homotrimers when resolved by blue native PAGE. Recording of ATP-gated currents revealed that elimination of 153N or 210N diminishes or increases functional expression levels, respectively. In addition, elimination of 210N causes a 3-fold reduction of the potency for ATP. If three or all four N-glycosylation sites are simultaneously eliminated, formation of P2X1 receptors is severely impaired or abolished, respectively. It is concluded that at least one N-glycan per subunit of either position is absolutely required for the formation of P2X1 receptors. The SDS-PAGE analysis of surface-labeled His-P2X2 and His-P2X5 receptors revealed that, while the His-P2X2 subunit acquires three complex-type carbohydrates, in case of His-P2X5 polypeptide, only two of the three N-glycans could obtain complex-type carbohydrates during transit of the Golgi apparatus. Furthermore, it was shown that DTT treatment blocked the appearance of newly made His-P2X1 at the plasma membranes of Xenopus oocytes. Also, it was revealed that the effects of DTT on His-P2X1 biogenesis are fully reversible. Removal of the reducing agent leads to subsequent folding and assembly into His-P2X1 receptor complex, followed by transport to the cell surface. The characterization of cysteine minus mutants by SDS PAGE and BN-PAGE demonstrated that, the cysteine substitution in the first cysteine rich domain (C1 - C6) does not have a major effect on assembly for the mutant receptors. In contrast, the replacement of the four cysteine residues (C7 - C10) from the second cysteine rich domain demonstrate a critical importance of this domain for the functional surface expression of P2X1 receptor. The investigations of several double cysteine mutants revealed that according to a similarity in the sensitivity to ATP, the C1 and C6, as well as C2 and C4 and finally C3 and C5 are pairs forming two disulfide bonds in each P2X1 subunit.
Die Mismatch-Reparatur (MMR) ist ein hochkonserviertes Kontroll- und Korrektursystem für die Erbinformation. Ihre Hauptaufgabe liegt in der Behebung von Kopierfehlern unmittelbar nach der Replikation (postreplikative Reparatur). Mutationen in Genen der Mismatch-Reparatur (vor allem in hMLH1 und hMSH2) führen beim Menschen zum "Erblichen nicht-polypösen kolorektalen Karzinom", HNPCC (Hereditary non-polyposis colorectal cancer). Diese Erbkrankheit geht mit einem gesteigerten Risiko einher, an verschiedenen Karzinomen, vor allem des Kolons, zu erkranken. Obwohl zumindest in Escherichia coli alle an der Mismatch-Reparatur beteiligten Proteine bekannt sind, ist ihr biochemischer Mechanismus nach wie vor ungeklärt. Es existieren drei verschiedene Modellvorstellungen zum Reparaturablauf: das Translocation model, das Sliding clamp model und das DNA bending model. Um einer Klärung des Reparaturmechanismus näherzukommen, sollten in dieser Arbeit die Bindungen der humanen Mismatch-Reparaturproteine an DNA und ihre Interaktionen untereinander näher untersucht werden. Im Zentrum stand dabei die Interaktion der heterodimeren ATPase hMutSa (hMSH2-hMSH6) mit den ebenfalls heterodimeren ATPasen hMutLa (hMLH1-hPMS2) und hMutLß (hMLH1-hPMS1). Die Hauptfunktion von hMutSa ist bekannt: das Dimer ist in der Lage, DNA-Paarungsfehler zu erkennen und an sie zu binden. Die Funktion von hMutLa liegt wahrscheinlich in der Weiterleitung des Signals "Fehler erkannt" von hMutSa an die Reparaturmaschinerie. Somit kommt der Interaktion von hMutSa mit hMutLa eine wesentliche Bedeutung in der Initiation der Reparatur zu. Die Funktion von hMutLß ist noch unbekannt. Zur Analyse der hMutSa-hMutL-Interaktion wurde eine neue Methodik entwickelt, bei der DNA-Substrate an magnetische Partikel gebunden, diese mit Proteinlösungen inkubiert und die gebundenen Proteine anschließend mit Salzlösungen eluiert wurden. Hierdurch konnten die Bindungsstärken anhand der Salzresistenz differenziert werden und die Bindungsreaktionen nach ATP-Zugabe bei verschiedenen DNA-Substraten verfolgt werden. Es konnte gezeigt werden, daß hMutSa zwar nicht quantitativ mehr, aber fester an DNA-Paarungsfehler band als an fehlerfreie DNA-Oligoduplices. Die Bindung reagierte empfindlich auf die Zugabe von ATP: auf Homoduplex-DNA bewirkte ATP unter geeigneten Bedingungen einen vollständigen Bindungsverlust von hMutSa, während es an Heteroduplex-DNA auch in Gegenwart des Nukleotidtriphosphates gebunden blieb. Eine weitere Wirkung von ATP bestand darin, daß hMutSa hMutLa und hMutLß rekrutierte. Dies geschah allerdings nur, wenn ausreichend lange DNA-Substrate (>= 81 Basenpaare) verwendet wurden. Für hMutLa konnte außerdem eine eigene DNA-Bindungsfähigkeit, und zwar vorzugsweise an Einzelstrang-DNA, nachgewiesen werden. Beide Ergebnisse zusammen genommen legen nahe, daß hMutSa und hMutLa nur interagieren können, wenn beide gleichzeitig an DNA gebunden sind. Obwohl nach bisherigen Erkenntnissen hMutLa, aber nicht hMutLß die Mismatch-Reparatur unterstützen kann, interagierte hMutLß ebensogut mit hMutSa. Dies läßt im Zusammenhang mit weiteren Ergebnissen vermuten, daß hMutLß eine modulierende Funktion in der MMR besitzen könnte. Alternativ könnte die hMutSa-hMutLß-Interaktion bei noch nicht charakterisierten anderen Prozessen von Bedeutung sein. Die weitere Untersuchung der Interaktion ergab, daß diese wahrscheinlich nicht von der ATP-Hydrolyse abhängt, sondern allein durch die Bindung des Nukleotidtriphosphates zustande kommt. Darüber hinaus spielen die ATPasen von hMutLa keine Rolle bei der Interaktion, da das Protein auch dann noch die Bindung einging, wenn seine Nukleotidbindungsstellen gezielt mutiert worden waren. Die Untersuchung zeigte außerdem, daß nur die hMutL-Untereinheiten hMLH1 und (in geringem Ausmaß) hPMS1 ATP-abhängig mit hMutSa interagierten, während hPMS2 alleine keine Bindung zeigte. Die sich daran anschließende Untersuchung von Fragmenten des hMLH1-Proteins erlaubte die Eingrenzung der Interaktionszone. hMutLa kontaktiert hMutSa demzufolge mit einem Proteinbereich, der innerhalb des N-Terminus von hMLH1 liegt. Zusammenfassend wird aufgrund der vorliegenden Ergebnisse für das DNA bending model der Mismatch-Reparatur plädiert. Dessen Reparaturablauf wird abschließend unter Berücksichtigung der vorliegenden Daten geschildert. In einem separaten Kapitel der Arbeit wird über die Identifizierung und Charakterisierung einer neuen Spleißmutation des humanen PTEN-Gens berichtet. Diese Mutation wurde bei einer Patientin mit dem Cowden-Syndrom, einem weiteren erblichen Krebssyndrom, nachgewiesen.
Stickstoffmonoxid (NO) ist ein kurzlebiges Gas, welches in biologischen Systemen verschiedene Funktionen übernehmen kann. Abhängig von der Konzentration ist NO ein zweischneidiges Schwert bezüglich seiner biologischen Effekte, da es in hohen Dosen proapoptotisch und in physiologischen Dosen anti-apoptotisch wirkt. Das von der eNOS in Endothelzellen gebildete NO ist ein wichtiger Faktor für die Gefäßrelaxation, ein antiinflammatorisches Molekül, ein zentraler Faktor für die Angiogenese und es inhibiert die Apoptose. Die reversible Modifikationen der Funktion von Zielproteinen durch S-Nitrosylierung ist ein Mechanismus, wie NO seine Effekte mediert. In den letzten Jahren sind eine Vielzahl von Zielproteinen entdeckt worden, deren Funktion durch S-Nitrosylierung modifiziert werden, die deutlich machen, dass S-Nitrosylierung die Funktion eines Signaltransduktionsmechanismus übernimmt. Da in humanen T-Zellen zum erstenmal auch eine Denitrosylierung beobachtet werden konnte, sollten in dieser Arbeit Mechanismen, die der Balance zwischen S-Nitrosylierung und Denitrosylierung zu Grunde liegen, untersucht werden. Dafür wurden zunächst Methoden zum Nachweis der S-Nitrosylierung etabliert. Zum einen zur Quantifizierung der S-Nitrosylierung in Endothelzellen der modifizierte Saville- Griess Assay und der DAN-Assay und zum anderen zur qualitativen Analyse der S-Nitrosylierung die biotin switch method. In dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass durch Stimulation der NO-Freisetzung mittels Applikation von laminarer Schubspannung der Gehalt an S-Nitrosylierung in HUVEC erhöht wird und auch die katalytische Untereinheit der Caspase-3 p17, ein bekanntes Zielprotein, verstärkt S-nitrosyliert wird. In einem in vitro Modell des Alterns konnte gezeigt werden, dass einhergehend mit der Reduktion der Proteinexpression der eNOS auch der Gehalt an S-Nitrosylierung, und damit die Bioverfügbarkeit von NO, reduziert ist. Nach Inkubation mit dem pro-apoptotischen TNFa und dem pro-atherogenen oxLDL konnte eine drastische Zunahme der Apoptosesensitivität von alternden HUVEC gegenüber diesen Stimuli beobachtet werden. Diese Ergebnisse unterstreichen die zentrale Rolle der Bioverfügbarkeit von NO für das Überleben der Endothelzelle. Zusätzlich konnte eine Denitrosylierung nach Inkubation von Endothelzellen mit TNFa oder oxLDL nach 18 h nachgewiesen werden. Durch Analyse mittels der biotin switch method wurde deutlich, dass dabei nicht nur der Gesamtgehalt an S-nitrosylierten Molekülen reduziert wird, sondern auch spezifische Zielproteine in unterschiedlicher Stärke denitrosyliert werden. Diese Daten machen deutlich, dass es sich bei der S-Nitrosylierung um einen differentiell regulierten Signaltransduktionsmechanismus handelt. Basierend auf diesen Ergebnissen wurde eine Strategie zur Identifizierung einer potentiellen Nitrosylase entwickelt, bei dem ein synthetisches, in vitro S-nitrosyliertes Peptid als Substrat verwendet wird. Weiterhin sollten neue Zielproteine für die S-Nitrosylierung identifiziert werden. Tatsächlich konnte ein neues Zielprotein für die S-Nitrosylierung, die Oxidoreduktase Thioredoxin identifiziert werden. Thioredoxin wird ubiquitär in Säugetierzellen exprimiert und ist ein essentieller Faktor für die Aufrechterhaltung des intrazellulären Redox-Status. Mit den Cysteinen an Position 32 und 35 besitzt Thioredoxin eine redox-regulatorische Domäne, die essentiell für seine Funktion als Oxidoreduktase ist. Neben seiner Funktion als Redox- Regulator, kann Thioredoxin Transkriptionsfaktoren wie z.B. NfK-B aktivieren und über die redox-regulatorische Domäne die pro-apoptotische Kinase ASK-1 binden und inhibieren. In dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass Thioredoxin an Cystein 69 S-nitrosyliert wird und dass der Gehalt an S-nitrosylierten Molekülen von der Proteinexpression des Thioredoxin abhängt. Desweiteren ist die S-Nitrosylierung von Thioredoxin in Endothelzellen wichtig für die Entfaltung seiner vollständigen Reduktaseaktivität. Für die zum erstenmal in Endothelzellen gezeigte anti-apoptotische Funktion von Thioredoxin wird sowohl die S-Nitrosylierung an Cystein 69 als auch die redox-regulatorische Domäne benötigt. Durch diese Experimente konnte eine neue wichtige Funktion von Thioredoxin für NOproduzierende Zellen beschrieben werden. Zusammenfassend zeigen die Ergebnisse dieser Arbeit, dass die S-Nitrosylierung in Endothelzellen ein Signaltransduktionsmechanismus ist, der sowohl durch protektive, als auch durch pathophysiologische Stimuli spezifisch reguliert wird. Die weitere Charakterisierung dieser Vorgänge könnte einen tieferen Einblick in die Biologie und Funktion der Endothelzelle geben. Zusätzlich konnte durch das neue Zielprotein Thioredoxin die direkte Verknüpfung von NO mit dem Redox-Status der Zelle und die zentrale Rolle von Thioredoxin für den Gehalt an S-Nitrosylierung in Endothelzellen gezeigt werden. Identifizierung weiterer Regulationsmechanismen für die S-Nitrosylierung könnte ein genaueres Verständnis dieses Wirkmechanismus von NO und somit eine bessere Protektion des Endothelzellmonolayers in den Gefäßen ermöglichen.
Der weltweiten Ausbreitung des humanen Immundefizienzvirus versucht man neben der Entwicklung eines präventiven HIV-Impfstoffes auch durch die Verbesserung der chemotherapeutischen Behandlung HIV-Infizierter entgegen zu wirken. Die hochwirksame antiretrovirale Kombinationsstherapie (HAART) hat neben der Anzahl der opportunistischen Infektionen und AIDS-bedingten Todesfälle auch die Viruslast in vielen HIV-Infizierten über einen langen Zeitraum unterhalb der Detektionsgrenze senken können. Es sind daher neben den klassischen Verlaufsmarkern wie der Viruslast und der Anzahl der CD4 T-Zellen neue Surrogatmarker zur Beurteilung der Effizienz der antiretroviralen Therapie notwendig. Der Einfluss der Viruslast auf den CD8 T-Zellaktivierungsstatus während der antiretroviralen Therapie zeigte sich durch den Vergleich von HAART-Respondern und den durch eine hohe Viruslast infolge eines Therapie-Versagens gekennzeichneten HAART-Non-Respondern. Die Beobachtung einer signifikant erhöhten Anzahl an basal, d.h. ohne vorangegangene in vitro Stimulation, aktivierten CD8 CD69 T-Zellen bei HAART-Non-Respondern (p = 0,0049) konnte die Rolle des T-Zell-Aktivierungsstatus als Marker der verbleibenden Viruslast unter HAART nachweisen. Um das Potential der von CD8 T-Zellen sezernierten HIVsupprimierenden ß-Chemokinen und IL-16 als HAART-begleitende Surrogatmarker zu untersuchen, wurde die Expression von MIP-1a, MIP-1ß und RANTES sowie des Lymphokins IL-16 im Serum und im Zellkulturüberstand aktivierter CD8 T-Zellen untersucht. Für HAART-Non-Responder konnte im Zellkulturüberstand von in vitro stimulierten CD8 TZellen eine signifikante Erhöhung der IL-16-Expression (p = 0,0077) und eine erhöhte Expression von MIP-1a im Vergleich zu HAART-Respondern gezeigt werden. Darüber hinaus wurde eine signifikant erhöhte MIP-1ß-Serumkonzentration bei HAART-Non- Respondern (p = 0,0175) nachgewiesen, die mit einer erhöhten Anzahl aktivierter CD8 CD69 T-Zellen assoziiert war. Im Rahmen dieser Untersuchungen konnte somit gezeigt werden, dass neben MIP-1a, vor allem das ß-Chemokin MIP-1ß und das Lymphokin IL-16 vielversprechende Surrogatmarker zur Beurteilung der Effizienz der antiretroviralen Therapie darstellen, die als sensitive therapiebegleitende Marker die rechtzeitige therapeutische Intervention vor einem signifikanten Anstieg der Viruslast ermöglichen könnten. Da trotz der intensiven Entwicklung und Verbesserung antiretroviral wirkender Therapeutika die vollständige Elimination des HI-Virus bislang nicht möglich ist, wurde in den vergangenen Jahren konzentriert an der Entwicklung neuer Impfstoffstrategien gearbeitet. Eine durch einen Impfstoff induzierte protektive Immunantwort gegen HIV sollte vor allem gegen Strukturproteine, sowie gegen die regulatorischen Proteine Tat und Rev gerichtet sein. Mit einem MLV-abgeleiteten Transfervektor für die SHIV-Gene tat, rev und env wurde in dieser Arbeit das immunogene Potential zur Induktion einer humoralen und zellulären Immunantwort im Rhesusaffen-Tiermodell untersucht. Durch die Etablierung einer stabilen Verpackungszellinie für den Transfervektor pMgDenv/tat/rev/Dlngfr konnte der effiziente Gentransfer in CD4 T-Zellen mittels [MLV(SHIV)]-Pseudotypvektoren gezeigt werden. Durch Optimierung der Transduktionsbedingungen konnte ein Transduktionstiter von 1-2 x 107 i.E./ml in primäre Rhesus-Lymphozyten erreicht werden. Um das immunogene Potential dieser HIV-Antigen-exprimierenden Zellen in vivo zu untersuchen, wurden in einer Immunisierungsstudie 0,7 - 3,4 x 107 Transfergen-positive PBMC in 3 aufeinander folgenden Transplantationen in einen Rhesusaffen reinfundiert. Die transplantierten Zellen waren nach der 3. Applikation bis zu 7 Tage nach Transplantation in vivo mittels PCR detektierbar. Eine HIV-gp120-spezifische Antikörperantwort konnte fünf Wochen nach der ersten bzw. zwei Wochen nach der letzten Immunisierung nachgewiesen werden. In einem ELIspot-Assay konnte erfolgreich die Induktion einer HIV-1-Env- und Rev-spezifischen CTL-Antwort in den nach 7,5 bzw. 10 Wochen nach der letzten Immunisierung entnommenen PBMCs nachgewiesen werden. Interessanterweise zeigten Sequenzanalysen, dass die induzierte CTL-Aktivität gegen die für einen effizienten Schutz bedeutenden Determinanten des HIV-1- Hüllproteins, gegen die variable Domäne des gp120 als auch gegen die CD4- Bindungsregion gerichtet war. In dieser Immunisierungsstudie war es somit erstmals möglich, durch die Transplantation autologer HIV-Antigen-exprimierender CD4 T-Zellen eine spezifische humorale wie auch zelluläre Immunantwort in vivo zu induzieren.
Für viele pädiatrische Patienten mit Leukämie ist die Durchführung einer Hoch-Dosis- Chemotherapie mit anschließender Stammzelltransplantation oft die einzige Möglichkeit die Heilungsrate zu verbessern. Die Eliminierung der residualen leukämischen Blasten basiert einerseits auf der Konditionierung mit hoch-aggressiver Chemotherapie. Andererseits ist sie auf immunologische Reaktionen zwischen immunkompetenten Zellen, die entweder in dem Transplantat enthalten sind, oder aus diesem neu entstehen und den verbliebenen leukämischen Blasten zurückzuführen. Diese immunologische Interaktion wird auch als Graftversus- Leukämie-Reaktion (GVL) bezeichnet und hauptsächlich von T-und NK-Zellen vermittelt. Trotz zunächst erfolgreicher allogener Transplantation erleidet ein beträchtlicher Anteil der Patienten ein Rezidiv. Während ein offenes Rezidiv oft nicht mehr behandelbar ist, können Patienten mit drohendem Rezidiv oder minimaler Resterkrankung (MRD) durch Infusion immunkompetenter Zellen des Spenders, sogenannte Donor-Lymphozyten-Infusionen (DLI), teilweise erfolgreich behandelt werden. Die Behandlung mit DLI ist limitiert durch die Graft-versus-host-disease (GVHD), eine mit zum Teil schweren Komplikationen verbundene Reaktion, die potentiell tödlich verlaufen kann. Die gentechnische Veränderung der alloreaktiven Zellen mit einem Suizidgen ermöglicht eine kontrollierte, spezifische Eliminierung dieser Zellen im Falle einer GVHD Entwicklung. Im Rahmen dieser Arbeit wurden zwei verschiedene retrovirale Selektions/Suizid- Fusionsvektoren für die Transduktion von Spender T-Zellen im Kontext einer DLI entwickelt. Beide Selektions/Suizid-Fusionselemente wurden in einem für die Transduktion in T-Zellen optimierten retroviralen Vektor generiert. Die Selektionsmarker waren so gewählt, dass eine Anreicherung der Transgen-positiven Zellen über eine immunomagnetische Selektion möglich war. Ein Vektor kodierte für ein Fusionsmolekül aus dem zytoplasmatisch trunkierten humanen CD34-Oberflächenmarker (tCD34) und der Zellzyklus-abhängigen GCV-hypersensitiven HSVtk39 (Herpes-simplex Virus I Thymidin Kinase) Mutante. Durch GCV-Applikation konnte in den transduzierten, tCD34/HSV-tk39 exprimierenden Zellen spezifisch die Apoptose induziert werden. Der zweite Vektor wurde so konstruiert, dass ein Fusionsprotein aus dem humanen DLNGFR-Oberflächenmarker und der Zellzyklus-unabhängigen death-effector-domain (DED) des humanen FADD (Fas-associated-protein with death domain) Moleküls entstand. Über zwei zwischengeschaltete FKBP (FK506-binding protein) Domänen wurden die beiden Elemente miteinander fusioniert. In DLNGFR/Fv'Fv/DED-exprimierenden Zellen konnte die Apoptose durch die Applikation eines spezifisch an die beiden FKBP-Domänen bindenden synthetischen Substrats (AP20187), das die Dimerisierung des DED-Moleküls induzierte, ausgelöst werden. Durchflusszytometrische Analysen von transduzierten und selektierten humanen primären TZellen zeigten, dass beide Fusions-Transgene korrekt in den Zielzellen exprimiert wurden. Die spezifische Induktion der Apoptose durch Aktivierung des jeweiligen Suizidmoleküls wurde in Funktionalitätstestungen nachgewiesen. Beide Fusionsmoleküle vermittelten eine effiziente Eliminierung der transduzierten Zellen (90 %-98 %). In vergleichenden Analysen wurde gezeigt, dass die beiden Suizidmechanismen einer unterschiedlichen Kinetik unterlagen. Während die DED-induzierte Apoptose sehr schnell auf die Applikation des Suizidaktivators folgte, vermittelte der HSV-tk39 Mechanismus eine deutlich langsamere aber etwas effizientere Eliminierung der Zellen. Erste Untersuchungen einer Kombination beider Fusionsmoleküle deuten auf einen additiven/synergistischen Effekt hin, der zu einer schnellen und effizienten Eliminierung der Zellen führt (>=99 %). Zur Zeit stellt die Strategie der Suizidgen-transduzierten T-Zellen die am vielversprechendste Methode zur Kontrolle einer GVHD-Reaktion dar. Die hier entwickelten Vektoren ermöglichen eine effiziente, kontrollierte Eliminierung der Zellen und bieten Potential zur Weiterentwicklung einer optimierten Strategie.
Das Adenokarzinom des Pankreas ist das fünfthäufigste Malignom der westlichen Länder mit einer sehr schlechten Prognose. Zum Zeitpunkt der Diagnosestellung ist das Pankreaskarzinom wegen der frühen lokalen Infiltration und Metastasierung meist nicht mehr kurativ behandelbar. 80 % aller Pankreaskarzinome werden in einem fortgeschrittenen Krankheitsstadium diagnostiziert. Die Therapie des fortgeschrittenen Pankreaskarzinoms gestaltet sich problematisch. Bislang führten systemische chemotherapeutische Ansätze nicht zur erhofften Verlängerung der Lebenszeit. In der vorliegenden Phase II Studie wurden in der Abteilung für Allgemein- und Gefäßchirurgie der Universitätsklinik Frankfurt am Main 17 Patienten mit lokal fortgeschrittenem oder metastasiertem Pankreaskarzinom mit einer regional/systemischen Kombinationschemotherapie behandelt. Ein Therapiezyklus bestand aus einer 3ominütigen intraarteriellen Infusion von 8,5 mg/m2 Mitomycin C und aus einer 60minütigen intraarteriellen Infusion von 500 mg/m² Gemcitabine über einen transfemoralen Truncuskatheter an den Tagen 1 und 22, gefolgt von einer systemischen lnfusion von 500 mg/rn² Gemcitabine über 30 Minuten an den Tagen 8, 15, 29 und 36. Die Komhinationschemotherapie war nebenwirkungs- und komplikationsarm. Schwere Nebenwirkungen im NCI-Stadium III/IV wurden im Verlauf von 37 Therapiezyklen mit 74 regionalen Applikationen und 148 systemischen Applikationen in 9 % der Applikationen als Beeinträchtigung der Knochenmarksfunktion (Leukopenie, Thrombopenie und Hämoglobinabfall) und in 15 % der Applikationen als Leberfunktionsstörungen (Erhöhung von Transaminasen, alkalischer Phosphatase und Bilirubin) beobachtet. Die Nebenwirkungen nach regionalen Therapien waren mit den Nebenwirkungen nach venösen Therapien vergleichbar. Kein Patient verstarb an den Folgen einer Nebenwirkung. Ein Patient erlitt nach einer regionalen Chemotherapie einen kompletten Verschluß der Arteria iliaca externa sinistra. Der Therapieerfolg wurde anhand von Computertomographien (CT) und Tumormarker CA 19-9 Bestimmungen nach jedem Chemotherapiezyklus beobachtet und gemäß den WHO-Kriterien beurteilt. Nach CT-Kriterien zeigten vier Patienten eine Regression. Eine komplette Remission wurde bei einer Patientin, eine partielle Remission bei drei Patienten beobachtet. Eine radiologische Remissionsrate von 24 % konnte errechnet werden. Bei fünf Patienten ließ sich unter Therapie keine Größenzunahme des Tumors erkennen (Stable disease). Das Tumorwachstum war bei neun Patienten progredient. Bei sieben Patienten konnte unter Therapie ein Tumormarkerrückgang von mehr als 50 % evaluiert werden (Remissionsrate 41%). Insgesamt zeigten sich zwei komplette Remissionen mit Sinken des Tumormarkers CA 19-9 in den Referenzbereich, d.h. unter 37 µg/ml, und fünf partielle Remissionen. Bei fünf Patienten war der Verlauf des Tumormarkers CA 19-9 unter Therapie stabil (Stable disease). Der Tumormarker CA 19-9 stieg progredient bei fünf Patienten. Das mediane Überleben nach der Kombinationschemotherapie betrug 9,1 Monate (95 % CI: 6-12 Monate). Das mediane Überleben war für Patienten ohne Fernmetastasen (n = 7) mit 15 Monaten (95 % CI: 3-23 Monate) signifikant (p = 0,037) länger als für Patienten mit Fernmetastasen (n = 10) mit 6,3 Monaten (95 % CI: 4,6-12 Monate). Die mediane progressionsfreie Zeit während der Kombinationschemotherapie betrug 4,6 Monate (95 % CI: 2,1-8,7 Monate). Das radiologische Ansprechen (24 %) und die mediane Überlebenszeit (9,1 Monate) dieser regional/systemischen Kombinationschemotherapie waren im Vergleich zu systemischen Standardchemotherapien mit Gemcitabine, die radiologische Remissionsraten von 6,3 % bis 12 % und mediane Überlebenszeiten von 4,8 bis 6,6 Monaten zeigten, erhöht. Die Studie wird aufgrund ihres hohen klinischen Nutzens weiter fortgesetzt. Eine randomisierte Phase III Studie, die die vorliegende regional/systemische Kombinationschemotherapie (Mitomycin C 8,5 mg/m2 Gemcitabine 500 mg/m2) mit dem systemischen Standardverfahren (Gemcitabine 1000 mg/m2) vergleicht, wird angestrebt.
Zahlreiche Hypothesen zur Bioaktivierung organischer Nitrate, welche nach etablierter Meinung als "Prodrug" anzusehen sind, wurden in den letzten Jahren formuliert. Nach Laboruntersuchungen an LLC-PK1 Nierenepithelzellen von Schweinen deutete vieles auf eine Cytochrom P-450-vermittelte Metabolisierung zu Stickstoffmonoxid als aktives Spaltprodukt hin. In der vorliegenden Studie wurden zwölf gesunde männliche Probanden im Alter zwischen 23 und 29 Jahren randomisiert zwei Gruppen zugeteilt, welche jeweils vier Tage mit täglich 800 mg Cimetidin Cytochrom P-450-Hemmstoff bzw. mit Placebo behandelt wurden. Die Untersuchungen fanden im Einfachblindverfahren statt, es handelt sich um einen Parallelgruppenvergleich mit intraindividuellem Crossover. Zwischen beiden Behandlungsphasen wurde eine siebentägige Auswaschphase festgelegt. Es sollte anschließend untersucht werden, ob die gefäßdilatierende Wirkung nach sublingualer Applikation von 1,6 mg Glyceroltrinitrat in der Cimetidingruppe abgeschwächt nachweisbar ist. Zu diesem Zweck wurden am vierten Tag beider Behandlungsphasen verschiedene hämodynamische Parameter vor und während eines Zeitraums von 25 Minuten nach Verabreichung von 1,6 mg GTN bestimmt: Es wurde sonografisch der Durchmesser der Vena portae, fingerpulsplethysmografisch der a/b-Quotient, der Blutdruck nach Riva-Rocci und palpatorisch die Pulsfrequenz ermittelt und dokumentiert. Cimetidin hatte in dieser Untersuchung keinen Einfluss auf die vaskuläre Wirkung von Glyceroltrinitrat. Die ermittelte prozentuale Zunahme des Durchmessers der Pfortader betrug 5,0% ± 2,58% (Placebo) bzw. 5,21% ± 4,2% (Cimetidin). Bei der Analyse der a/b-Quotienten beobachteten wir bei beiden Gruppen eine deutliche Steigerung gegenüber den Ausgangswerten: Placebo: 99,0% ± 53,8%, Cimetidin: 79,2% ± 44,7%. Die hämodynamischen Parameter Blutdruck und Herzfrequenz zeigten im Vergleich beider Behandlungsphasen einen nahezu identischen Kurvenverlauf mit nur geringem initialen Blutdruckabfall und Herzfrequenzsteigerung innerhalb der ersten fünf Minuten. Bezüglich aller erhobenen Parameter war zwischen beiden Gruppen kein signifikanter Unterschied erkennbar. Die Hypothese einer durch Cimetidin hemmbaren, Cytochrom P-450 abhängigen Metabolisierung von Glyceroltrinitrat kann mit den gewählten Meßmethoden an gesunden Probanden nicht unterstützt werden.
Optimierte Labordiagnostik zum Nachweis einer Heparin-induzierten Thrombozytopenie (HIT) Typ II
(2002)
Es ist bekannt, dass nicht alle Patienten, die sich unter einer Heparintherapie nachweislich gegen Heparin/PF4-Komplex immunisieren, das klinische Bild einer Heparin-induzierten Thrombozytopenie (HIT) Typ II entwickeln, wenngleich Heparin/PF4-Antikörper ursächlich für diese schwerwiegende Nebenwirkung angeschuldigt werden. Es ist davon auszugehen, dass in Abhängigkeit von der Grunderkrankung der Anteil der Patienten mit Heparin/PF4-Antikörpern, der keine Klinik entwickelt, relativ groß ist. Da die bisher entwickelten Testsysteme auf dem Nachweis von Heparin/PF4-Antikörpern beruhen, wirkt sich dieses Phänomen nachteilig auf die Testspezifität aus. In der vorliegenden Arbeit wurde untersucht, welche der Immunglobulinklassen der HITspezifischen Antikörper für die Auslösung einer HIT Typ II von Bedeutung sind, und inwieweit die isolierte Bestimmung einer der Immunglobulinklassen IgG, IgM und IgA in der Lage ist, die Aussagekraft eines immunologischen Testsystems zu verbessern. Hierzu wurden Patienten, bei denen Heparin/PF4-Antikörper nachweisbar waren, nach klinischen Kriterien in drei verschiedene Gruppen unterteilt und bezüglich der Immunglobulinklassen verglichen. In Gruppe I wurden Patienten zusammengefasst, bei denen sich der klinische Verdacht einer HIT Typ II labordiagnostisch durch Heparin/PF4-Antikörpernachweis bestätigte, und die als besonderes Kriterium thromboembolische Komplikationen entwickelten. Patienten mit einer isolierten Heparin-induzierten Thrombozytopenie und positivem Antikörpernachweis aber ohne thromboembolische Komplikationen wurden als Gruppe II unterschieden. Durch die getrennte Beobachtung dieser beiden Patientengruppen sollte der prädiktive Wert der Immunglobulinklassen für die Entwicklung von Thrombosen unter HIT Typ II untersucht werden. Verglichen wurden diese beiden Gruppen mit einer dritten Gruppe von selektierten Patienten aus einer prospektiven Studie. Die eingeschlossenen gefäßchirurgischen Patienten aus dieser Studie mussten die Kriterien "positiver Heparin/PF4-Antikörpernachweis während Heparintherapie" und "keine klinischen Zeichen einer Heparin-induzierten Thrombozytopenie Typ II" erfüllen. In dieser Arbeit wurde weiter untersucht, welche der Immunglobulinklasse IgG, IgM und IgA am besten zwischen Patienten mit positiven Heparin/PF4-Antikörpern mit und ohne typischer "HIT-Klinik" unterscheiden kann. Die Bestimmung der Immunglobulinklassen erfolgte zum Zeitpunkt des akuten thrombozytopenischen Geschehens, bzw. bei den asymptomatischen Patienten in einem Zeitfenster von 5 bis 20 Tagen nach Therapiebeginn mit einer ELISA-Methode nach Amiral et al. (1991). Parallel zu den immunologischen Untersuchungen wurde ein etablierter, funktioneller Test, der Heparin-induzierte Plättchenaktivierungstest (HIPA) von Greinacher et al. (1991) bei allen Patienten angewandt. Es kam zu folgenden Ergebnissen im Vergleich der Gruppen: Die Patienten mit einer HIT Typ II mit thromboembolischen Komplikationen ließen sich durch keine der untersuchten Immunglobulinklasse oder den Heparin-induzierten Plättchenaktivierungstest (HIPA-Test) signifikant von den Patienten mit HIT ohne thromboembolische Ereignisse unterscheiden. Die asymptomatischen Patienten mit positivem Heparin/PF4-Antikörpernachweis waren signifikant (p < 0,05) von den Patienten mit einer klinisch wahrscheinlichen und laborchemisch nachgewiesenen HIT Typ II zu unterscheiden durch die Immunglobulinklasse IgG und den Heparin-induzierten Plättchenaktivierungstest (HIPA-Test), nicht aber durch die Immunglobulinklassen IgM und IgA. Dementsprechend zeigte IgG in der Diskriminanzanalyse zwischen Patienten mit klinisch eindeutigem HIT Typ II und asymptomatischen Patienten mit positivem Heparin/PF4- Antikörpernachweis mit 20 % eine um 9 % niedrigere Fehlklassifikationsrate als die Mischung aus IgG, IgM und IgA. Der durch die Diskriminanzanalyse optimierte Cut-Off konnte zwar für die Mischung aus IgG, IgM und IgA eine Spezifitätssteigerung von 0 auf 66,6 % erzielen, dies verursachte jedoch einen Verlust an Sensitivität von 91 % auf 76 %. Der Verlust an Sensitivität ist bei der Immunglobulinklasse IgG mit 2 % deutlich günstiger, während die Spezifität zusätzlich durch die Cut-Off Optimierung von 62,5 auf 70,8 % gesteigert werden konnte. Damit ist der Heparin/PF4-Antikörper-EIA mit der isolierten Bestimmung der Immunglobulinklasse IgG bei vergleichbarer Sensitivität spezifischer als der funktionelle HIPA-Test. Aus diesen Ergebnissen lässt sich bestätigen, dass die Immunglobulinklasse IgG eine zentrale Rolle in der Pathogenese spielt, während die Klassen IgM und IgA keinen Einfluß auf die Klinik der HIT Typ II zu haben scheinen. Da nicht alle Patienten mit Heparin/PF4-Antikörpern der Klasse IgG eine HIT Typ II entwickeln, müssen weitere Faktoren am Zustandekommen der klinischen Symptomatik beteiligt sein. Weiter lässt sich schlussfolgern, dass der Heparin/PF4-Antikörper-EIA (HPIA), sofern man nur die relevante Immunglobulinklasse IgG misst, ein brauchbares Instrument zur Diagnostik der HIT Typ II darstellt, und daher von weniger spezialisierten Labors wegen seiner besseren Praktikabilität einem funktionellen Test wie dem HIPA-Test vorgezogen werden sollte. Zwischen Immunglobulinklassen und dem Risiko, ein thromboembolisches Ereignis während einer HIT Typ II zu entwickeln, konnte kein Zusammenhang festgestellt werden. Es ist zu vermuten, dass der überwiegende Teil der Patienten mit initial isolierter Thrombozytopenie bei fortlaufender Therapiedauer auch Thrombosen entwickelt hätte und sich die beiden Patientengruppen I und II nur hinsichtlich der Dauer der Heparintherapie unterscheiden.
Mit unserer Studie sollte der Einfluß von körperlicher Belastung auf Lymphozytenpopulationen bei Patienten mit variablem Immundefektsysndrom CVID untersucht werden. Um eine Verbindung zu alltäglichen Situationen zu schaffen, wählten wir eine moderate Belastung, in Form einer Laufstrecke von 3.5 km. Es wurden vielfach signifikante Unterschiede der Zellverteilung zwischen der Patienten- und Kontrollgruppe deutlich bei der CD8 T-Zellpopulation, bei den CD4 Helferzellen sowie bei den CD45RO - und CD95 - positiven CD4 Helferzellen und bei den Natürlichen Killerzellen. Wir konnten sehen, daß bei den Patienten in der CD8 T-Zellpopulation bereits vor der Belastung eine höhere Zellzahl vorlag als bei den Kontrollpersonen. Die körperliche Belastung hatte bei dieser Zellgruppe dann zur Folge, daß direkt im Anschluß, durch einen Zellzahlanstieg bei den Patienten, ein signifikanter Unterschied der Zellzahl vorlag. Bei den T4-Helferzellen war bereits zum Ausgangszeitpunkt eine signifikant erniedrigte CD4-Zellzahl bei der Patientengruppe zu erkennen (p = 0.02; Median 616 Zellen/µl; Range 450 - 677 Zellen/µl ). Unter Belastung kam es hierbei zu einem signifikanten Zellzahlanstieg (p < 0.01), wohingegen sich bei der Kontrollgruppe keine signifikante Reaktion zeigte (p > 0.05). Bei der näheren Betrachtung der CD4-Untergruppen ergab sich, daß sich die Zellzahlerhöhung in erster Linie in der Population der CD45RO positiven Memory-Zellen abspielte. Desweiteren war ein Anstieg in der Gruppe der CD95 exprimierenden CD4-Zellen zu sehen. In der Kontrollgruppe war hierbei, wie zu erwarten, keine auffällige Entwicklung in der Zellzahl zu erheben. Bei den Natürlichen Killerzellen, die, wie in der Literatur beschrieben, sehr sensibel auf körperliche Belastung reagieren, zeigte sich ein ähnlicher Verlauf in den beiden Gruppen. Erst zu den Meßpunkten 90 Minuten und 120 Minuten nach Belastung war dann bei den Patienten eine grenzwertig (p=0.053) signifikante Zellzahlerniedrigung auffällig. Inwieweit diese Abweichungen nun als pathologische Erscheinungen bzw. als Kompensationsmechanismen zu werten sind, ist anhand der bislang vorliegenden Daten schwer zu beurteilen. Weiterführende Studien sollten zusätzlich Bezug auf die Zellaktivität, bzw. die Zytotoxizität nehmen. Andererseits wäre eine Langzeitbetrachtung der Patienten unter körperlicher Leistung wünschenswert, um Entwicklungen erkennen und eventuell nützen zu können, im Sinne eines gezielten "immununterstützenden" Trainings.
Rezeptortyrosinkinasen der Familie der epidermalen Wachstumsfaktorrezeptoren (EGFR) sind in vielen Krebsarten dereguliert und ursächlich an der malignen Transformation beteiligt. Da die Aktivierung vom Rezeptor ausgehender Signaltransduktionskaskaden auf spezifischen Protein-Protein-Interaktionen basiert, kann durch gezielte Interferenz mit diesen Interaktionen das proliferative Signal ausgeschaltet und das Tumorwachstum angehalten werden. Für diese gezielte Interferenz wurde in der vorliegenden Arbeit das Peptid-Aptamer-System eingesetzt, mittels dem Peptide, die in ein Gerüstprotein inseriert sind, aufgrund ihrer Affinität zu einem Zielprotein selektiert werden können. Drei Peptid-Aptamere (KDI1, KDI3, KDI4), die spezifisch mit dem EGF-Rezeptor interagieren, konnten isoliert werden. lntrazelluläre Expression von Peptid-Aptamer KDI1 oder Einbringung des bakteriell exprimierten Peptid-Aptamers KDI1 mittels einer Proteintransduktionsdomäne führte zu reduzierter EGF-abhängiger Proliferation und Transformation. Durch Interferenz des Aptamers mit dem EGF-Rezeptor war die EGF-induzierte Phosphorylierung von Tyrosin 845, 1068 und 1148, sowie die Aktivierung von p46 Shc und STAT3 reduziert. Daher wurde gefolgert, dass das Peptid-Aptamer die EGF-abhängige Rekrutierung der zytoplasmatischen Kinase c-Src an den Rezeptor inhibiert. Durch Fusion einer zusätzlichen Domäne wie der SOCS-Box-Domäne konnte den Peptid-Aptameren eine zusätzliche inhibitorische Funktion gegeben werden. Hierbei handelt es sich um eine Domäne, die spezifisch Kontakt mit E3-Ubiquitin-Ligasen aufbauen kann. Es konnte gezeigt werden, dass durch Transduktion eines solchen Peptid-Aptamers der Rezeptor spezifisch ubiquitinyliert und damit degradiert wird. Das Peptid-Aptamer-System eignet sich somit dazu, Inhibitoren für vorgegebene Zielmoleküle zu isolieren, die sowohl in der Grundlagenforschung als auch in der Tumortherapie Anwendung finden können.
G-Protein-gekoppelte Rezeptoren (GPCRs) bilden eine Superfamilie von plasmamembranständigen Proteinen. Die chemische Vielfalt ihrer Aktivatoren macht sie zu der größten und variantenreichsten Proteinfamilie mehrzelliger Organismen. Moderne Klonierungstechniken sowie der Abschluß der Humangenom-Sequenzierung im Jahr 2001 haben die Existenz von ca. 140 unbekannten GPCR-Sequenzen offengelegt, denen bislang weder ein natürlicher Ligand noch eine physiologische Funktion zugeordnet werden konnte. Sie werden daher als orphan Rezeptoren (engl.: Waisenkind) bezeichnet. Mehr als 30% der auf dem internationalen Pharma-Markt zugelassenen Substanzen sind GPCRWirkstoffe mit einem Jahresumsatz (2000) von 23,5 Mrd. US-$ (Wise et al., 2002). Aufgrund der großen wirtschaftlichen Bedeutung dieser Rezeptorfamilie ist es verständlich, daß die pharmazeutische Forschung mit hohem Aufwand an der Ligandenidentifizierung von orphan GPCRs arbeitet und die Ergebnisse patentrechtlich absichert. Die unter den Begriffen Reverse Pharmakologie und Orphan Rezeptor Strategie zusammengefaßte, praktische Wirkstoffentwicklung an orphan GPCRs vereinigt Techniken aus Bioinformatik, Zell- und Molekularbiologie, Biochemie und Pharmakologie. Im Zentrum dieser Arbeit stehen die humanen orphan Rezeptoren gpr3 (Iismaa et al., 1994), gpr6 (Heiber et al., 1995) und gpr12 (Song et al., 1995). Die Sequenz-Identität beträgt 57-61% auf der Proteinebene, und das deutet auf eine neue GPCR-Subfamilie hin. Aufgrund dominanter Präsenz von gpr3-, 6- und 12-mRNA-Transkripten im ZNS ist bislang ein Ligand mit neuromodulatorischen Eigenschaften vermutet worden. Eggerickx et al., 1995 zeigen, daß gpr3-transfizierte COS-7-Zellen konstitutiv, d.h. Agonist-unabhängig, die Adenylat-Zyklase aktivieren und so zu basal erhöhten cAMP-Spiegeln führen. Die Autoren vermuten die Ursache der Agonist-Unabhängigkeit entweder in einer basalen Aktivierung durch einen ubiquitären Serumfaktor im Kulturmedium oder in einer starken Überexpression im COS-7-Zellmodell. Bioinformatische Analysen im Vorfeld dieser Arbeit (Dr. Gassenhuber, Aventis Pharma, 2000) zeigen große Ähnlichkeiten von gpr3, 6 und 12 zu der Cannabinoid (cb)- und zu der endothelial differentiation gene (edg)-Lipidrezeptorfamilie von 42-44% auf der Proteinebene, und das deutet auf ein Lipid als potentiellen Liganden hin. Die edg-Rezeptoren regulieren über die bioaktiven Lipid-Mediatoren Sphingosin-1-Phosphat (S1P) und Lysophosphatidsäure (LPA) zentrale physiologische Funktionen im Rahmen von Proliferation und Zelldifferenzierung sowie eine Vielzahl kardiovaskulärer Effekte (z.B. Plättchenaktivierung, Schutz des Endothels vor Apoptose, Angiogenese, negative Chronotropie, Entwicklung des Herzens etc.). Aventis Pharma Deutschland GmbH beschäftigt sich u.a. mit der molekularbiologischen und pharmakologischen Charakterisierung dieser kardiovaskulären Effekte. Die zentrale Fragestellung dieser Arbeit besteht darin, zu klären, ob auch die orphan Rezeptoren gpr3, 6 und 12 über bioaktive Lipide und eine zusätzliche Expression in peripheren, Herz-Kreislauf-relevanten Organen eine Rolle spielen. Die Ergebnisse dieser Arbeit identifizieren gpr3, 6 und 12 als eine Familie von konstitutiv aktiven Rezeptoren, wobei die konstitutive Aktivierung unabhängig vom Rezeptor-Subtyp, der Spezies oder dem Zelltyp ist. Die Beobachtung, daß HEK293-Zellen, die mit den potentiellen Lipidrezeptoren gpr3, 6 und 12 transfiziert wurden, in lipidfreiem Medium (Aktivkohle-resorbiertes Serum) reduzierte, basale cAMP-Spiegel zeigen, führt zu der Schlußfolgerung, daß zumindest ein Teil der konstitutiven Aktivität auf ein Lipid des Serums zurückzuführen sein muß. In second messenger-Assays sind die bioaktiven Lipide S1P und Dihydro-S1P (DHS1P) als Modulatoren der konstitutiven gpr3-, 6- und 12-Aktivität identifiziert und funktionell charakterisiert worden. S1P- und DHS1P-Wirkungen an diesen Rezeptoren induzieren in HEK293-Zellen sowohl eine Ca2 -Mobilisierung (EC50 = 50-100nM), eine Stimulation der Adenylat-Zyklase als auch eine funktionelle Internalisierung eines Fusionskonstruktes aus gpr6 mit einem grün fluoreszierenden Protein (GFP). Das im Rahmen dieser Arbeit klonierte gpr3-Homologe der Ratte (Acc.Nr.: AJ427482) läßt sich ebenfalls durch S1P und DHS1P in funktionellen Ca2 - und cAMP-Assays anschalten. Eine Substanz-Bibliothek mit 200 bioaktiven Lipiden bestätigt die Wirksamkeit von S1P und DHS1P und liefert darüber hinaus keinen weiteren Liganden mit agonistischen Eigenschaften an den humanen Rezeptoren gpr3, 6 und 12. Expressionsprofile von gpr3, 6 und 12 sind mittels Nachweismethoden auf mRNA- (RT-PCR, Echtzeit- Taqman-PCR, Northern Blot, RNA-Chip) und Proteinebene (Western Blot) erstellt worden. Sie konnten mit Informationen aus der LifeSpan Bioscience-Datenbank (www.isbio.com) ergänzt werden, die ein immunhistologisches Profil des humanen Rezeptors gpr12 im gesunden und kranken Gewebe zur Verfügung stellt. Der Nachweis von gpr3-, 6- und 12-mRNA-Transkripten und Proteinen in einer Vielzahl humaner peripherer Organe und in isolierten Zellsystemen des Herz-Kreislauf- (Herz, Niere, Endothel- und glatte Gefäßmuskelzellen, Blutplättchen) und Immunsystems (Milz, Thymus, Leukozyten) weist eindeutig auf zusätzliche, periphere Funktionen dieser Rezeptorfamilie hin. Dies untermauert die kardiovaskuläre Relevanz, die bereits aufgrund des Liganden S1P zu vermuten war. In einem endothelialen Funktionsmodell, bei dem der pulsierende Blutstrom im Gefäßlumen simuliert wird (Scherstress), wird der Rezeptor gpr3 um den Faktor 2 auf Proteinebene hochreguliert. Es ist jedoch offen, ob diese Regulation auf eine Schutzfunktion im Endothel oder auf eine funktionelle Gegenregulation zurückzuführen ist. Zur Klärung dieser Frage sind Antisense-Oligonukleotide gegen den Rezeptor gpr3 getestet worden; eine Reduktion des gpr3-Proteinniveaus konnte jedoch nicht nachgewiesen werden. Die Ergebnisse der vorliegenden Arbeit identifizieren die humanen orphan Rezeptoren gpr3, 6 und 12 als weitere Mitglieder einer kontinuierlich wachsenden Lipidrezeptorfamilie. Es ist ein wesentlicher Schwerpunkt zukünftiger Studien, diesen für die Herz-Kreislauf-Forschung interessanten Rezeptoren eine physiologische bzw. pathophysiologische Funktion zuzuordnen.
Stickstoffmonoxid (NO) ist ein gasförmiger Botenstoff, der über die Regulation des Vasotonus, die Hemmung der Thrombocytenaggregation sowie die Stimulation der Angiogenese auf die vaskuläre Homöostase einwirkt. Das wichtigste NO-produzierende Enzym im kardiovaskulären System ist die endotheliale NO-Synthase (eNOS), deren Aktivität durch posttranslationale Modifikationen wie Phosphorylierung und Acylierung, durch Interaktionen mit regulatorischen Proteinen wie Ca2 /Calmodulin und Caveolin sowie durch differentielle subzelluläre Lokalisation reguliert wird. Dabei sind die Faktoren, welche die (Trans-)Lokation der eNOS zwischen subzellulären Kompartimenten wie den Caveolae der Plasmamembran und dem Golgi-Apparat dirigieren, weitgehend unbekannt. Zur Identifizierung neuer Interaktionspartner wurde humane eNOS im "yeast two-hybrid"-System als "Köderprotein" eingesetzt und dabei das Fragment eines neuen humanen Proteins identifiziert, das vorläufig NOSTRIN (für: eNOS traffic inducer) genannt wurde. Im Rahmen der vorliegenden Arbeit gelang nun die Klonierung der kompletten NOSTRIN-cDNA, der Nachweis einer spezifischen Interaktion von eNOS und NOSTRIN in Säugerzellen sowie die Charakterisierung von NOSTRIN als Modulator der subzellulären Lokalisation und Aktivität von eNOS. Nach der kompletten Klonierung der NOSTRIN-cDNA mit Hilfe einer 5'-RACE resultierte ein offenes Leseraster von 506 Aminosäuren entsprechend einer Größe von ca. 58 kDa für NOSTRIN. Eine Datenbankrecherche zum Vergleich der NOSTRIN-Sequenz mit Sequenzen bekannter Proteinmotive ergab die Vorhersage einer N-terminalen Cdc15-Domäne sowie einer C-terminalen SH3-Domäne. Die direkte Interaktion zwischen eNOS und NOSTRIN konnte durch Copräzipitation in vivo und in vitro bestätigt werden. Weiterhin wurde nachgewiesen, dass die SH3-Domäne von NOSTRIN essentiell für die Bindung an eNOS ist. Zur Untersuchung des Einflusses von NOSTRIN auf die eNOS-Lokalisation wurden stabil transfizierte CHO-Zellen, die eNOS überexprimierten ("CHO-eNOS") eingesetzt. In der Immunofluoreszenz war eNOS vornehmlich in Assoziation mit der Plasmamembran und dem Golgi-Apparat zu sehen. Mit Hilfe des Semliki-Forest-Virussystems (SFV) wurde nun NOSTRIN transient überexprimiert; dabei zeigte sich für NOSTRIN eine vesikelartige Verteilung im Cytoplasma. Die NOSTRIN-Überexpression führte zu einer drastischen Umverteilung von eNOS, die nun in charakteristischen vesikelartigen Strukturen mit NOSTRIN colokalisierte. Die Verwendung von NOSTRIN-Konstukten, bei denen die SH3- Domäne deletiert war ("NOSTRIN.SH3"), veränderte zwar die typische NOSTRIN-Lokalisation nicht, ließ aber auch die subzelluläre Verteilung von eNOS unverändert, so dass NOSTRIN.SH3 und eNOS in unterschiedlichen zellulären Kompartimenten lokalisiert waren. Mit Hilfe der Immunofluoreszenz konnte ebenfalls eine Colokalisation von NOSTRIN und Caveolin-1, einem inhibitorisch wirkenden Interaktionspartner von eNOS, nachgewiesen werden. Die Analyse von Copräzipitationen mit NOSTRIN bzw. NOSTRIN.SH3 zeigte, dass Caveolin-1 in eNOS-unabhängiger Weise an NOSTRIN bindet, so dass ein ternärer Komplex aus NOSTRIN, eNOS und Caveolin-1 resultiert. Zur Klärung der Frage, ob NOSTRIN neben der subzellulären Lokalisation auch die Aktivität von eNOS beeinflusst, wurde die NO-Freisetzung von CHO-eNOS-Zellen analysiert. Dabei ergab sich, dass die transiente Überexpression von NOSTRIN in CHO-eNOS-Zellen die eNOS-Aktivität um 62 % im Vergleich zu Kontrollzellen reduzierte. In humanen primären Endothelzellen konnte mittels Immunoblotting und Immunofluoreszenzmikroskopie das Vorkommen von endogenem NOSTRIN sowie dessen Colokalisation mit endogener eNOS an der Plasmamembran nachgewiesen werden. Die Ergebnisse der vorliegenden Dissertation führen zur Hypothese, dass NOSTRIN als "molekulare Klammer" zwischen eNOS und Caveolin-1 dient, eine dynamische Umverteilung von eNOS innerhalb der Zelle vermittelt und damit das Enzym - direkt und/oder indirekt - inhibiert. Somit dürfte NOSTRIN als Modulator der Aktivität und Lokalisation von eNOS eine wichtige Rolle bei der Regulation der endothelialen NO-Produktion spielen.
Das R( )-Enantiomer der rac-a-Liponsäure ist als Coenzym wichtiger Multienzymkomplexe (Pyruvatund a-Ketoglutarat-Dehydrogenase) essentiell für die Zell- und Stoffwechselfunktion. Gerade in den wichtigen Prozessen der Zelle, die Substrate für die Atmungskette bereitstellen (Glykolyse, Citratcyclus), spielt die R( )-a-Liponsäure eine entscheidende Rolle. Zusätzlich besitzt dieser Wirkstoff die Eigenschaft als Chelatkomplex-Bildner, Radikalfänger und Antioxidans zu wirken, und er kann damit den Organismus vor "oxidativem Stress" schützen. Klinische und präklinische Studien geben Hinweise, daß R( )-a- Liponsäure einen positiven Effekt auf die Insulinsensitivität, die Insulin stimulierte Glukoseaufnahme und die Glukoseoxidation hat, weiterhin die Glukoneogenese hemmt und damit eine positive Wirkung auf den Krankheitsverlauf des Typ II - Diabetes hat. Das Ziel dieser Arbeit war es, die in der Literatur beschriebenen lang anhaltenden Wirkungen (Pharmakodynamik) der R( )-a-Liponsäure (12 - 24 h nach Gabe des Wirkstoffes) mit meßbaren Konzentrationen dieser Substanz im Organismus in Zusammenhang zu bringen, um erste Ansätze für die Korrelation zwischen Pharmakokinetik und Pharmakodynamik, also für die Konzentrations-(Dosis)- Wirkungsbeziehung, zu geben. Außerdem sollte geklärt werden, weshalb die Mehrfachgabe zu einer deutlichen Absenkung der nach Einfachgabe wirksamen Dosis führte. Eine wichtige Grundlage dazu ist die genaue Kenntnis der Pharmakokinetik der Wirksubstanz und ihrer wichtigsten Stoffwechselprodukte. Bisher ist nur die Pharmakokinetik der R( )- und S(-)-a-Liponsäure nach Gabe der razemischen a-Liponsäure untersucht worden. Da noch keine Erkenntnisse über die Pharmakokinetik der Metaboliten oder der R( )-a-Liponsäure nach Gabe des reinen R-Enantiomers bestanden, lag der Schwerpunkt der Arbeit auf den Untersuchungen der Pharmakokinetik des R( )- Enantiomers und der Metaboliten nach Gabe von R( )-a-Liponsäure als Trometamolsalz (Dexlipotam) und rac-a-Liponsäure am Tier (Einfach- und Mehrfachgabe) und am Menschen (Einfachgabe). Untersuchungsmodell Ratte: Erster Ausgangspunkt der kinetischen Untersuchungen war das zentrale Kompartiment, abgebildet durch den Blutkreislauf. Die resultierende Plasmakonzentrations-Zeitkurve nach oraler (p.o.), intravenöser (i.v.) oder intraperitonealer (i.p.) Gabe von Dexlipotam konnte mathematisch, basierend auf einem Zwei-Kompartiment-Modell, beschrieben werden. Charakteristisch für die Pharmakokinetik der R( )-a-Liponsäure war die kurze terminale Halbwertszeit (0,6 - 1,6 h) und die hohe, mit dem hepatischen Blutfluß vergleichbare, totale Plasma-Clearance. Diese Eigenschaften führten zu einem schnellen Absinken der Plasmakonzentration auf Werte unterhalb der Nachweisgrenze (6 h nach Gabe des Wirkstoffes). Mit Hilfe der Mikrodialyse wurde nach 1-stündiger Infusion von Dexlipotam die freie ungebundene R( )-a-Liponsäure-Konzentration im Interstitium des Muskels bestimmt. Der zeitliche Verlauf der Gewebekonzentration konnte basierend auf der physiologischen Grundlage eines peripheren Kompartiments (Zwei-Kompartiment-Modell) beschrieben werden. Es zeigte sich, daß nur der freie ungebundene Anteil der im Plasma vorliegenden Konzentration (20 %) für die Distribution in das Gewebe zur Verfügung steht. Die ermittelten Halbwertszeiten der Muttersubstanz im Plasma und im Muskel lagen in vergleichbarer Größenordnung und gaben keinen Hinweis auf eine unterschiedliche Kinetik im Plasma und im Gewebe. Sowohl nach p.o. als auch nach einmal täglicher i.v. Mehrfachgabe über 3 - 4 Wochen konnte keine Anreicherung im Plasma bestimmt werden. Dieser Befund erklärte somit nicht die nach Mehrfachgabe erforderliche Dosisreduktion. Die in weiteren Untersuchungen bestimmten Gewebekonzentrationen in der Leber, in der Niere, im Muskel und im Herzen, die sich aus dem freien ungebundenen und dem reversibel gebundenen Anteil der extrazellulären und intrazellulären Konzentration zusammensetzten, zeigten einen zur Plasmakinetik korrespondierenden Zeitverlauf. Nur einzelne spezifische Geweberegionen zeigten nach p.o. (Aorta) und nach i.v. (Nerven) Mehrfachgabe eine Anreicherung des Wirkstoffes. In in-vitro Testmodellen wurde weiterhin die Pharmakokinetik auf zelluläre Ebene untersucht. Es zeigte sich, daß Hepatozyten in der Lage sind, R( )-a-Liponsäure aufzunehmen und die durch b-Oxidation entstandenen Metaboliten Bisnorliponsäure (BNLA) und Tetranorliponsäure (TNLA) zu bilden und aus der Zelle heraus zu transportieren. Im Hinblick auf die Konzentrations-Wirkungsbeziehung rückten die Metaboliten Tetranorliponsäure und Bisnorliponsäure in das Interesse, da diese Stoffwechselprodukte wie die Muttersubstanz über einen aktiven Dithiolan-Ring verfügen, der möglicherweise das für die Wirkung verantwortliche Strukturelement darstellt. Im Interstitium des Muskels wurde der Metabolit TNLA in vergleichbaren Konzentrationen wie die Muttersubstanz gemessen, der Metabolit BNLA war dort nur in Spuren meßbar. Im Plasma hingegen waren die maximalen TNLA-Konzentrationen um den Faktor 3 geringer als die Muttersubstanz- Konzentrationen. Der Metabolit BNLA war im Plasma nur in geringem Ausmaß, um den Faktor 15 geringer als die Muttersubstanz, meßbar. Untersuchungsmodell Mensch: Im Menschen wurden die Metaboliten TNLA, BNLA, 6,8-Bis(methylmercapto)octansäure (BMOA), 4,6- Bis(methylmercapto)hexansäure (BMHA) und 2,4-Bis(methylmercapto)butansäure (BMBA) im Plasma und im Urin pharmakokinetisch untersucht. Die Metaboliten BMOA, TNLA und BNLA zeigten Halbwertszeiten in vergleichbarer Größenordnung wie die Muttersubstanz (0,5 - 0,9 h). Für die Metaboliten BMBA und BMHA wurden höhere terminale Halbwertszeiten (2 h) ermittelt. Aufgrund der insgesamt kurzen Halbwertszeiten konnte eine Kumulation der Metaboliten nach Mehrfachgabe ausgeschlossen werden. Mit Hilfe eines pharmakokinetischen Modells (Zwei-Kompartiment-Modell) war es möglich, die Bildung der Stoffwechselprodukte BNLA, TNLA, BMOA, BMHA und BMBA im Plasma zeitlich simultan zu beschreiben. Dadurch konnte der Metabolisierungsweg der a-Liponsäure im Organismus genauer erklärt und die resultierenden Konzentrationen der Metaboliten auf Basis der Muttersubstanz-Konzentrationen errechnet werden. Es war nicht möglich, die gemessenen Konzentrationen, weder von der Muttersubstanz noch von den möglichen wirksamen Metaboliten, in den verschiedenen Kompartimenten (Blutkreislauf, Gewebe oder Zelle) mit der lang anhaltenden Wirkung in einen zeitlichen Zusammenhang zu bringen. Weitere Untersuchungen mit empfindlicheren Meßmethoden und weitergehende zusätzliche Konzentrationsbestimmungen in den Kompartimenten in der Zelle (z.B. Mitochondrien) sind erforderlich, um die Korrelation zwischen der Pharmakokinetik und der Pharmakodynamik der R( )-a-Liponsäure oder möglicher wirksamer Metaboliten zu beschreiben.
Die Dissertation kombiniert die Methode der funktionellen Magnetresonanztomographie (fMRT) zur genauen räumlichen Lokalisation aufgabenkorrelierter parietaler Aktivierungen mit Transkranieller Magnetstimulation (TMS) zur systematischen Untersuchung der funktionellen Relevanz dieser Aktivierungen für die tatsächliche Leistungsfähigkeit. Die experimentelle Kombination beider Methoden ermöglichte die gezielte Stimulation der im tMRT identifizierten, mit visuospatialen Fähigkeiten assoziierten Hirnareale. Durch die systematische Auswertung der TMS-induzierten visuospatialen Leistungsveränderungen wurde die spezifische funktionelle Bedeutung dieser Hirnareale für visuospatiale Leistungen experimentell untersucht. Der zugrunde gelegte Versuchsplan umfasste sowohl visuospatiale Leistungen auf der Grundlage visuell dargebotener als auch mental vorgestellter Aufgaben. Dies ermöglichte die systematische Untersuchung, ob und inwieweit mentale visuospatiale Informationsverarbeitung die gleichen oder ähnliche Aktivierungsmuster im fMRT aufweist wie visuospatiale Verarbeitung visuell dargebotener Stimuli, und ob sich diese Aktivierungsmuster vorgestellter Stimuli unter dem Einfluss von rTMS in gleicher Weise als funktionell relevant erweisen. Aufgrund der separaten unilateralen Stimulation beider Hemisphären konnten darüber hinaus die unterschiedlichen behavioralen Auswirkungen einer Aktivierungsunterdrückung des linken und rechten Parietalkortex systematisch untersucht werden. Obwohl die Ausführung visuospatialer Aufgaben, sowohl auf der Grundlage visuell dargebotener als auch mental vorgestellter Stimuli, im fMRT mit einer bilateralen Aktivierung im Parietalkortex korrelierte, führte lediglich die TMS-induzierte temporäre Unterbrechung der neuronalen Aktivierung im rechten Parietalkortex zu einer signifikanten Verschlechterung in der Leistungsfähigkeit der damit assoziierten visuospatialen Aufgaben. Auf der Grundlage dieser Ergebnisse wurde ein modulares Modell der visuospatialen Imagination formuliert, in welchem den aufgabenkorrelierten bilateralen Aktivierungen aufgrund ihrer raum-zeitlichen Separierbarkeit unterschiedliche mentale Prozesse und aufgrund der mit TMS aufgezeigten funktionellen hemisphärischen Asymmetrie parietaler Aktivierung für visuospatiale Informationsverarbeitung unterschiedliche Kompensationsmechanismen zugeordnet wurden.
In der vorliegenden Dissertation wurden Antikörperfragmente, um sie zu oligomerisieren, an alpha-Helixbündel rekombinant fusioniert und die Fusionsproteine sowie deren Produktion untersucht. Dabei wurde durch Fusion eines Fv-Antikörperfragmentes an das trimere alpha-Helixbündel "Coil-Ser" das Fusionsprotein "Fv7E2-CS" entwickelt. Wegen der Fusion an Coil-Ser liegt das Ev-Fragment selbst in trimerem Zustand vor und kann auch sein Antigen, eine Cytochrom-c-Oxidase aus Paracoccus denitri/icans, binden und dadurch trimersieren. Antikörper gehören zur Immunabwehr der Wirbeltiere und sind Proteine, die in den Organismus eingedrungene, fremde Moleküle als "Antigene" spezifisch binden. Im momentan stark expandierenden Forschungsgebiet des "Antikörper-Designs" werden Antikörper und ihre Fragmente modifiziert, was besonders für die Entwicklung medizinischer Diagnostiken und Therapien vielversprechend ist. Eines der vielen Ziele ist die Steigerung der Bindungsaffinitäten, was unter anderem über die Vervielfältigung der natürlichen Bindestellen innerhalb eines künstlichen Antikörpermoleküls erreicht werden kann. Weiterhin möchte man Bindestellen gegen unterschiedliche Antigene in einem einzigen Antikörpermolekül vereinen, um dem Antikörper komplexere Funktionsfähigkeiten zu verleihen. Beide Ziele können durch Oligomerisierung der bindenden Antikörperfragmente verwirklicht werden. Zur künstlichen Oligomerisierung von Antikörperfragmenten wurde, neben anderen Strategien, die rekombinante Fusion an alpha-Helixbündel bereits einige Male erfolgreich angewandt. alpha-Helixbündel bestehen aus zwei bis etwa acht alpha-helikalen, längsseitig miteinander oligomerisierenden Peptidketten und können auch in natürlichen Proteinen als Oligomerisierungseinheiten fungieren. In der vorliegenden Dissertation wurden drei Fv-Antikörperfragmente und ein SchwerkettenAntikörperfragment mit drei verschiedenen alpha-Helixbündeln in unterschiedlichen Kombinationen rekombinant fusioniert und anschließend ihre Produktion und Funktion untersucht. Als Helixbündel zum Einsatz kamen das heterotetramere alpha-Helixbündel des neuronalen "SNARE"-Komplexes, die homo- als auch mit "Fos" heterodimerisierende Helix des AP-1-Transkriptionsfaktors ".Jun" und das synthetische, antiparallel homotrimerisierende Peptid "Coil-Ser". Die Expressionsprodukte vieler Fusionen konnten in Zellaufschlüssen mit Western Blots gefunden werden, nur einige aber ließen sich mit Affinitäts-Chromatographie in geringen Mengen (<0,1 mg/L Kultur) anreichern. Andere Produkte, bzw. bei einigen Fv-Fragmenten die Untereinheiten mit Peptid, waren durch die Fusion in ihrer Produktion deutlich gestört bis gar nicht vorhanden. Alle drei an Coil-Ser fusionierten Ev-Fragmente ließen sich in Mengen bis 0,5 mg/L Kultur anreichern. In der Gelfiltration zeigten sie sich mit vollständig assoziierten Untereinheiten, als auch mit vergrößerter, apparenter Molmasse im Vergleich zu den Fv-Fragmenten ohne fusioniertes Peptid. Von zweien der Coil-Ser-Fv-Fragmente konnte Antigenbindung beobachtet werden und davon bei Fv7E2-CS die Entstehung eines Fv-Antigen-Komplexes mit einer gegenüber dem ursprünglichen Antigen-Komplex sehr stark vergrößerten apparenten Molmasse. Mit analytischer Ultrazentrifugation wurde die Oligomerisierungsfähigkeit von Fv7E2-CS näher untersucht und für das ungebundene Fv-Fragment sowie für seinen Antigen-Komplex eine Massenkomponente mit im Vergleich zum jeweiligen Monomer dreifacher Molmasse gefunden. Für die Probe des Fv7E2-CS alleine wurde dabei ein Anteil an Komponenten trimerer Größenordnung von gut 95% ermittelt, also nahezu Homogenität, und in der Probe des Antigen-Komplexes zu 35 - 50 % Komponenten trimerer, sonst monomerer Größenordnung. Die Ursache für den niedrigeren Anteil an trimeren Komponenten in der Probe des Komplexes könnte hauptsächlich das hier vorhandene Detergenz sein, welches für das als Antigen fungierende Membranprotein Cytochrom-c-Oxidase nötig ist. Denn schon für das Fv7E2-CS alleine wurde in Kontrollen mit Detergenz eine Verringerung des Anteils an trimerer Komponente bzw. seiner mittleren Molmasse festgestellt. Das Fv-Fragment Fv7E2 ohne Peptid als auch dessen Antigen-Komplex zeigten in der Ultrazentrifuge keine bzw. nur unbedeutende Anteile an trimeren Massenkomponenten. Die Experimente deuten somit daraufhin, daß durch die Fusion des trimerisierenden Peptides Coil-Ser an Fv7E2 sowohl die Trimerisierung des Fv-Fragmentes, als auch bei Bindung des Antigens dessen Trimerisierung bewirkt wird. Das alpha-Helixbündel Coil-Ser ist folglich potentiell in der Lage, als Oligomerisierungseinheit für Fv-Antikörperfragmente eingesetzt zu werden. Wegen der aus Röntgenstrukturanalysen bekannten und für in Lösung prognostizierten Antiparallelität der Peptide im Coil-Ser-Bündel werden für die drei Fv-Fragmente bzw. die drei Bindestellen im Coil-Ser-Fusionsprotein einander entgegen-gesetzte Orientierungen vermutet, was für spätere Anwendungen von Bedeutung ist.
Das Angiotensin konvertierende Enzym (ACE) ist als eine der zentralen Komponenten des ReninAngiotensin-Systems entscheidend an der Regulation der vaskulären Funktion und Homöostase sowie an der Regulation des Flüssigkeits- und Elektrolythaushaltes beteiligt. Dabei katalysiert die Zinkmetallopeptidase ACE vor allem die Bildung des vasokonstriktorisch wirkenden Angiotensins II und die Degradation des vasodilatorisch wirkenden Bradykinins. Die Hemmung des ACE zur antihypertensiven Therapie ist klinisch weit verbreitet, wobei die zahlreichen protektiven Eigenschaften der eingesetzten, hochpotenten ACE-lnhibitoren nicht allein durch die Beeinflussung des Metabolismus der zwei beschriebenen vasoaktiven Peptide zu erklären sind. Vielmehr wird seit einiger Zeit angenommen, dass ACE beispielsweise durch eine Interaktion mit dem Bradykinin-B2-Rezeptor aktiv an der Regulation intrazellulärer Signaltransduktionsprozesse beteiligt ist. Da ACE als plasmamembranäres Ektoenzym in seiner kurzen cytoplasmatischen Sequenz fünf potentiell phosphorylierbare Serinreste besitzt, deren posttranslationale Modifikation durch Phosphorylierung möglicherweise intrazelluläre Signaltransduktionskaskaden beeinflussen könnte, wurde die potentielle Phosphorylierung von ACE sowie die Assoziation von ACE mit intrazellulären Proteinen analysiert. Mittels 32P-Markierung humaner Endothelzellen und ACE-überexprimierender Schweineaortenendothelzellen konnte erstmals die Phosphorylierung des ACE gezeigt werden, sowie unter Verwendung spezifischer Kinaseinhibitoren und anhand von in vitro Phosphorylierungsexperimenten die Proteinkinase CK2 als ACE-phosphorylierende Kinase identifiziert werden. Dies wurde zudem durch die Assoziation der CK2 sowohl mit ACE, als auch mit einem dem cytoplasmatischen Anteil von ACE entsprechenden Peptid bestätigt. Drei der intrazellulären Serinreste des ACE liegen innerhalb Konsensusse1uenzen bekannter Proteinkinasen, wobei nach Punktmutation der Serinreste Ser1253, Ser1263 oder Ser1270, entsprechend in Konsensussequenzmotiven für die PKC, PKA oder CK2 lokalisiert, der Ser1270-Rest als Hauptphosphorylierungsstelle des ACE identifiziert werden konnte. Die Reduktion der ACE-Phosphorylierung nach Mutation des Ser1270 zu Alanin sowie nach Hemmung der CK2 durch Einsatz des spezifischen lnhibitors 5,6-Dichloro-1-ß-D-ribofuranosylbenzimidazol (DRB) resultierte in einer verstärkten proteolytischen Spaltung des ACE, weiche extrazellulär in der juxtamembranär gelegenen "Stalk"-Region des Enzyms erfolgt, so dass vermehrt sekretiertes lösliches ACE in den Zellkulturüberständen der untersuchten Zellen zu finden war. Neben der CK2 fanden sich auch die schwere Kette nicht-muskulären Myosins (NMMHC), ß-Aktin, Annexin 2, die c-Jun NH2-terminalen Kinase (JNk) und die Proteinphosphatase PP1 assoziiert mit ACE oder einem dem intrazellulären Anteil von ACE entsprechenden Peptid. Da die an ACE gebundenen Proteine mehr oder minder in die Regulation intrazellulärer Signaltransduktionskakaden involviert sind, wurde überprüft, inwiefern die Aktivität oder Phosphorylierung dieser Proteine durch die Hemmung des ACE beeinflusst werden kann. Die Behandlung P-markierter Endothelzellen mit dem ACE-lnhibitor Ramiprilat resultierte deutlich nicht nur in einer transient gesteigerten Phosphorylierung des ACE selbst, sondern auch in einer verstärkten Phosphorylierung des ACE-gebundenen NMMHC. Dabei werden beide Proteine durch die ACE-assoziierte CK2 phosphoryliert, deren Aktivität deutlich nach Hemmung des ACE zunahm. Die Identität des ACE als aktives Signaltransduktionsmoleküi wurde zudem sehr überzeugend durch die Messung der JNK-Aktivität bestätigt, da die Stimulation mit Ramiprilat nur in Wildtyp-ACE exprimierenden Endothelzelien in einer Aktivierun dieser Kinase resultierte, wohingegen nach Mutation der ACE-Phosphorylierungsstelle (Ser1270) keine durch Ramiprilat gesteigerte JNK-Aktivität zu verzeichnen war. Ebenso führte neben der Hemmung des ACE die Stimulation mit dem ACE-Substrat Bradykinin zur lnitiation der beschriebenen Prozesse. Die durch ACE-lnhibitoren induzierte Signaltransduktion scheint auch an der Potenzierung und Reaktivierung der durch Bradykinin vermittelten Zellaktivierung beteiligt zu sein, da nur in ACE-exprimierenden Zellen die Hemmung der CK2 in einer verminderten Bradykinin-induzierten Endothelzellaktivierung resultierte und der ACE-lnhibitor diese Reduktion vollständig umkehrte. Die Entdeckung der posttranslationalen Modifikation des ACE durch Phosphorylierung zur Regulation der Sekretion des Enzyms sowie zur lnitiation intrazellulärer Signalkaskaden eröffnet eine neue molekulare Basis für das Verständnis und die Charakterisierung der zahlreichen protektiven Eigenschaften der ACE-lnhibitoren. Zudem liefert die Identifizierung des ACE als aktives Signaitransduktionsmolekül mit der Fähigkeit zum "Outside-In-Signaling" möglicherweise neue Ansatzpunkte für die Entwicklung antihypertensiver Therapien.