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Endocannabinoids (eCB) are signaling lipids and became known for their importance in the central nervous system as well as in immune defense. Beneficial effects of eCB are shown in processes of excitotoxic lesion, secondary damage and neuronal plasticity throughout the last years. Two canabinoid receptors, type 1 (CB1) and type 2 (CB2) as the respective endogenous ligands belong to the endocannabinoid system (eCBS). In 1990, the CB1 could be cloned and was localised mainly on neurons. Shortly thereafter in 1993, the CB2 was characterised and found primarily on cells belonging to the immune system. N-arachidonoylethanolamide (AEA), often called anandamide, and 2-arachidonoylglycerol (2-AG) are the best characterised eCB. N-palmitylethanolamide (PEA) and N-oleoylethanolamide (OEA) have no or only low affinity to CB1 but enhance the affinity of AEA significantly. This group is therefore often summarized as N-ethanolamides (NEA). ECB are derivates of arachidonic acid and are stored in membranes where they become hydrolysed on demand by specific enzymes. Traumatic brain injury altered the levels of eCB in the blood in vivo and when applied in vitro after neuronal damage, eCB could reduce the damaging burden. Further studies demonstrated that eCB are potent to down-regulate pro-inflammatory cytokines and most important to decrease neuronal excitation.
In the present study, the intrinsic regulation of the endocannabinoid system after neuronal damage over time was investigated in rat Organotypic Hippocampal Slice Cultures (OHSC). Temporal and spatial dynamics of eCB levels were analysed after transection of the perforant pathway (PPT) in originating neurons (enthorhinal cortex, EC), areas of deafferentiation/anterograde axonal degeneration (dentate gyrus, DG) and of the synaptically linked cornu ammonis region 1 (CA1) as well as after excitotoxic lesion in the respective regions.
A strong increase of all eCB was observed only in the denervation zone of the DG 24 hours post PPT. In excitotoxic lesioned OHSC all eCB were elevated, in the investigated regions up to 72 hours post lesion (hpl). The responsible enzyme for biosynthesis of the NEA, NAPE-PLD protein, was increased during the early timepoints of measurement (1-6 hpl). The responsible catabolizing enzyme, FAAH, and the CB1 receptor were up-regulated at a later timepoint, 48 hpl, explaining the eCB levels. In the present model, the inhibition of the enzyme responsible for 2-AG hydrolysis (MAGL) was neuroprotective as previously shown and a re-distribution within neurons and astrocytes during neuronal damage could be observed. In primary cell cultures microglia expressed the regulating enzymes of 2-AG and the enzyme responsible for NEA down-regulation, FAAH. Astrocytes expressed mainly the catalyzing enzymes, indicating the role for eCB break-down. All these findings together demonstrate the great capacity of the eCBS to control inflammatory processes and consequently neuronal cell death.
All effects of the known eCB could not be clarified by CB1/CB2 deficient mice. Several G-protein coupled receptors (GPR) are recently in discussion whether they might and should belong to the endocannabinoid system. The GPR55, the not yet cloned abnormal cannabidiol receptor and further GPRs are candidates as potential endocannabinoid receptors. Recently GPR55 has been discussed as a putative cannabinoid receptor type 3 (CB3). Quantitative PCR revealed that Gpr55 is present in primary microglia and the brain, but the exact regional and cellular distribution and the physiological/pathological effects downstream of GPR55 activation in the CNS still remain open. Therefore, the excitotoxic rat OHSC model, previously used to investigate the neuroprotective potency of eCB, was now used to investigate the neuroprotective potency of GPR55. Activation of GPR55 protected dentate gyrus granule cells in vitro after excitotoxic lesion, induced by NMDA. In parallel, GPR55 activation was able to reduce the number of microglia in the dentate gyrus. These neuroprotective effects vanished however in microglia depleted OHSCs as well as in OHSC transfected with Gpr55 siRNA, indicating a strong involvement of microglia in GPR55 mediated neuroprotection.
In summary, the present study found a strong time-dependent and anterograde mechanism of action of eCB after long-range projection damage and provided further evidence for the neuroprotective properties of eCB. The potential cannabinoid receptor 3 (GPR55) mediates neuronal protection on behalf of microglia.
Bei ca. 95% der chronisch myeloischen Leukämie (CML) und 20-30% der akuten lymphatischen Leukämie (ALL) des Erwachsenen liegt eine reziproke Chromosomentranslokation t(9;22)(q34;q11) vor, in deren Rahmen das BCR (Breakpoint Cluster Region) Gen auf Chromosom 22 mit dem ABL (Abelson-Leukämie-Virus) Gen auf Chromosom 9 fusioniert. Auf Chromosom 22 gibt es zwei verschiedene Bruchpunkte, die somit zur Bildung von unterschiedlichen Fusionsgenen führen. Bei der CML findet man den sogenannten „großen“ Bruchpunkt (M-bcr), während bei der Ph+ ALL der sogenannte „kleine“ Bruchpunkt (m-bcr) vorkommt. Das hybride Fusionsgen auf Chromosom 22q+ (Philadelphia-Chromosom) kodiert für das jeweilige BCR/ABL Protein, während das Fusionsgen auf Chromosom 9q+ für das reziproke ABL/BCR Protein kodiert. Das ABL-Protein ist eine Nicht-Rezeptor Tyrosinkinase, die eine wichtige Rolle in der Signaltransduktion und der Regulation des Zellwachstums spielt. Im BCR/ABL Fusionsprotein wird die Kinase-Aktivität von ABL, die im Normalfall streng reguliert ist, durch die Fusion mit BCR konstitutiv aktiv. Dadurch kommt es zur Deregulierung intrazellulärer Signalwege, welche die maligne Transformation hämatopoetischer Zellen verursacht. Eine zielgerichtete Inhibierung von BCR/ABL mittels ABL-Kinase-Inhibitoren induziert Apoptose in BCR/ABL transformierten Zellen, was eine komplette Remission im größten Teil Ph+ Leukämie Patienten zur Folge hat.
The Chikungunya virus (CHIKV) is a mosquito-transmitted alphavirus that causes high fever, rash, and recurrent arthritis in humans. The majority of symptoms disappear after about one week. However, arthritis can last for months or even years (in about 30% of cases), which makes people unable to work during this period. The virus is endemic in Sub-Saharan Africa, the Indian Ocean islands, India, and Southeast Asia. It has additionally caused several large outbreaks in the last few years, affecting millions of people. The mortality rate is very low (0.1%), but the infection rates are high (sometimes 30%) and the number of asymptomatic cases is rare (about 15%). The first CHIKV outbreak in a country with a moderate climate was detected in Italy in 2007. Furthermore, the virus has spread to the Caribbean in late 2013. Due to climate change, globalization, and vector switching, the virus will most likely continue to cause new worldwide outbreaks. Additionally, more temperate regions of the world like Europe or the USA, which have recently reported their first cases, will likely become targets. Alarmingly, there is no specific treatment or vaccination against CHIKV available so far.
The cell entry process of CHIKV is also not understood in detail, and was thusly the focus of study for this project. The E2 envelope protein is responsible for cell attachment and entry. It consists of the domain C, located close to the viral membrane, domain A, in the center of the protein, and domain B, at the distal end, prominently exposed on the viral surface.
In this work, the important role of cell surface glycosaminoglycans (GAGs) for CHIKV cell attachment was uncovered. GAGs consist of long linear chains of heavily sulfated disaccharide units and can be covalently linked to membrane associated proteins. They play an important role in different cell signaling pathways. So far, solely cell culture passage has revealed an increased GAG-dependency of CHIKV due to mutations in E2 domain A, which was associated with virus attenuation in vivo. However, in this work it could be shown that cell surface GAGs promote CHIKV entry using non-cell culture adapted CHIKV envelope (Env) proteins. Transduction and infection of cell surface GAG-deficient pgsA-745 cells with CHIKV Env pseudotyped vector particles (VPs) and with wild-type CHIKV revealed decreased transduction and replication rates. Furthermore, cell entry and transduction rates of GAG-containing cells were also dose-dependently decreased in the presence of soluble GAGs. In contrast, transduction of pgsA-745 cells with CHIKV Env pseudotyped VPs was enhanced by the addition of soluble GAGs. This data suggests a mechanism by which GAGs activate CHIKV particles for subsequent binding to a cellular receptor. However, at least one GAG-independent entry pathway might exist, as CHIKV entry could not be totally inhibited by soluble GAGs and entry into pgsA-745 was, albeit at a lower rate, still possible. Further binding experiments using recombinant CHIKV E2 domains A, B, and C suggest that domain B is responsible for the GAG binding, domain A possibly for receptor binding, and domain C is not involved in cell binding. These results are in line with the geometry of CHIKV Env on the viral surface. They altogether reveal that GAG binding promotes viral cell entry and that the E2 domain B plays a central role for this mechanism.
As no vaccine against CHIKV has been approved so far, another goal of this project was to test new vaccination approaches. It has been published that a single linear epitope of E2 is the target of the majority of early neutralizing antibodies against CHIKV in patients. Artificial E2-derived proteins were created, expressed in E.coli, and successfully purified. They consisted of 5 repeats of the mentioned linear epitope (L), the surface exposed regions of domain A linked by glycine-serine linkers (sA), the whole domain B plus a part of the β-ribbon connector (B+), or a combination of these 3 modules. Vaccination experiments revealed that B+ was necessary and sufficient to induce a neutralizing immune response in mice, with the protein sAB+ yielding the best results. sAB+, as a protein vaccine, efficiently and significantly reduced viral titers in mice upon CHIKV challenge, which was not the case for recombinant Modified Vaccinia virus Ankara (MVA; MVA-CHIKV-sAB+), as a vaccine platform expressing the same protein. These experiments show that a small rationally designed CHIKV Env derived protein might, after optimization of some vaccination parameters, be sufficient as a safe, easy-to-produce, and cheap CHIKV vaccine.
Epigallocatechin-3-gallate (EGCG) is a catechin found in green tea and was, in this work, found to inhibit the CHIKV life cycle at the entry state in in vitro experiments using CHIKV Env VPs and wild-type virus. EGCG was recently published to inhibit attachment of several viruses to cell surface GAGs, which is in line with the role for GAGs in CHIKV entry revealed in this work. EGCG might serve as a lead compound for the development of a small molecule treatment against CHIKV.
The human Long Interspersed Nuclear Element-1 (LINE-1, L1) is a member of the group of autonomous non-LTR retrotransposons found in almost every eukaryotic genome. L1 elements generate copies of themselves by reverse transcription of an RNA intermediate and integrate into the host genome by a process called Target Primed Reverse Transcription (TPRT). They are responsible for the generation of approximately 35% of the human genome, cover about 17% of the genome and represent the only group of active autonomous transposable elements in humans. L1 activity bears several risks for the integrity of the human genome, since the L1-encoded protein machinery generates DNA double-strand breaks (DSBs) and is capable of conducting numerous genome-destabilizing effects, e.g. causing deletions at insertion sites, disrupting or rearranging coding sequences and deregulating transcription of functional host genes. On the other side, L1 elements have had and still exert a great impact on human genome structure and evolution by increasing the genome size and rearranging and modulating gene expression. Furthermore, due to its endogenous and generally non-pathogenic nature, L1 is a promising candidate as vector for gene delivery in somatic gene therapy. The structure of the flanking regions between de novo L1 integrants and the genomic sequence suggests an involvement of cellular DSB repair pathways in L1 mobilization. To elucidate the role of DSB repair proteins in L1 retrotransposition, I disabled DSB repair factors ATM, ATR, DNA-PK, p53 and Ku70 by knock down (KD) using short hairpin RNA (shRNA) expression constructs. To inhibit the function of DSB repair factors PARP and Rad51, I used dominant negative (DN) PARP and Rad51 mutants. Applying a well established L1-retrotransposition reporter assay in HeLa cells, de novo retrotransposition events were launched in order to test L1 for its retrotransposition activity in the context of altered DSB repair conditions. I could show that L1 retrotransposition frequency after ATM KD had increased by 3-fold, while ATR and p53 KD reduced L1 retrotransposition by approximately one third. Unfortunately, the cytotoxic effects of the DNA-PK and Ku70 shRNA expression constructs were too strong to determine potential effects of DNA-PK and Ku70 KD on L1 retrotransposition. Inhibition of PARP function by expression of the DN mutant and overexpression of wild type PARP were found to increase L1 retrotransposition by 1.8 and 1.5, respectively, while Rad51 DN had no detectable effect. Interestingly, overexpression of wild type Rad51 seemed to roughly double L1 retrotransposition frequencies. Since in my experiments KD or expression of DN mutants was time-delayed to the onset of L1 retrotransposition after transfection into the cells, I developed a temporally controllable, tetracyclin transactivator (tTA)-dependent L1 retrotransposition reporter assay which will be of great value for future L1 retrotransposition studies that rely on temporally controllable retrotransposition. Due to a previously published hypothesis of L1 playing a role in brain development by contributing to somatic mosaicism in neuronal precursor cells, I generated a transgenic mouse (LORFUS) using the tTA-dependent L1 construct to further test this hypothesis. LORFUS harbors a bidirectional cassette driving simultaneous expression of a GFP-tagged L1 retrotransposition reporter and beta-galactosidase. It was bred to another transgenic mouse line expressing tTA in the forebrain. The double transgenic offspring was used to characterize L1 expression and retrotransposition patterns in the brain at postnatal day 15 (P15). General transgene expression indicated by beta-galactosidase activity was found in hippocampus, cortex and striatum, while retrotransposition events revealed by GFP expression were found in hippocampus, cortex, striatum, olfactory bulb and brainstem. These results suggested L1 retrotransposition in the granule layer of the dentate gyrus earlier than P15 and migration of cells carrying these events along the rostral migratory stream into the olfactory bulb. To facilitate the use of L1 as gene delivery tool in gene therapy or genetic engineering, I furthermore intended to manipulate the L1 target site recognition to allow the site-specific integration into defined genomic locations. To this end, I performed crystal structure-guided mutational analysis exchanging single amino acid residues within the endonuclease (EN) domain of L1 to identify residues influencing target site recognition. However, individual point mutations did not change the nicking pattern of L1-EN, but resulted in a reduction of endonucleolytic activity reflected by a reduced retrotransposition frequency. This suggests that additional factors other than the DNA nicking specificity of L1-EN contribute to the targeted integration of non-LTR retrotransposons in the host genomes.
This thesis reports on the results obtained by expression photoactivatable adenylyl cyclase from Beggiatoa spp. (bPAC) in cholinergic neurons from Caenorhabditis elegans (C. elegans) and the characterization of the role of a single neuron, RIS, during locomotion in the adult animal.
Pharmacological activation of adenylyl cyclases through Forskolin is known to induce increased neuronal output in diverse model organisms through a protein kinase A (PKA) dependent mechanism. Nevertheless, pharmacological assays are not spatially restricted, do not allow for precise and acute activation nor to cessation of the signal. Thus, an optogenetic approach for was selected trough the expression of photoactivatable adenylyl cyclase from Beggiatoa spp. (bPAC) in cholinergic neurons of Caenorhabditis elegans (C. elegans). This model organism was chosen due to its transparency, ease of maintenance, fast generation cycles as well as for being an eutelic animal. Further, its genome has been fully sequenced and the connectome of the neuronal network is known, thus allowing for precise analysis of neuronal function. Furthermore, the molecular mechanisms governing neuronal functions are well conserved up to primates. Mainly two optogenetical tools were applied, bPAC and the light gated cation channel channelrhodopsin 2 (ChR2).
Behavioral assays of bPAC photostimulation in cholinergic neurons recapitulated previous work performed with the photoactivatable adenylyl cyclase from Euglena gracilis (EuPACa), in which swimming frequency and speed on solid substrate were increased. Electrophysiological recordings of body wall muscle (BWM) cells by Dr. Jana F. Liewald showed that bPAC photoactivation led to an increase in miniature postsynaptic current (mPSC) rate and, in contrast to ChR2 invoked depolarization, also amplitude. Analysis of mutants deficient in neuropeptidergic signaling (UNC- 31) via electrophysiology performed by Dr. Jana F. Liewald showed that the increase in mPSC amplitude due to bPAC photoactivation requires neuropeptide release. This was confirmed by co-expression of bPAC with the neuropeptide marker NLP-21::Venus and subsequent fluorescence analysis of release, exploiting the fact that released neuropeptides are ultimately degraded by scavenger cells (coelomocytes). These were enriched with NLP-21::Venus after bPAC photostimulation, but no fluorescence could be observed in the UNC-31 mutants.
Additional analysis of the electrophysiological data performed by myself showed no modulation of mPSC kinetics dues to neuropeptidergic release induced by bPAC. Hence, neuropeptide release and action sites were in the cholinergic neurons, the latter including cholinergic motoneurons.
Dr. Szi-chieh Yu provided electron microscopy images of high pressure frozen, bPAC or ChR2 expressing animals. These were tagged by myself for automatic analysis of ultrastructural properties of the cholinergic presynapse, also during photoactivation of both optogenetic tools. Photoactivation of both induced a reduction of synaptic vesicles, with ChR2 showing a more severe effect. In contrast to ChR2, though, bPAC also reduced the amount of dense core vesicles (DCV), the neuropeptide transporters. Additionally, long bPAC photoactivation as well as ChR2 photoactivation led to the appearance of large vesicles (LV), presumably in response to the increased SV fusion rate. bPAC photostimulation also induced an increase in SV size, not observed after ChR2 photostimulation. In UNC-31 mutants, bPAC photostimulation could not lead to the SV size increase, a further argument for the presynaptic effect of the released neuropeptide. Additional analysis of electrophysiology paired with pharmacology, performed by Dr. Jana F. Liewald, showed that mPSC amplitude increase requires the function of the vesicular acetylcholine transporter.
A further effect observed in the ultrastructure of bPAC photostimulated cholinergic presynapses was a shift in the distribution of SV regarding the dense projection. An analysis of cAMP pathway mutants showed that synapsin is required for bPAC induced behavior effects. Synapsin is known to mediate SV tethering to the cytoskeleton. Here, I show evidence for a new role of synapsin in controlling the availability of DCVs for fusion and thus, in neuropeptidergic signaling.
In the second part of my thesis I characterized the function of the GABAergic interneuron RIS in the neuronal network of C. elegans. RIS was shown to induce lethargus, a sleep-like state, during all larval molts, but its function in the adult animal was not yet described. Specific RIS expression of ChR2 achieved by a recombinase based system allowed to acutely depolarize the neuron during locomotion, which led to an acute behavioral stop. Diverse signal transduction pathway mutants were analyzed showing that the phenotype was induced by neuropeptidergic signaling. Through mutagenesis followed by whole genome sequencing data analysis as well as analysis of RIS specific RNA sequencing data further narrowed the signal transduction pathway to mediate the locomotion stop behavior. Since the neuropeptide and, to some extent, the neuron are conserved across nematodes, an argument is outlined in favor of the conservation of this sleep-like state.
In addition, since ChR2 could induce neuropeptidergic signaling from RIS, secretion of vesicles is regulated by variable pathways depending on the neuronal identity. Nevertheless, expression of bPAC in RIS allowed to optogenetically increase the probability of short stops, as observed by expression of a calcium sensor (GCaMP) in RIS and analysis of its intrinsic activity in the adult animal.
Die Etablierung der Festphasensynthese innerhalb der letzten Jahrzehnte macht hoch modifizierte Oligonukleotide verfügbar. Damit werden Methoden wie Einzelmolekül-aufgelöstes Tracking möglich, um beispielsweise den Weg einer einzelnen RNA von der Transkriptionsstelle im Nukleus bis zur Proteinbiosynthese im Cytoplasma verfolgen und kritische Stelle verstehen zu können. In den letzten Jahren entwickelten sich auch vermehrt Fragen zur lokalen Proteinsynthese. Dabei nimmt man besonders im Fall von polaren Zellen wie Neuronen an, dass die Proteinbiosynthese nicht global im Cytosol stattfindet, sondern es einen Transport der „ruhenden“ RNA bis zu dem Ort geben muss, an dem das entsprechende Protein lokal benötigt wird. In dieser vorliegenden Arbeit sollen nun in zwei Hauptprojekten molekulare Werkzeuge entwickelt werden, mit deren Hilfe oben genannte Fragestellungen in Zukunft beantwortet werden könnten. Im ersten Hauptprojekt wurde dazu eine neue Generation lichtaktivierbarer Molecular Beacons (von engl.: molekulare Leuchtfeuer) entwickelt. Dabei handelt es sich um Oligonukleotide, die komplementär zu einer intrazellulären RNA-Sequenz (Target-RNA) sind und mit Fluorophor und Fluoreszenz-Quencher modifiziert werden. Bei den lichtaktivierbaren Designs kann Fluoreszenz detektiert werden, wenn der Molecular Beacon an seine Targetsequenz gebunden und zusätzlich zuvor eine Lichtaktivierung stattgefunden hat. Im Gegensatz zu früheren Designs wurde bei diesem hier vorgestellten Molecular Beacon der Fluorophor mit Hilfe eines zweiten photoabspaltbaren Quenchers verbunden. Dadurch kann der Beacon an seine Targetsequenz binden, obwohl noch keine Lichtaktivierung stattgefunden hat. Fluoreszenz kann allerdings erst nach photoinduzierter Abspaltung des zusätzlichen Quenchers detektiert werden. In der vorliegenden Studie konnten dadurch extrem gute Signal-zu-Rausch-Verhältnisse von bis zu 170:1 erreicht werden. Zusätzlicher Vorteil dieses Designs ist die Tatsache, dass eine Vielzahl kommerziell erhältlicher Fluorophor-Quencher-Paare verwendet werden kann. Dabei ist es nicht relevant, ob der entsprechende Farbstoff co-synthetisch während der Festphasensynthese oder post-synthetisch durch die Modifikation funktioneller Gruppen angebracht wird. Nach anfänglichen in vitro Tests wurden die besten Molecular Beacons in vivo in der Zuckmücken-Art Chironomus tentans getestet. Dieser Organismus ist aufgrund seiner Polytänchromosomen, der sog. Balbiani Ringe, interessant. Dabei handelt es sich um ein Chromosom, das viele Chromatiden mit jeweils identischen Gensequenzen enthält. Diese Balbiani Ringe haben eine sehr charakteristische Struktur. Die Molecular Beacons wurden in den Zellkern injiziert und anschließend photoinduziert. Auch in den in vivo Messungen zeigte sich die Überlegenheit des neuen Design mit Signal-zu-Rausch-Verhältnissen von bis zu 80:1. Im zweiten Hauptprojekt war es das Ziel, lokale mikroRNA-Reifung in Neuronen nachzuweisen bzw. sichtbar zu machen. MikroRNA (kurz miRNA) ist einer der wichtigsten zellulären Werkzeuge, um Genregulation auf post-transkriptioneller Ebene zu ermöglichen. Für dieses Projekt wurde eine Sonde entwickelt, die den nativen miRNA-Vorläufer – die sog. prä-miRNA – nachbildet. Der enzymatische Reifungsprozess durch die RNase Dicer sollte durch Fluoreszenz nachweisbar sein. Dies gelang durch Modifikationen der Sequenz um die enzymatische Schnittstelle herum. Durch den Dicer-vermittelten, enzymatischen Verdau wurde ein Fluorophor von einem Quencher getrennt, wobei der fluoreszente Farbstoff an der reifen mikroRNA verblieb. Nach der Etablierung der in vitro Tests und Auswahl des optimalen Fluorophor-Quencher-Paars zeigte sich in einem Kontrollexperiment, dass bei Verwendung von neuronalen Ganglien aus Dicer-Knock-Out Mäusen kein Fluoreszenzanstieg zu beobachten war. Dieses Experiment bewies, dass bisher beobachtete Fluoreszenzanstiege Dicer-spezifisch waren. Im nächsten Schritt wurden in vivo Messungen durchgeführt. Es zeigte sich dabei, dass die sog. Patch Clamp Technik herkömmlichen Transfektionsmethoden überlegen war. Unter normalen Bedingungen zeigte sich sowohl im Soma als auch in den Dendriten ein Fluoreszenzanstieg. Durch Depolarisation des Neurons konnte dieser Effekt noch verstärkt werden, wobei das somatische Signal grundsätzlich als höher einzustufen war. Interessanterweise führte eine Blockade der NMDA-Rezeptoren auch bei gleichzeitiger Depolarisation zu einer verringerten Fluoreszenz. Dies lässt darauf schließen, dass die Reifung der untersuchten prä-miRNA in Dendriten von der Aktivität des NMDA-Rezeptors bzw. einem als Konsequenz ansteigenden Ca2+-Spiegels in der Zelle abhängig ist. In einem weiteren Experiment wurde nach „Beladung“ eines Neurons mit der prä-miRNA-Sonde Dendriten punktuell aktiviert. Dies konnte durch Licht-aktivierbares Glutamat erreicht werden. Im zentralen Nervensystem gilt Glutamat als der wichtigste aktivierende Neurotransmitter. Es konnte beobachtet werden, wie einerseits Fluoreszenz lokal an der aktivierten Stelle anstieg und gleichzeitig sog. dendritische Spines wuchsen. Zum Teil war auch ein Wachstum benachbarter Spines zu beobachten. Dabei handelt es sich um pilzförmige Aussackungen der Dendriten an Stellen, an denen Vernetzungen zu Synapsen anderer Neuronen existieren. Als Ergebnis kann geschlussfolgert werden, dass es eine lokale Reifung der untersuchten prä-miRNA durch Dicer in Dendriten gibt. Dieser Prozess kann sehr spezifisch und lokal durch die Aktivierung einzelner synaptischer Verbindungen initiiert werden.
This thesis primarily covers a systematic assessment of quantum chemical methods to predict accurate 19F NMR shifts for fluoroarenes and magnetic exchange coupling constant (J) in organic spin dimers which are basic building blocks for rational designing of organic magnetic materials.
One of the most important goals in chemistry is to design and synthesize molecules with optimum properties. This thesis is divided into two parts: the first part comprises of a systematic effort to find an inexpensive quantum chemical method to predict accurate 19F NMR chemical shifts (within an accuracy of 2 ppm) for perfluoraromatics. Essentially, these strenuous efforts have been devoted to find best DFT functional and basis set combination to predict accurate 19F shifts. In addition,the influence of geometrical parameters, solvents, chemical environment was also analyzed. Various correction approaches were tested to correct the calculated shifts. The influence of various functionals and basis sets was also analyzed on the correction efficiency of an individual scheme. All the NMR calculation methods already being used and correction approaches were verified to predict shifts of three different fluorine-substituted molecular sets. These structure sets include fluorobenzenes, substituted benzenes and fluorine substituted aromatic fused rings (e.g. fluorine substituted anthracene).
In the second part of this thesis, we investigated the accurate prediction of magnetic exchange couplings (J) for organic spin dimers using quantum chemical methods. We analyzed the performance of various DFT methods and various post-HF methods, such as the CASSCF, CASPT2, MSTDISD, DDCI1, DDCI2, DDCI3, and FCI to predict magnetic exchange couplings (J).
Overview of the Chapters:
Chapter 1, presents a brief theoretical introduction to the Schrödinger equation and its application in quantum mechanical calculations, the Hartree-Fock approximation, basis sets, electron correlation energy, and density functional theory (using pure and hybrid functionals).
In chapters 2 and 3, an introduction is given for quantum chemical approaches used to calculate NMR parameters and magnetic exchange coupling constants. We discuss an effective spin Hamiltonian, the Breit-Pauli Hamiltonian (BPH), chemical shielding tensor and total energy relationship, measuring of the NMR spectra, and different techniques to deal with gauge origin problem. In addition, the theoretical background of magnetic exchange coupling constant calculation for spin dimers, the Heisenberg-Dirac-van-Vleck Hamiltonian (HDVV) and the Noodelman's broken-symmetry approach for calculating J values are briefly discussed.
Chapter 4, presents a benchmark study of various DFT functionals and basis sets to calculate accurate C-F bond lengths and 19F chemical shifts. High-resolution NMR spectral data of complex molecules are often difficult to interpret. Great scientific efforts have been devoted to search for a computational approach to interpret experimental NMR data. Quantum chemical methods such as the CCSD(T) method offer high accuracy in calculation of NMR parameters but being computationally too demanding they cannot be applied to large chemical systems. On the other hand, density functional theory (DFT) is achieving a steady progress among diversity of computational techniques. An accuracy within 2 ppm deviation from the experimental values in 19F chemical shifts can be achieved if the NMR calculation is performed using accurate equilibrium geometries, GIAO is used to tackle gauge origin problem and electron correlation is properly treated by employing a high level of theory (e.g. CCSD (T)/cc-pVQZ). We found that the calculation of 19F shielding tensors with the density-functional theory does not provide any noticeable improvement over the HF method. Post-HF theory demands too much computational resources that makes them impossible to use for large systems [35] .
We found that a quantitative prediction of NMR shifts can be made as the errors introduced by theoretical methods are cancelled out while calculating shifts. Various benchmark studies in this thesis show that 19F chemical shifts calculated for perfluoraromatics with the M06-L, BHandH, BHandHLYP in combination with the 6-311+G (2d,p) basis set are within 4 ppm deviation from the experiments. Furthermore, we noted that NMR calculations on accurate
C-F (e.g. PBE/6-311G (d, p)) bond lengths does not show any improvement if the NMR calculation and optimization are performed at the same level of theory. A significant improvement can be achieved on calculated 19F NMR shifts, if some correction schemes are used.
In chapter 4 we discuss various correction schemes applied to correct the calculated 19F chemical shifts. A multi-standard approach (MSTD) was used to minimize the error that may occur due to the difference in the nature of the reference compound and test molecules [122]. We propose another approach to correct shielding constants which is the reference corrected approach. This approach makes a correction similar to the MSTD. We also tested a Linear Regression Correction Approach and we noted that this is the best approach amongst all. This is found to be less dependent on the theoretical method. We use conformation averaging corrections to correct the calculated shifts[126].
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In der vorliegenden Arbeit wurde ein integrativer Netzwerkmodellierungsansatz gewählt, um die Rolle des Endothels im Kontext der Arteriosklerose zu untersuchen. Hierbei wurden bioinformatische Analysen, laborexperimentelle Versuche und klinische Daten vereinigt und aus dieser Synthese neue klinisch relevante Gene identifiziert und beschrieben.
Das Endothel trägt maßgeblich zur Homöostase des vaskulären Systems bei und eine Dysfunktion des Endothels fördert die Entstehung der Arteriosklerose. Im Zuge der Atherogenese entstehen vermehrt reaktive Sauerstoffspezies, die Lipide in der Membran von Plasma-Lipoprotein-Partikeln und in der zellulären Plasmamembran oxidieren. Eine Gruppe solcher oxidierter Membranlipide ist oxPAPC, das in erhöhter Konzentration in arteriosklerotischen Plaques und lokal an Orten chronischer Entzündung im vaskulären System vorkommt. Weitherhin findet sich diese Gruppe von oxidierten Phospholipiden in oxidierten LDL-Partikeln, in denen oxPAPC die Bindung an Makrophagen vermittelt und hierdurch maßgeblich zur Bildung der Schaumzellen und damit zum arteriosklerotischen Prozess beiträgt. Die durch oxPAPC verursachte Veränderung der Endothelzelle ist bisher wenig erforscht. Es ist jedoch bekannt, dass oxPAPC die Transkriptionslandschaft in Endothelzellen tiefgreifend verändert. Um der Komplexität der Endothelzellveränderung gerecht zu werden, wurde ein bayesscher Ansatz angewendet.
In einem ersten Schritt wurden Expressionsprofile von humanen Aortenendothelzellen (HAEC) aus 147 Herztransplantatspendern verwendet. Diese Expressionprofile enthalten Transkriptionsinformationen der 147 HAEC, die mit oxPAPC oder Kontrollmedium behandelt worden waren. Es wurden signifikant koexprimierte Gene identifiziert und hiervon Gen-Paare berechnet, die einen differentiellen Vernetzungsgrad zwischen Kontroll- and oxPAPC-Status aufweisen. Dieses Netzwerkmodell gibt darüber Aufschluss, welche Gene miteinander in Verbindung stehen. 26759 Gene-Paare, die differentiell verbunden und signifkant koexprimiert waren, wurden hierarchisch gruppiert. Es wurden neun Gen-Gruppen mit einer erhöhten und elf Gen-Gruppen mit einer verminderten Konnektivität nach oxPAPC identifiziert. Gruppe 6 der erhöhten Konnektvitäts-Gruppen wies hierbei die höchste kohärente Konnektivität von allen Gruppen auf. Eine Analyse signifikant überrepräsentierter kanonischer Gensätze ergab, dass diese Gruppe insbesondere Serin-Glycin-Aminosäuremetabolismus, tRNA- und mTOR-Aktivierung wiederspiegelte. Der hier gewählte Netzwerkmodellierungsansatz zeigte auf, dass der Aminosäuremetabolismus durch oxidizerte Phospholipide massiven Veränderungen unterworfen ist.
Um den Mechanismus der Veränderung des Aminosäuremetabolismus näher zu untersuchen, wurden bayessche Netzwerkmodelle verwendet. Dieses Netzwerkmodell enthält im Gegensatz zum differentiellen Koexpresssionsmodell gerichtete Informationen innerhalb des Netzwerkgraphes. Die Gen-Gen Verbindungen sind kausal, wodurch sich eine Hierarchie bildet und Schlüsselfaktoren innerhalb des Netzwerks bestimmt werden können. Durch die Integrierung von Expressionsprofilen und Genomprofilen derselben HAEC-Kohorte und der Inferenz von kausalen Gen-Gen-Verbindungen ergaben sich zwei bayessche Netze: Kontroll- und oxPAPC-Netzwerk. Permutationsuntersuchungen und systematische Beurteilung im Vergleich zu Gen-Gen-Verbindungen in Online-Datenbanken zeigten eine erhöhte Prognosefähigkeit der beiden HAEC bayesschen Netze. Es wurden die Schlüsselfaktoren und deren Teilnetzwerke berechnet und auf biologische Wege hin untersucht. Hierbei wurde das mitochondriale Protein MTHFD2 als ein Schlüsselfaktor für ein Teilnetzwerk des oxPAPC bayesschen Netzes identifiziert. Dieses Teilnetz zeigte eine ähnliche Gensatzanreicherung wie GOC-AA und überlappte mit diesem signifikant.
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Die Entwicklung von neuartigen, funktionellen Materialien ist eine komplexe Aufgabe, da die Gesamteffizienz der zu entwickelnden Materialien von einer Vielzahl von Faktoren abhängt. Während die auf einer molekularen Ebene durchgeführte Funktionalisierung via chemischer Reaktionsführung genauso wichtig ist wie die makromolekulare Anordnung, kann die Frage nach einer geeigneten Verbesserung von gegenwärtigen Materialien nicht nur auf einer dieser beiden Ebenen beantwortet werden. Die in dieser Arbeit präsentierten Ergebnisse basieren auf der mirkoskopischen aber auch markoskopischen Betrachtung von neuartigen, funktionellen Nanomaterialien und den daraus gewonnenen Erkenntnissen. Das übergeordnete Ziel ist dabei das Verständnis und die Charakterisierung von Ladungsseparationsprozessen und die daraus resultierende Erzeugung von elektrischen Strömen in organischen photovoltaischen Materialien.
Die relevanten Ladungsseparationsprozesse werden oft im Kontext der Dissoziation von Exzitonen, gebundenen Elektron-Loch Paaren, beschrieben, welche innerhalb der Donordomäne eines beliebigen Donor-Akzeptor-Materials erzeugt werden. Dabei ist der Prozess der Exzitonengenerierung abhängig von der Nanomorphologie des entsprechenden Materials, typischerweise so genannten Bulk-Heterojunctions. Dahingehend ist es notwendig, die Effekte von intermolekularen Wechselwirkungen sowohl mittels quantenmechanischer als auch dynamischer Methoden zu betrachten. Um alle relevanten Zeitskalen und Prozesse zu betrachten ist es weiterhin notwendig, auf sowohl eine deterministische Darstellung im Rahmen von quantendynamischen Methoden als auch statistischen Methoden zurückzugreifen.
Um die oft ultraschnellen und kohärenten Exzitonendissoziationsprozesse zu untersuchen wurde eine Kombination aus high-level ab initio Methoden und zeitabhängiger Dichtefunktionaltheorie (TDDFT) angewandt, um geeignete Modellhamiltonians zu parametrisieren, welche schließlich mittels der Multi-Configurational Time-Dependent Hartree (MCTDH) und der Multilayer (ML-MCTDH) variante propagiert wurden. Die MCTDH Methode hat sich als geeignete Methode erwiesen um eine voll quantendynamische Beschreibung von bis zu 100 Freiheitsgraden durchzuführen; die ML-MCTDH Methode erlaubt gar bis zu 1000 Freiheitsgrade quantendynamisch zu behandeln. Die Parametrisierung der Modellhamiltonians, auf welchen die quantendynamische Behandlung basiert, wurde dabei für kleine, jedoch repräsentative Fragmente durchgeführt. Die geeignete Wahl dieser Fragmente sollte sicherstellen, dass zum einen alle relevanten intermolekularen als auch intramolekularen Wechselwirkungen enthalten sind, jedoch gleichzeitig eine möglichst akkurate Beschreibung mittels high-level elektronenstrukturtheoretischer Methoden in gegebener Zeit möglich ist.
Mit Hilfe dieser Methodenkombination wurden zwei Arten von funktionellen organischen Materialien untersucht. Das erste untersuchte System ist ein neuartiges Donor-Akzeptor System, bestehend aus selbstorganisierenden Oligothiophen-Perylenediimid Dimeren, welche in der Gruppe von S. Haacke und S. Mery der Universität Straßburg synthetisiert und spektroskopisch untersucht wurden. Die quantendynamischen Simulationen an diesem System sollten die Ergebnisse der experimentellen, zeitaufgelösten pump-probe Spektroskopie validieren und die dürftige Effizienz im Hinblick auf eine effektive Ladungstrennung erklären. Dabei konnte gezeigt werden, dass nach der Exzitonendissoziation Elektron und Loch auf räumlich benachbarten Donor- und Akzeptorfragmenten lokalisiert werden, was schließlich zu einem Rekombinationsprozess führen wird. Das zweite untersuchte System ist eine Kombination von Poly(3-Hexylthiophen-2,5-diyl) (P3HT) als Elektronendonor und [6,6]-Phenyl-C61 Butansäure Methyl-Ester (PCBM) als Elektronenakzeptor, welches schon hinreichend stark in diversen theoretischen und experimentellen Studien untersucht wurde. Aufbauend auf einem Gittermodell, welches in unserer Gruppe entwickelt wurde, wurde das Modellsystem um Charge Transfer Exzitonen in der Donordomäne erweitert. Die Bedeutung von solchen Charge Transfer Exzitonen in regioregulären Oligothiophenaggregaten ist ein aktuelles Thema in der Wissenschaft, sowohl in experimentellen aber auch theoretischen Abhandlungen. Neben der theoretischen Beschreibung zur Entstehung solcher Charge Transfer Exzitonen liegt ein besonderes Augenmerk auf dem Einfluss dieser predissoziierten Elektron-Loch Paaren auf die Ladungsseparationsdynamik zwischen Donor und Akzeptor sowie die Generierung von freinen Ladungsträgern. Dieser Aspekt der Ladungsseparation in einem P3HT-PCBM System wurde in dieser Art und Weise in dieser Arbeit zum ersten mal untersucht.
Neben dem zuvor erwähnten Donor-Akzeptor System erster Generation der Universität Straßburg wurde eine zweite Variante dieses Systems entwickelt, welches sich bei bisherigen experimentellen Untersuchungen als wesentlich effizienter erwies. Der interessante Prozess der Ladungsseparation ist dabei allerdings auf einer Zeitskala von mehreren hundert Pikosekunden angesiedelt, sodass kinetische Monte Carlo Methoden verwendet werden mussten um diese Prozesse zu modellieren. Dazu wurde ein Fortran90 Code entwickelt, welcher den First Reaction Method Algorithmus verwendet und explizite Delokalisationsprozesse behandelt, welche in dieser Form in kommerziellen Programmpaketen nicht enthalten ist. In vorangehenden Arbeiten konnte gezeigt werden, dass die Delokalisation von Exzitonen zu einer effektiven Herabsetzung der energetischen Barriere der Ladungsseparation führt und somit die Effizienz zur Stromumwandlung gesteigert werden konnte. Erste Simulationen mit diesem Code an idealisierten und zufällig generierten Donor-Akzeptor Morphologien lieferten realistische Werte für makroskopische Observablen wie Ladungsträgermobilitäten. Weiterhin wurden Simulationen einer coarse-grained Struktur zur zweiten Generation des Donor-Akzeptor Systems durchgeführt, ebenfalls mit Hinblick zur Untersuchung der Ladungsträgermobilität.
Gepulste dipolare EPR-Spektroskopie ist eine wertvolle Methode, um Abstände von 1.5 bis 10 nm zwischen zwei Spinmarkern zu messen. Diese Information kann für Strukturbestimmungen hilfreich sein, wo traditionelle Methoden wie Kristallstrukturanalyse und NMR nicht angewendet werden können. Zusätzlich ist es möglich, Änderungen in Konformation und Flexibilität zu verfolgen. Für diese Studien haben sich stabile Nitroxidradikale als Spinmarker etabliert. Diese werden spezifisch durch die site-directed spin labelling Methode (SDSL) kovalent an das zu untersuchende Biomolekül gebunden. In den letzten Jahren wurden weitere Spinmarker für Abstandsbestimmungen mittels EPR-Spektroskopie entwickelt. Besonders interessant sind Triarylmethylradikale (im Folgenden abgekürzt als Trityl) und paramagnetische Metallzentren.
Im Vergleich zu Nitroxidradikalen hat das Tritylradikal einige Vorteile: Eine höhere Stabilität in einer reduzierenden Umgebung wie im Inneren von Zellen, längere Elektronenspin-Relaxationszeiten bei Raumtemperatur und ein schmaleres EPR-Spektrum. Deswegen ist dieses organische Radikal ein alternativer Spinmarker, der besonders gut für die Forschung von Biomolekülen in einer nativen Umgebung unter physiologischen Bedingungen geeignet ist. Auch paramagnetische Metallzentren sind weniger reduktionsempfindlich als Nitroxidradikale. Zusätzlich sind diese Spinmarker interessant in biologischen Fragestellungen. Zum Beispiel besitzen zahlreiche Enzyme paramagnetische Manganzentren als Cofaktoren. Zudem kann Magnesium, ein wesentlicher Cofaktor in Enzymen, Nukleinsäuren und Nukleotid-Bindungsdomänen der G- und Membranproteine, oft durch das paramagnetische Mangan ersetzt werden. Um Abstandsmessungen an Biomolekülen, die nur ein Metallzentrum besitzen, durchzuführen, können zusätzliche Spinmarker in Form eines Nitroxid-, Tritylradikals oder eines anderen paramagnetischen Metallkomplexes mithilfe der SDSL-Methode kovalent gebunden werden.
Nitroxidradikale, Tritylradikale und Metallzentren haben deutlich unterschiedliche EPR-spektroskopische Eigenschaften, welche oft als orthogonale Spinmarker bezeichnet werden. Solche Spinmarker sind nützlich für die Untersuchung von verschiedenen Untereinheiten bei makromolekularen Komplexen. Somit können die intramolekularen Abstände innerhalb einer Untereinheit sowie intermolekularen Abstände zwischen den unterschiedlichen Untereinheiten mit nur einer einzigen Probe bestimmt werden. Zusätzlich können die orthogonalen Marker sehr effektiv genutzt werden, um Metallzentren in Biomolekülen mithilfe der Trilateration-Strategie genau zu lokalisieren.
Die hier vorliegende Doktorarbeit beschäftigt sich mit der Nutzung dieser neuen Spinmarker für Abstandsmessungen. Solche Spinmarker sind noch kaum erforscht, obwohl sie für biologische Anwendungen eine große Rolle spielen könnten.
Das erste Ziel dieser Doktorarbeit war eine Studie über Tritylradikale mithilfe der dipolaren EPR-Spektroskopie. Zu diesem Zweck wurden sowohl double quantum coherence (DQC) und single frequency technique for refocussing dipolar couplings (SIFTER) Experimente als auch Hochfrequenz pulsed electron electron double resonance (PELDOR) Experimente mit einem Trityl-Modellsystem durchgeführt. Dabei wurden die Besonderheiten der unterschiedlichen dipolaren Spektroskopiemethoden mit diesem Spinmarker untersucht, um die Empfindlichkeit und Robustheit für die Abstandsmessungen zu optimieren.
Das zweite Ziel war eine Studie über den Einfluss der Hochspin-Multiplizität des Mangans auf die Abstandsbestimmungen. Für diesen Zweck wurde zuerst ein Modellsystem mit einem orthogonalen Mn2+ Ion und Nitroxidradikal mithilfe der PELDOR-Spektroskopie untersucht. Anschließend wurde ein weiteres Modellsystem mit zwei Mn2+-Ionen untersucht, um PELDOR und relaxation-induced dipolar modulation enhancement (RIDME) Experimente bezüglich ihrer Empfindlichkeit und Robustheit sowie Genauigkeit der Datenanalyse zu optimieren.
Das Trityl-Modellsystem wurde in der Arbeitsgruppe von Prof. Sigurdsson synthetisiert. Die EPR Messungen wurden bei zwei verschiedenen Mikrowellenfrequenzen (34 und 180 GHz) durchgeführt. Es wurde gezeigt, dass die Auswahl der optimalen Methode von den EPR-spektroskopischen Eigenschaften des Systems bei den jeweiligen Mikrowellenfrequenzen abhängig ist. Das EPR-Spektrum des Trityls ist bei 34 GHz so schmal, dass das ganze Spektrum von einem üblichen Mikrowellenpuls angeregt werden kann. In diesem Fall sind die DQC und SIFTER Experimente am besten geeignet. Der mit diesen Methoden bestimmte Abstand von 4.9 nm ist in guter Übereinstimmung mit Werten aus der Literatur. Es wurde festgestellt, dass die SIFTER Messung eine höhere Empfindlichkeit als DQC besitzt, da das Signal-zu-Rausch Verhältnis um den Faktor vier größer ist. Außerdem ist die SIFTER-Methode experimentell weniger anspruchsvoll, da ein deutlich kürzerer Phasenzyklus für die Mikrowellenpulse benötigt wird. ...