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Im Rahmen der vorliegenden Arbeit wurden zwei Knockout-Mutanten für die Cyclophiline CypA1 und CypA2 hergestellt. Für die Konstruktion wurde nicht nur das eigentlich Gen verwendet, sondern auch umliegende Bereiche. Im Endeffekt standen der homologen Rekombination an beiden Seiten des Knockout-Konstrukts ca. 1000 bp zur Verfügung. Zunächst wurden die DNA-Abschnitte der Cyclophiline aus der genomischen DNA von Streptomyces lividans mittels PCR isoliert. Aufgrund des hohen GC-Gehalts wurde die Amplifikation in Fragmenten durchgeführt. Es wurden verschiedene PCR-Bedingungen getestet und für jedes Fragment optimale Bedingungen ermittelt. Nach Aufreinigung und A-Tailing folgte eine Ligation mit pGemT-Easy. Die erhaltenen Fragmente wurden sequenziert und anschließend über mehrere Klonierungsschritte in E. coli wieder zusammengefügt. Dabei wurde eine Apramycinresistenz-Kassette so in das Gen eingebaut, dass die eigentliche Information für das Cylophilin-Gen zerstört wurde. Das daraus resultierende Knockout-Konstrukt wurde in den temperatursensitiven pGM160, einem E.coli-Streptomyces-Shuttle Vektor, kloniert und in Streptomyces lividans transformiert. Nach einem Temperaturshift integrierte der temperatursensitive Vektor über homologe Rekombination in das Genom. Die DNA der potenziellen Mutanten wurde auf den zielgerichteten Einbau des Knockout-Konstrukts im gewünschten Cypclophilin-Gen untersucht. Mittels PCR konnten entsprechende Amplifikate hergestellt werden, die den Nachweis für die erfolgreiche homologe Rekombination lieferten. Der physiologische Zustand des Zellstoffwechsels kann durch extreme Umweltbedingungen wie Nährstoffdefizienz oder Hitzeschock in radikaler Weise verändert werden. Bei diesen Prozessen können Peptidyl-Prolyl cis/trans Isomerasen beteiligt sein, indem sie durch Isomerisation der Prolyl-Bindung ein Enzym modulieren oder bei der Expression von neuen Proteinen im Rahmen der Proteinfaltung mitwirken. Experimente unter veränderten Wachstumsbedingungen wie z.B. Nährstoffdefizienz oder Hitzeschock können Aufschluss darüber geben, ob in diesem Fall Peptidyl-Prolyl cis/trans Isomerasen an der Modulation von Enzymen beteiligt sind.
The formation and maintenance of a defined three-dimensional structure is a prerequisite for most proteins in order to fulfill their function in the native context. However, there are proteins, which are intrinsically unstructured and thus natively unfolded. In addition, the misfolding and aggregation of many proteins can lead to severe diseases. The investigation of non-native states of proteins significantly contributes to the understanding of protein folding and misfolding. Nuclear magnetic resonance (NMR) spectroscopy is the only known technique that can provide information on structure and dynamics of non-native states of proteins at atomic resolution. Unfolded and non-native states of proteins have to be treated as ensembles of rapidly interconverting conformers and their observed properties are ensemble and time averaged. In this thesis, hen egg white lysozyme (HEWL) and mutants thereof have been investigated by NMR spectroscopy. The reduction of its four disulfide bridges and the successive methylation of the cysteine residues renders HEWL permanently non-native (‘HEWL-SMe’). Alternatively, the exchange of the eight cysteines for alanines results in very similar states (‘all-Ala-HEWL’). Under these conditions, HEWL-SMe and all-Ala-HEWL do not resemble random coil conformations, but exhibit residual secondary and tertiary structure. The presence of hydrophobic clusters and long-range interactions around the proteins six tryptophan residues and the modulation of these properties by single-point mutants has been observed. For the NMR spectroscopic investigation, HEWL has been isotopically labelled in E. coli by expression into inclusion bodies. After purification, the 1HN, 15NH, 13Calpha, 13Cbeta, 13C’, 1Halpha and 1Hbeta resonances of HEWL-SMe and all-Ala-HEWL have been assigned almost completely using three-dimensional NMR experiments. The analysis of secondary chemical shifts revealed regions in the proteins sequence — particularly around the six tryptophan residues—with significantly populated alpha-helix like conformations. In order to further elucidate the influence of the tryptophan side chains, a set of two new pulse sequences has been developed that allowed for the successful assignment of the 13Cg, 15Ne and 1HNe resonances in these side chains. This knowledge was eventually exploited in the interpretation of two-dimensional 15N-1H photo-CIDNP spectra, which revealed a differential solvent accessibility of the tryptophan residues in all-Ala-HEWL but not in the single point mutant W62G-all-Ala-HEWL. In addition, heteronuclear R2 relaxation rates have been determined for the indole 15Ne nuclei of all-Ala-HEWL and W62G. While in the wild-type like all-Ala-HEWL, the rates are different among the six tryptophan residues, in W62G they are more uniform. Together with relaxation data from the amide backbone, these results indicate the significant destabilization of the hydrophobic clusters in the absence of W62. In contrast, in the W108G mutant the profile of the R2 relaxation rates was not found to be significantly altered. No evidence was found by R1rho relaxation rates and relaxation dispersion measurements for conformational exchange on slower (micro- to millisecond) timescales. Residual dipolar couplings have been determined for non-native HEWL in order to retrieve structural information of these states. The differences of the W62G and the wild-type like non-native HEWL is also picked up in NH-RDCs of these proteins aligned in polyacrylamide gels. Significant positive RDCs are observed in the regions of the hydrophobic clusters in all-Ala-HEWL, but to a much lesser degree in W62G. So far, all attempts to simulate RDCs from generated non-native ensembles failed even when including long-range contacts or specific phi/psi backbone angle propensities. However, the measured RDCs can be used to cross-validate structural ensembles of non-native HEWL generated by molecular dynamics simulations that are based on restraints from the other experimental data, such as the differential solvent accessibilities from the photo-CIDNP experiments and the data on the hydrophobic clustering gained from the combined mutational and relaxation studies. Finally, non-native HEWL has been investigated for the first time using two-dimensional NMR in organic solvents, which are able to induce secondary structures and ultimately lead to amyloid formation. Under these conditions severe line broadening was observed, which was attributed to exchange between different — mostly a-helical— conformations. In summary, in this thesis methods have been developed, optimized and successfully applied for the structural and dynamical characterization of non-native states of proteins and the effect of single-point mutants on the properties of such ensembles has been investigated. Data has been gained that can considerably contribute to the further elucidation of the nature of non-native states of HEWL by molecular dynamics simulations.
Das Steroid-Hormon 17ß-Estradiol ist maßgeblich an der Entstehung und Entwicklung von Brustkrebs beteiligt. Die intrazelluläre Verfügbarkeit des aktiven Estrogens, 17ß-Estradiol, wird durch die 17ßHydroxysteroiddehydrogenase (17ßHSDl) reguliert, die die NADPH-abhängige Reduktion von Estron zu Estradiol katalysiert. Damit stellt die 17ßHSD1 einen interessanten Ansatzpunkt für die Entwicklung neuer Inhibitoren im Hinblick auf potente Wirkstoffe gegen Brustkrebs dar. Die 17ß-Hydroxysteroiddehydrogenase 2 bevorzugt hingegen die oxidative Aktivität und wandelt die biologisch aktiven Hydroxysteroide wie Estradiol in ihre inaktiven Ketoformen um. Ein möglicher Inhibitor der 17ß-HSD1 sollte demnach die Funktion der 17ß-HSD2 nicht beeinträchtigen. Im Rahmen dieser Arbeit wurden Strategien und Methoden entwickelt, die 17ßHSD1 durch heterologe Expression erstmals in E. coli darzustellen. Durch NMR-Spektroskopie in Kombination mit Docking konnten detaillierte Aussagen über die Bindungsepitope der untersuchten Liganden gemacht werden. Diese Informationen sind für eine gerichtete Optimierung von Leitstrukturen von großer Bedeutung.
Die Eigenschaften, die im Rahmen dieser Arbeit untersuchten Co-Polymeren auf Basis von a-Hydroxycarbonsäuren und Polyolen, unterscheiden sich deutlich von denn entsprechenden reinen Polymeren ohne Polyolkomponente. Die Polymere dieser Klasse, die sich durch Variation der Parameter Alkoholkomponente, Alkohol/Lactid-Verhältnis, Lactid/Glycolid-Verhätnis, L/DL-Verhältnis ergibt sind äußerst vielfältig. Schwerpunktmäßig wurden Polymere untersucht, die als Carbonsäurekomponente Milch- und/oder Glycolsäure enthalten und bei denen Glycerin oder Ethylenglycol als Polyol verwendet wurde. Diese Arbeit verfolgte zum einen das Ziel, grundlegende Erkenntnisse über die neuartige Polymerklasse zu gewinnen und zum anderen die Eignung dieser Polymere als implantierbares Arzneistoffdepot zu untersuchen. Dabei konnte – wie im ersten Teil dieser Arbeit beschrieben – nur ein Ausschnitt aus dem großen Spektrum der Polymere beispielhaft synthetisiert und untersucht werden. Von vornherein ausgeschlossen waren bei diesen Untersuchungen Polymere, deren Glasübergangstemperatur unter Raum- und über Körpertemperatur lagen. Es sollten so lagerstabile, aber nach Applikation ins Gewebe anpassungsfähige Formkörper erhalten werden. Die Untersuchungen mit den entwickelten Polymerstäbchen haben gezeigt, dass sich die Klasse der Polyol-oligolactide/co-glycoliden von herkömmlichen, reinen Polylactiden bzw. Polylactiden/co-glycoliden in einigen Punkten unterscheidet. So wurde bei keinem der Versuche ein inhomogenes Abbauverhalten festgestellt, wie dies in der Literatur bei reinen Polylactiden/co-glycoliden beschrieben ist. Es kam also nicht zu einem beschleunigten Polymerabbau im Inneren der Stäbchen durch Autokatalyse der sich dort akkumulierenden Milchsäure. Die Glycerol-Polymere scheinen eine ausreichende Diffusion der Degradationsprodukte nach außen zu gewährleisten. Dies ist eine wichtige Voraussetzung für die gleichmäßige Freisetzung von Wirkstoffen. Die Eigenschaften der Polymerstäbchen ließen sich auf unterschiedliche Weise beeinflussen. So konnte ihre Wasseraufnahmefähigkeit durch das Verhältnis der Mischung von L-Polymeren zu DL-Polymeren sehr weit variiert werden. Das amorphe DL-Polymer ermöglicht eine erleichterte Wasseraufnahme gegenüber der reinen teilkristallinen L-Variante. Die Co-Polymerisation mit Glycolid bot eine weitere Möglichkeit, die Eigenschaften der Polymere zu beeinflussen. So stieg bei den Polymeren mit gleichem Glycerin/Monomer-Verhältnis die Hydrophilie in der Reihe GOL-DL-1:18 < GOL-DL-1:13,5:4,5 < GOL-DL-1:9:9 < GOL-L-1:4,5:13,5 an. Die Versuche, die im zweiten Teil der Arbeit beschrieben werden, wurden im Rahmen der Entwicklung eines Applikationssystems für niedermolekulare Cyclooligo-peptide durchgeführt, die in der Krebstherapie eingesetzt werden sollten. Es wurde deutlich, dass die bisher verwendeten Polymerstäbchen für eine solche Anwendung nicht geeignet waren. Sie boten der zur Applikation notwendigen Menge an Peptid eine zu geringe Menge an Polymermatrix, was zu einer hohen Beladungsrate führte. Die Folge war ein mechanisch instabiles System, das nach Implantation zerbrechen könnte und so den Wirkstoff unkontrolliert freisetzen würde. Aus diesem Grund wurde ein Verpressungsverfahren gewählt, um Tabletten beziehungsweise stäbchenförmige Presslinge als Applikationssystem zu erhalten. Für beide Varianten wurde das Polymer gemahlen, die zu untersuchenden Hilfs- oder Wirkstoffe eingemischt und dann verpresst. Bei den Untersuchungen zeigte es sich, dass eine gleichmäßige Freisetzung über mehrere Tage mit diesen resorbierbaren Trägersystemen nicht möglich war. Der Grund hierfür war ein zweiphasiger Verlauf der Freisetzung. Im ersten Teil des zweiphasigen Verlaufs wurde eine große Menge des Wirkstoffes zusammen mit der niedermolekularen Komponente ausgespült. In der zweiten Phase wurde der Wirkstoff im Zuge der Degradation der höhermolekularen Komponente langsam freigesetzt. Der Einfluss des Pressdruckes bei Erstellen der Prüfkörper war für die Freisetzung eher von untergeordneter Bedeutung, während eine vermehrte Zumischung von leicht wasserlöslichen Substanzen oder die Verwendung von hydrophileren Polymeren (DL-Lactide anstelle von reinen L-Lactiden) die Freisetzung des Peptides deutlich erhöhte. Im dritten Teil der Arbeit wurde beispielhaft an den Substanzen Gentamicinsulfat, Methotrexat und einem Cyclo-Oligo-Peptid die Freisetzung aus 13 verschiedenen halbfesten Polymersystemen untersucht. Diese Systeme wurden durch Mischung von nieder- mit höhermolekularen Polymeren hergestellt. Die Menge an freigesetztem Arzneistoff korrelierte erwartungsgemäß mit der Oberfläche der Probenkörper. Die Freisetzung des gut wasserlöslichen Gentamicinsulfats erfolgte aus den Systemen mit einem hohen Anteil an niedermolekularem Polymer sehr schnell und vollständig. Systeme mit überwiegend höhermolekularem Polymer gaben den Wirkstoff weniger schnell frei und es konnte gezeigt werden, dass der Wirkstoff sich in beiden Polymeren der Mischung verteilt. Das Freisetzungsverhalten bei dem in Wasser schwerlöslichen Methotrexat war nicht grundsätzlich anders. Die Verteilung zwischen der höher- und niedermolekularen Phase ähnelt der des Gentamicinsulfates. Eine relativ hohe Beladungsrate mit einem hydrophilen Wirkstoff (EMD 121974) führte zu einer deutlich höheren Freisetzung aus dem höhermolekularen Teil des Polymergemisches, so dass insgesamt eine beinahe vollständige Freisetzung erreicht wurde. Das im vierten Teil der Arbeit untersuchte Beschichten von Hydroxylapatit- Zylindern aus einer Kombination von bFGF mit einem Glycerin-L-1:13 Lactid Polymer führte zu einer gleichmäßigeren Freisetzung als bei Zylindern, die ohne Einsatz von Polymer beschichtet wurden. Außerdem war auch noch nach dem 5. Tag eine Freisetzung von bFGF zu beobachten. Eine signifikante Verzögerung des Einwachsens von Knochen in das Implantat nach 42 und 84 Tagen konnte bei der Gruppe mit bFGF/Polymer-Beschichtung histomorphologisch gezeigt werden. Die Poren des Implantates waren mit dem Polymer gefüllt, was das Einwachsen in den ersten Wochen deutlich erschwerte. Erst nach Beginn der Degradation des Polymers war das Eindringen des umgebenden Knochen möglich. Das Polymer GOL-L-1:12 war also aufgrund seiner langsamen Degradation für eine solche Anwendung ungeeignet. Für eine Verwendung als Beschichtungsmaterial sollte ein Polymer deutlich schneller degradieren und die Beschichtungsdicke müsste optimiert werden. Die Charakterisierung der Polyol-oligolactide/co-glycoliden in dieser Arbeit hat gezeigt, dass es sich bei dieser Polymerklasse um eine sehr interessante Variante der resorbierbaren Polymere handelt. Die einfache Synthese, die gute Bioverträglichkeit und die in sehr weiten Bereichen variierbaren Eigenschaften machen diese Polymere zu vielversprechenden Kandidaten bei der Entwicklung von Arzneimittelträgern oder Medizinprodukten.
Zur Rolle der Typ-I-Interferone in der Abwehr von viralen Infektionen des zentralen Nervensystems
(2007)
Das zentrale Nervensystem (ZNS) bildet eine einzigartige Umgebung für Immunantworten, da Neuronen eine essentielle und in weiten Teilen nicht-erneuerbare Zellpopulation bilden. Virale Infektionen des ZNS und lokale anti-virale Immunantworten können zu dem Verlust von Neuronen und somit zu katastrophalen Erkrankungen führen. Unter normalen Bedingungen ist das ZNS weitgehend von der Kontrolle durch das Immunsystem ausgeschlossen. In diesem Zusammenhang wurde das ZNS oft auch als „immunprivilegiert“ bezeichnet. Dieses Konzept musste in den letzten Jahren revidiert werden, da es sich gezeigt hat, dass das ZNS nicht völlig vom Immungeschehen isoliert ist. Wichtige Mediatoren antiviraler Immunantworten sind die Typ I Interferone (IFN). Die verschiedenen Typ I IFN binden an einen gemeinsamen Rezeptor, den Typ I Interferon-rezeptor (IFNAR). Die Bedeutung von Typ I IFN Antworten für die Kontrolle viraler Infektionen wurde besonders eindrucksvoll mit IFNAR-defizienten Mäusen (IFNAR-/-) gezeigt. Nach Infektion mit dem neurotropen Vesikulären Stomatitis Virus (VSV) führt das Fehlen des IFNAR zu einer stark erhöhten Empfänglichkeit für tödlich verlaufende Infektionen. In allen Organen und besonders im ZNS von VSV infizierten IFNAR-/- Tieren fanden sich stark erhöhte Virusmengen. Um zu untersuchen, ob die VSV-Infektion des zentralen Nervensystems in IFNAR-/- Mäusen in erster Linie auf ein Versagen der peripheren Immunität oder des IFN Systems innerhalb des ZNS zurückzuführen ist, wurden mittels der Cre loxP Tech-nologie Mäuse hergestellt, die auf allen peripheren Zellen IFNAR exprimieren, während die Neuronen des ZNS IFNAR defizient sind (NesCre+/-IFNARflox/flox). Nach intranasaler VSV Infektion zeigten NesCre+/-IFNARflox/flox Mäuse zunächst keine Krankheitssymptome. Nach 5 bis 6 Tagen traten aber aufsteigende und halbseitige Lähmungen auf, so dass die infizierten Tiere verstärkt im Kreis liefen und schließlich verstarben. Im Vergleich dazu verstarben IFNAR-/- Mäuse bereits nach 2 bis 3 Tagen während normale C57BL/6 Tiere nach Infektion keine Symptome zeigten und überlebten. Der beobachtete Krankheitsverlauf lässt in den IFNAR-/- Mäuse auf ein Multiorganversagen als Todesursache schließen. 3 und 6 Tage nach Infektion konnte in den Organen von C57BL/6 Tieren kein Virus reisoliert werden. In den NesCre+/ IFNARflox/flox Tieren fanden sich zum Todeszeitpunkt nur im Gehirn Viruspar-tikel, während alle anderen Organe virusfrei waren. Die Virustiter im Hirn waren im Vergleich zu den IFNAR-/- Mäusen 10- bis 100-fach erhöht. In den anderen Organen und im Blut sind keine Viruspartikel nachweisbar. Dieser Befund deutete gemeinsam mit den beobachteten Krankheitsverläufen auf eine neuropathologische Symptomatik hin, bei der es wahrscheinlich zu einer VSV-Infektion des Hirnstammes kam. Die Analyse einzelner Regionen des ZNS zeigte in IFNAR-/- Tieren, dass 2 Tage nach Infektion in allen Regionen des ZNS signifikante Virusmengen zu finden waren. In den NesCre+/-IFNARflox/flox und den C57BL/6 Tieren fanden sich zu diesem Zeitpunkt nur im Riechhirn (Bulbus olfactorius) signifikante Virustiter. In den C57BL/6 Tieren blieb das Virus auf diese Region beschränkt und wurde dort innerhalb von 6 Tagen eliminiert. In den NesCre+/-IFNARflox/flox Tieren kam es in den folgenden Tagen jedoch zu einer fortschreitenden Infektion des ZNS, und auch das Großhirn, das Kleinhirn, der Hirn-stamm und das Rückenmark zeigten hohe Virustiter. In der Induktion peripherer Immunantworten unterschieden sich NesCre+/-IFNARflox/flox und C57BL/6 Mäuse nicht. In den WT Tieren kam es im Gegensatz zu den NesCre+/ IFNARflox/flox und IFNAR-/- Tieren innerhalb von 48 Stunden nach Infektion im Riechhirn zu einer Typ I IFN abhängigen Phosphorylierung von STAT-1, einer Komponente des IFNAR-Signaltransduktionsweges. Alles deutet darauf hin, dass die Induktion geringer Mengen Typ I IFN innerhalb des Riechhirns notwendig ist, um Im-munantworten zu aktivieren, die ein Übergreifen der Virusinfektion auf andere Regio-nen des ZNS verhindern. Eine funktionierende Immunität in der Peripherie und die Blut-Hirn-Schranke scheinen nicht ausreichend zu sein, um eine Infektion des ZNS mit VSV zu verhindern. Stattdessen muss es zur Aktivierung von IFN-abhängigen Mechanismen innerhalb des Riechhirns kommen, die ein Übergreifen der VSV Infektion auf andere Hirnregionen verhindert und zur Elimination von VSV im Riechhirn beiträgt.
Das humane Cytomegalovirus (hCMV) ist ein ubiquitär verbreitetes Pathogen. Die CMV-Infektion ist eine nicht selten lebensbedrohliche Komplikation bei immunsupprimierten Organ- und Knochenmarktransplantat-Empfängern. Bei immunkompetenten Individuen hingegen verläuft eine CMV-Infektion in der Regel asymptomatisch. Wie am Beispiel der murinen CMV (mCMV)-Infektion gezeigt werden konnte, erfolgt die Immunkontrolle durch CD8 T-Zellen. Im Infektionsmodell der BALB/c (H-2d) Maus dominieren CD8 T-Zellen mit Spezifität für zwei antigene Peptide: Ein Ld-restringiertes Peptid aus dem immediate early (IE1)-Protein m123, sowie ein Dd-restringiertes Peptid aus dem early (E)-Protein m164. Der konzertierten Aktion der viralen Immunevasionsproteine von mCMV gelingt es nicht, die Expression dieser beiden Peptide auf der Oberfläche infizierter Zellen zu verhindern. Der ORFm164 wurde 1996 von Rawlinson et al. vorhergesagt und umfasst demnach 1284 Nukleotide, die für ein Protein von 46,6 kDa kodieren. Über die mRNA und das tatsächliche Genprodukt des ORFm164 war zu Beginn dieser Arbeit jedoch nichts bekannt. Die in der vorliegenden Arbeit durchgeführten Transkriptions- und Translations-Analysen zeigten, dass der eigentliche ORFm164 kürzer ist als vorhergesagt. So konnte mittels 5´/3´ RACE eine ungespleißte, 2004 Nukleotide große mRNA identifiziert werden, die einen 1011 Nukleotide langen ORF, sowie 5´ und 3´ flankierende UTRs umfasst. Das eigentliche Start-AUG der m164-mRNA liegt in einer Kozak-ähnlichen Konsensussequenz, wobei dieses Startcodon nicht dem von Rawlinson vorhergesagten ersten AUG entspricht. Vielmehr startet die Translation am dritten AUG und generiert ein m164 Genprodukt mit einer apparenten molekularen Masse von 38 kDa. Schließlich konnte m164 als Typ-I Membranglykoprotein charakterisiert werden. Das Protein ist ein frühes E-Phase Protein, das bereits ab 2 h p.i. und während der gesamten E-Phase abundant exprimiert wird. Pulse-Chase Experimente wiesen darauf hin, dass m164 relativ instabil ist. Mit Hilfe der indirekten Immunfluoreszenz konnte neben einer ER-Lokalisation auch eine Kolokalisation von m164/gp38 mit den Proteinen der inneren Kernmembran Emerin und LaminB2 nachgewiesen werden. Eine direkte Interaktion zwischen diesen Proteinen und m164/gp38 konnte durch Fluoreszenz Resonanz Energie Transfer (FRET)-Experimente allerdings ausgeschlossen werden. FRAP (Fluorescence recovery after photobleaching)-Analysen haben ergeben, dass m164/gp38 in der äußeren Kernmembran lokalisiert ist. Somit könnte m164/gp38 eine Rolle beim Prozess des Deenvelopments der im Perinuklearraum lokalisierten primären Virionen spielen, indem es die Fusion zwischen primärer Virushülle und äußerer Kernmembran unterstützt und dadurch die Freisetzung der Kapside ins Zytoplasma ermöglicht. Diese Hypothese soll in weiterführenden Arbeiten überprüft werden.
Lichtsensitive Proteine bzw. Photorezeptoren eignen sich hervorragend für das Studium des Zusammenhangs von Proteinstruktur und –funktion. Lichtrezeptorproteine werden leicht durch Licht angeregt, wodurch eine gute Zeitauflösung für deren Untersuchung erreicht werden kann. Weiterhin sind sie als Signalproteine während der Etablierung des aktiven Zustandes und dessen Zerfalls großen konformationellen und strukturellen Änderungen unterworfen. Ausgehend von diesen Eigenschaften wurde bereits eine große Zahl von Lichtrezeptorproteinen genauer untersucht. Diese vorliegende Arbeit beschäftigt sich mit lichtinduzierten konformationellen Änderungen in Membranproteinen. Dafür wurden drei verschiedene Systeme herangezogen: das kleine α-helikale Peptid Gramicidin A, der G-Protein gekoppelte Rezeptor Rhodopsin and die BLUF (blue light using FAD) Domäne des hypthetischen Membranproteins Blrp (blue-light regulated phosphodiesterase) aus E. coli. Gramicidin A (gA) ist ein aus dem Bodenbakterium B. brevis isoliertes Antibiotikum, das Transportkanäle für einwertige Kationen wie Lithium, Natrium und Kalium ausbildet. Gelöst in Detergenzmizellen, wurde für gA unerwartet eine Wechselwirkung mit Blaulicht fest gestellt (Abbildung 1). Diese Beobachtung wurde mit statischen und zeitaufgelösten NMRspektroskopischen Methoden genauer untersucht und ist in Kapitel 2 näher beschrieben. Basierend auf den gewonnenen Erkenntnissen wird postuliert, dass einer der Tryptophanreste (Trp9) eine lichtinduzierte konformationelle Änderung erfährt. Ausgehend von der Konformation in Lösung befindet sich die Seitenkette von Trp9 in einem Gleichgewicht (70:30) mit einer zweiten Konformation. Bei der zweiten Konformation handelt es sich möglicherweise um die Orientierung, die der Tryptophanrest unter Festkörper-NMR Bedingungen einnimmt. Die Lebensdauer der neuen Konformation beträgt in etwa eine Sekunde. Der G-Protein gekoppelte Rezeptor Rhodopsin ist verantwortlich für die Verarbeitung von Lichtsignalen in den Stäbchenzellen der Retina. Die Absorption eines einzelnen Photons führt zur Isomerisierung des kovalent gebundenen Chromophors 11-cis-Retinal, wodurch konformationelle Änderungen im Protein veranlasst werden. Der aktivierte Metarhodopsin II (MetaII) Zustand induziert eine Enzymkaskade und schließlich einen Nervenimpuls, das Säugern das Kontrastsehen ermöglicht. Eine große Bandbreite an hochauflösenden NMRspektroskopischen Methoden, (einschließlich zeitaufgelöster und Festkörper-NMR Methoden) wurde im Laufe dieser Arbeit angewandt, um Konformation und Dynamik von bovinem Rhodopsin näher zu untersuchen. In Kapitel 3.1 sind zu Beginn mehrere Optimierungsschritte im Hinblick auf ein kostengünstiges, isotopenmarkiertes Säugerzellenmedium beschrieben. In diesem Zusammenhang wurden mehrere Rhodopsin NMR-Proben hergestellt, wobei der Gehalt an isotopenmarkierten Aminosäuren ca. 50% betrug. Anhand dieser Proben konnte bewiesen werden dass sich mit Lösungs-NMR-Spektroskopie auch sehr große, in Detergenzmizellen stabilisierte Membranproteine (~150 kD Gesamtmasse) detailliert studieren lassen. Die Untersuchungen konzentrierten sich auf den C-Terminus, für den nach sequentieller Zuordnung (Abbildung 2a) und heteronuklearern Relaxationsmessungen ein Mobilitätsverhalten bestimmt wurde, das dem mittelgroßer Proteine ähnelt. Des Weiteren konnten keinerlei definierte Strukturelemente innerhalb des C-Terminus identifiziert werden, u.a. durch einen Vergleich mit eines 19mer Peptids, dessen Primärsequenz des Rhodopsin C-Terminus entspricht (Abbildung 2a und 2b). In Kapitel 3.2 wird die nichtinvasive Zuordnung der Rückgratresonanzen aller fünf Trytophane mit Hilfe einer Kombination aus Lösungs- und Festkörper-NMR beschrieben. Dazu wurden verschiedene Rhodopsinproben hergestellt, die alle möglichen 13C’i-1-Carbonyl/15Ni-Tryptophan isotopenmarkierten Amidpaare enthielten. Eine Teilzuordnung der Tryptophanindolsignale konnte in Lösung durch Protonen-/Deuteriumaustausch und heteronukleare Relaxationsmessungen erreicht werden. Die Ergebnisse legen nahe, dass die Kombination aus Lösungs- und Festkörper-NMR-Spektroskopie sehr gut geeignet ist um komplementäre Informationen zu strukturellen und dynamischen Eigenschaften von Rhodopsin zu liefern. Fehlende Zuordnungen in den Lösungspektren konnten durch den Verglich mit Festkörperspektren ergänzt werden und umgekehrt (Abbildung 3). In Kapitel 3.3 ist die erfolgreiche Adaption der zeitaufgelösten NMR-Spektroskopie für die Untersuchung des Rhodopsin MetaII Zerfalls in vitro beschrieben. Die zeitaufgelösten protonendetektieren NMR-Experimente wurden mit unmarkiertem, in Detergenzmizellen stabilisiertem Protein bei verschiedenen Temperaturen aufgenommen, wobei sich die anschließende Auswertung auf die stark tieffeldverschobene Indolregion konzentrierte (Abbildung 4). Für die berücksichtigten Signale traten nach Induktion des aktivierten Zustandes deutliche chemische Verschiebungsänderungen auf, außerdem zeigten sie unterschiedlich schnellen MetaII Zerfall. Zusätzlich zu der erwarteten Zeitkonstante des MetaII Zerfalls (~6 min bei 298 K) konnte erstmalig eine zweite, ca. zehnmal langsamere Zeitkonstante bestimmt werden. Diese zweite Zeitkonstante ist möglicherweise ein Ausdruck für die langsame Entfaltung von Sekundärstrukturelementen nach dem Zerfall des Proteins in Opsin und Retinal. Die BLUF-Domänen verwenden Flavinadeninnukleotid (FAD) als Chromophor und gehören zu der Familie der Blaulichtrezeptoren. In Kapitel 4 wird die Untersuchung des lichtadaptierten Zustandes der E. coli BLUF Domäne auf Protein- und Ligandenebene mit zeitaufgelösten proton- und phosphordetektierten NMR-Experimenten beschrieben. In Abbildung 5 sind die statischen Licht- und Dunkelspektren (jeweils licht- und dunkeladaptiert) dargestellt. Im Folgenden konnte durch Beobachtung der Dunkeladaption bei verschiedenen Temperaturen die Aktivierungsenergie des Lichtzustandes bestimmt werden. Des Weiteren wurden zum ersten Mal phosphordetektierte NMR-Experimente erfolgreich angewandt, um einen biologisch relevanten Vorgang zeitabhängig näher zu bestimmen.
An application of EPR spectroscopy that is becoming increasingly important is the measurement of distances between electron spins. Several EPR methods have been developed for this purpose, all based on measuring the dipolar coupling between two spins. Due to the specific nature of the sample, we applied dipolar relaxation enhancement measurements to study the geometry of a protein-protein complex. The paramagnetic centers in question had EPR spectra that were too broad and had such short relaxation time that they could not be studied using the more straightforward PELDOR technique. EPR spectral resolution can be increased appreciably by measuring at a frequency higher than conventional X-band (9 GHz) frequency. The spectra of many paramagnetic species can only be resolved at frequencies higher than 90 GHz. For accurate measurement of the orientation of the vector between two dipolar coupled spins with respect to the g-tensors of the spins, high spectral resolution is required. We therefore performed our EPR measurements at G-band (180 GHz) frequency. Dipolar relaxation measurements were applied to study the complex that is formed by the two electron-transfer proteins cytochrome c and cytochrome c oxidase (CcO) from the soil bacterium Paracoccus denitrificans. We were able to detect dipolar relaxation enhancement due to complex formation of soluble subunit II of P.d. CcO (CcOII) with two substrate cytochromes, which was practically absent in a mixture of CcOII with the negative control protein cytochrome c1. This complex formation was characterized by a pronounced temperature dependence that could be simulated using a home-written computer program. The G-band EPR measurements could not be simulated with a single complex geometry. This provided evidence for the hypothesis that electron-transfer protein complexes are short-lived and highly dynamic; they do not seem to form one specific electron-transfer conformation, but rather move around on each other’s binding surfaces and transfer an electron as soon as the distance between donor and acceptor is short enough. As a test of our simulation program, we also applied dipolar relaxation measurements to specially synthesized organic molecules that contained a nitroxide radical and a metal center. The transverse relaxation of Cu2+-OEP-TPA was compared to the relaxation of Ni2+-OEP-TPA at temperatures between 20 and 120 K. In this temperature range, the nitroxide relaxation was enhanced due to the presence of Cu2+, but not by Ni2+. Similarly, relaxation enhancement was found in the nitroxide-Mn2+ pair in Mn2+-terpyridine-TPA with respect to the terpyridine-TPA ligand. Due to the fast T2 relaxation of the nitroxide radical at high temperatures, the measurements were all performed in the low-temperature regime where the T1 relaxation rate of the metal ion was smaller than the dipolar coupling frequency. In this region, no structural information about the molecule can be deduced, since the dipolar relaxation enhancement is only determined by the T1 of the metal ion. The dipolar relaxation measurements we performed at high field indicated a difference in relaxation times between X-band and G-band frequencies. Extensive T1 - measurements of different paramagnetic centers (CuA, Cu2+) confirmed a strong dependence of T1 on magnetic field in the temperature range where the direct process is the dominating T1 relaxation process. This dependence is very strong (factor of 103 with respect to X-band), but does not follow the B04 dependence predicted in literature. The T1 relaxation of low-spin iron in cytochrome c at high magnetic field, estimated from dipolar relaxation data, is also in agreement with a larger contribution by the direct process (factor of 104). Dipolar relaxation enhancement was found to be a technique that is useful for measuring distances between paramagnetic centers, but only for systems where several important conditions are met, such as: the system exists in one certain static geometry, and the relaxation rate of the fast-relaxing spin is faster than the dipolar coupling frequency within the accessible temperature range. Additionally, it is a great advantage for the analysis of dipolar relaxation data if the procedure of dividing the relaxation trace of the dipolar-coupled slow-relaxing spin by the relaxation trace of the slow-relaxing spin in absence of dipolar coupling can be applied. Another useful application of dipolar relaxation enhancement measurements is the measurement of T1 relaxation of extremely fast-relaxing spins, or spins that are otherwise difficult to detect.
The retinoic acid related orphan receptor alpha (RORalpha) regulates the expression of various target genes by binding to specific response elements in their promoter region. RORalpha is an interesting pharmaceutical target since it positively affects several pathophysiological processes of clinical relevance. RORalpha enhances the expression of Apo-AI protein, the major constituent of HDL, which is responsible for the cholesterol transportation. RORalpha notably contributes to the bone mineralization and generation of the extracellular bone matrix, demonstrating its involvement in osteoporosis, and by up-regulating the gene for IKBalpha, RORalpha has anti-inflammatory effects. Moreover, RORalpha is necessary for cerebellar development and the maintenance of the mammalian day-night periodicity governed by the core-clock within the suprachiasmatic nuclei. RORalpha receptors have been reported to bind cholesterol, melatonin, or to function ligand-independent. By monomeric binding to the recognition motif AGGTCA preceded by an A/T-rich sequence (ROR response element, RORE), RORalpha constitutively activates gene transcription. However, RORalpha activity is passively suppressed by its opponents RevErbalpha and RevErbbeta, which both bind to the same target sequence. ...