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Zentrales Forschungsanliegen der vorliegenden Abhandlung ist die Erörterung der Probleme, welche sich für die Corporate Governance einer Aktiengesellschaft ergeben, wenn abweichend vom gesetzlichen Optimalbild eine Divergenz zwischen dem Stimmrecht des Aktionärs und dessen wirtschaftlicher Betroffenheit vorliegt. Der von seinen Entscheidungen nicht proportional betroffene Aktionär soll als Corporate Governance Akteur in den Blick genommen werden.
Wieso aber lohnt sich eine erneute Befassung mit einem Problem, welches Easterbrook und Fischel bereits 1983 als ein solches identifiziert haben? Zum einen ist die internationale und deutsche Corporate Governance Debatte erheblich vorangeschritten. Steckte diese zum Zeitpunkt des Aufsatzes „Voting in Corporate Law“ noch in den Kinderschuhen, hat sie sich heute zu einem eigenen Forschungsfeld entwickelt, welches Juristen und Ökonomen in aller Welt beschäftigt. Der nicht proportional betroffene Aktionär wird in das durch diese Forschungsströmung entwickelte moderne Corporate Governance System eingeordnet. Zum anderen sind vor allem durch die Entwicklung vielfältiger Finanzderivate im Rahmen der sogenannten „derivatives revolution“ die Möglichkeiten durch schuldrechtliche Vereinbarungen eine entsprechende Disproportionalität zu erzeugen erheblich gestiegen. Während Easterbrook und Fischel noch feststellten „[…] it is not possible to seperate the voting right from the equity interest“, gestatten moderne Finanzprodukte es Aktionären, ihre wirtschaftliche Betroffenheit und zugleich deren Verhältnis zu ihrer Stimmrechtsmacht fast beliebig auszugestalten.
Die Zusammenschau aus einer erheblich diffizileren Corporate Governance Debatte in Verbindung mit einer neuen Vielzahl an Möglichkeiten eine Disproportionalität zwischen Stimmrecht und wirtschaftlicher Betroffenheit zu erzeugen, gibt der Thematik die notwendige Aktualität, die eine vertiefte Befassung anzeigt.
In Abgrenzung zu den bislang in diesem Themenkreis erschienenen Arbeiten, welche sich vor allem isoliert mit den Folgen für das Stimmrecht bzw. den einzelnen Anteilseigner befassen, thematisiert die vorliegende Abhandlung vor allem die Auswirkungen, welche die Trennung von Stimmrecht und wirtschaftlicher Betroffenheit für die Corporate Governance Struktur der Aktiengesellschaft nach sich ziehen kann. Auf diese Weise wird die Problematik der Ausübung disproportionaler Stimmrechte in die Erkenntnisse der Corporate Governance Theorie eingeordnet und insbesondere auch die ökonomischen Folgen selbiger herausgearbeitet. Die so gewonnenen Ergebnisse verdeutlichen den gesetzgeberischen Handlungsbedarf.
Systemerkrankungen der arteriellen Gefäße stellen eine häufige Todesursache in Deutschland und der westlichen Welt dar. Hierbei sind vor allem die auf Grundlage von Arteriosklerose entstehende Koronare Herzerkrankung sowie der Myokardinfarkt zu nennen. Ursache des Myokardinfarktes ist eine Minderperfusion und damit bedingte Ischämie des Myokardgewebes. Ziel einer jeden Minderperfusion ist die therapeutisch schnellstmögliche Reperfusion. Ischämie- und Hypoxie-bedingt entstehen hierbei durch inflammatorische Prozesse, Ansammlung toxischer Metabolite, veränderter Protein-Expressionsmuster sowie durch das reperfundierende Blut der sogenannte Ischämie-Reperfusionsschaden. Dieser komplexe Effekt lässt sich über dem hinaus auch bei Organtransplantationen beobachten.
Die vorliegende Arbeit beschreibt den Versuch den Ischämie-Reperfusionsschaden durch den Einfluss von mTOR-Inhibition im humanen Gefäßmodel zu quantifizieren. Hierbei wurden die mTOR-Inhibitoren Sirolimus und Everolimus verwendet. Beide Immunsuppressiva finden aktuell unter anderem klinische Anwendung nach Organtransplantationen. Bereits in einigen Studien konnten positive Effekte von Sirolimus als auch Everolimus auf den Ischämie-Reperfusionsschaden nachgewiesen werden. Dieser Versuch sollte nun weitere zielführende Erkenntnisse hinsichtlich mTOR-Inhibition und proinflammatorischer Prozesse sowie der Expression von Zell-Adhäsionsmolekülen im humanen Gefäßmodell liefern. Ebenso sollte die Qualität des Bioreaktors als adäquates Humangefäß-Perfusionsmodell evaluiert werden.
Als Versuchsgrundlage wurde hierbei eine Ischämiezeit der Gefäße von vier bis fünf Stunden festgelegt. Die verwendeten Gefäße wurden in der Folge nach standardisierten Kriterien (Präoxygenierung, Heparinisierung, 37° Grad Celsius Temperatur, Blutgruppe AB Rhesusfaktor negativ, Hämatokritwert 30%) zwei Stunden lang mittels Vollblut im Bioreaktormodel reperfundiert. Unterschieden wurde hierbei eine Gefäßkontrollgruppe (n=7), von einer Sirolimus-Gruppe (n=6, standardisierte Blutkonzentration 10ng/ml) und einer Everolimus-Gruppe (n=7, standardisierte Blutkonzentration 5 ng/ml). Nach standardisierten Zeitpunkten der Reperfusion (0 Minuten, 15 Minuten, 30 Minuten, 60 Minuten und 120 Minuten) wurden jeweils Blutproben dem simulierten Kreislauf entnommen. Mittels Blutgasanalyse wurde über die Bestimmung des Sauerstoffpartialdrucks, des Kohlendioxidpartialdrucks sowie des pH-Wertes eine qualitative Evaluierung des Bioreaktors als humanes Gefäßmodel vorgenommen. Des Weiteren dienten die Blutproben zur Erfassung der proinflammatorischer Marker Interleukin-6, TNF-α, sowie VEGF während der unterschiedlichen Zeitpunkte der Blutentnahme. Nach Beendigung der Reperfusion wurden Gefäßproben mittels immunhistochemischen Verfahren auf die Expression der Zell-Adhäsionsmoleküle CD31 sowie CD11b hin untersucht.
Aufgrund durchgeführter Versuche konnte gezeigt werden, dass in der Kontrollgruppe die Interleukin-6- sowie VEGF-Spiegel signifikant im Zuge der Reperfusion anstiegen. Sirolimus als auch Everolimus konnten demgegenüber einen signifikanten Anstieg dieser proinflammatorischen Signalmoleküle verhindern. Im Vergleich des proinflammatorischen TNF-α konnte allerdings ein signifikanter Einfluss der mTOR-Inhibitoren nicht bestätigt werden. Hinsichtlich des Expressionsmusters konnte Sirolimus als auch Everolimus eine signifikante Reduktion von sowohl CD31-positiven als auch CD11b-positiven Zellen im Vergleich zur Kontrollgruppe aufzeigen.
In der Zusammenschau lässt sich aus den erhobenen Daten schlussfolgern, dass der Bioreaktor als humanes Gefäßmodell ein suffizientes Perfusionssystem darstellt. Sirolimus als auch Everolimus können über ihren Wirkungsmechanismus der mTOR-Inhibition einen Anstieg proinflammatorischen Moleküle zum Teil verhindern. Den größten Einfluss auf den Ischämie-Reperfusionsschaden nehmen Sirolimus als auch Everolimus hierbei mittels der Suppression von Zell-Adhäsionsmolekülen CD31 und CD11b.
Um den aktuellen Bildungsstand einer Gesellschaft abbilden zu können müssen Resultate von Bildungsprozessen, wie erworbenes Wissen oder ausgebildete Fähigkeiten, modelliert und gemessen werden (Leutner, Klieme, Fleischer & Kuper, 2013). Im Rahmen sogenannter Large-Scale-Assessments (LSAs) werden Kompetenzen in bestimmten Bereichen definiert und erfasst, die generell für die gesellschaftliche Teilhabe benötigen werden (bspw. Fraillon, Schulz & Ainley, 2013). Durch die fortschreitende Digitalisierung aller Lebens- und Arbeitsbereiche ist der kompetente Umgang mit Informations- und Kommunikationstechnologien (ICT) eine wichtige Voraussetzung für die erfolgreiche Teilhabe an unserer modernen Wissensgesellschaft. Die detaillierte Beschreibung solcher, auch als ICT-Skills bezeichneter Kompetenzen, und die Entwicklung von theoriebasierten Instrumenten zu deren Erfassung ist von großer Bedeutung, um mögliche sozial bedingte Disparitäten aufzudecken.
Im Rahmen der vorliegenden Arbeit werden Annahmen, Ergebnisse und Daten aus dem Projekt CavE-ICT, in dem verhaltensnahe simulationsbasierte Items zur Erfassung von ICT-Skills entwickelt wurden, aufgegriffen und weitergenutzt mit dem Ziel eine besonders effiziente und ökonomisch Messung von ICT-Skills im LSA-Kontext und darüber hinaus zu ermöglichen. Ein vielversprechender Ansatz durch den Testzeiten verkürzt und/oder die Messpräzision erhöht werden kann ist das computerisierte adaptive Testen (CAT; bspw. Frey, 2012). Beim adaptiven Testen orientiert sich die Auswahl der Items am Antwortverhalten der untersuchten Person, so dass durch die Berücksichtigung der individuellen Fähigkeit einer Person Items mit möglichst viel diagnostischer Information administriert werden können. Damit auch bei der Vorgabe unterschiedlicher Items in unterschiedlicher Reihenfolge Testleistungen von Personen miteinander verglichen werden können, stellen Modelle der Item-Response-Theorie (IRT; bspw. Hambleton & Swaminathan, 2010) die Basis der Anwendung von CAT dar.
Im Rahmen dieser Arbeit wurde untersucht, wie ICT-Skills auf Basis der Item-Response-Theorie und unter Einsatz computerisierter Messinstrumente erfasst werden können. Dabei setzten die empirischen Studien dieser Arbeit unterschiedliche Testformen um und an unterschiedlichen Punkten im Prozess der Testentwicklung an. Studie I setzt noch vor der Entwicklung von Items zur Messung von ICT-Skills an und zielt darauf ab Hinweise zum Umfang des zu erstellenden ICT-Itempools und zur Testlänge eines adaptiven Messinstruments bereitzustellen. Studie II baut direkt auf Studie I auf und nutzt die im Rahmen des Projekts CavE-ICT entwickelten und kalibrierten Items beziehungsweise ihre ermittelten Itemeigenschaften zur weiteren Erprobung verschiedener CAT-Algorithmen. Es werden Möglichkeiten aufgezeigt, wie multidimensionales adaptives Testen zur Messung von ICT-Skills gewinnbringend eingesetzt werden kann, und zudem eine differenzierte Messung auf Ebene der verschiedenen kognitiven Prozesse von ICT-Skills erlaubt. Dabei werden explizit Möglichkeiten exploriert Items die unterschiedliche kognitive Prozesse von ICT-Skills abbilden sequentiell geordnet und trotzdem adaptiv vorzulegen. Die durch Studie II erarbeiteten Erkenntnisse können insbesondere für die Erfassung von multidimensionalen Konstrukten oder facettierten Merkmalen in LSAs genutzt werden. Durch den Vergleich der Ergebnisse von Studie I und II ergeben sich zudem Implikationen für ein angemessenes Design von Simulationsstudien die insbesondere noch vor der eigentlichen Test- beziehungsweise Itementwicklung ansetzen. In Studie III werden lineare Kurztests zur Messung von ICT-Skills zusammengestellt. Durch die gezielte Auswahl geeigneter ICT-Items soll bei möglichst geringer Testzeit zugleich eine hohe Messgenauigkeit und Zuverlässigkeit realisiert werden. Die in Studie III manuell und automatisiert computerbasiert zusammengestellten Tests werden hinsichtlich des Einsatzes sowohl auf Populationsebene, im Sinne einschlägiger LSAs, als auch darüber hinaus für gruppen- und individualdiagnostische Zwecke evaluiert und Empfehlungen für den Kurztesteinsatz abgeleitet.
Stechmücken (Dipteren: Culicidae) sind weltweit mit über 3500 Arten und mit Ausnahme der arktischen Regionen ubiquitär vertreten. Die medizinische Relevanz dieser Tiergruppe, begründet durch die hämatophage Lebensweise der Weibchen, erschloss sich bereits Ende des 19. Jh. und hat bis heute Bestand. Jedes Jahr sterben rund 600.000 Menschen an den Folgen der Malaria und fast 100 Mio. Menschen infizieren sich mit dem Denguefieber. Zwar beziehen sich diese Zahlen fast ausschließlich auf die Entwicklungsländer, aber im Zuge des Klimawandels und des immer stärkeren Welthandels kommt es auch in Europa und den USA immer wieder zu Ausbrüchen vorher nicht relevanter Krankheiten. So hat sich das West-Nil- Virus seit 1999 in Nordamerika rasant verbreitet. Im Jahr 2013 gab es dort rund 2500 Fälle, von denen 119 zum Tod führten. In Europa traten hingegen Krankheiten wie das Chikungunyafieber (Italien 2007) oder das Denguefieber (Frankreich 2010/2013) auf. Die Gründe für diese Ausbrüche sind vor allem in der Einschleppung neuer Vektorspezies und Krankheitserreger sowie in den veränderten Wirtspräferenzen einheimischer Stechmückenarten zu suchen. Das Wissen um das Vektorpotential der in Deutschland heimischen Stechmücken konnte vor allem durch die seit 2009 initiierten Monitoring-Programme stetig erweitert werden. Auch die Veränderung der heimischen Fauna durch invasive Arten wie Ochlerotatus japonicus japonicus oder Aedes albopictus wird intensiv erforscht. Dennoch ist hinsichtlich der Biologie, Ökologie sowie Genetik vieler Arten noch immer wenig bekannt.
Die vorliegende Dissertation, welche auf Basis von vier (ISI-) Einzelpublikationen kumulativ angefertigt wurde, beschäftigte sich mit der Analyse der genetischen Variabilität sowie der Zoogeographie der untersuchten Arten und der Etablierung einer schnellen und kostengünstigen Methode zur Artdiagnostik. Besonderes Augenmerk wurde bei den Analysen auf die beiden heimischen Arten Culex pipiens und Culex torrentium sowie die invasive Art Ochlerotatus japonicus japonicus gelegt. Ziel war es, die noch bestehenden Wissenslücken zu füllen, um zukünftige Monitoring-Programme besser koordinieren sowie Analysen zur Vektorkompetenz und Genetik dieser Arten gezielter durchführen zu können.
Es konnte gezeigt werden, dass Cx. pipiens und Cx. torrentium deutliche Unterschiede in ihren Populationsstrukturen aufwiesen welche auf verschiedene evolutive Prozesse hindeuten. Die geringere genetische Variabilität in Cx. pipiens lässt auf positive Selektion durch z.B. Insektizidresistenz im Zuge durchgeführter Bekämpfungsmaßnahmen oder die Infektion mit Wolbachien schließen. Die analysierte Populationsstruktur von Cx. torrentium spricht hingegen für eine geringe Ausbreitung, wodurch der genetische Austausch reduziert wurde und so die untersuchten Populationen genetisch stärker voneinander abwichen. Des Weiteren ließen die Analysen des Cytochrom c Oxidase Untereinheit 1-Fragmentes (cox1) Rückschlüsse auf die Zoogeographie dieser Arten in Deutschland zu - wobei beide Arten über das Untersuchungsgebiet verteilt waren, Cx. torrentium jedoch in den neuen Bundesländern weniger häufig nachgewiesen wurde als in den alten und eine geringere gefangene Individuenzahl aufwies. Basierend auf der ökologischen Nischenmodellierung konnten potentiell neue Verbreitungsgebiete für die Art Ochlerotatus japonicus japonicus identifiziert werden. Als klimatisch besonders günstig zeigten sich dabei Südhessen, das Saarland sowie nördliche Teile Nordrhein-Westfalens. Mit Hilfe der etablierten Methode der direct-PCR wird in Zukunft eine schnellere und kostengünstigere Identifizierung von Stechmücken erfolgen können, welche aufgrund bestimmungsrelevanter Merkmale nicht mehr morphologisch zu identifizieren sind.
Um das Wissen über die Stechmücken in Deutschland fortlaufend zu intensivieren, ist sowohl das Weiterführen der Monitoring-Programme als auch die molekularbiologische Aufarbeitung der Proben nötig. Durch die Anwendung neuer Techniken und weiterer molekularer Marker wird es möglich sein, weitere Krankheitserreger sowie genetische Besonderheiten der heimischen Stechmückenfauna nachzuweisen. Aber auch die Überwachung invasiver Stechmückenarten durch die Modellierung potentieller Verbreitungsgebiete und die Anwendung molekularbiologischer Analysemethoden zum Detektieren der Arten und möglicher Krankheitserreger wird ein wichtiger Bestandteil der weiteren Forschung sein.
Wir haben in dieser Arbeit einige Probleme auf Objekten betrachtet, deren Struktur wohlgeformten Klammerworten entspricht. Dies waren spezielle Routing-Probleme, das Umformen und Auswerten algebraischer Ausdrücke, sowie die Berechnung korrespondierender Symbole zweier Ausdrücke. Eine effiziente Lösung dieser Probleme gelang durch einen rekursiven Divide-and-Conquer Ansatz, der auf Grund der “natürlichen” rekursiven Definition der betrachteten Objekte auch nahe liegt. Im Divide-Schritt wurde das jeweilige Problem in viele wesentlich kleinere Teilprobleme zerlegt, so daß die gesamte Laufzeit des Algorithmus asymptotisch gleich der des Divide-Schrittes und des Conquer-Schrittes blieb. Das Zerlegen der Probleme erfolgte im wesentlichen unter Anwendung bekannter Routing-Algorithmen für monotone Routings und Bit-Permute-Complement Permutationen. Im Conquer-Schritt für das Klammerrouting und das Knotenkorrespondenzproblem wurden nur die Datenbewegungen des Divide-Schrittes rückwärts ausgeführt. Für das Tree-Contraction-Problem wurde dagegen im Conquer-Schritt die Hauptarbeit geleistet. Die Methode der Simulation eines PRAMAlgorithmus durch die Berechnung seiner Kommunikationsstruktur und eine entsprechende Umordnung der Datenelemente konnte sowohl für eine effiziente Implementierung des Tree-Contraction Conquer-Schrittes auf dem Hyperwürfel als auch für die Konstruktion eines einfachen NC1-Schaltkreises zum Auswerten Boolescher Formeln angewandt werden. In einer Implementierung eines Divide-and-Conquer Algorithmus auf einem Netzwerk müssen den generierten Teilproblemen für ihre weitere Bearbeitung Teile des Netzwerks zugeordnet werden. Um die weiteren Divide-Schritte nach der gleichen Methode ausführen zu können, sollte die Struktur dieser Teilnetzwerke analog zu der des gesamten Netzwerks sein. Wir haben das Teilnetzwerk-Zuweisungsproblem für den Hyperwürfel und einige hyperwürfelartige Netzwerke untersucht. Der Hyperwürfel und das Butterfly-Netzwerk können so in Teilnetzwerke vorgegebener Größen aufgeteilt werden, daß nur ein geringer Anteil der Prozessoren ungenutzt bleibt, und die Teilprobleme können schnell in die ihnen zugeordneten Teilnetzwerke gesendet werden. Unter Anwendung dieser Teilnetzwerk-Zuweisungs-Algorithmen haben wir optimale Implementierungen für eine große Klasse von Divide-and-Conquer Algorithmen auf dem Hyperwüfel und hyperwürfelartigen Netzwerken erhalten. Wir konnten garantieren, daß die Laufzeit der gesamten Implementierung des Divide-and-Conquer Algorithmus asymptotisch gleich der Laufzeit ist, die sich aus dem gegebenen Divide-Schritt und Conquer-Schritt ergibt, wenn man alle mit der Teilnetzwerk-Zuweisung verbundenen Probleme außer acht läßt. Wir haben die hier vorgestellte allgemeine Divide-and-Conquer Implementierung im optimalen Teilwürfel-Zuweisungs-Algorithmus, im Klammerrouting-Algorithmus, der selbst ein wesentlicher Teil des Tree-Contraction-Algorithmus ist, und im Algorithmus für das Knotenkorrespondenzproblem eingesetzt.
Kompetenzen bezeichnen „erlernbare kontextspezifische Leistungsdispositionen, die sich funktional auf Situationen und Anforderungen in bestimmten Domänen beziehen“ (Klieme & Hartig, 2007, S. 17). Für den Bereich der Lehrerbildung wurden durch die Kultusministerkonferenz (2004) Standards für die Lehrerbildung: Bildungswissenschaften formuliert, die als Explikation professioneller pädagogischer Kompetenzen gelten können. Durch die Formulierung dieser Standards sieht sich die Lehrerbildung mit der Aufgabe konfrontiert, Studierende des Lehramts so auszubilden, dass die resultierenden Kompetenzen den genannten Standards genügen. Dies impliziert eine standard- und somit kompetenzorientierte Evaluation der Lehrerbildung. Bislang wird eine Evaluation der Lehrerbildung jedoch meist durch Selbsteinschätzungsverfahren umgesetzt – eine Methodik, die im Bereich der Kompetenzdiagnostik kritisch diskutiert wird (z. B. Nerdinger et al, 2008).
Der Situational Judgement Test als kompetenzdiagnostisches Instrumentarium weist die Vorteile situationsorientierter Verfahren auf und kann zusätzlich aufgrund der schriftlichen Darbietung problemlos auf große Stichproben angewandt werden. In der vorliegenden Studie wurde ein solcher Test entwickelt, um die professionelle pädagogische Kompetenz Lehramtsstudierender kontextnah und ökonomisch erfassen zu können. Die Studie hatte zum Ziel, den entwickelten standardorientierten Situational Judgement Test anhand verschiedener Außenkriterien konvergent und diskriminant zu validieren. Hierbei wurden konvergente Validitätsnachweise lediglich teilweise signifikant, wobei diskriminante Validitätsnachweise anhand des Studienfachs (Lehramtsstudium vs. Studium technisch-naturwissenschaftlicher Fächer) deutliche Signifikanzen und Effektstärken zeigten.
Das extrem thermophile Eubakterium Thermus thermophilus ist in den letzten Jahren zu einem Modell für thermophile Organismen geworden und verdankt seinen Statuszum Teil seiner hohe Wachstumsrate, den guten Zellerträgen und der konstitutivenExpression eines natürlichen Kompetenzapparates, der seine genetische Manipulation ermöglicht. Die Verfügbarkeit von kompatiblen Plasmiden und bis zu vier thermostabilen Antibiotikaresistenzmarkern konnten den Wert des Organismus in Hinblick auf biotechnologische Anwendungen noch weiter steigern und tatsächlich besteht nach wie vor ein ungebrochenes Interesse an der Struktur- und Funktionsaufklärung thermophiler Proteine. Der Focus der hier vorliegenden Arbeit richtete sich auf eine der insgesamt zwei terminalen Oxidasen der Atmungskette von T. thermophilus, die Cytochrom ba3 Oxidase. Es wurden verschiedene rekombinante Varianten des Proteins, die sich hinsichtlich der Position und Länge des verwendeten Histidin-Tags unterschieden, kloniert, exprimiert und aufgereinigt. Das Einfügen eines internen His12-Tags in einen periplasmatischen Loop zwischen den Transmembranhelices IV und V führte zu einer rekombinanten Version der Oxidase, die in ihren Eigenschaften dem nativen Wildtyp entsprach und sich durch die in dieser Arbeit etablierte Aufreinigungsstrategie relativ schnell, in guten Ausbeuten und hoher Reinheit aufreinigen ließ. Weiterhin konnten verschiedene Punktmutationen von möglicherweise am Elektronentransfer beteiligten Aminosäureresten generiert und die resultierenden Proteine aufgereinigt und über ihre enzymatische Aktivität charakterisiert werden. Eine weiterführende Charakterisierung der Mutanten erfolgte im Rahmen einer Kooperation und ist bisher noch nicht abgeschlossen. Das Herzstück dieser Arbeit machte jedoch die Definition der Transkriptionseinheit der Cytochrom ba3 Oxidase und die sich daraus ergebenden Fragestellungen aus. So konnte gezeigt werden, dass das ba3 Operon zusätzlich zu den Strukturgenen der dort kodierten Untereinheiten noch mindestens ein, höchst wahrscheinlich jedoch zwei zusätzliche Gene enthält: cbaX und cbaY. Bioinformatische Charakterisierungen ordneten CbaY der diversen Gruppe von sekundären Transportern zu, und es konnte experimentell gezeigt werden, dass seine Anwesenheit für die Expression der Cytochrom ba3 Oxidase förderlich ist. CbaX hingegen konnte über die durchgeführte Homologiesuche keine Funktion zugeordnet werden; uncharakterisierte Homologe waren einzig in der Thermaceae Gruppe zu finden. Durch Deletions- und Komplementationsstudien konnte dem Protein eine entscheidende Rolle in der Assemblierung der ba3 Oxidase bescheinigt werden. CbaX scheint eine zentrale Aufgabe bei der Häm a Insertion in Untereinheit I zu spielen und könnte, ohne Sequenzhomologie aufzuweisen, die Rolle des Surf1-Proteins übernehmen, welches in den sequenzierten Organismen der Thermaceae Gruppe nicht konserviert ist. Die homologe Expression und Aufreinigung von CbaX führte nicht zur erwarteten Ausbeute und Reinheit des Proteins, konnte aber durch immunologische Experimente eine potentielle Interaktion von CbaX und der Cytochrom ba3 Oxidase nachweisen.
Plattenepithelkarzinome des oberen Aerodigestivtraktes (SCCHN) sind Karzinome, die in den westlichen Industrienationen mit dem sechsten Rang in den Tumorstatistiken recht häufig sind. Ihre Inzidenz ist positiv mit einem erhöhten Tabak- und Alkoholkonsum und dem männlichen Geschlecht korreliert. Die Standardtherapie besteht in der Regel in einer operativen Sanierung und einer adjuvanten Radio- beziehungsweise Radio-Chemotherapie. Eine Induktionschemotherapie verspricht fortgeschrittene Primärtumoren und Tumoren vor einer operativen Intervention zu verkleinern. Jedoch besteht hierbei immer noch das Problem der hohen Rezidivfreundlichkeit dieser Tumoren, die wahrscheinlich mit der hohen Anzahl an G0-Phase-Zellen korreliert ist. Die vorliegende Arbeit hat die Frage untersucht, ob es möglich ist mit einer vorgeschalteten Stimulation durch Wachstumsfaktoren die Anzahl der G0-Phase-Zellen signifikant zu reduzieren und dadurch die gesamte Population der Tumorzellen sensibler für eine chemotherapeutische Intervention zu machen. Hierbei wurden besonders die Wachstumsfaktoren EGF und Serotonin als Stimulus verwendet. Die untersuchten Chemotherapeutika waren Mab425 und ZD1839, die die Signaltransduktion über einen EGFR-vermittelten Weg blockieren, sowie Docetaxel und Cisplatin, die als zytotoxische Substanzen wirksam sind. Die Untersuchungen wurden in vitro an drei Zelllinien durchgeführt. Detroit-562 und A431 bezogen wir von ATCC. Die Zelllinie UMSCC-10B wurde uns freundlicherweise von Thomas Carey von der University of Michigan zur Verfügung gestellt. Im Rahmen von Sondierungsversuchen stimulierten die Zellen mit IL-6, Serotonin, EGF und GCSF und fanden mit Hilfe der FACS-Analyse heraus, dass eine Kombination von EGF und Serotonin zur am stärksten ausgeprägten Stimulation der von uns untersuchten Zellen führte. In einem dreiphasigen Versuchsablauf wurden vier verschiedene Probengruppen untersucht. Zum einen eine Kontrollgruppe, die weder stimuliert noch chemotherapiert wurde. Eine Gruppe, die vor einer chemotherapeutischen Intervention mit Serotonin und EGF stimuliert wurde. Eine weitere Gruppe, die ausschließlich mit Serotonin und EGF stimuliert wurde und eine Gruppe, die nur eine Chemotherapie erhielt. Nach der Kultivierung der entsprechenden Proben, wurden die Zellen geerntet und zur Weiterverarbeitung vorbereitet. Es wurde mit Hilfe der Western-Blot-Analyse die Aktivität der Proteine untersucht, die an der über EGFR vermittelten Signaltransduktion beteiligt sind. Dazu wurden Antikörper gegen Proteine der Signaltransduktion eingesetzt, die dann mit Hilfe von zweiten Antikörpern erkannt wurden. Zum anderen wurden immunhistochemische Zellausstriche angefertigt mit einer Antikörperfärbung gegen das Kernprotein Ki-67, die uns zwischen proliferierenden und nichtproliferierenden Zellen unterscheiden ließ. Es erfolgte eine Auswertung der Gesamtzellanzahl bezogen auf die Reduktion der G0-Phase-Zellen. Die statistische Auswertung erfolgte mittels des Mann-Withney-U-Tests und des Wilcoxon- Tests. Hierbei lag das Signifikanzniveau bei 5%. Als Ergebnis kann man festhalten, dass eine signifikante Reduktion der Anzahl an G0-Phase-Zellen bei einer Vorstimulation und anschließender Chemotherapie durch Docetaxel oder Cisplatin zu beobachten war. Eine chemotherapeutische Intervention durch Mab425 und ZD1839 führte zwar zu einer Reduktion der Zellanzahl, aber nicht zu vergleichbar signifikanten Ergebnissen wie bei einer Intervention mit Docetaxel oder Cisplatin. Hieraus lässt sich der Schluss ableiten, dass eine chemotherapeutische Intervention auf Basis einer Blockade der durch EGFR vermittelten Signaltransduktion nicht ausreichend ist, es also einer zytotoxischen Komponente bedarf, um die Gesamtzellzahl signifikant zu reduzieren. Trotzdem nicht bei allen untersuchten Chemotherapeutika eine signifikante Reduktion der G0-Phase-Zellen beobachtet werden konnte, zeigten unsere Untersuchungen zum ersten Mal, dass durch eine Stimulation mit Wachstumsfaktoren vor einer chemotherapeutischen Intervention, die Sensibilität der Tumorzellen bei SCCHN für eine Chemotherapie durch eine Reduktion der G0-Phase-Zellen erhöht wird.
Viele aerobe Organismen besitzen eine NADH:Ubichinon Oxidoreduktase, ein Enzym, welches der Haupteintrittspunkt für Elektronen in die Atmungskette darstellt. An den Elektronentransfer ist die Protonentranslokation vom Zytosol in den Intermembranenraum der Mitochondrien gekoppelt. Störungen des mitochondrialen Energiestoffwechsels bedingen Mitochondriopathien. Der Befall verschiedener Organsysteme, v.a. denjenigen mit hohem Energiestoffwechsel (Gehirn, Skelettmuskel, Retina, Myokard), verursacht multiple Symptome, was für diese Erkrankungen bezeichnend ist. Die Aufklärung der exakten Funktionsweise eines Enzyms bedarf der Kenntnis über seine räumliche Struktur. Diese lässt sich zur Zeit für ein Protein dieser Größe nur mittels Elektronenmikroskopie an zweidimensionalen Kristallen oder durch Röntgenkristallographie an dreidimensionalen Einkristallen realisieren. Das Ziel und die Herausforderung dieser Arbeit galt der Kristallisation und Strukturanalyse der NADH:Ubichinon Oxidoreduktase, eines der größten Membran-proteinkomplexe. Mit Hilfe der Kristallisation sollten Auskünfte über die Struktur und Rückschlüsse auf seine Funktion, sowie weitere Einblicke in die Bedeutung dieses Proteinkomplexes ermöglicht werden. Elektronenmikroskopische Aufnahmen zeigen eine L-förmige Struktur des Enzyms mit einem peripheren Arm, der in die mitochondriale Matrix ragt, und einem Membranarm, der in der Lipiddoppelschicht angeordnet ist. In beiden Armen befinden sich insgesamt bis zu 46 Untereinheiten des Enzymkomplexes. Die NADH-Bindungsstelle und alle bekannten Redoxgruppen (FMN, bis zu neun FeS-Zentren) liegen im peripheren Arm. Der Winkel zwischen beiden Armen ist variabel. Mit dem Ziel Komplex I in seiner Gesamtheit zu kristallisieren, wurden Antikörperfragmente zur Ko-Kristallisation eingesetzt. Die Βedeutung der Fv-Fragmente, als kleinste antigenbindende Domäne eines Antikörpers, liegt in der Vergrößerung der hydrophilen Oberfläche. Es wurden Fv-Fragmente gegen die NADH:Ubichinon Oxidoreduktase aus Yarrowia lipolytica erzeugt und ihre Eignung für die Kristallisation überprüft. Die Klonierung und Expression erfolgte in Escherichia coli. Es zeigte sich durchweg nur ein sehr niedriges oder auch vollkommen unbefriedigendes Expressionsniveau der Fv-Fragmente. Nach gezielter Mutation konnte bei dem Klon Y30C12 eine Expressionssteigerung erreicht werden, welche allerdings für Kristallisationsversuche noch immer unzureichend war. Mit dem Klon Y34C10 konnte in Expressionsversuchen eine ausreichende Menge an Fv-Fragmenten gewonnen werden. Mit diesen Fv-Fragmenten gelang auch die Einschrittreinigung an der Streptavidin-Sepharosesäule und es konnten Bindungs- und Kristallisationsversuche mit Komplex I unternommen wurden. Durch eine FPLC-Gelfiltration konnte ein stöchiometrischer 1:1 Komplex aus der NADH:Ubichinon Oxidoreduktase und dem Fv-Fragment Y34C10 gewonnen werden, welcher bei der Suche nach geeigneten Kristallisationsbedingungen eingesetzt wurde. Eine Kristallisation des Komplexes gelang unter den ausgewählten Bedingungen mit diesem Komplex jedoch noch nicht. Dennoch eignen sich die Klone Y34C10 und Y30C12-M für weitere Studien, die eine Expressionssteigerung durch Punktmutationen in der schweren und leichten Kette (siehe unter 4.3) beinhalten sollten. Zum anderen besteht die Wahrscheinlichkeit den Kristallisationserfolg durch breite Variation der Bedingungen zu erhöhen. ...
Lichtsensitive Proteine bzw. Photorezeptoren eignen sich hervorragend für das Studium des Zusammenhangs von Proteinstruktur und –funktion. Lichtrezeptorproteine werden leicht durch Licht angeregt, wodurch eine gute Zeitauflösung für deren Untersuchung erreicht werden kann. Weiterhin sind sie als Signalproteine während der Etablierung des aktiven Zustandes und dessen Zerfalls großen konformationellen und strukturellen Änderungen unterworfen. Ausgehend von diesen Eigenschaften wurde bereits eine große Zahl von Lichtrezeptorproteinen genauer untersucht. Diese vorliegende Arbeit beschäftigt sich mit lichtinduzierten konformationellen Änderungen in Membranproteinen. Dafür wurden drei verschiedene Systeme herangezogen: das kleine α-helikale Peptid Gramicidin A, der G-Protein gekoppelte Rezeptor Rhodopsin and die BLUF (blue light using FAD) Domäne des hypthetischen Membranproteins Blrp (blue-light regulated phosphodiesterase) aus E. coli. Gramicidin A (gA) ist ein aus dem Bodenbakterium B. brevis isoliertes Antibiotikum, das Transportkanäle für einwertige Kationen wie Lithium, Natrium und Kalium ausbildet. Gelöst in Detergenzmizellen, wurde für gA unerwartet eine Wechselwirkung mit Blaulicht fest gestellt (Abbildung 1). Diese Beobachtung wurde mit statischen und zeitaufgelösten NMRspektroskopischen Methoden genauer untersucht und ist in Kapitel 2 näher beschrieben. Basierend auf den gewonnenen Erkenntnissen wird postuliert, dass einer der Tryptophanreste (Trp9) eine lichtinduzierte konformationelle Änderung erfährt. Ausgehend von der Konformation in Lösung befindet sich die Seitenkette von Trp9 in einem Gleichgewicht (70:30) mit einer zweiten Konformation. Bei der zweiten Konformation handelt es sich möglicherweise um die Orientierung, die der Tryptophanrest unter Festkörper-NMR Bedingungen einnimmt. Die Lebensdauer der neuen Konformation beträgt in etwa eine Sekunde. Der G-Protein gekoppelte Rezeptor Rhodopsin ist verantwortlich für die Verarbeitung von Lichtsignalen in den Stäbchenzellen der Retina. Die Absorption eines einzelnen Photons führt zur Isomerisierung des kovalent gebundenen Chromophors 11-cis-Retinal, wodurch konformationelle Änderungen im Protein veranlasst werden. Der aktivierte Metarhodopsin II (MetaII) Zustand induziert eine Enzymkaskade und schließlich einen Nervenimpuls, das Säugern das Kontrastsehen ermöglicht. Eine große Bandbreite an hochauflösenden NMRspektroskopischen Methoden, (einschließlich zeitaufgelöster und Festkörper-NMR Methoden) wurde im Laufe dieser Arbeit angewandt, um Konformation und Dynamik von bovinem Rhodopsin näher zu untersuchen. In Kapitel 3.1 sind zu Beginn mehrere Optimierungsschritte im Hinblick auf ein kostengünstiges, isotopenmarkiertes Säugerzellenmedium beschrieben. In diesem Zusammenhang wurden mehrere Rhodopsin NMR-Proben hergestellt, wobei der Gehalt an isotopenmarkierten Aminosäuren ca. 50% betrug. Anhand dieser Proben konnte bewiesen werden dass sich mit Lösungs-NMR-Spektroskopie auch sehr große, in Detergenzmizellen stabilisierte Membranproteine (~150 kD Gesamtmasse) detailliert studieren lassen. Die Untersuchungen konzentrierten sich auf den C-Terminus, für den nach sequentieller Zuordnung (Abbildung 2a) und heteronuklearern Relaxationsmessungen ein Mobilitätsverhalten bestimmt wurde, das dem mittelgroßer Proteine ähnelt. Des Weiteren konnten keinerlei definierte Strukturelemente innerhalb des C-Terminus identifiziert werden, u.a. durch einen Vergleich mit eines 19mer Peptids, dessen Primärsequenz des Rhodopsin C-Terminus entspricht (Abbildung 2a und 2b). In Kapitel 3.2 wird die nichtinvasive Zuordnung der Rückgratresonanzen aller fünf Trytophane mit Hilfe einer Kombination aus Lösungs- und Festkörper-NMR beschrieben. Dazu wurden verschiedene Rhodopsinproben hergestellt, die alle möglichen 13C’i-1-Carbonyl/15Ni-Tryptophan isotopenmarkierten Amidpaare enthielten. Eine Teilzuordnung der Tryptophanindolsignale konnte in Lösung durch Protonen-/Deuteriumaustausch und heteronukleare Relaxationsmessungen erreicht werden. Die Ergebnisse legen nahe, dass die Kombination aus Lösungs- und Festkörper-NMR-Spektroskopie sehr gut geeignet ist um komplementäre Informationen zu strukturellen und dynamischen Eigenschaften von Rhodopsin zu liefern. Fehlende Zuordnungen in den Lösungspektren konnten durch den Verglich mit Festkörperspektren ergänzt werden und umgekehrt (Abbildung 3). In Kapitel 3.3 ist die erfolgreiche Adaption der zeitaufgelösten NMR-Spektroskopie für die Untersuchung des Rhodopsin MetaII Zerfalls in vitro beschrieben. Die zeitaufgelösten protonendetektieren NMR-Experimente wurden mit unmarkiertem, in Detergenzmizellen stabilisiertem Protein bei verschiedenen Temperaturen aufgenommen, wobei sich die anschließende Auswertung auf die stark tieffeldverschobene Indolregion konzentrierte (Abbildung 4). Für die berücksichtigten Signale traten nach Induktion des aktivierten Zustandes deutliche chemische Verschiebungsänderungen auf, außerdem zeigten sie unterschiedlich schnellen MetaII Zerfall. Zusätzlich zu der erwarteten Zeitkonstante des MetaII Zerfalls (~6 min bei 298 K) konnte erstmalig eine zweite, ca. zehnmal langsamere Zeitkonstante bestimmt werden. Diese zweite Zeitkonstante ist möglicherweise ein Ausdruck für die langsame Entfaltung von Sekundärstrukturelementen nach dem Zerfall des Proteins in Opsin und Retinal. Die BLUF-Domänen verwenden Flavinadeninnukleotid (FAD) als Chromophor und gehören zu der Familie der Blaulichtrezeptoren. In Kapitel 4 wird die Untersuchung des lichtadaptierten Zustandes der E. coli BLUF Domäne auf Protein- und Ligandenebene mit zeitaufgelösten proton- und phosphordetektierten NMR-Experimenten beschrieben. In Abbildung 5 sind die statischen Licht- und Dunkelspektren (jeweils licht- und dunkeladaptiert) dargestellt. Im Folgenden konnte durch Beobachtung der Dunkeladaption bei verschiedenen Temperaturen die Aktivierungsenergie des Lichtzustandes bestimmt werden. Des Weiteren wurden zum ersten Mal phosphordetektierte NMR-Experimente erfolgreich angewandt, um einen biologisch relevanten Vorgang zeitabhängig näher zu bestimmen.