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Der Name Histamin hat seinen Ursprung aus dem griechischen Wort "histos" (Gewebe) und spielt auf sein breites Spektrum an Aktivitäten, sowohl unter physiologischen als auch unter pathophysiologischen Bedingungen an. Histamin ist eines der Moleküle mit welchem man sich im letzten Jahrhundert am intensivsten beschäftigt hat.
Im Jahr 1907 wurde das Histamin erstmals synthetisiert. Drei Jahre später gelang es, dieses Monoamin erstmals aus dem Mutterkornpilz Claviceps purpurea zu isolieren. Weitere 17 Jahre vergingen, ehe Best et al. Histamin aus der humanen Leber und der humanen Lunge isolieren konnten. Best konnte somit beweisen, dass dieses biogene Amin einen natürlichen Bestandteil des menschlichen Körpers darstellt. Nach der Entdeckung wurden dem Histamin mehrere Effekte zugeschrieben. Dale et al. beobachteten, dass Histamin einen stimulierenden Effekt auf die glatte Muskulatur des Darms und des Respirationstraktes hat, stimulierend auf die Herzkontraktion wirkt, Vasodepression und ein schockähnliches Syndrom verursacht.
Popielski demonstrierte, dass Histamin dosisabhängig einen stimulierenden Effekt auf die Magensäuresekretion von Hunden hat. Lewis wiederum beschrieb erstmals, dass Histamin einen Effekt auf der Haut hervorruft. Dies zeigte sich durch verschiedene Merkmale, wie geröteter Bereich aufgrund der Vasodilatation und Quaddeln aufgrund der erhöhten Gefäßpermeabilität. Des Weiteren wurde Histamin eine mediatorische Eigenschaft bei anaphylaktischen und allergischen Reaktionen zugeschrieben. Zusätzlich spielt das biogene Amin eine entscheidende Rolle im zentralen Nervensystem (ZNS), unter anderem beim Lernen, bei der Erinnerung, beim Appetit und beim Schlaf-Wach-Rhythmus. Von den zahlreichen physiologischen Effekten des Histamins ist seine Rolle bei Entzündungsprozessen, der Magensäuresekretion und als Neurotransmitter am besten verstanden.
Habituation ist eine der einfachsten Formen des Gedächtnisses. Hierbei handelt es sich um die erlerne Gewöhnung an einen harmlosen Reiz. Dies bedeutet, dass nach mehrfacher wiederholter Repräsentation eines harmlosen Reizes die Reaktion darauf stetig abnimmt, bis sie völlig zum erliegen kommt. Je nach Trainingsprotokoll kann diese Gewöhnung bis zu mehren Tagen andauern. Habituation ist hoch konserviert und ein Verhaltensmuster, dass auch bei sehr einfachen vielzelligen Organismen zu finden ist und untersucht werden kann. Zur Untersuchung des Zusammenspiels innerhalb eines neuronalen Netzwerkes, welches für die Habituation des Rückzugsreflexes (Ausweichreaktion nach Berührung) verantwortlich ist wurde hier der Fadenwurm Caenohabditis elegans (C. elegans) als Modell Organismus verwendet. Aufgrund seines einfachen, nur 302 Zellen umfassenden, Nervensystems eignet sich C. elegans sehr gut für Grundlagenforschung in diesem Bereich. Das neuronale Netzwerk, das verantwortlich ist für den Rückzugsreflex ist in drei Ebenen organisiert. Wahrgenommen wird der Reiz von sensorischen Neuronen (ASH, ALM, AVM, PLM, PVM). Die Weiterleitung erfolgt über verschiedene Interneuronen (AVA, AVB, AD, AVE, PVC) hin zu den Motorneuronen, welche die Muskeln enervieren und somit die Reaktion auf den in erster Ebenen wahrgenommen Reiz auslösen.
Mit Hilfe von optogenetischen Werkzeugen wurde hier Untersucht welche Rolle einzelne Zellen innerhalb dieses Netzwerkes innehaben und an welcher Stelle innerhalb des Netzwerkes die kurzzeitige Habituation des Reizes, nach einem Einfachen Lernprotokoll stattfindet. Zuerst musste eine Möglichkeit gefunden werden die zur Verfügung stehenden optogenetischen Werkzeuge zellspezifisch zu exprimieren. In dieser Arbeit wurden hierfür Rekombinasesysteme verwendet, die es ermöglichten zur Expression eine Kombination aus 2 verschiedenen Promotoren zu verwenden. Beide Promotoren dürfen hierbei nur in einer Zelle, der Zielzelle, überlappen. Es konnte zellspezifische Expression des Kationenkanals Chanelrhodopsin 2 (ChR2) in den beiden Zellparen AVAL/R und ASHL/R (nimmt aversive Reize wahr) erreicht werden.
Zur Untersuchung der Habituation wurde zusätzlich noch ein Wurmstamm verwendet, welcher ChR2 unter dem mec-4 Promotor exprimiert. ChR2 ist hier in den Mechanorezeptorneuronen (MRN) ALM, AVM, PLM und PVM exprimiert. Die hier durchgeführten Experimente deuten darauf hin das den MRNs die Größte Rolle bei der Ausbildung einer Habituation zukommt. Es gibt jedoch auch Hinweise darauf, dass AVA zusätzlich eine Rolle spielt.
Im weiteren Verlauf der Arbeit wurde die Rolle von AVA genauer untersucht. AVA gilt als der Hauptsignalgeber für eine Rückwärtsbewegung (spontan und nach Reizempfang). Es konnte gezeigt werden dass eine Unterbrechung der ’Gap Junktionen’ zwischen AVA und PVC eine stärkere Reaktion zur Folge haben. AVA scheint also durch PVC inhibiert zu werden. Ebenfalls mit AVA direkt interagierende Neuronen sind AVD und AVE. Mit den hier zur Verfügung stehenden Mitteln konnte die genaue Modulation von AVA durch diese Zellen jedoch nicht gezeigt werden.
In dieser Arbeit konnte der Grundstein für eine funktionale Aufklärung des Nervensystems von C. elegans gelegt werden. Vor allem durch die Möglichkeit der zellspezifischen Expression kann es zukünftig gelingen das Zusammenspiel der einzelnen Nervenzellen und ihren Anteil an einem bestimmtem Verhalten zu Untersuchen.
Im Rahmen dieser Arbeit sollte untersucht werden, ob eine Zellzyklusabhängigkeit der CD95- vermittelten Apoptose besteht. Dazu wurde ein ecdysoninduzierbares Genexpressionsystem für die induzierte Überexpression der CDK-Inhibitoren p21 und p27 in RKO-Zellen (Kolonkarzinomzellen) zur Herbeiführung eines Zellzyklusarrests in der G1-Phase benutzt. Nach Induktion mit dem Ecdysonhomolog Muristeron wurde durch Zugabe von rekombinanten hCD95-Liganden Apoptose ausgelöst und anschließend untersucht. Die erzielten Ergebnisse zeigen, dass der Induktor Muristeron an sich und nicht die p21- bzw. p27-Überexpression die anti-apoptotische Akt-Kinase aktiviert, die Expression des anti-apoptotischen Bcl-xL erhöht, die Caspase-8-Aktivierung (entweder am CD95-DISC oder durch "Feedback"-Aktivierung durch Caspase-3) und die darauf folgenden Ereignisse verhindert und somit die hCD95L-induzierte Apoptose blockiert. Zusätzlich beeinflusst der Induktor auch das Genexpressionsmuster der behandelten Zellen, was ebenfalls für die Hemmung der Apoptose mit verantwortlich sein könnte. Somit ist das ecdysoninduzierbare Genexpressionsystem zur Apoptoseuntersuchung in RKO-Zellen nicht verwendbar. Mit der Untersuchung des Apoptoseverhaltens proliferierender RKO-Zellen konnte gezeigt werden, dass überlebende Zellen nach hCD95L-Behandlung vermehrt in der G0/G1-Zellzyklusphase nachweisbar sind, während apoptotische (Caspase-3-positive) Zellen aus der G2/M-Phase heraus sterben. Allerdings weisen die apoptotischen Zellen kaum Cyclin B1 auf, ein für die G2-Phase wichtiges und typisches Cyclin. Somit bleibt die genaue Verknüpfung von Zellzyklusregulation und Apoptose auch nach diesen Analysen ungeklärt. In einem dritten Ansatz - Zellzyklusarrest durch Dichtearretierung - konnte eine Hemmung der CD95- vermittelten Apoptose in der arretierten Zellpopulation nachgewiesen werden. Allerdings sekretieren RKO-Zellen einen anti-apoptotischen Faktor in ihr Medium, dessen Konzentration und Wirkung mit größerer Zelldichte zunimmt und somit für die Protektion, unabhängig von Zellzyklusarrest oder Proliferation, verantwortlich ist. Konfluente und auch mit konditioniertem Medium behandelte RKO-Zellen zeigen im Vergleich zu dünn ausgesäten RKO-Zellen Veränderungen, die denen sehr ähnlich sind die beim Übergang einer epithelverankerten Zelle zu einer migrierenden Einzelzelle (EMT) auftreten. Beispielsweise verändert sich die Zusammensetzung des Zytoskeletts, die Zellen verlieren den Zell-Zell-Kontakt und lösen sich ab, bleiben aber am Leben. Zusätzlich steigt die Sekretion von Zytokinen an, die Angiogenese, Migration und Invasion positiv beeinflussen. Sowohl konfluente als auch mit konditioniertem Medium behandelte sub-konfluente Zellen sind apoptoseresistent (hCD95L, TRAIL, UV, Staurosporin), woran u.a. die Kinasen PKC und PI3K, aber auch das anti-apoptotische Bcl-xL beteiligt sind. Die Zellen sterben interessanterweise, wenn ein agonistischer anti-CD95-Antikörper statt des rekombinanten CD95-Liganden verwendet wird, was vermuten lässt, dass eine mangelhafte Vernetzung der einzelnen DISC-Komplexe zur Apoptosehemmung führt, welche durch den Antikörper dann aber erzwungen wird. Zwar handelt es sich hierbei um ein reines Zellkulturmodell, dennoch könnte es bedeuten, dass die Umgebung in einer dichten RKO-Zellkultur vergleichbar ist mit der in größeren soliden Tumoren. Die Zellen brauchen Nährstoffe, versuchen über eine Neovaskularisierung Anschluss an ein Blutsystem zu finden und sekretieren Lockstoffe, Wachstumsfaktoren sowie Proteasen, um die Metastasierung zu erleichtern. PI3K, cPKCs und Bcl-xL tragen dabei zu einer Apoptoseresistenz bei, welche die Zellen zum einen resistent gegenüber Anoikis, Nährstoffmangel, aber auch gegen angreifende zytotoxische T-Zellen macht. Eine weitere Aufklärung der hier ablaufenden Prozesse würde es erleichtern, Möglichkeiten zu finden, in diese Signalwege einzugreifen, um die Apoptosesensitivität wieder herzustellen und die Metastasierung zu verhindern. Insbesondere ist die Identifizierung des für die Apoptoseprotektion verantwortlichen Zytokins das nächste wichtige Ziel bei der Fortsetzung dieser Arbeiten.
Die vorliegende Arbeit ist das Extrakt umfangreicher Untersuchungen an ausgewählten organischen und metallorganischen Verbindungen im Hinblick auf ihre Polymorphie. Nicht nur die praktischen Arbeiten, wie Synthesen, Polymorphie-Screenings (nach eigens entwickeltem Vorgehen), die chemisch-physikalischen Charakterisierungen neuer polymorpher Formen, sondern auch die Kristallstrukturbestimmungen aus Röntgenbeugungsdaten wurden durchgeführt. Im Fokus der Untersuchungen standen Pigmentvorprodukte, Pigmente, pharmazeutische Wirkstoffe und weitere organische und metallorganische Verbindungen.
Ein Auszug zu Pigmentvorprodukten bilden 2-Ammoniobenzolsulfonate, welche klassische Vorprodukte verlackter Hydrazonpigmente sind. Die bislang unbekannte tautomere Form und Kristallstruktur der CLT-Säure als Zwitterion konnte erfolgreich aus dem Zusammenspiel von IR-, Festkörper-NMR-Spektroskopie und Röntgen-Pulverdiffraktometrie ermittelt werden [1]. Mit Hilfe eines Polymorphie-Screenings konnten nicht nur zwei neue Pseudopolymorphe, sondern auch das Ansolvat der CLT-Säure selbst kristallisiert und ihre Strukturen aus Röntgen-Einkristalldaten bestimmt werden. Hierbei konnte das, aufgrund der Strukturbestimmung aus Röntgen-Pulverdaten proklamierten Tautomer der CLT-Säure verifiziert werden [2]. Mit Hilfe thermischer und röntgenographischer Untersuchungen an drei Derivaten der CLT-Säure, konnte der Einfluss des Substitutionsmusters (Chlor- und Methylsubstituenten) auf die Kristallpackung aufgezeigt werden [3]. Mit Hilfe eines Polymorphie-Screenings an der Iso-CLT-Säure konnten Reaktionen der zum Polymorphie-Screening eingesetzten Lösungsmittel und der Iso-CLT-Säure beobachtet und mittels thermischer und röntgenographischer Ergebnisse aufgeklärt werden. In zwei Fällen konnte eine Deprotonierung und im dritten Fall eine Desulfonierung beobachtet werden. Durch Erwärmen der deprotonierten und desulfonierten Verbindung(en) ist die Rückgewinnung der Iso-CLT-Säure möglich [4]. Ein Polymorphie-Screening an Pigment Red 53 lieferte vierundzwanzig neue Phasen, welche identifiziert und charakterisiert werden konnten. Ferner konnten von neun Phasen die Kristallstrukturen bestimmt werden (acht aus Röntgen-Einkristall- und eine aus Röntgen-Pulverdaten). Mit Hilfe dieser konnte ein Teil der Funktionalisierung von Lösungsmittelmolekülen in Pigment Red 53 aufgedeckt werden. Diverse Beziehungen pseudopolymorpher Formen zueinander konnten auf Basis der gewonnenen Erkenntnisse bestimmt werden [5]. Mit Hilfe der Ergebnisse aus den Untersuchungen zu Pigment Red 53 konnte mittels Modifizierung der bekannten Syntheseroute zu Pigment Red 53:2 die bekannte α-Phase erhalten werden. Weiterhin konnten neben zehn bekannten weitere fünfzehn neue Polymorphe identifiziert und weitestgehend charakterisiert werden. Die Kristallstrukturen von fünf bekannten und zwei neuen Phasen (sechs aus Röntgen-Einkristall- und eine aus Röntgen-Pulverdaten [6]) konnten bestimmt werden. Anhand der Ergebnisse aus den chemisch-physikalischen Charakterisierungen konnten Einzelbeziehungen zwischen den Phasen beobachtet werden. Die eigene Synthese von Pigment Red 57:1 resultierte in der bereits bekannten α-Phase. Ein Polymorphie-Screening an der α-Phase lieferte neben der bereits bekannten β-Phase elf neue Modifikationen. Schließlich konnte mit Hilfe der gesammelten Daten zur α-, β- und γ-Phase ein Zusammenhang zwischen De-/Rehydratation und dem damit einhergehenden Farbwechsel hergestellt und nachgewiesen werden [7]. Die bislang unbekannte Protonierung und Kristallstruktur von Nimustin-Hydrochlorid konnten erfolg-reich aus der Symbiose von Festkörper-NMR und Röntgen-Pulverdiffraktometrie des Handelsproduktes ermittelt werden [8]. Ebenso konnte die bislang unbekannte Kristallstruktur von 5′-Deoxy-5-fluorouridin konnte erfolgreich aus Röntgen-Pulverdaten des Handelsproduktes bestimmt werden [9]. Nach einem umfangreichen Polymorphie-Screening gelang es, Einkristalle von Tizanidin-Hydrochlorid zu erhalten und dessen Struktur aus Röntgen-Einkristalldaten zu bestimmen. Die bislang angenommene Tautomerie von Tizanidin im Festkörper und flüssiger Phase konnte mittels Röntgen-Einkristalldiffraktometrie und 1H-NMR korrigiert werden [10]. Während thermischer Untersuchungen wurden zwei bisher nicht beschriebene Polymorphe (ein Hochtemperatur- und ein Raumtemperaturpolymorph) gefunden. Schließlich konnte die Kristall-struktur des zweiten bei Raumtemperatur stabilen Polymorphs aus Röntgen-Pulverdaten bestimmt werden.
Es konnte die Kristallstruktur von 4,5,9,10-Tetramethoxypyren [11], eines neuen 2:1 Co-Kristalls aus Chinolin und Fumarsäure [12] und einer biradikalen Azoverbindung [13] aus Röntgen-Pulverdaten bestimmt werden. Neben diesen Verbindungen konnten aus analytischen und röntgenographischen Untersuchungen an ausgewählten Stereoisomeren von Inositol dreizehn neue Phasen erhalten werden. Zudem konnten mehrere Schmelzpunkte mittels DSC-Messungen korrigiert oder als Phasenübergänge oder Zersetzungs-punkte identifiziert werden. Acht Strukturen geordneter Phasen konnten aus Röntgen-Pulverdaten bestimmt werden. Zusätzlich konnten fünf der dreizehn Phasen als Rotatorphasen identifiziert und deren Elementarzelle ermittelt werden [14]. Auf Basis einer neuen Syntheseroute konnten ein Cobalt(II)- und ein Zink(II)-fumarat-Anhydrat, welche im Vergleich zu den bisher bekannten Hydraten besser wasser-löslich sind, erhalten werden. Diese Anhydrate konnten zur Kristallisation eingesetzt werden und lieferten alle bisher bekannten und zusätzlich drei neue Kristallphasen (zwei neue Cobalt(II)-fumarat-Hydrate und ein neues Zink(II)-fumarat-Hydrat). Die Kristallstrukturen der drei neuen Kristallphasen konnten aus Röntgen-Einkristalldaten bestimmt werden [15 und 16].
[1] S. L. Bekö, S. D. Thoms, J. Brüning, E. Alig, J. van de Streek, A. Lakatos, C. Glaubitz & M. U. Schmidt (2010), Z. Kristallogr. 225, 382–387; [2] S. L. Bekö, J. W. Bats & M. U. Schmidt (2012), Acta Cryst. C 68, o45–o50; [3] S. L. Bekö, C. Czech, M. A. Neumann & M. U. Schmidt. "Doubly substituted 2-ammonio-benzenesulfonates: Substituent influence on the packing pattern", eingereicht; [4] S. L. Bekö, J. W. Bats, E. Alig & M. U. Schmidt (2013), J. Chem. Cryst. 43, 655–663; [5] S. L. Bekö, E. Alig, J. W. Bats, M. Bolte & M. U. Schmidt. "Polymorphism of C.I. Pigment Red 53", eingereicht; [6] T. Gorelik, M. U. Schmidt, J. Brüning, S. Bekö & U. Kolb (2009), Cryst. Growth Des. 9, 3898–3903; [7] S. L. Bekö, S. M. Hammer & M. U. Schmidt (2012), Angew. Chem. Int. Ed. 51, 4735–4738 und Angew. Chem. 124, 4814–4818; [8] S. L. Bekö, D. Urmann, A. Lakatos, C. Glaubitz & M. U. Schmidt (2012), Acta Cryst. C 68, o144–o148; [9] S. L. Bekö, D. Urmann & M. U. Schmidt (2012), J. Chem. Cryst. 42, 933–940; [10] S. L. Bekö, S. D. Thoms, M. U. Schmidt & M. Bolte (2012), Acta Cryst. C 68, o28–o32; [11] M. Rudloff, S. L. Bekö, D. Chercka, R. Sachser, M. U. Schmidt, K. Müllen & M. Huth. "Structural and electronic properties oft he organic charge transfer system 4,5,9,10-tetramethoxypyrene - 7,7,8,8-tetracyanoquinodimethane", eingereicht; [12] S. L. Bekö, M. U. Schmidt & A. D. Bond (2012), CrystEngComm 14, 1967–1971; [13] S. L. Bekö, S. D. Thoms & M. U. Schmidt (2013), Acta Cryst. C 43, 1513–1515; [14] S. L. Bekö, E. Alig, M. U. Schmidt & J. van de Streek (2014), IUCrJ 1, 61–73; [15] S. L. Bekö, J. W. Bats & M. U. Schmidt (2009), Acta Cryst. C 65, m347–m351; [16] S. L. Bekö, J. W. Bats & M. U. Schmidt. "One-dimensional zinc(II) fumarate coordination polymers", akzeptiert.
The formation of aliphatic α-amino acids by X-ray induced carboxylation of simple amines or amination of simple carboxylic acids is not favored over the formation of other amino acids. The new carboxylic and amino groups are more or less distributed statistically over the carbon atoms of the starting material. On radiationchemical formation of aliphatic hydrocarbons over C3, therefore, an increasing amount of unusual amino acids is produced. The results are influenced by various parameters such as temperature, pH, concentration, linear energy transfer and total dosis of radiation applied. Also peptides can be formed radiationchemically. However, the formation of greater molecules by radiationchemical processes under the conditions of a primitive earth seems to have only a low probability. The reaction mechanisms of radiationchemical carboxylation and amination are discussed.
Zur Rolle der Typ-I-Interferone in der Abwehr von viralen Infektionen des zentralen Nervensystems
(2007)
Das zentrale Nervensystem (ZNS) bildet eine einzigartige Umgebung für Immunantworten, da Neuronen eine essentielle und in weiten Teilen nicht-erneuerbare Zellpopulation bilden. Virale Infektionen des ZNS und lokale anti-virale Immunantworten können zu dem Verlust von Neuronen und somit zu katastrophalen Erkrankungen führen. Unter normalen Bedingungen ist das ZNS weitgehend von der Kontrolle durch das Immunsystem ausgeschlossen. In diesem Zusammenhang wurde das ZNS oft auch als „immunprivilegiert“ bezeichnet. Dieses Konzept musste in den letzten Jahren revidiert werden, da es sich gezeigt hat, dass das ZNS nicht völlig vom Immungeschehen isoliert ist. Wichtige Mediatoren antiviraler Immunantworten sind die Typ I Interferone (IFN). Die verschiedenen Typ I IFN binden an einen gemeinsamen Rezeptor, den Typ I Interferon-rezeptor (IFNAR). Die Bedeutung von Typ I IFN Antworten für die Kontrolle viraler Infektionen wurde besonders eindrucksvoll mit IFNAR-defizienten Mäusen (IFNAR-/-) gezeigt. Nach Infektion mit dem neurotropen Vesikulären Stomatitis Virus (VSV) führt das Fehlen des IFNAR zu einer stark erhöhten Empfänglichkeit für tödlich verlaufende Infektionen. In allen Organen und besonders im ZNS von VSV infizierten IFNAR-/- Tieren fanden sich stark erhöhte Virusmengen. Um zu untersuchen, ob die VSV-Infektion des zentralen Nervensystems in IFNAR-/- Mäusen in erster Linie auf ein Versagen der peripheren Immunität oder des IFN Systems innerhalb des ZNS zurückzuführen ist, wurden mittels der Cre loxP Tech-nologie Mäuse hergestellt, die auf allen peripheren Zellen IFNAR exprimieren, während die Neuronen des ZNS IFNAR defizient sind (NesCre+/-IFNARflox/flox). Nach intranasaler VSV Infektion zeigten NesCre+/-IFNARflox/flox Mäuse zunächst keine Krankheitssymptome. Nach 5 bis 6 Tagen traten aber aufsteigende und halbseitige Lähmungen auf, so dass die infizierten Tiere verstärkt im Kreis liefen und schließlich verstarben. Im Vergleich dazu verstarben IFNAR-/- Mäuse bereits nach 2 bis 3 Tagen während normale C57BL/6 Tiere nach Infektion keine Symptome zeigten und überlebten. Der beobachtete Krankheitsverlauf lässt in den IFNAR-/- Mäuse auf ein Multiorganversagen als Todesursache schließen. 3 und 6 Tage nach Infektion konnte in den Organen von C57BL/6 Tieren kein Virus reisoliert werden. In den NesCre+/ IFNARflox/flox Tieren fanden sich zum Todeszeitpunkt nur im Gehirn Viruspar-tikel, während alle anderen Organe virusfrei waren. Die Virustiter im Hirn waren im Vergleich zu den IFNAR-/- Mäusen 10- bis 100-fach erhöht. In den anderen Organen und im Blut sind keine Viruspartikel nachweisbar. Dieser Befund deutete gemeinsam mit den beobachteten Krankheitsverläufen auf eine neuropathologische Symptomatik hin, bei der es wahrscheinlich zu einer VSV-Infektion des Hirnstammes kam. Die Analyse einzelner Regionen des ZNS zeigte in IFNAR-/- Tieren, dass 2 Tage nach Infektion in allen Regionen des ZNS signifikante Virusmengen zu finden waren. In den NesCre+/-IFNARflox/flox und den C57BL/6 Tieren fanden sich zu diesem Zeitpunkt nur im Riechhirn (Bulbus olfactorius) signifikante Virustiter. In den C57BL/6 Tieren blieb das Virus auf diese Region beschränkt und wurde dort innerhalb von 6 Tagen eliminiert. In den NesCre+/-IFNARflox/flox Tieren kam es in den folgenden Tagen jedoch zu einer fortschreitenden Infektion des ZNS, und auch das Großhirn, das Kleinhirn, der Hirn-stamm und das Rückenmark zeigten hohe Virustiter. In der Induktion peripherer Immunantworten unterschieden sich NesCre+/-IFNARflox/flox und C57BL/6 Mäuse nicht. In den WT Tieren kam es im Gegensatz zu den NesCre+/ IFNARflox/flox und IFNAR-/- Tieren innerhalb von 48 Stunden nach Infektion im Riechhirn zu einer Typ I IFN abhängigen Phosphorylierung von STAT-1, einer Komponente des IFNAR-Signaltransduktionsweges. Alles deutet darauf hin, dass die Induktion geringer Mengen Typ I IFN innerhalb des Riechhirns notwendig ist, um Im-munantworten zu aktivieren, die ein Übergreifen der Virusinfektion auf andere Regio-nen des ZNS verhindern. Eine funktionierende Immunität in der Peripherie und die Blut-Hirn-Schranke scheinen nicht ausreichend zu sein, um eine Infektion des ZNS mit VSV zu verhindern. Stattdessen muss es zur Aktivierung von IFN-abhängigen Mechanismen innerhalb des Riechhirns kommen, die ein Übergreifen der VSV Infektion auf andere Hirnregionen verhindert und zur Elimination von VSV im Riechhirn beiträgt.
Das Ziel dieser Arbeit war die Evaluierung der Einsatzmöglichkeiten eines mikrostrukturierten Reaktorsystems in der heterogenen Katalyse. Hierzu wurde eine Reaktion herangezogen, welche typische Problemstellungen der heterogenen Katalyse abbildet. Zu diesen Problemen gehören Temperaturkontrolle, sichere Handhabung von explosiven Gasgemischen und das Erzielen von zufriedenstellenden Selektivitäten. Die Reaktion sollte außerdem bereits gut untersucht worden und die Prozessparameter aus der Literatur bekannt sein. Aus diesem Grund wurde die Partialoxidation von Ethen zu Ethenoxid an Silberkatalysatoren gewählt. Es konnte gezeigt werden, dass die Reaktion in einem Mikrostrukturreaktorsystem sicher durchführbar ist. Vor allem wurde an einer ganzen Reihe von Beispielen veranschaulicht, dass eine herausragende Eigenschaft des Mikrostrukturreaktors seine inhärente Explosionssicherheit ist. Gasgemische, welche sich mitten im explosiven Gemischbereich befanden, konnten bei Drücken von 2 bis 20 bar und Temperaturen von 230 bis 310 °C sicher gehandhabt werden. So konnte gezeigt werden, dass der Mikrostrukturreaktor sich dazu eignet Reaktionen mit explosiven Gasgemischen durchzuführen. Die Verwendung von Mikrostrukturreaktoren in der heterogenen Katalyse befindet sich noch im Anfangsstadium. Um Probleme bei der Übertragung von Katalysatorsystemen auf ein System mit Mikrostruktur zu vermeiden, erfolgte zunächst der Einsatz von Vollsilberkatalysatoren. Die Mikrostruktur wurde deshalb aus dem katalytisch aktiven Material selbst hergestellt. Die Herstellung wurde auf drei unterschiedliche Weisen (LIGA-, Ätz- und Sägeverfahren) durchgeführt. So konnte gezeigt werden, dass eine Kostenreduzierung bei der Darstellung von Mikrostrukturen möglich ist. Der Nachteil der Nutzung von Vollsilber war, dass sich deutlich schlechtere Selektivitäten bei der Partialoxidation von Ethen ergaben. Es konnte jedoch gezeigt werden, dass mit dem Mikrostrukturreaktor die Selektivitäten für Vollsilber im Schnitt 10 % über denen für Rohrreaktorexperimenten bei gleichen Umsätzen lagen. Die effektive Wärmeabführung und die homogene Verteilung der Wärme über den Mikrostrukturreaktor scheinen eine Verbesserung der Selektivität zu erbringen. Kinetische Untersuchungen zeigten, dass sowohl durch Anheben des Partialdrucks von Ethen als auch von Sauerstoff eine Erhöhung der Reaktionsgeschwindigkeit erzielt werden kann. Dabei wurde für Ethen eine formale Reaktionsordnung bei der Bildung von Ethenoxid von 0,53 gefunden, während sie für Sauerstoff 0,78 betrug. Mit diesen Untersuchungen wurde verdeutlicht, dass ein Erhöhen des Sauerstoffpartialdrucks einen positiven Einfluss auf die Selektivität hat. So konnte durch Anheben der Sauerstoffkonzentration von 5 %, wie es in industriellen Prozessen aus Sicherheitsgründen notwendig ist, auf bis zu 95 % eine Verbesserung der Selektivität von bis zu 15 % erzielt werden. Über diesen Sachverhalt wurde zwar bereits in der Literatur (16) berichtet, jedoch erfolgten die Untersuchungen hierfür unter Hochvakuumbedingungen. Der Mikrostrukturreaktor ermöglichte einen Nachweis dieses Phänomens auch unter Hochdruckbedingungen, wie sie für industrielle Reaktoren üblich sind. Damit konnte ein in der heterogenen Katalyse bekanntes Problem, nämlich die Übertragung von Erkenntnissen aus Ultrahochvakuumexperimenten auf Hochdruckbedingungen (pressure-gap), untersucht werden. Eine wissenschaftliche Prüfung, ob dem Ergebnis die gleichen Ursachen sowohl im Ultrahochvakuum als auch bei Hochdruckbedingungen zugrunde liegen, muss noch erfolgen. Es zeigte sich aber auch, dass durch eine Verweilzeiterhöhung keine weitere Verbesserung der Raum-Zeit-Ausbeute möglich ist. Vielmehr wurde klar, dass Reaktionsgeschwindigkeit und Selektivität mit längeren Verweilzeiten abnehmen. Als Grund hierfür konnte die Bildung von elementarem Kohlenstoff an der Silberoberfläche festgestellt werden. Aufgrund der Limitierung bei der Verweilzeit wurden maximale Umsätze von 24 % erzielt. Der Einsatz von 1,2-Dichlorethan als Oxidationsinhibitor für Vollsilber wurde ebenfalls untersucht. Dabei konnte die Selektivität auf bis zu 69 % gesteigert werden. Es erfolgte jedoch eine Einbuße an Aktivität von etwa 42 %. Es ist bekannt, dass die Oberflächenmorphologie von Silberkatalysatoren unter Reaktionsbedingungen starke Veränderungen erfährt. (68) Es wurde aufgezeigt, dass dies für die Oberfläche von mikrostrukturierten Silberfolien ebenfalls festzustellen ist. Dabei wurde gleichzeitig festgestellt, dass die Katalysatoren trotz unterschiedlicher Herstellungsmethoden und den daraus resultierenden unterschiedlichen Oberflächenmorphologien vergleichbare Aktivitäten aufweisen. Industriell verwendete Katalysatoren basieren auf alpha-Aluminiumoxid als Trägermaterial. Dabei wurde bereits seit vielen Jahren an Optimierungen des Katalysators gearbeitet. Durch das Einstellen der spezifischen Oberfläche und Partikelgröße des Silbers und den Einsatz von Alkali- und Erdalkalimetallen als Promotoren werden so Katalysatoren hergestellt, welche eine Selektivität von 80 % besitzen. Die Übertragung dieser Erkenntnisse auf ein Mikrostrukturreaktorsystem kann nicht ohne weiteres vorgenommen werden. Es wurden verschiedene Darstellungsmöglichkeiten für eine alpha-Aluminiumoxidschicht in einem Mikrostrukturreaktor untersucht. Dabei zeigte sich, dass nur die direkte Darstellung von alpha- Aluminiumoxid ohne Phasenumwandlung aus anderen Modifikationen erfolgversprechend ist. Eine Darstellung der Aluminiumoxidschicht durch Sol-Gel- oder CVD-Prozesse war nicht erfolgreich, da die für die Phasenumwandlung von gamma-Aluminiumoxid nach alpha-Aluminiumoxid notwendige Temperatur von 1100 °C die Ausbildung einer Eisenoxidschicht an der Oberfläche der mikrostrukturierten Edelstahlfolien zur Folge hatte. Diese eignete sich nicht als Träger. Alternativ wurde erfolgreich der Einsatz von aluminiumhaltigen Edelstählen untersucht. Diese bilden beim Ausheizen bei 1100 °C eine alpha-Aluminiumoxidschicht an der Oberfläche aus, welche mittels Sputtern mit Silber geträgert wurde. Katalytische Untersuchungen zeigten, dass mit dem Einsatz von alpha-Aluminiumoxidträgern eine Verbesserung der Selektivität im Vergleich zu Vollsilber von 17 % erreicht werden kann. Gleichzeitig konnte anhand eines Gegenüberstellens von katalytischen Daten mit TEM-Aufnahmen der Sputterschichten festgestellt werden, dass eine geschlossene Silberschicht an der Oberfläche notwendig ist, um eine zufriedenstellende Aktivität und Selektivität zu erzielen. Während bei Schichtdicken von 1 nm noch einzelne Silberinseln an der Oberfläche zu finden sind, liegt bei einer Schichtdicke von 5 nm eine fast geschlossene Silberschicht vor. Ein Anheben der Schichtdicke ergab keine weitere Verbesserung der Aktivität oder Selektivität. Dagegen ergab der Einsatz von 1,2-Dichlorethan eine weitere Steigerung der Selektivität auf 77 %. Industriell eingesetzte Rohrbündelreaktoren erreichen im Sauerstoffverfahren eine Selektivität von 80 %. Die hier erzielten 77 % Selektivität bei vergleichbaren Umsätzen zeigt, dass der Einsatz eines Mikrostrukturreaktors für die Synthese von Ethenoxid möglich ist, vor allem unter dem Gesichtspunkt, dass Potenzial für die Optimierung von Reaktoren und die Katalysatorpräparation besteht. Die Nutzung von Reaktionsbedingungen, wie Ethen in reinem Sauerstoff, und der daraus resultierenden Verbesserung für Aktivität und Selektivität, ermöglichen Raum-Zeit-Ausbeuten, die über denen von Industriereaktoren liegen. Ob Mikrostrukturreaktoren in industriellen Prozessen jemals eingesetzt werden, hängt allein von ökonomischen Faktoren ab. Dazu müsste die Selektivität über die bestehenden 80 % angehoben werden. Zur Zeit entfallen 80 % der Produktionskosten von Ethenoxid auf den Rohstoff Ethen, so dass jeder Prozentpunkt, um den die Selektivität angehoben werden könnte, eine deutliche Kosteneinsparung mit sich brächte und darüber entschiede, ob ein neuer Prozess eingeführt wird. Hierzu wäre es auch notwendig, die Kosten für die Produktion der Mikrostrukturreaktoren pro Volumeneinheit um mehrere Größenordnungen zu reduzieren. Außerdem müssten Lösungen entwickelt werden, welche die Peripherie des Reaktors betreffen, vor allem die Heizung und die Gasversorgung. Im Rahmen dieser Arbeit sollte überprüft werden, welche Leistungsfähigkeit ein Mikrostrukturreaktorprozess im Vergleich zu einem bestehenden Prozess besitzt. Es konnte dargestellt werden, dass Raum-Zeit-Ausbeuten über denen eines Industriereaktors erzielt werden können bei vergleichbareren Selektivitäten. Außerdem konnte gezeigt werden, dass der Mikrostrukturreaktor ein geeignetes Werkzeug ist, welches helfen kann, Reaktionen unter bisher nicht einfach zugänglichen Bedingungen durchzuführen.
In der vorliegenden Arbeit ist es gelungen, OTS-, MPTMS-, und MPTMS/OTS gemischte SAMs aus der Lösung auf SC-1 chemisch oxidierten Siliziumwafern („SiO2“) zu präparieren. Die Adsorption der OTS oder MPTMS SAMs auf SiO2 wird von zwei konkurrierenden Reaktionen bestimmt, d.h. „Selbstaggregation” in der Ausgangslösung und “Oberflächendehydration” des SiO2 -Substrates. Die beiden Alkylsiloxan-SAMs weisen unterschiedliches Bildungsverhalten auf. Die Reifungsdauer der Ausgangslösung vor der Adsorption wirkt sich signifikant auf die Bildung der OTS SAMs aus, demgegenüber ist bei MPTMS SAMs kein Einfluß zu beobachten. Für OTS SAMs sind große Dendriten oftmals von kleinen Rundinseln umgeben, dagegen für MPTMS SAMs treten prinzipiell nur sporadisch verteilte kleine Rundinseln auf. Die Abwesenheit des Chlor-Signals in XPS-Spektren bestätigt, dass innerhalb der Adsorption die Si-Cl Bindungen der OTS-Moleküle zum größten Teil hydrolysiert werden. Doch für MPTMS SAMs ist in C 1s-Spektren ein Peak bei 286.4 eV, der der unhydrolysierten Si-OCH3 Bindung entspricht, zu beobachten. Die Hydrolysefähigkeit der Si-Cl Bindung des OTS ist erwartungsgemäß stärker als jene der Si-OCH3 Bindung des MPTMS. Diese Tendenz samt dem Unterschied in der Alkylkettenlänge wirkt sich beträchtlich auf die Bildung und die Morphologie der adsorbierten Inseln aus. Bei gleicher Konzentration (5 mM) und Reifungsdauer der Ausgangslösung bilden sich OTS SAMs viel schneller als MPTMS SAMs bei Raumtemperatur. Sie hat auch eine größere Oberflächenbedeckung wegen der seitlichen Vernetzung zur Folge. Diese Beobachtung zeigt eine prognostizierbare kinetische Schwierigkeit zur Präparation der OTS/MPTMS gemischten SAMs durch Koadsorption. Grund hierfür ist, dass die Adsorption voraussichtlich von OTS-Molekülen dominiert wird. Darüber hinaus ist Aggregation zwischen hydrolysierten OTS- und MPTMS-Molekülen nicht ausgeschlossen. Neben der Koadsorption steht in der zweistufigen Adsorption ein weiteres herkömmliches Verfahren zur Verfügung. Das Endprodukt kann nach der Reaktionsreihe der Silane mit „OTS+MPTMS“ oder „MPTMS+OTS“ gemischte SAMs bezeichnet werden. Unter Berücksichtigung der individuellen Oberflächenbedeckung und Morphologie wurde eine Rezeptur aufgestellt, in der die Adsorption jeweils höchstens 30s (für OTS) und 20 min (für MPTMS) dauert. Angesichts der vielfältigen Inselstruktur, d.h. Monoschicht, polymerisierte Bälle, und sogar Multischicht, ist eine Phasenunterscheidung nach der Dicke, z.B. mittels AFM, nicht zu erwarten. Die Existenz der lateralen unvernetzten Si-OH Gruppen der adsorbierten OTS-Inseln könnte die Präparation der homogenen OTS+MPTMS gemischten SAMs erschweren. In diesem Fall ist es fraglich, ob die hydrolysierten MPTMS-Moleküle vollständig wie geplant mit oberflächnahen OH-Gruppen von SiO2 reagieren. Mit einer umgekehrten Reaktionsreihe löst sich das Problem von selbst, da die adsorbierten MPTMS-Inseln hauptsächlich unhydrolysierte seitliche Si-OCH3 Gruppen besitzen. Die morphologische Erkennbarkeit unterstützt die Machbarkeit der Präparation der MPTMS+OTS gemischten SAMs. Die unterschiedlichen Messmodi des AFM, mit denen die Morphologie der OTS SAMs aufgenommen wurde, ergaben deutliche Unterschiede in ihrem Erscheinungsbild. Im Vergleich zum Tappingmodus sind die Grenzen der OTS-Inseln auf Kontaktmodus-Bildern nur undeutlich erkennbar. Die großen Inseln erscheinen nicht so dendritisch. Die Ursache dieser Phänomene könnte am Wassermeniskus zwischen Spitze und Probe liegen, da die Messung nicht in Flüssigkeit, sondern an Luft durchgeführt wurde. Auf LFM-Bildern sind die adsorbierten OTS-Inseln heller als unbedecktes SiO2, während die MPTMS-Inseln dunkler als SiO2 aussehen. Eine ähnliche Auswirkung der Messmodi auf die Morphologie der MPTMS SAMs wurde nicht beobachtet. Durch die Adsorption von 1-Decanthiol lässt sich die Si3N4-AFM-Spitze modifizieren. Eine solche CH3-terminierte Spitze ist hydrophob und verursacht einen gegenteiligen Helligkeitskontrast auf LFM-Bildern der adsorbierten OTS-Inseln.
Das Photosystem II (PSII) und die F1Fo-ATP-Synthase, zwei Membranproteinkomplexen der Energieumwandlung, wurden im Rahmen dieser Dissertation bearbeitet. Mittels zweidimensionaler (2D) Kristallisation und elektronenkristallographischen Methoden sollte die dreidimensionale (3D) Struktur aufgeklärt werden. PSII katalysiert den ersten Schritt der Lichtreaktion der Photosynthese. Es ist für das Einfangen von Lichtquanten, die Anregung von Elektronen, die Freisetzung von Sauerstoff aus Wasser verantwortlich. Über 25 Untereinheiten sind an diesem Prozess in den Thylakoidmembranen der Chloroplasten beteiligt. Ziel des ersten Projekts war die Verbesserung der 8 Å-Struktur des CP47-RC-Subkomplexes durch neue oder bessere 2D-Kristalle. Die Aufreinigung aus Spinat lieferte reproduzierbar eine gute Ausbeute an aktivem PSII. Das solubilisierte PSII enthielt genug endogenes Lipid, um es ohne den Zusatz von weiterem Lipid direkt durch Mikrodialyse zu rekonstituieren. Während der Rekonstitution verlor der PSII-Komplex CP43 und andere Untereinheiten, wahrscheinlich durch das Detergenz begünstigt, und ergab hoch geordnete Membranen aus CP47-RC. Die besten vesikulären 2D-Kristalle hatten eine tubuläre Morphologie und waren bis zu 1 µm breit und 3 µm lang. Elektronenmikroskopische Bilder unter Cryo-Bedingungen von ihnen aufgenommen zeigten nach der Bildverarbeitung Daten bis 6 Å. Durch Erhöhung der Zinkazetatkonzentration im Dialysepuffer konnten dünne 3D-Kristalle gezüchtet werden, die aus 2D-Kristallstapeln bestanden. Obwohl Elektronenbeugungsmuster Reflexe bis 4,5 Å aufwiesen, konnte auf Grund der unbekannten und veränderlichen Anzahl von Schichten keine 3D-Struktur erstellt werden. Weitere Versuche die Qualität der 2D-Kristalle von CP47-RC zu verbessern waren nicht erfolgreich. Durch die kürzliche Veröffentlichung der Röntgenkristallstruktur des dimeren PSII-Komplexes aus Synechococcus elongatus wurden weitere Untersuchungen eingestellt. Im letzten Schritt der Energieumwandlungskette bildet die F1Fo-ATP-Synthase unter Ausnutzung eines elektrochemischen Gradienten schließlich ATP, die universelle Energieeinheit der Zelle. Die Struktur und Funktion des löslichen, katalytischen F1-Teils sind seit einigen Jahren im Detail bekannt. Im Gegensatz zeichnet sich die Struktur des membranintegrierten, Ionen-translozierenden Fo-Teiles aus den Untereinheiten ab2cx erst langsam ab. Der c-Ring besteht in Hefe aus 10 und in Spinatchloroplasten aus 14 Untereinheiten. Ziel des zweiten Projekts war die Aufklärung der 3D-Struktur des sehr stabilen, undecameren c-Rings aus dem Bakterium Ilyobacter tartaricus, welches Na als Kopplungsion nutzt. Große, tubuläre 2D-Kristalle mit einer Einheitszelle von 89,7 x 91,7 Å und p1-Symmetrie bildeten sich nach der Rekonstitution von gereinigten c-Ringen mit dem Lipid Palmitoyl-Oleoyl-Phosphatidylcholin, nachdem das Detergenz durch Mikrodialyse entzogen wurde. Bilder von in Trehalose eingebetteten 2D-Kristallen wurden im Elektronenmikroskop JEOL 3000 SFF bei 4 K aufgenommen. Ein 3D-Datensatz, bestehend aus 58 Bilder bis zu einem Kippwinkel von 45°, ermöglichte die Berechnung einer 3D-Dichtekarte mit einer Auflösung von 4 Å in der Membranebene und 15 Å senkrecht dazu. Die elffach symmetrisierte Karte eines c-Rings zeigt einen taillierten Zylinder mit einer Höhe von 70 Å und einem äußeren Durchmesser von 50 Å, der aus zwei konzentrischen Ringen von transmembranen (-Helices besteht. Ein C-(-Modell der c-Untereinheit, die eine helikale "hair pin" bildet, konnte in die Dichte eingepaßt werden. Die inneren Helices sind nur 6,5 Å (Zentrum-zu-Zentrum-Abstand) von einander entfernt um eine zentrale Öffnung von 17 Å Durchmesser angeordnet. Die dichte Helixpackung wird durch ein konserviertes Motiv aus vier Glycinresten ermöglicht. Jede innere Helix ist mit einer äußeren, C-terminalen Helix über einen kurzen, wohl geordneten Loop auf der cytoplasmatischen Seite verbunden. Die äußere Helix weist in der Nähe der Ionenbindungsstelle einen Knick auf, der gleichzeitig in der Mitte der Membran liegt, wo sich die äußeren und inneren Helices am nächsten kommen. Dadurch wird es möglich, dass die Ionenbindungsstelle aus den Resten von zwei äußeren (Glu65, Ser66) und einer inneren Helix (Pro28) geformt wird. Zur Unterstützung der Ein-Kanal-Modell der Ionentranslokation konnte ein Zugang von der Ionenbindungsstelle zum Cytoplasma durch polare Reste in der c-Untereinheit vorgeschlagen werden. Des Weiteren kann spekuliert werden, dass drei Ionenbrücken zwischen den c-Untereinheiten für die hohe Temperaturstabilität des Oligomers von I. tartaricus verantwortlich sind. Die Vorstellung dieses 3D-Modells des c-Rings ist ein erster Schritt hin zum Verständnis der Kopplung der Ionentranslokation an die Rotation der F1Fo-ATP-Synthase. Wenn die Struktur der a-Untereinheit gelöst worden ist, wird hoffentlich auch der Mechanismus des kleinsten, biologischen Rotationsmotors entschlüsselt werden.
Um die Funktionsweise von biologischen Prozessen zu untersuchen, werden Trigger-Signale benötigt, die die Prozesse initiieren können, ohne dabei dem Organismus zu schaden oder Nebenreaktionen hervorzurufen. Ein geeignetes Trigger-Signal stellt Licht dar, da es bei geeigneter Wellenlänge nichtinvasiv ist und nur wenige biologische Prozesse durch Licht gesteuert werden. Um einen Prozess mit Licht aktivierbar zu machen, benötigt man eine lichtsensitive Einheit, beispielsweise eine photolabile Schutzgruppe, die durch die Bestrahlung mit Licht einen zuvor blockierten Bereich freisetzt.
Hauptziel dieser Arbeit war es die Zweiphotonen-Technik für die Photolyse von photolabil geschützten Oligonukleotiden nutzbar zu machen und das Photolyseergebnis zu visualisieren.
Dazu wurden zunächst verschiedene mit Zweiphotonen-sensitiven Schutzgruppen modifizierte Phosphoramidite synthetisiert und über Festphasensynthese in Oligonukleotide eingebaut. Die Oligonukleotide mit den erstmals neu eingebauten Schutzgruppen ANBP und hNDBF wurden zunächst auf ihre Einphotonen-Eigenschaften, wie Schmelzpunkt, Absorptionsverhalten und Quantenausbeute untersucht. Weiterhin wurden erste Versuche zur wellenlängenselektiven Photolyse von hNDBF- und ANBP-geschützten Oligonukleotiden durchgeführt.
Die Existenz eines Zweiphotonen-induzierten Effekts kann durch die quadratische Abhängigkeit des erzeugten Effekts von der eingestrahlten Leistung nachgewiesen werden. Dazu wurde ein Verdrängungs-Assay entwickelt, dessen Doppelstrang-Sonde aus einem FRET-Paar besteht. Der Fluorophor-markierte Strang dient dabei als Gegenstrang zum photolabil geschützten Strang. Durch einen Thiol-Linker am photolabil geschützten Oligonukleotid konnte dieses erfolgreich in Maleimid-Hydrogele immobilisiert werden und der Verdrängungs-Assay im Gel durchgeführt werden. Die immobilisierten Stränge enthielten DEACM bzw. ANBP Schutzgruppen. Neben der quadratischen Abhängigkeit der Photolyse von der eingestrahlten Leistung konnten in diesen Hydrogelen auch 3D-aufgelöste Photolysen realisiert werden, die eindeutig die Zwei-Photonen-Photolyse belegen. Diese 3D-Experimente wurden zusammen mit Dr. Stephan Junek am MPI für Hirnforschung durchgeführt. Durch die Wahl zweier unterschiedlicher Sequenzen für die dTDEACM und dGANBP modifizierten Stränge und zwei unterschiedlicher Fluorophore für die Doppelstrang-Sonden, konnte die orthogonale Zweiphotonen-Photolyse gezeigt werden. Um zu zeigen, dass die Zweiphotonen-Photolyse von Oligonukleotiden auch in Organismen realisiert werden kann ohne das biologische System zu schädigen, wurde versucht den Verdrängungs-Assay auch in Zellen durchzuführen. Durch die Verwendung der Patch-Clamp-Technik in Zusammenarbeit mit Dr. Stephan Junek am MPI für Hirnforschung konnten die Stränge über die Elektrolyt-Lösung in Hippocampus-Neuronen eingebracht werden und durch Zweiphotonen-Bestrahlung dort photolysiert werden, was zu einem deutlichen Fluoreszenzanstieg führte. Durch die angeschlossene Patch-Clamp-Pipette konnten so zusätzlich elektrophysiologische Messungen durchgeführt werden, die zeigten, dass die durchgeführte Zweiphotonen-Bestrahlung nicht invasiv für die Zellen ist.
Die durchgeführten Experimente beweisen, dass Zweiphotonen-sensitive Schutzgruppen auf Oligonukleotiden photolysiert werden können und dass ihr Einsatz auch in biologischen Systemen möglich ist. Der entwickelte Verdrängungs-Assay ermöglicht es weiterhin neue photolabile Schutzgruppen auf Oligonukleotiden auf ihre Zweiphotonen-Sensitivität zu untersuchen.
Ein weiteres Projekt beschäftigte sich mit der Synthese der neuen Schutzgruppe DMA-NDBF-OH, die in-silico von der Arbeitsgruppe von Prof. Andreas Dreuw aus Heidelberg als effiziente Zweiphotonen-sensitive Schutzgruppe beschrieben wird. Es wurde versucht DMA-NDBF-OH über zwei Syntheserouten herzustellen. Eine Route basierte auf der Einführung der Funktionalitäten an einem unmodifizierten Dibenzofuran, die leider an der Bromierung der Seitenkette scheiterte. Die zweite Syntheseroute wurde in Anlehnung an die NDBF-Synthese von Deiters et al., bei der das Dibenzofuran durch eine Kondensation zweier modifizierter Benzolringe und einem Pd-katalysierten Ringschluss aufgebaut wird, durchgeführt. Mit dieser Syntheseroute konnte das DMA-NDBF-OH erfolgreich synthetisiert werden. Aufgrund ihrer starken bathochromen Verschiebung sollte sich diese Schutzgruppe hervorragend für die wellenlängenselektive Photolyse auf Ein- und Zweiphotonenebene eignen.