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Das humane Immundefizienz-Virus (HIV) benötigt für die Virus-Zellbindung spezifische Oberflächenrezeptoren auf den Wirtszellen (z. B. CD4, CXCR4, CCR5). Zurzeit basiert die Behandlung der chronisch persistierenden HIV-Erkrankung auf einer lebenslangen Chemotherapie (Highly Active Antiretroviral Therapy, ART) bestehend beispielsweise aus einer Kombination von 2 Nukleosidanaloga und einem Protease-Inhibitor, die das Virus nicht eradiziert, sondern nur in seiner Vermehrung hemmt. Dies birgt jedoch die Gefahr der Entwicklung von Resistenzen gegenüber der medikamentösen Therapie. Zusätzlich wird eine Veränderung der HIV-Rezeptorspezifität unter der Behandlung mit Antagonisten des HIV-Rezeptors CCR5 befürchtet. Cytarabin (Ara-C) ist ein Zytostatikum, das in der Therapie von Leukämien eingesetzt wird. Als Nukleosidanalogon gehört es strukturell zur selben Wirkstoffklasse wie die in der HIV-Therapie eingesetzten Nukleosidanaloga, jedoch sind bisher keine antiretroviralen Eigenschaften für Ara-C beschrieben worden. Die T-lymphoide Zelllinie C8166 ist permissiv für HIV. Die Adaptation von C8166-Zellen an das Wachstum in Gegenwart von Ara-C (Zellinie C8166rAra-C5μM) resultierte in einer signifikanten Verringerung der Oberflächenexpression der HIV-Rezeptoren CD4 und CXCR4 und zu einer verringerten Permissivität gegenüber HIV. In der vorliegenden Arbeit sollte untersucht werden, ob die Adaptation an Ara-C bei anderen T-lymphoiden Zelllinien ebenfalls zur Verringerung der Expression von CD4, und CXCR4 führt. Zusätzlich sollte untersucht werden, wie sich die Expression von CCR5 verhält. Es wurden die folgenden parentalen und an Ara-C adaptieten T-lymphoiden Zelllinien verwendet: H9, H9rAra-C600μM, MOLT4/8, MOLT4/8rAra-C100μM und MOLT4/8rAra-C200μM. Bei allen Ara-C resistenten Zelllinien kam es zu einer signifikant verringerten Expression von CD4 und CXCR4 auf mRNA und Proteinebene sowie zu einer signifikanten Erhöhung der CCR5-Expression. Im Gegensatz hierzu zeigten an AZT adaptierte H9-Zellen (H9rAZT3000μM) keine signifikante Veränderung in der Expression von CD4, CXCR4 oder CCR5 im Vergleich zu parentalen H9-Zellen. Die akute Behandlung der parentalen H9-Zellen mit niedrigen, untoxischen Ara-C Konzentrationen führte ebenfalls zu einem Anstieg der CCR5-Expression und zu einer Verminderung der CD4- und CXCR4-Expression. Zellzyklusmessungen ergaben, dass der Zellzyklus in mit untoxischen Ara-C-Konzentrationen behandelten H9-Zellen (Anstieg der Zellteilungsrate auf das 2-fache) und in allen an Ara-C adaptierten Zelllinien im Vergleich zu den unbehandelten bzw. parentalen Zellen stärker stimuliert war. Epigenetische Einflüsse könnten bei der veränderten Expression von CD4, CXCR4 und/oder CCR5 in Ara-C resistenten Zellen eine Rolle spielen. Dies erscheint jedoch unwahrscheinlich, da weder der DNA-Methylierungsinhibitor Aza-C noch der Histondeacetylase-Inhibitor SAHA die Expression von CD4, CXCR4 oder CCR5 beeinflussten. Weitere Untersuchungen müssen zeigen, ob eine Kombination von Ara-C, das zu einer Verringerung der CXCR4- und CD4-Expression und zu einer Erhöhung der CCR5-Expression führt, mit CCR5-Inhibitoren eine therapeutische Option darstellt. Möglicherweise wirkt die Verwendung von Ara-C auch einem CCR5/CXCR4-Shift entgegen.
Ziel der vorliegenden, multizentrischen Studie war es, das Standardtherapieschema Mitoxantron-Chlorambucil-Prednison (MCP) mit der neueren Kombination Cladribin (2-CdA)-Mitoxantron (CdM) bezüglich Ansprechraten, Überlebensraten und Toxizität als firstline-Therapie bei Patienten mit niedrigmalignem Non-Hodgkin Lymphom zu vergleichen. Es wurden insgesamt 178 Patienten in die Studie aufgenommen, 92 wurden zu CdM randomisiert und 86 zu MCP. Es gab 15 Dropouts. Histologisch hatten 84 Patienten ein follikuläres Lymphom, 37 hatten ein Mantelzelllymphom, 28 ein Immunozytom und 14 ein Marginalzonenlymphom. Die Patienten bekamen bis zu sechs Therapiezyklen. Im Arm CdM wurden an den Tagen 1-3 5 mg/m² Cladribin als Infusion verabreicht, sowie an Tag 1+2 8 mg/m² Mitoxantron als i. v. Bolus. Die Patienten die dem Arm MCP zugeordnet waren bekamen an den Tagen 1–5 3x 3mg/m² Chlorambucil per os, sowie einmal täglich 25 mg/m² Prednison per os. An Tag 1+2 wurde außerdem 8 mg/m² Mitoxantron als i. v. Bolus verabreicht. Auf die Therapie mit MCP sprachen insgesamt 81 % der Patienten an (CR 24,1 %, PR 57 %). Die Therapie mit CdM hatte eine Remissionsrate von 85,7 % (CR 34,5 %, PR 51,2 %). Die Unterschiede waren nicht signifikant. Der Median des overall survival (OS) konnte nicht erreicht werden, in Arm CdM lag das OS nach 77 Monaten bei 64 %, im Arm MCP lag es nach 71 Monaten bei 51 %. Der Median des event-free survival lag bei MCP bei 20 Monaten und unter CdM bei 21 Monaten. Der Median des progression-free survival betrug 26 Monate bei MCP und 27 Monate bei CdM Keiner dieser Unterschiede war signifikant. Nicht-hämatologischen Nebenwirkungen gaben nur wenige Patienten an, diese waren hauptsächlich Übelkeit, Erbrechen, Durchfall und Alopezie. Häufigste hämatologische Nebenwirkung war eine Leukozytopenie. Bei CdM kam es in 81,7 % der Zyklen zu einer Leukozytopenie WHO Grad 3 oder 4, bei MCP in 64,1 % der Zyklen. Die Ergebnisse zeigen, dass CdM gegenüber MCP keine Vorteile aufweist, jedoch auch keine Nachteile hat. Die evtl. bessere Wirkung bei Mantelzelllymphomen lässt sich Aufgrund der nicht-repräsentativen Größe dieser Gruppe nur vermuten.
Im Laufe der Evolution hat sich bei allen Lebewesen eine innere Uhr entwickelt, die u.a. zirkadiane Rhythmen vieler Körperfunktionen, wie z. B. bei Säugetieren die Körpertemperatur oder auch den Schlaf-Wach-Rhythmus steuert. Diese innere Uhr befindet sich bei Säugetieren im SCN des Hypothalamus. Das adulte molekulare Uhrwerk setzt sich aus Transkriptions-/ Translations-Rückkopplungsschleifen zusammen, in denen die Translationsprodukte der Uhrengene eine wesentliche Rolle spielen. Dabei sind CLOCK und BMAL aktivierende Transkriptionsfaktoren, die konstitutiv vorhanden sind. PER und CRY sind negative Regulatoren der Genexpression, die im Gegensatz zu CLOCK und BMAL1 rhythmisch auftreten. Es sollte nun am Beispiel der Labormaus die ontogenetische Entwicklung des zirkadianen Systems untersucht werden, um festzustellen, wann diese innere Uhr zu „ticken“ anfängt. Dazu wurden die Uhrengenproteine im SCN der Maus am Embryonaltag 18, am Postnataltag 2 und im adulten Tier im Tagesgang immunhistochemisch dargestellt. Wir konnten zeigen, dass die positiven Regulatoren BMAL1 und CLOCK während des zirkadianen Zyklus im fötalen SCN vorhanden waren, jedoch war die Anzahl der Zellen mit einer CLOCK-IR in den Feten signifikant geringer als in den Neugeborenen und in den Adulten. Diese Differenz zwischen BMAL1-Zellen und CLOCK-Zellen im fötalen SCN deutet darauf hin, dass BMAL1 im sich entwickelnden SCN einen anderen Dimerisationspartner als CLOCK hat. Möglicherweise spielen BMAL1 und CLOCK unterschiedliche Rollen im sich entwickelnden SCN. Auch gibt es nur eine geringe Anzahl von fötalen SCN Zellen, die einen Rhythmus von mPER1 und mPER2 aufweisen. Daher wird vermutet, dass nur wenige Zellen im fötalen SCN zur Rhythmogenese fähig sind (sog. Schrittmacherzellen). Der fötale SCN zeigt auch nur wenige Zellen, die eine Immunreaktion für mCRY1 zeigen, während mCRY2 noch gar nicht nachweisbar ist. Diese geringe Menge an mCRY1 im fötalen SCN reicht scheinbar aus, um die mPER-Proteine vor der Proteolyse zu schützen. mCRY1 zeigt jedoch noch keinen zirkadianen Rhythmus im fötalen SCN, was darauf hindeutet, dass hier das molekulare Uhrwerk noch nicht vollständig ausgereift ist. Da die PER-Rhythmen im fötalen SCN die gleiche Phasenlage wie im Muttertier aufweisen, kann davon ausgegangen werden, dass die Schrittmacherzellen durch mütterliche Signale synchronisiert werden. Die Anzahl der CLOCK-ir SCN Zellen sowie die Anzahl der SCN Zellen, die einen zirkadianen Rhythmus von mPER1 aufweisen, nimmt im Neugeborenen graduell zu. Interessanterweise steigt auch die Anzahl der synaptischen Verbindungen zwischen den SCN Neuronen während dieser Entwicklungsphase an, und auch auf Lichtreize reagiert der SCN bereits schon kurz nach der Geburt. Diese zeitliche Korrelation deutet darauf hin, dass neuronale Kopplung sowie photische Stimulation die Ausreifung des endogenen Rhythmusgenerators im SCN antreiben.
Im Rahmen der vorliegenden Dissertation wurde die Rolle des Transkriptionsfaktors Meis2 als Ko-Faktor in der Entwicklung des anterioren Neuralrohrs untersucht. Hierbei gaben funktionelle Untersuchungen durch Fehl- und Überexpressionsstudien mittels in ovo Mikroelektroporation im Hühnchenembryo, Aufschluss über eine besondere Rolle von Meis2 bei der Spezifizierung und Entwicklung des Tectum opticums. Überdies führten bio-chemische Untersuchungen zur Identifizierung neuer, bislang noch nicht beschriebener Interaktionspartner von Meis2 im sich entwickelnden optischen Tektum und in den Anlagen der Augen. Diese Untersuchungen geben einen weiteren Einblick in die Funktionsweise von Meis2 als Ko-Transkriptionsfaktor. Zusammengefasst lieferten die Untersuchungen der vorliegenden Arbeit folgende Erkenntnisse: I) Im Mittelhirn ist Meis2-Expression unter den bislang beschriebenen Regulatoren der Mittelhirnentwicklung einzigartig: es ist von Beginn an nicht dynamisch und kennzeichnet ausschließlich die dorsalen Alarplatten des Mittelhirns, den Bereich des zukünftigen optischen Tektums (Kapitel 3.1). Diese Expression unterliegt einer strikten negativen Regulation durch sezernierte Moleküle und Transkriptionsfaktoren der benachbarten Regionen des Neuralrohrs (Kapitel 3.2). II) Meis2 ist für tektale Entwicklung erforderlich: Die Überexpression des dominant negativ wirkenden Konstruktes Meis2EnR störte die Entwicklung tektumspezifischer Strukturen sowohl in der frühen als auch in der späteren Entwicklung (Kapitel 3.3.1 und 3.3.2). Zudem kam es zur Unterdrückung der tektalen Gene ephrinB1 und Dbx1 (Kapitel 3.3.3 und 3.3.4). III) Meis2 ist für tektale Entwicklung ausreichend: Die Fehlexpression von Meis2 führte zur Induktion und Entwicklung ektopischer tektaler Strukturen im Dienzephalon (Kapitel 3.3.5). Dabei führte Meis2 bereits 24 h nach Fehlexpression zur Transdifferenzierung des dienzephalischen in mesenzephalisches Zellschicksal, veränderte jedoch nicht das Schick-sal des metenzephalischen Gewebes (Kapitel 3.3.7). IV) Bei der Induktion tektaler Strukturen ist Meis2 nicht Bestandteil des regulatorischen Netzwerks des Mittel-Hinterhirn Organisators (MHO), eines sekundären Organisators, welcher die Entwicklung der Mittel-Hinterhirn Region steuert (Kapitel 3.3.8). V) Meis2 bildet jedoch im Mittelhirn in vivo Komplexe mit Otx2, einem Schlüsselmolekül zur Spezifizierung des anterioren Neuralrohrs (Kapitel 3.4.1 - 3.4.3). VI) Meis2 kann in vitro durch Bindung an Otx2 einer Grg4/Tle4-vermittelten Unter-drückung der transkriptionellen Aktivität von Otx2 entgegenwirken (Kapitel 3.4.4). Otx2 kann, wie bereits in Arbeiten anderer Labors beschrieben, kontext-abhängig entweder als transkriptioneller Repressor oder Aktivator wirken. Die in dieser Arbeit dargestellten Ergebnisse zeigen daher einen möglichen molekularen Mechanismus auf, wie durch zeitlich und räumlich kontrollierte Bindung eines Ko-Aktivators an Otx2 dessen transkrip-tionelle Aktivität wieder hergestellt werden kann. Die Ergebnisse dieser Arbeit beschreiben zum ersten Mal einen Transkriptionsfaktor, der unabhängig vom regulatorischen Netzwerk des MHO, die Entwicklung des optischen Tektums induziert. Sie liefern somit ein neuartiges mögliches Modell zur Spezifizierung anteriorer Hirnstrukturen: Die Induktion tektaler Entwicklung erfolgt nach Etablierung der Mittel-Hinterhirn Region durch Meis2, einem tektumspezifischen Ko-Faktor von Otx2. VII) Meis2 bildet, im sich entwickelnden Mittelhirn, auch Komplexe mit den beiden Regulatoren der Tektumentwicklung Pax3 und Pax7 (Kapitel 3.4.5). VIII) Außerdem konnten im Rahmen dieser Arbeit zwei weitere mögliche Interaktions-partner von Meis2 in den Anlagen der Augen identifiziert werden: Pax6, einem „master control gene“ der Augenentwicklung (Kapitel 3.4.6) und das Enzym Parp-1 (Kapitel 3.4.7), einem weit verbreiteten und vielseitigen Regulator der Genexpression. Diese Ergebnisse liefern Hinweise auf weitere wichtige Funktionen des Ko-Transkriptions-faktors Meis2 in der Entwicklung des anterioren Zentralnervensystems.
Die Detektion und die Charakterisierung von Leberläsionen gehört zu den wichtigsten Aufgaben der radiologischen Leberdiagnostik. Dafür stehen verschiedene bildgebende Verfahren wie Sonographie, Computertomographie (CT) und Magnetresonanztomographie (MRT) zur Verfügung. Aufgrund der technischen Verbesserungen und der Entwicklung von neuen Sequenzen zur Leberbildgebung in der MRT hat sich die Diagnostik von fokalen Leberläsionen entscheidend verbessert. Verbunden mit dem Einsatz von modernen MRT-Kontrastmitteln ist die MRT in den letzten Jahren zum Goldstandard für die bildgebende Diagnostik von Lebertumoren, vor allem in deren Differentialdiagnose, avanciert. Magnevist® (Gd-DPTA), wurde 1988 als erstes extrazelluläres MRT-Kontrastmittel auf dem Markt eingeführt, und ist seither verfügbar. Resovist® (SHU 555 A) ist ein leberspezifisches, superparamagnetisches Kontrastmittel bestehend aus Eisenoxid (SPIO)- Partikeln, das seit 2001 für die Magnetresonanztomographie der Leber zugelassen ist. Als ein extrazelluläres Kontrastmittel ist Gadovist® (Gadobutrol), das einzige 1.0 molare Kontrastmittel, seit dem Jahr 2000 von der deutschen Gesundheitsbehörde (BfArM) für die Magnetresonanztomographie des zentralen Nervensystems zugelassen. Das Sicherheitsprofil, Kontrastverhalten und die Wertigkeit von Gadovist® in der Diagnostik der Leber wurde unter Verwendung unterschiedlicher Sequenzprotokolle in Phase-III-Studien weiter untersucht. Als ein Teil einer klinisch offenen, randomisierten, doppelblinden, interindividuell kontrollierten Phase III-Studie wurden 60 Patienten mit dem hochgradigen Verdacht auf eine Leberläsion oder mit einer bekannten Leberläsion an unserem Institut in diese Studie eingeschlossen. Der Hälfte der Patienten wurde Gadobutrol (Gadovist®, Molarität 1,0 mol/l), der anderen Hälfte Gd-DTPA (Magnevist®, Molarität 0,5 mol/l) intravenös im Bolus für die MRTBildgebung der Leber appliziert. Hierbei wurden keine schwerwiegenden Nebenwirkungen registriert. Die Sicherheit und Verträglichkeit von Gadobutrol war mit der von herkömmlichen, Gadolinium-haltigen MRT-Kontrastmitteln vergleichbar. Routinemäßig wurden weitere Vergleichsuntersuchungen bei den Patienten aufgrund der vorliegenden Erkrankung durchgeführt. Als Goldstandard zur Erfassung der Leberläsionen wurden MRT-Untersuchungen mit Resovist® (50 Patienten), CT-Untersuchungen (10 Patienten), Sonographie, Biopsie, chirurgische Maßnahmen, Szintigraphie und Laboruntersuchungen eingesetzt. In der dynamischen und statischen Gd-verstärkten MRT wiesen die einzelnen Läsionen in Abhängigkeit vom Vaskularisationsgrad ein spezifisches Kontrastverhalten auf, was eine Unterscheidung in maligne und benigne zu einem hohen Grad ermöglichte. In der eisenverstärkten MRT zeigte sich die T2- gewichtete Sequenz als die geeignetste Methode zur Detektion und Differenzierung der Leberläsionen. Besonders bei den gutartigen Lebertumoren mit Kupffer’schen Sternzellen, wie FNH oder hoch differenzierten HCC’s, war ein signifikanter Signalintensitätsverlust zu evaluieren. Anders hingegen zeigten die undifferenzierten bis mäßig differenzierten HCC’s und maligne Lebermetastasen keinen wesentlichen Signalintensitätsabfall. In einem Vergleich mit dem Goldstandard wurden die Sensivität, die Spezifität und die Genauigkeit der nativen-MRT, Gd-MRT, SPIO-MRT/CT und SPIO-MRT ermittelt. Der Einsatz von MRT-Kontrastmitteln führte zur Erhöhung von Sensivität, Spezifität und Genauigkeit bei der Untersuchung der Leberläsionen im Vergleich zur MRT ohne Kontrastmittel. Die Sensivität von Gadolinium-MRT (94%) war vergleichbar mit der von SPIO-MRT/CT (96%) und SPIO-MRT (95%). Im indirekten Vergleich wurde für die Gadobutrol-MRT eine höhere Sensivität (100%) als für die Gd-DTPA-MRT (86%) dokumentiert. Die Spezifität war bei Gadolinium-MRT mit 88% schlechter als bei SPIO-MRT/CT (95%) und SPIO-MRT (95 %). In der indirekten Evaluierung zeigte sich für die Gadobutrol-MRT eine höhere Sensivität (100%) und Spezifität (91%) als für die Gd-DTPA-MRT (Sensivität 86%, Spezifität 84%). Die diagnostische Genauigkeit der Gd-DTPA-verstärkten MRT war mit 85% schlechter als die der Gadobutrol-verstärkten MRT (96%). Jedoch war zwischen der Genauigkeit von Gadobutrol-MRT (96%), SPIO-MRT/CT (96%) und SPIO-MRT (95%) kein statistisch signifikanter Unterschied feststellbar. Insgesamt zeigte sich für die Gadobutrol-verstärkte MRT im Vergleich zur Gd-DTPAverstärkten MRT eine verbesserte Sensivität, Spezifität und diagnostische Genauigkeit. Aufgrund des interindividuellen Ansatzes der Studie konnte kein direkter Vergleich der Wertigkeit zwischen den beiden extrazelluären Kontrastmitteln dargestellt werden. Die Ergebnisse dieser Studie weisen Gadovist® als ein ausgezeichnetes extrazelluläres Kontrastmittel mit gutem Sicherheitsprofil, hoher Detektionsrate, ausgezeichneter Charakterisierung von Lebertumoren und guter diagnostischer Genauigkeit aus.
Nahrungsmittelallergikern steht aufgrund inakzeptabler Nebenwirkungen bei der spezifischen Immuntherapie zurzeit noch keine kausale Therapie dieser Erkrankung zur Verfügung. Demzufolge bleibt die Vermeidung der entsprechenden Lebensmittel für Nahrungsmittelallergiker der einzige Weg möglicherweise lebensbedrohlichen allergischen Reaktionen zu entgehen. Ziel dieser Arbeit war es, das Potential eines viralen Vektors für die Verwendung bei der spezifischen Immuntherapie der Lebensmittelallergie zu untersuchen. Die Überlegung dahinter war, das Risiko eines anaphylaktischen Schocks, der bei Injektion eines Allergens immer gegeben ist, durch intrazelluläre Expression des Proteins über das rekombinante Virus zu verringern. Zusätzlich dazu bringt das modifizierte Vacciniavirus Ankara (MVA) ideale Voraussetzungen für eine Allergievakzine mit: Die Infektion mit MVA führt zu einer stark Th1-gerichteten Immunantwort gegen die viral exprimierte Proteine, die möglicherweise die allergische Th2-gerichtete Immunantwort modulieren kann. Die prophylaktische Immunisierung mit MVA-OVA im Mausmodell der systemischen Sensibilisierung gegen Ovalbumin (OVA) führte dosisabhängig zur Suppression der spezifischen IgE-Antwort und somit zum Schutz vor allergischer Sensibilisierung. Zusätzlich konnte nachgewiesen werden, dass die Vakzinierung mit MVA-OVA eine dauerhafte spezifische IgG-Antwort induziert. Diese Daten unterstützen das Konzept einer Modulation der Sensibilisierung durch MVA-Vakzine. Weiterhin wurden zwei rekombinante Vakzinen generiert, mittels derer entweder das Tropomyosin aus Garnelen (Pen a 1) oder das Lipid-Transfer-Protein aus Haselnuss (Cor a 8) intrazellulär exprimiert werden konnte. Dass die Sensibilisierung gegen diese Allergene häufig mit schweren allergischen Reaktionen korreliert, unterstreicht die Notwendigkeit einer verbesserten Immuntherapie in diesem Bereich. Während MVA-Pen a 1 in ausreichender Menge und Qualität für die Verwendung im Mausmodell hergestellt werden konnte, gelang es nicht, eine homogene Population von MVA-Cor a 8 zu gewinnen, in der das Selektionsgen K1L nicht mehr vorhanden war. Parallel zur Virusherstellung wurden Mausmodelle der Sensibilisierung gegen Cor a 8 und Pen a 1 entwickelt. Vergleiche unterschiedlicher Mausstämme ergaben, dass sich Mäuse des Stammes CBA/J am empfänglichsten für eine systemische Sensibilisierung mit Cor a 8 sind. Aufgrund von Erfahrungen zur Sensibilisierung gegen Pen a 1 wurden Mäuse des Stammes C3H/HeJ bei der Etablierung eines Garnelenallergiemodells verwendet. Es zeigte sich, dass durch die intragastrale Applikation von 0,1 mg Pen a 1 sowie Choleratoxin als Adjuvanz (drei Gaben in dreiwöchigem Abstand), gefolgt von einer systemischen Gabe des Allergens mit Aluminiumhydroxid eine spezifische Sensibilisierung hervorgerufen werden konnte, die nach Exposition mit Pen a 1 zu allergischen Symptomen führte. Auch in diesem Modell bot die prophylaktische Immunisierung mit MVA-Pen a 1 Schutz vor Pen a 1spezifischer Sensibilisierung. Um die therapeutische Effektivität der Vakzine ermitteln zu können, muss die begonnene Etablierung eines Allergiemodells mit symptomauslösenden Provokationen und immunologischen Analysen weitergeführt werden. Der in dieser Studie beobachtete starke schützende Effekt einer Vakzinierung mit MVA vor allergischer Sensibilisierung und das sehr gute Sicherheitsprofil dieses Vektors in klinischen Studien zu anderen Erkrankungen belegt die Möglichkeit einer Verwendung von MVA zur erfolgreichen spezifischen Immuntherapie der Lebensmittelallergie.
In den letzten Jahren hat sich die subkutane Schweißdrüsensaugkürettage als Therapie der Wahl bei den operativen Therapieverfahren der Hyperhidrosis axillaris etabliert. In der vorliegenden Studie wurde der klinische Langzeiterfolg der subkutanen Schweißdrüsensaugkürettage unter Einbeziehung quantitativer Meßmethoden untersucht. Der durchschnittliche Nachbeobachtungszeitraum lag bei 31 Monaten. Die Datenerhebung wurde anhand der gravimetrisch ermittelten Schweißmenge präund postoperativ sowie anhand eines Fragebogens vorgenommen. 149 Patienten wurden angeschrieben, 27 waren zum Zeitpunkt der Nachuntersuchung nicht erreichbar, 25 Patienten konnten den Fragebogen ausfüllen aber nicht persönlich zur Nachuntersuchung erscheinen. Bei 97 Patienten konnte auch eine Nachuntersuchung durchgeführt werden. 77% der Patienten waren weiblich und 33% männlich. Der Altersdurchschnitt bei Erstmanifestation der Hyperhidrosis axillaris lag bei 20 Jahren, das Durchschnittsalter der Patienten bei der Operation betrug 29 Jahre. Die Anamnesedauer bis zur subkutanen Schweißdrüsensaugkürettage lag im Durchschnitt bei 7,91 Jahre. Bei 45% der Patienten konnte eine positive Familienanamnese ermittelt werden. In der vorliegenden Arbeit erfolgten gravimetrische Messungen prä- und postoperativ. Es zeigte sich eine signifikante Reduktion der Schweißproduktion um 54% von 271mg/5min an der rechten Axilla auf 103mg/5min und um 62% von 242mg/5min auf 90mg/5min an der linken Axilla. Es konnte zusätzlich eine Korrelation der von den Patienten subjektiv empfundenen Schweißmengenreduktion mit den gravimetrisch ermittelten Werten nachgewiesen werden. Langfristige Nebenwirkungen wurden nicht festgestellt. Es entstanden nur kleine OPNarben, die von keinem Patient als kosmetisch störend beurteilt wurde. Zusammenfassend zeigen die Ergebnisse dieser Arbeit, dass durch die subkutane Schweißdrüsensaugkürettage eine langfristige Reduktion der Schweißmengensekretion über 31 Monaten bei der Hyperhidrosis axillaris erzielt werden kann und somit mittels minimalinvasiver Chirurgie eine Krankheit erfolgreich behandelt werden kann, die die Lebensqualität der Patienten massiv einschränkt.
Die supratentorielle dekompressive Kraniektomie mit Eröffnung und Erweiterungsplastik der Dura mater ist heutzutage eine wichtige Therapiemaßnahme in der Behandlung des konservativ nicht kontrollierbaren Hirndrucks. Unter Kranioplastik versteht man den chirurgischen Verschluss des entstandenen Knochendefekts zum Schutz des direkt unter der Kopfhaut liegenden Gehirns, zur ästhetischen Wiederherstellung der Konturen sowie zur Verbesserung einer neurologischen Symptomatik („syndrome of the trephined“).
In der vorliegenden Arbeit werden die Daten von insgesamt 242 Patienten, die einer Kranioplastik unterzogen worden waren, retrospektiv analysiert. Die Patienten wurden im Zeitraum 2001-2008 in der neurochirurgischen Abteilung der Städtischen Kliniken Frankfurt am Main-Höchst operiert. Um Aufschluss über das postoperative, funktionelle und kosmetische Ergebnis zu erhalten, wurde im Anschluss an die Aktenauswertung bei diesen Patienten eine telefonische Befragung durchgeführt.
Ziel der Arbeit war es, die bisherigen Erfahrungen der Kalottenplastik und insbesondere der autogenen orthotopen Knochendeckelreimplantation im Hinblick auf die verschiedenen Kranioplastik Zeitpunkte zu untersuchen und unter klinischen Aspekten zu bewerten.
Die Frage des Kranioplastik Zeitpunktes ist essentiell für die Therapieplanung.
Das autologe Schädelknochentransplantat hat bessere Eigenschaften und Qualitäten als alle anderen alloplastischen Materialien. In Anbetracht der perfekten Histokompatibilität, der optimalen biomechanischen Eigenschaften, der guten anatomischen Fusion mit dem umgebenden Knochen und der Möglichkeit der partiellen oder totalen Revitalisation des Transplantats, besteht kein Zweifel, dass der autologe Knochen immer zu verwenden ist, wenn die Möglichkeit dazu besteht.
Die Analyse der Patientengruppen ergab, dass die ultra frühe Kranioplastik der Patienten mit großen Defekten nach dekompressiver Kraniektomie ein besseres Outcome im langfristigen Follow-up hat. Diese Patienten hatten keine gesteigerte Infektions- oder andere Komplikationsraten. Das Timing der Kranioplastik spielt eine Rolle in der Komplikationsrate nur bei den Patienten, die sekundär eine Komplikation erlitten haben. Patienten, die nach der Kraniektomie eine Nachblutung, einen Infarkt oder eine Infektion erlitten haben, hatten eine signifikant höhere Infektionsrate bei ultra früher Kranioplastik. Insbesondere soll betont werden, dass der Trend einer Häufung von Wundheilungsstörungen und Infektionen mit der Folge einer erneuten Explantation des Knochendeckels bei Patienten nach autogener Knochendeckelreimplantation mit mehr als 2 Risikofaktoren und bei Patienten mit kompliziertem Verlauf nach Kraniektomie festgestellt wurde.
Gemäß den Ergebnissen dieser Patientenserie kann die ultra frühe Kranioplastik bei ausgewählten Patienten mittels Reimplantation des Eigenknochens als ein sicheres und hilfreiches Verfahren für die schnellere Rehabilitation und Besserung der neurologischen Funktion und der Prognose bewertet werden. Ähnlich gute Ergebnisse zeigten die Pantienten in der Gruppe 1 der ultra frühen Kranioplastik die aufgrund einer Liquorzirkulationsstörung ein VP Shunt System als kombinierte Therapie in der gleichen Sitzung erhalten haben.
Somit kann zusammenfassend festgehalten werden:
Die Ergebnisse dieser Arbeit bestätigen, dass die Kranioplastik nach einer supratentoriellen dekompressiven Kraniektomie mit Reimplantation des eigenen Schädelknochens zum frühesten möglichen Zeitpunkt ein sicheres und effektives Verfahren darstellt und bei ausgewählten Patienten sogar bessere Ergebnisse als die späte Kranioplastik haben kann. Eine mögliche Erklärung dafür könnte das Auftreten und die Persistenz von neurologischen Defiziten im Rahmen des „syndrome of the trephined“ bei Patienten bieten, bei denen eine späte Kranioplastik durchgeführt wurde. In diesem Patientengut hatten die Patienten mit ultra-früher Kranioplastik das beste neurologische Outcome, die Komplikationsrate war in allen Gruppen vergleichbar.
Um Komplikationen zu vermeiden, sollten Patienten mit einer vorausgegangenen lokalen Infektion spät kranioplastiert werden.
Das neurologische Outcome der Patienten, bei denen ein kombiniertes Verfahren Kranioplastik –VP Shunt durchgeführt wurde, war vergleichbar mit anderen Patientengruppen. Somit ist eine Kranioplastik bei Patienten mit konvexen, über Kalottenniveau prolabierten Kraniektomielappen aufgrund eines Hydrocephalus keine Kontraindikation.
In der vorliegenden Arbeit wurden zwei motivationale Erklärungsmodelle, Zielorientierungen und das kognitiv-motivationale Prozessmodell, im Rahmen des selbstregulierten Lernens integriert. Selbstregulationsprozesse sind nach Carver und Scheier (1981) zyklisch angelegt. Zu den Bestandteilen der Selbstregulation gehören nach Boekaerts (1999)Regulation der Informationsverarbeitung, Regulation des Lernprozesses und Regulation des Selbsts. Auf dieser Ebene sind die Zielorientierungen angesiedelt. In dieser Arbeit das 2 x 2 Modell von Elliot und McGregor (2001) herangezogen. Es berücksichtigt zwei Dimensionen, die Valenz (Annäherungs- und Vermeidungskomponente) und die Kompetenz (Vergleichsmaßstab intern und extern). Hieraus resultieren: 1) Lern-Annäherungs-Ziele (positive Valenz & interner Vergleich, 2) Lern-Vermeidungs-Ziele (negative Valenz & interner Vergleich), 3) Leistungs-Annäherungs-Ziele (positive Valenz & externer Vergleich) und 4) Leistungs-Vermeidungs-Ziele (negative Valenz & externer Vergleich). Diese vier Zielorientierungen sind der erste Teil des integrierten Modells, der zweite zentrale Teil ist das kognitiv-motivationale Prozessmodell (Vollmeyer & Rheinberg, 1999, 2006). Ausgangspunkt ist die aktuelle Motivation, die aus 1) der Erfolgswahrscheinlichkeit, 2) der Misserfolgsbefürchtung, 3) dem Interesse und 4) der Herausforderung als unabhängige Faktoren besteht. Diese aktuelle Motivation wirkt nicht direkt auf die Leistung, sondern durch kognitive (hier: Metakognition) und motivationale (hier: Flow-Erleben) Mediatoren. Es wurden drei Fragestellungen bearbeitet. Die erste Fragestellung betraf das Zusammenspiel der Zielorientierungen und der aktuellen Motivation. Eine Überprüfung dieses integrierten Motivationsmodell erfolgte mittels Pfadanalyse. Die zweite und dritte Fragestellung befasste sich spezifisch mit dem kognitiv-motivationalen Prozessmodell. Es wurden Subgruppen auf der Basis der aktuellen Motivation identifiziert und ihre Bedeutung für die Mediatoren und die Leistung untersucht. Die dritte Fragestellung fokussierte den Prozesscharakter des Modells. Hier erfolgten Analysen über den Arbeitsprozess hinweg. Die Fragebögen (Achievement Goal Questionnaire (Elliot & McGregor, 2001), Metakognitionsfragebogen (aufbauend auf LIST (Wild, 2000) und Metacognitive Awareness Inventory (Schraw & Dennison, 1994), Fragebogen zur aktuellen Motivation (Rheinberg, Vollmeyer & Burns, 2001), Flow-Kurz-Skala (Rheinberg, Vollmeyer & Engeser, 2003)) und die Problemlöseaufgaben (Sudokus) wurden in einer Pilotstudie getestet. An der Hauptstudie nahmen 202 Personen teil (73% weiblich). Das integrierte Motivationsmodell geht davon aus, dass eine positiver Effekt der Zielorientierungen als Personenvariable auf die aktuelle Motivation besteht. Die aktuelle Motivation als Startpunkt des situationalen Geschehens wiederum wirkt positiv auf die Mediatoren Flow-Erleben und Metakognition, hat aber keinen direkten Effekt auf die Leistung. Dieser wird nämlich über die Mediatoren vermittelt. Deswegen wird ein positiver Effekt des Flow-Erlebens und der Metakognition auf die Leistung erwartet. Das Zusammenwirken der beiden Mediatoren kann aus dem kognitiv-motivationalen Prozessmodell nicht abgeleitet werden. Ob ein Zusammenhang besteht oder nicht wird geprüft. Für das Vorwissen wird ein positiver Effekt auf die aktuelle Motivation und die Leistung erwartet. Die Pfadanalyse zur Überprüfung des integrierten Motivationsmodells zeigte, dass eine Integration nicht nur theoretisch sinnvoll ist, sondern auch empirisch gestützt wird. Die Bedeutung der Metakognition als kognitiver Mediator wurde gezeigt. Die zweite Fragestellung fokussierte auf die aktuelle Motivation. Auf der Basis dieser wurden mittels Clusteranalyse drei distinkte Gruppen identifiziert: hoch Motivierte, niedrig Motivierte und ängstlich Motivierte (vergleichbar zu Vollmeyer & Rheinberg, 2004). Diese Gruppen unterschieden sich hinsichtlich ihres Flow-Erlebens, ihrer Metakognition und ihrer Leistung. Die hoch Motivierten erlebten am meisten Flow, berichteten mehr Metakognition und zeigten bessere Leistung. Der Prozesscharakter des kognitiv-motivationalen Prozessmodells stand im Mittelpunkt der dritten Fragestellung. Diese Analyse über die drei Sudokus hinweg zeigte eine ähnliche Entwicklung des Flow-Erlebens bei den hoch und niedrig Motivierten. Vom ersten zum zweiten Sudoku stieg es an, um dann wieder abzufallen. Dies war bei der Metakognition nicht der Fall. Die hoch Motivierten berichteten einen stärkeren Rückgang der Metakognition beim dritten Sudoku als die niedrig Motivierten. Bei der Leistung zeigte sich für die hoch Motivierten ein Anstieg beim zweiten Sudoku und dann ein Rückgang beim dritten, wohingegen die Leistung der niedrig Motivierten kontinuierlich abfiel. Abschließend wurden die Schwierigkeiten und Grenzen der vorliegenden Arbeit diskutiert und Implikationen der Ergebnisse für die Theorieentwicklung und ihre Bedeutung für den Anwendungskontext aufgezeigt.
Untersuchung hochmolekularer Proteinkomplexe in menschlichen Leukämien mittels Proteomics-Werkzeugen
(2009)
Funktionelle Multiproteinkomplexe stellen im Sinne von Proteomics das kleinste isolierbare Proteom dar. Die Untersuchung von Proteinkomplexen gibt uns die Möglichkeit, Funktionen innerhalb der Zelle oder des Zellkompartiments genauer zu verstehen. Erst durch das Verständnis der einzelnen kleinen Zusammenspiele innerhalb einer Zelle, können wir die Auswirkungen auf ein betreffendes Organ und damit auf den Körper betrachten. Wir erhalten dadurch auch Informationen über die Funktion von spezifischen Genen und können so Erklärungsansätze für Gendefekte finden und über mögliche Therapieansätze nachdenken. Neben den Hefe-Zwei-Hybrid-Analysen und dem Nachweis von Protein-Interaktionen mittels Immunopräzipitationsexperimenten stellt die Massenspektrometrie seit den 90er Jahren ein essentielles Werkzeug der Proteom-Forschung dar. Sie entwickelte sich zu einem etablierten Verfahren für die Charakterisierung von Biomolekülen und ermöglicht die Identifizierung unbekannter Proteine eines Komplexes. Das MLL-Gen auf Chromosom 11 Bande q23 ist in zahlreiche, reziproke chromosomale Translokationen verwickelt, die mit der Entstehung von akuten Leukämien assoziiert sind. Chromosomale Translokationen des MLL-Gens werden aufgrund ihrer sehr schlechten Prognose und Therapierbarkeit als Hochrisiko-Leukämien eingestuft. Bis heute konnten 64 Translokations-Partnergene identifiziert werden, wobei das AF4-Gen mit 42% bei allen untersuchten Leukämien und mit ca. 66% bei ALL (akute lymphatische Leukämie) den größten Prozentsatz ausmacht. Bei der Translokation t(4;11) sind das MLL-Gen auf Chromosom 11 und das AF4-Gen auf Chromosom 4 beteiligt. Akute Leukämien mit einer t(4;11)-Translokation treten häufig bei Säuglingen und Kleinkindern auf und betreffen vorwiegend den lymphatischen Zweig des blutbildenden Systems. Durch die Translokation entstehen zwei neue Derivatchromosomen – Derivat 11 (MLL•AF4, der11) und Derivat 4 (AF4•MLL, der4). Beide Fusionsgene verfügen über einen intakten Leserahmen und führen zur Expression der zwei Fusionsproteine MLL•AF4 (der11) und AF4•MLL (der4). Der pathomolekulare Mechanismus der t(4;11)-vermittelten ALL ist bis heute noch nicht hinreichend geklärt. Funktionen des der11-Fusionsproteins werden zwar schon intensiv erforscht, aber es gibt noch keine Erkenntnisse über die Funktion des der4-Fusionsproteins. Ähnlich sah die Situation zu Beginn dieser Arbeit für das AF4-Protein aus. Während schon einige Daten zur Funktion des MLL-Multiproteinkomplexes vorlagen, gab es nur wenige Informationen über die Funktion von AF4. Im Zuge dieser Arbeit wurden der AF4- und der der4-Multiproteinkomplex mittels affinitätschromatographischer Methoden aus transient transfizierten 293T-Zellen erfolgreich isoliert. Eine Größenbestimmung der Komplexe über eine Größenausschlusschromatographiesäule ergab für beide Komplexe eine Größe von ca. 2 MDa. Die Charakterisierung der beteiligten Interaktionspartner erfolgte mittels nLC-MALDI-MS/MS, Western Blot Analyse und Immunopräzipitation. Es konnte gezeigt werden, dass AF4 zusammen mit den Proteinen ENL/AF9, CDK9, CCNT1, AF10, DOT1L und der RNA-Polymerase II in einem Komplex vorliegt. Bereits 2007 konnte dieser Komplex in einem Mausmodell isoliert werden. Damit fungiert der AF4-Komplex auch in humanen Zellen als Stimulator der RNA-Polymerase-II-abhängigen transkriptionellen Elongation und vermittelt eine DOT1L-abhängige H3K79-Methylierung, die einen aktiven Transkriptionsstatus aufrechterhält. Zusätzlich konnten 6 neue Interaktionspartner identifiziert werden (AF5q31, BDR4, DDX6, HEXIM1, NFkB1/RELA und NPM1). Die Anwesenheit von BRD4 und HEXIM1 lässt vermuten, dass der AF4-Komplex in einem aktiven und einem inaktiven Zustand vorliegen kann. Außerdem wird der AF4-Komplex möglicherweise über den NFkB-Signalweg reguliert bzw. durch die Anwesenheit von NFkB1 an dessen Zielgene rekrutiert. Die Untersuchung des der4-Komplexes zeigte, dass er sich aus Mitgliedern der beiden Wildtyp-Proteinkomplexe zusammensetzt. So wurden die Proteine P-TEFb, HEXIM1, NFkB1, NPM1, DDX6 und das AF4 selbst aus dem AF4-Komplex sowie ASH2L, RBBP5, WDR5, DPY-30, CBP, HCF-1 und HCF-2 aus dem MLL-Komplex identifiziert. Der der4-Komplex weist somit partielle Eigenschaften des AF4- und MLL-Wildtyp-Proteins auf. Diese Eigenschaften sind ausreichend für eine kompetitive Situation zwischen dem der4-Komplex und den beiden AF4- und MLL-Wildtyp-Komplexen. Die Gleichgewichte dieser Wildtyp-Komplexe werden vermutlich gestört. Für beide Komplexe wurde mit Hilfe eines in vitro Histon-Methyltransferase-Assays eine Histon-Methyltransferase-Aktivität nachgewiesen. Für den AF4-Komplex muss zusätzlich eine bisher noch unbekannte Methyltransferase-Aktivität angenommen werden, da eine Methylierung des Histons H3 in den ersten 46 Aminosäuren gezeigt werden konnte, die sich nicht auf die Methyltransferase-Aktivität des DOT1L-Proteins im AF4-Komplex zurückführen lässt. Die H3K4-Methyltransferase-Aktivität des der4-Komplexes wird auf die Anwesenheit des SET-Domänen-Komplexes (ASH2L, WDR5, RBBP5 und DPY-30) zurückgeführt. Im Zusammenhang mit dem AF4-Protein wurde auch der ENL-Komplex untersucht. Mittels Western Blot konnten die Interaktionspartner AF4, CDK9, CCNT1, RNA-Polymerase II, NFkB1 und RING1 identifiziert werden. Damit ist auch das ENL mit dem globalen positiven transkriptionellen Elongationsfaktor P-TEFb assoziiert und beeinflusst die RNA-Polymerase-II-abhängige transkriptionelle Elongation.
Zwischen Juni 2006 und Juni 2007 wurde in unserem Zentrum bei 24 Patienten im Alter von 52 bis 86 Jahren und einem durchschnittlichen Alter von 73,9 ± 8,4 Jahren der interventionelle Verschluss des Vorhofohrs mit dem neuen WATCHMAN-Okkluder versucht. 61% der Patienten waren männlich, 39% weiblich. Im Mittel ergab der CHADS₂-Wert 2,6 ± 1,2 bei Werten zwischen 1 und 5. Damit lag das jährliche Schlaganfallrisiko bei 5,6 ± 3,0%. Die Ostienweite der Vorhofohren betrug zwischen 17,6mm und 26,4mm, der durchschnittliche Wert lag bei 21,8 ± 2,2mm. Die Länge der Vorhofohren variierte zwischen 25,0mm und 45,7mm bei einer mittleren Länge des Vorhofohrs von 33,5 ± 5,5mm. Watchman-Okkluder mit einem Schirmdurchmesser von 27mm waren mit 52% die am häufigsten implantierten Okkluder. Die technische Erfolgsrate betrug 95,8%. Die Implantation der Okkluder dauerte 43,9 ± 14,0 Minuten (19,0 bis 70,0 Minuten). Die Durchleuchtungszeiten betrugen 5,7 bis 18,1 Minuten (im Mittel 8,7 ± 3,0 Minuten). Es wurden zwischen 57 und 193ml Kontrastmittel während des Eingriffs benötigt (durchschnittlich 131 ± 44ml). Die postinterventionelle stationäre Krankenhausaufenthaltszeit betrug im Durchschnitt 2,8 ± 4,1 Tage (1 bis 21 Tage). Bei einer technischen Erfolgsrate des Eingriffs von 95,8% (23/24 Fällen) betrug die Verschlussrate 100%, so dass bei allen Patienten Marcumar abgesetzt werden konnte. Auch bei allen nachfolgenden transösophagealen Echo-Kontrolluntersuchungen betrug die Verschlussrate 100%. Der Unterschied der Verschlussrate war im Vergleich zu den Ergebnissen anderer Studien über interventionelle Vorhofohrverschlüsse statistisch nicht signifikant. In der vorliegenden Arbeit lag das nach dem CHADS₂-Score kalkulierte jährliche Risiko für ischämische Schlaganfälle bei 5,6%. Im gesamten Nachbeobachtungszeitraum von 37,6 Jahren bei einer mittleren Nachbeobachtung von 20,8 ± 3,3 Monaten traten in unserem Patientenkollektiv keine ischämischen Schlaganfälle auf. Bei einem Patienten trat nach 22 Monaten eine aphasische Episode mit begleitender Schwäche der rechten Körperseite auf. Bei diesem Ereignis kann eine TIA nicht ausgeschlossen werden. Dieses Ergebnis lässt sich mit den von Sick et al. publizierten Ergebnissen der multizentrischen Watchman-Studie [72] vergleichen. Innerhalb der Nachbeobachtungszeit traten keine Todesfälle und keine Okkluderembolisationen auf. Zwei Ereignisse (8,7%) traten innerhalb des ersten Monats nach der Implantation auf: Ein Patient entwickelte wenige Stunden nach dem Eingriff nach Beginn der Marcumarisierung eine rechtsseitige Kleinhirnblutung. Der INR-Wert einen Tag vor der Implantation hatte 2,0 betragen. Im Verlauf blieb eine leichte Schreibschwäche der rechten Hand zurück. Bei einem Patienten trat ein Perikarderguss auf. Nach einer Perikardiozentese sowie Absetzen von Aspirin und Marcumar war der Patient beschwerdefrei. Nach dem ersten Monat kam es bei mehreren Patienten zu Krankenhausaufenthalten: eine Humerusfraktur nach Sturz, eine gangränöse Pyodermie, eine entgleiste Hyperglykämie, eine Inguinalhernien-Operation, eine hypertensive Krise mit konsekutiver beatmungspflichtiger respiratorischer Insuffizienz, eine Defibrillator-Implantation nach rezidivierenden Synkopen, eine Pneumonie, drei exazerbierte COPDs, drei neu aufgetretene Belastungsdyspnoen, zwei NSTEMIs bei einem Patienten, ein Bänderriss, eine Defibrillatorimplantation, eine operative Spinalkanaldekompression, eine Schrittmacherimplantation, ein epileptischer Anfall, eine Überlaufinkontinenz, eine penetrierende Hornhautverletzung, eine sensorische Aphasie Die Patienten konnten in gutem Gesundheitszustand aus dem Krankenhaus entlassen werden.
Ziel der vorliegenden Promotionsarbeit war die Herstellung und Charakterisierung einer neuen Stat5 Reportermaus zur Analyse der transkriptionellen Aktivität von STAT5 in verschiedenen Entwicklungsstadien, Zelltypen und Organen auf Einzelzellebene in vivo. Die Zusammenfassung dieser Promotionsarbeit gibt im Folgenden einen Überblick über den JAK/STAT Signalweg und seine einzelnen Komponenten. Das Hauptaugenmerk liegt hierbei auf STAT5, da es eine wichtige Rolle in der zellulären Entwicklung, Differenzierung und Proliferation spielt. Anschließend werden die Klonierung des Stat5 Reportergenkonstruktes und die Herstellung der Reportermaus durch DNA-Mikroinjektion besprochen und die Ergebnisse sowie Schlussfolgerungen der funktionellen in vivo Analyse dieses neuen Reportermausmodells dargestellt. Signal transducer and activator of transcription (STAT) Proteine gehören zu einer Familie von Transkriptionsfaktoren, die latent im Zytoplasma vorkommen. Diese Proteinfamilie besteht aus sieben Mitgliedern: STAT1, STAT2, STAT3, STAT4, STAT5a, STAT5b und STAT6. Alle STAT Proteine weisen eine konservierte Struktur auf, bestehend aus einer N-terminalen Domäne (NTD), einer Coiled-Coil-Domäne (CCD), einer DNA-Bindedomäne (DBD), einer Linkerdomäne (LD), einer src-homology 2- Domäne (SH2) und einer Transaktivierungsdomäne (TAD). Eine Vielzahl löslicher, extrazellulärer Signalmoleküle wie zum Beispiel Hormone, Zytokine und Wachstumsfaktoren binden an ihre spezifischen Oberflächenrezeptoren und Aktivieren so die JAK/STAT Signalkaskade. Dabei führt die Ligandenbindung an den entsprechenden Rezeptor zunächst zur Dimerisierung des Rezeptors und anschließend zur Transphosphorylierung von Janus Kinasen (JAKs). Aktivierte JAKs phosphorylieren dann den Rezeptor an spezifischen Tyrosinresten. An diese können STAT Proteine über ihre SH2 Domäne binden. Die gebundenen STAT Proteine werden anschließend durch JAKs an einem Tyrosinrest (und Serinrest) in der TAD phosphoryliert und dimerisieren im Zytoplasma. Dimerisierte STAT Proteine translozieren anschließend in den Nukleus und binden an spezifische DNA-Sequenzen, die sogenannten GAS (gamma-IFN-aktivierende Seite) Elemente in der Promotorregion ihrer Zielgene. GAS Elemente sind kurze palindromische DNA Regionen mit einer TTTCCNGGAAA Konsensussequenz. Nach Bindung der aktivierten, phosphorylierten STAT Proteine an die GAS Elemente werden weitere Kofaktoren, wie zum Beispiel das CREB Bindeprotein p300/CBP rekrutiert, die gemeinsam als Transkriptionsfaktoren wirken und die Transkription ihrer Zielgene anschalten. Die Identifizierung von STAT5 erfolgte im Rahmen von Promotorstudien am β-Casein Milchgen in der murinen Brustepithelzelllinie HC11 (Schmitt-Ney et al., 1991). Kurz darauf wurde STAT5 auch im Brustgewebe von laktierenden Mäusen, Ratten und Kühen gefunden. Bevor eine Sequenzhomologie zu Proteinen der STAT Genfamilie festgestellt wurde, wurde STAT5 zunächst MGF – „mammary gland factor“ genannt (Schmitt-Ney et al., 1992b; Wakao et al., 1992). Es sind zwei Stat5 Gene bekannt, Stat5a und Stat5b, die eine Sequenzhomologie von 96 % aufweisen und ihren größten Unterschied in der TAD Domäne zeigen. Da keine STAT-ähnlichen Proteine in Hefezellen identifiziert wurden, ist der JAK/STAT Signalweg nur für multizelluläre Organismen von Bedeutung, vermutlich weil diese auf komplexe Zell-Zell Kommunikationen angewiesen sind, um im Zellverband auf Signale in der Umgebung reagieren zu können. STAT5 im Speziellen reguliert neben der Entwicklung des Brustgewebes während der Schwangerschaft, die Produktion von Blutzellen in der fötalen Leber sowie die Zellproliferation während der adulten Hämatopoese. Im Embryo ist die fötale Leber der Ort der Hämatopoese, bevor hämatopoetische Stammzellen im Knochenmark kolonialisieren und sich die Leber zu einem metabolischen Organ entwickelt. In der Maus gelangen ab dem Embryonaltag E12 hämatopoetische Stammzellen aus der Aorta, den Gonaden und dem Mesonephros (Urniere), der sogenannten AGM Region, sowie aus der Plazenta durch den Blutstrom in die fötale Leber. Die Zellen proliferieren hier und migrieren etwa zwei Tage vor der Geburt (E18) ins Knochenmark, wo die Hämatopoese nach der Geburt erfolgt. Durch die Übermittlung einer Vielzahl von Zytokinsignalen reguliert STAT5 die Differenzierung der pluripotenten Zellen in reife Blutzellen und sorgt zusätzlich für die Generierung von Zellen, die anschließend in der Lage sind, das Knochenmark zu repopulieren. Ein STAT5 Verlust führt aufgrund einer auftretenden Anämie zu einer pränatalen Letalität. Während der adulten Hämatopoese fördert STAT5 hingegen die Zellproliferation und den Zellzyklus sowie die Apoptose in hämatopoetischen Stammzellen. Im Brustgewebe ist STAT5 sowohl in der Mammogenese als auch in der Laktogenese involviert. Die Aktivierung von STAT5 erfolgt hierbei durch eine Vielzahl von Faktoren, wie zum Beispiel Prolaktin und Erythropoietin. Der Phosphorylierungsstatus von STAT5 im virgin Stadium ist hierbei gering, steigt aber während der Schwangerschaft und Laktation stetig an und führt zur Aktivierung von einer Reihe von Zielgenen wie Milchproteinen, aber auch Zellzyklusregulatoren wie CyclinD1 und negativen Regulatoren des JAK/STAT Signalweges, wie zum Beispiel SOCS3. Nach der Laktation nimmt die Phosphorylierung von STAT5 hingegen ab und aufgrund von Apoptose kommt es zu einer Rückbildung des alveolaren Gewebes. Die Regulation der Apoptose erfolgt durch eine erhöhte STAT3 Phosphorylierung. Eine Deregulierung des JAK/STAT Signalweges wird in einer Vielzahl von Tumoren beobachtet. Hier liegt STAT5 typischerweise konstitutiv aktiv vor, führt dadurch zu einer verstärkten Zellproliferation und Angiogenese und verhindert gleichzeitig die Apoptose der mutierten Zellen und eine Immunantwort, was zusammen die Tumorentstehung begünstigt. Konstitutiv aktives STAT5 spielt vor allem bei der Entstehung von soliden Tumoren wie Brustkrebs sowie verschiedenen Leukämieformen wie zum Beispiel akute und chronische myelogene Leukämien eine wichtige Rolle. Neben diesen bereits bekannten STAT5 Funktionen ist die Funktion von aktivem, phosphoryliertem STAT5 im Kontext der Mausentwicklung und in adultem Gewebe noch unklar. Um die Rolle von STAT5 während der Entwicklung näher zu charakterisieren, wurden bereits verschiedene Mausmodelle generiert. Seit dem ersten Gentransfer in Mäuse im Jahre 1980 bieten transgene Tiere eine Möglichkeit, detaillierte Einblicke in zelluläre Prozesse im Rahmen der Entwicklung, des Stoffwechsels und der Entstehung von (Krebs-) Erkrankungen zu erlangen. Transgene Mäuse wurden somit zu einem wichtigen Modellsystem, das in der Lage ist, die Mechanismen, die hinter diesen Prozessen stehen, näher zu beleuchten. STAT5a und STAT5b knock out Mäuse sind überlebensfähig, zeigen jedoch phänotypische Unterschiede. Da eine Signalweiterleitung nach Prolaktininduktion in Brustgewebszellen von STAT5a knock out Mäusen nicht erfolgt, sind diese nicht in der Lage während der Schwangerschaft zu Proliferieren und zu Differenzieren. Die Deletion von STAT5a und STAT5b hingegen ist pränatal letal und die Embryos zeigen schwere Anämien aufgrund einer erhöhten Apoptoserate der erythroiden Zellen in der fötalen Leber. Zusätzlich zu den knock-out und gain-of-function Mäusen wurde die Generierung von Reportermäusen immer wichtiger, um spezifische Signalwege im Kontext des gesamten Organismus zu untersuchen. Das Ziel dieser Promotionsarbeit war somit die Herstellung und funktionelle Analyse einer neuen Stat5 Reportermaus. Hierfür wurde zunächst ein neues Stat5 Reporterkonstrukt kloniert. Dieses Reporterkonstrukt sollte eine Vielzahl spezifischer Eigenschaften aufweisen, um speziell durch phosphoryliertes STAT5 aktiviert zu werden: (i) ein LacZ Reportergen, (ii) Stat5 Responsive-Elemente und (iii) einen minimalen Promoter. Das LacZ Reportergen wurde hierbei gewählt, um die transktiptionelle Aktivität von STAT5 in Gewebeschnitten direkt durch Blaufärbung der Zellen zeigen zu können. Bei dem gewählten Promoter handelt es sich um einen Minimalpromoter, für die Bindung genereller Transkriptionsfaktoren. Eine Aktivierung des LacZ Reportergens erfolgt jedoch nur nach vorheriger Bindung eines Transaktivators. Damit STAT5 diese Funktion übernimmt wurden zusätzliche Responsive-Elemente aus dem β-Casein Gen in das Konstrukt eingefügt. Nach erfolgreicher Klonierung von insgesamt sieben verschiedenen Stat5 Reporterkonstrukten, wurde ihre spezifische Induzierbarkeit nach STAT5 Phosphorylierung mittels transienter Transfektionsstudien in vitro analysiert und bestätigt. Das p(Stat5RE)4-CMVmin-LacZ Konstrukt wurde anschließend zwischen humane matrix attachment regions (MAR) kloniert, die als sogenannte Insulatoren fungieren. Diese sollen in der transgenen Maus verhindern, dass entfernt bindende Faktoren die Expression der Reportergenkassette positiv (enhancer) oder negativ (silencer) beeinflussen. Zusätzlich zu den sieben hier generierten Stat5 Reporterkonstrukten, wurde das p(Stat5RE)4-CMVmin-LacZ Reportergenkonstrukt im Rahmen einer Diplomarbeit in einen lentiviralen Gentransfervektor kloniert. Dieser erlaubt die stabile Transduktion von Krebszellen und Primärzellen, so dass eine ineffiziente Transfektion dieser Zellen umgangen werden kann (Gäbel, 2009). Zur Herstellung der transgenen Stat5 Reportermaus wurde das linearisierte und aufgereinigte Stat5 Reporterkonstrukt mittels DNA-Mikroinjektion in den Pronukleus von 470 Eizellen von FVB und C57BL/6 Mäusen injiziert. Die Eizellen wurden anschließend in Ammenmäuse transplantiert. Von den 470 Eizellen kamen 57 Mäuse auf die Welt. Die Integration des Transgens wurde anschließend mittels PCR und Southern Blot analysiert und die Integration des kompletten Transgens konnte in zwei der 57 Mäuse festgestellt werden. Bei beiden transgen-positiven Mäusen handelte es sich um C57BL/6 Mäuse, die anschließend mit Wildtyp C57BL/6 Mäusen verpaart wurden. Nachkommen der F2 Generation wurden dann auf die spezifische Induzierbarkeit des Stat5 Reportergenkonstruktes durch phosphoryliertes STAT5 in vivo untersucht. Da der Phosphorylierungsstatus von STAT5 im Brustgewebe bereits eingehend untersucht wurde und bekannt ist, erfolgte zunächst die Analyse der Reportergenaktivität im murinen Brustgewebe. Hierfür wurde das Brustgewebe isoliert, fixiert und über Nacht gefärbt. Anschließend wurden Paraffinschnitte hergestellt und im Detail analysiert. Im Vergleich zu Wildtyp-Kontrollmäusen konnte die Aktivierung des Reportergens im Brustgewebe in verschiedenen Entwicklungsstadien, vor allem während der späten Schwangerschaft und der Laktation, durch Blaufärbung einzelner Zellen, gezeigt werden. Eine Korrelation der Blaufärbung mit der Phosphorylierung von STAT5 in diesen Zellen wurde anhand von immunhistologischen Färbungen von Paraffinschnitten mit Antikörpern gegen Stat5 und P-Stat5 gezeigt. Zusätzlich zu der hormonell induzierten STAT5 Phosphorylierung bedingt durch eine Schwangerschaft, wurde die Aktivierung des Reportergens durch das Verabreichen von LPS gezeigt. Eine Behandlung der Stat5 Reportermäuse mit LPS führt zu einer Phosphorylierung von STAT5 in Zellen des hämatopoetischen Systems, speziell Granulozyten und Makrophagen, und sollte anschließend das LacZ Reportergen in diesen Zellen aktivieren. Dies konnte durch die Färbung von Blut- und Knochenmarkzellen mit spezifischen Oberflächenmarkern, sowie einer Färbung mit FDG (Fluoresceindi-β-D-galactopyranoside) mittels FACS Analysen bestätigt werden. Das nicht-fluoreszierende FDG wird hierbei von der exprimierten β-Galaktosidase zunächst zu Fluoreszein-monogalactosid (FMG) und anschließend zum hoch fluoreszierenden Fluoreszein hydrolysiert, was eine messbare Erhöhung der Fluoreszenz nach sich zieht. Zusammenfassend konnte das Stat5-Reportergen sowohl durch endogene Signale als auch durch extern zugeführte Signale induziert werden. Anschließend erfolgte die Analyse der Reportergenaktivierung in anderen Organen der Stat5 Reportermaus. Hierbei konnte die Aktivierung des LacZ Reportergens sowohl in der Leber (Hepatozyten), Milz (Pulpa) und Niere (Mark und Rinde) als auch im Thymus (Lymphozyten und antigen präsentierende Zellen) und im Uterus (endometrisches Epithel) bestätigt werden. Diese Ergebnisse korrelieren mit zuvor durchgeführten Western Blot Analysen, die eine Phosphorylierung von STAT5 in eben diesen Organen gezeigt haben. Zusätzlich wurde phosphoryliertes STAT5 auf Proteinebene im Herz und im Gehirn gefunden, jedoch nicht in Gewebsschnitten der β-Galactosidase gefärbten Organe. Dies deutet darauf hin, dass das Reportergen trotz der Anwesenheit von phosphoryliertem STAT5, nicht immer eingeschaltet wird und somit weitere Faktoren für die transkriptionelle Aktivität von STAT5 notwendig sind. Western Blot Analysen sind somit alleine nicht ausreichend, um eine Aussage über die transkriptionelle Aktivität von phosphoryliertem STAT5 zu treffen, so dass die im Rahmen dieser Arbeit generierte Stat5 Reportermaus einen wichtigen Beitrag zum Verständnis von aktivem STAT5 bietet. Das generierte Stat5 Reportermausmodel wurde dann im Rahmen dieser Arbeit genutzt, um die Beteiligung von aktivem STAT5 in der Entwicklung von ΔTrkA induzierter akuter myeloischer Leukämie näher zu untersuchen. Hierfür wurden lineage negative Knochenmarkszellen aus den Stat5 Reportermäusen isoliert. Dabei werden sogenannte „Lin“ Antigene (z.B. CD3, CD4, CD8, Gr-1, Ter-119) genutzt, um reife murine Blutzellen zu identifizieren. Zellen, die diese Oberflächenmarker nicht oder nur in sehr geringen Mengen exprimieren, werden als lineage negativ bezeichnet. Ein Mix monoklonaler Antikörper gegen lineage Antigene kann somit zur Isolation lineage negativer Knochenmarkszellen genutzt werden. Diese negative Selektion führt letztendlich zur Anreicherung hämatopoetischer Stammzellen oder früher Progenitorzellen, die diese Marker (noch) nicht exprimieren. Diese Progenitorzellen wurden dann retroviral mit einem ΔTrkA Konstrukt transduziert und anschließend in bestrahlte Rag-1-/- Mäuse transplantiert und repopulierten in diesen das Knochenmark. Durch die ΔTrkA Transduktion wurde in den Rag-1-/- Mäusen myeloische Leukämie induziert. Jedoch konnte im Rahmen dieser Arbeit keine Aktivierung des Stat5 Reportergenkonstruktes beobachtet werden. Dies deutet darauf hin, dass STAT5 in ΔTrkA induzierten Leukämien keine Rolle spielt und bestätigt die Annahmen von Meyer et al. Durch die hier vorgestellten Ergebnisse bestätigt sich sowohl die Generierung eines neuen Stat5 Reportermausmodels als auch ihre spezifische Induzierbarkeit sowohl durch endogene hormonelle Prozesse (Schwangerschaft) als auch durch externe Manipulation (LPS Behandlung). Diese neue Stat5 Reportermaus wird in Zukunft als wichtiges und effizientes Modell fungieren, um die Rolle von transkriptionel aktivem STAT5 näher zu beleuchten. Hierbei wird sich der Fokus nicht nur auf die Rolle einzelner Zellen bei der normalen Entwicklung von Organen während verschiedener Entwicklungsstadien beschränken, sondern sich mehr und mehr in Richtung Tumorinitiierung und Tumorentwicklung bewegen. Anhand des hier generierten Stat5 Reportermausmodels können in Zukunft weitere Brustkrebs- und Leukämie-Tumormodelle herangezogen werden, um die Rolle und Funktion von STAT5 in der Tumorentwicklung in vivo detailliert analysieren zu können. Auf diesen Ergebnissen aufbauend wird dann die Möglichkeit bestehen, dieses neue Stat5 Reportermausmodell als Plattform zu nutzen, um zahlreiche neue Krebsmedikamente zu entwickeln und zu evaluieren.
Veränderungen in der akustischen Umwelt sind häufig mit Ereignissen verbunden. Diese wiederum können für ein Tier eine besondere Verhaltensrelevanz haben, im Gegensatz zu einem gleichbleibenden akustischen Hintergrund, der mit keinem positiven oder negativen Ereignis verbunden ist. Es ist also naheliegend zu spekulieren, dass Veränderungen oder neue akustische Reize im zentralen Nervensystem anders repräsentiert werden als der kontinuierliche Hintergrund und dass diese Repräsentation sowohl von der Häufigkeit der Stimuli als auch vom Unterschied zum akustischen Hintergrund abhängt. In Elektroenzaphalografie-Messungen (EEG) am Menschen wurde eine besondere Aktivitätsänderung bei auditorischen Abweichungen erstmals 1978 nachgewiesen. Dabei wurde ein akustischer Reiz über einen längeren Zeitraum regelmäßig wiederholt (Standard) und in einigen, seltenen Fällen durch einen anderen Reiz (Deviant) ersetzt. Dieser Deviant löste eine zusätzliche negative Komponente im EEG aus (Mismatch negativity), die bei den Standard-Stimuli nicht vorhanden war. Eine Voraussetzung, um MMN auszulösen, ist die Präsentation von einigen Standard-Stimuli, sodass eine neuronale Repräsentation des Stimulus aufgebaut werden kann, gegen die jeder weitere Reiz abgeglichen wird. Die zelluläre Basis von MMN und des zugrunde liegenden Mechanismus zur Detektion von auditorischen Veränderungen ist nur wenig erforscht. Als möglicher zellulärer Detektionsmechanismus akustischer Veränderungen wurde die Stimulus-spezifische Adaptation (SSA) vorgeschlagen, die zugleich der Ursprung von MMN im primären auditorischen Kortex sein könnte. SSA beschreibt die Eigenschaft von Neuronen der Hörbahn, auf die Wiederholung von identischen Reizen mit abnehmender Aktivität zu antworten und zugleich die Fähigkeit beizubehalten, andere Stimuli weiterhin mit hoher Aktivität zu repräsentieren. Die veränderte neuronale Repräsentation von Tönen mit niedriger Auftrittswahrscheinlichkeit, im Vergleich zu Tönen mit hoher Auftrittswahrscheinlichkeit, wurde bereits sehr eindrücklich im auditorischen Kortex der anästhesierten Katzen demonstriert. Die vorliegende Arbeit hat es sich zum Ziel gesetzt, bei der Repräsentation von auditorischen Abweichungen die Lücke zwischen der Ebene aufsummierter Potenziale (EEG beim Menschen) und der Ebene einzelner kortikaler Neurone zu schließen. Gleichzeitig sollte dabei erstmalig SSA im auditorischen Kortex des wachen Tieres nachgewiesen und so eine pharmakologische Interaktion der normalerweise eingesetzten Anästhetika mit SSA ausgeschlossen werden. Der experimentelle Ansatz basierte auf elektrophysiologischen Messungen mit chronisch implantierten Mikroelektroden im wachen Tier. Die Elektroden waren im auditorischen Kortex positioniert und ermöglichten eine gleichzeitige Messung der lokalen aufsummierten Potenziale (lokale Feldpotenziale, LFP) und der Aktionspotenziale einzelner Neurone als extrazelluläre Potenzialveränderungen. Das Stimulationsparadigma bestand aus Folgen zweier Reintöne, die mit unterschiedlicher Auftrittwahrscheinlichkeit präsentiert wurden. Der Ton mit hoher Auftrittwahrscheinlichkeit bildete den akustischen Hintergrund, der Ton mit niedriger Auftrittswahrscheinlichkeit (Deviant) die akustische Abweichung. In dieser Arbeit konnte erstmalig nachgewiesen werden, dass Neurone im auditorischen Kortex der wachen Ratte akustische Abweichungen mit einer höheren Aktivität repräsentieren als den auditorischen Hintergrund (bis zu 19,5% Aktivitätsunterschied). Stimulusspezifische Adaptation ist somit auch im wachen Tier Teil der neuronalen Codierung der akustischen Umwelt. Mithilfe der Signalentdeckungstheorie konnte des Weiteren gezeigt werden, dass die unterschiedliche neuronale Repräsentation von häufigen und seltenen Stimuli auch zu einer erhöhten neuronalen Unterscheidbarkeit zwischen beiden Stimuli führte. Auf der Ebene der ereigniskorrelierten LFPs konnte SSA in zwei Komponenten nachgewiesen werden: der ersten, negativen Auslenkung und der folgenden, positiven Auslenkung. Besonders in der ersten, negativen Komponente war SSA systematisch nachzuweisen und sie war zusätzlich starkmit der Aktivität der einzelnen Neuronen korreliert, während die positive Komponente der LFPs keine Korrelation mit den Messungen der einzelnen Nervenzellen zeigte. Der Grad der SSA hing von der Auftrittwahrscheinlichkeit und dem Frequenzabstand der beiden Töne ab. Keine der Messungen hatte die besondere Charakteristik von MMN. Zusammenfassend lässt sich die Aussage treffen, dass SSA auch im wachen Tier nachgewiesen wurde, sowohl auf der Ebene einzelner Neurone als auch in der aufsummierten Aktivität, wenn auch in einer schwächeren Ausprägung als in den bisher veröffentlichten Ergebnissen in anästhesierten Tieren. Ein direkter Beitrag der kortikalen Neurone zu MMN konnte nicht gezeigt werden, es gab aber einen starken Zusammenhang zwischen den einzelnen Neuronen und den LFPs.
In den Neurowissenschaften führt die Erforschung des vegetativen Nervensystem (VNS) immer noch ein Schattendasein. Einer der wichtigsten Teile des VNS, der Hirnstamm, ist dabei besonders schlecht erforscht, obwohl er die Steuerzentren für Herzschlag, Blutdruckregulation, Atmung, Verdauung, und viele weitere lebenswichtige Funktionen beherbergt. Ein wichtiger Grund für diesen Umstand ist, dass die funktionelle Kernspintomographie (fMRT) sich in ihrer bisherigen Form nur bedingt für Messungen im Hirnstamm eignet. Ziel dieser Arbeit war es daher, neue Ansätze zur fMRT-Messung vegetativer Zentren im menschlichen Hirnstamm zu entwickeln. Nach einer Einführung in die Neuroanatomie sowie die physikalischen und physiologischen Grundlagen der strukturellen und funktionellen MRT werden im mittleren Teil der Arbeit die Entwicklung sowie der Test neuer Ansätze zur Hirnstamm-fMRT beschrieben. Dabei untersucht der Autor zunächst, welche grundlegenden Probleme einer konventionellen fMRT-Messung im Hirnstamm entgegenstehen. Es stellt sich heraus, dass alle hirnstamm-spezifischen Störquellen direkt oder indirekt auf den Herzschlag zurückzuführen sind. Aus den vorhandenen Ansätzen zur Korrektur solcher Störungen wird die Herzschlag-Taktung ausgewählt. Bei diesem Verfahren erfolgt die Aufnahme der fMRT-Bilder zeitlich gekoppelt an dem Herzschlag des Probanden, um sämtliche kardiogenen Rauschquellen zu unterdrücken. Anstelle des häufig verwendeten, aber statistisch problematischen Guimaraes-Verfahrens zur Korrektur der durch die Herzfrequenzvariabilität bedingten Schwankungen des MR-Signals wird in der vorliegenden Arbeit der die sog. Dual-Echo-Bildgebung verwendet. Dabei wird die konventionelle EPI-Sequenz (echo-planar imaging) dahingehend erweitert, dass pro Bild anstelle eines Echos zwei aufgenommen werden. Durch Quotientenbildung der beiden Bilder kann so der fluktuierende Teil des Signals entfernt werden. Beim Vergleich verschiedener Varianten der Quotientenbildung stellt sich ein neu entwickelter, exponentieller Ansatz als überlegen heraus. Danach werden die Auswirkungen verschiedener Methoden der Bewegungskorrektur und Schichtorientierung verglichen, um das Optimum für Messungen im Hirnstamm zu ermitteln. Nach Tests des neuen Verfahrens an verschiedenen fMRT-Datensätzen werden Empfehlungen für die Kombination der verschiedenen Parameter gegeben. Es zeigt sich, dass die Standardabweichung der fMRT-Bilder mit der neuen Methode im unteren Hirnstamm um 13% - 33% reduziert werden kann. Ein Sensitivitätstest an motorischen Hirnstammkernen, welche durch ein motorisches Paradigma aktiviert werden, zeigt, dass die jeweiligen Kerne in 85% - 95% der Fälle eindeutig identifiziert werden können. Im dritten Teil der Arbeit erfolgt die Anwendung der neuen Methode auf die Messung von Aktivierungen vegetativer Zentren. Hier wird als unkonventionellen Stimulus des vegetativen Nervensystems die Akupunktur verwendet. Dies geschieht u.a. mit der Zielsetzung, zur Aufdeckung des noch immer unbekannten Wirkmechanismus dieser Therapieform beizutragen. Als Akupunkturpunkt wird Pc6 am Handgelenk gewählt, da die Studienlage eindeutig dessen Effektivität bei der Behandlung von Übelkeit und Erbrechen sowie eine Beeinflussung der Magen-Peristaltik zeigt und die neuralen Zentren hierfür größtenteils im Hirnstamm lokalisiert sind. Der Autor stellt daher die Hypothese auf, dass die Akupunkturwirkung in diesem Fall über den Vagusnerv und dessen Hirnstammkern, den Nucleus dorsalis nervi vagi, vermittelt wird. Vor der Überprüfung dieser Hypothese erfolgt zunächst eine Methodenkritik der bisherigen Akupunktur-fMRT-Forschung. Anhand einer Gruppe von Studien, welche über Aktivierungen der Sehrinde bei Akupunktur visuell relevanter Punkte berichten, weist der Autor eine Reihe methodischer Probleme nach. Anhand einer eigenen Studie kann er mittels Independent Component Analysis (ICA) zeigen, dass die von den bisherigen Studien berichteten, visuellen Aktivierungen höchstwahrscheinlich nicht auf die Wirkung der Akupunktur zurückzuführen sind. Um einige der Probleme dieser Studien zu umgehen, entwickelt der Autor ein neues psychophysikalisches Verfahren, bei dem die Probanden während der Akupunktur kontinuierlich die Stärke der Nadelempfindung („DeQi“) auf einer visuellen Analogskala bewerten. Mit Hilfe dieses Verfahrens gelingt schließlich der Nachweis einer Hirnstamm-Aktivierung unter Akupunktur-Stimulation, deren Lokalisation mit der des Nucleus dorsalis nervi vagi vereinbar ist. Dies bestätigt die ursprüngliche Hypothese und zeigt gleichzeitig die Eignung des neuen Verfahrens für die Bildgebung vegetativer Hirnstammzentren.
Ein weit verbreitetes Merkmal von Leukämien sind genetische Veränderungen, wobei die Entstehung der Leukämie häufig mit reziproken chromosomalen Translokationen assoziiert ist, welche zur Bildung chimärer Genprodukte führen. Eine Vielzahl dieser reziproken Translokationen basieren auf Translokationen des MLL Gens (Mixed Lineage Leukemia), die mit dem Krankheitstyp einer AML oder einer ALL verbunden sind. Die häufigste chromosomale Translokation ist die t(4;11) Translokation. Sie tritt vor allem bei Kleinkindern bzw. auch bei älteren Patienten mit einer Sekundärleukämie auf und resultiert in einer akuten lymphatischen Leukämie. Es handelt sich um eine Hochrisikoleukämie, welche aufgrund ihrer nahezu Therapie-resistenten Blasten mit einer besonders schlechten Prognose assoziiert ist. Der Mechanismus der Leukämieentstehung durch die MLL-Translokationen und der dabei entstehenden Fusionsproteine konnte bis heute nicht ausreichend geklärt werden. Für einige MLL-Translokationen, die mit einer myeloischen Leukämie verknüpft sind, konnte zunächst das onkogene Potenzial der Fusionsproteine im Mausmodell belegt werden. Im Bezug auf die t(4;11) Translokation blieben Ansätze zur Etablierung eines Tiermodells jedoch lang erfolglos. Erst 2006 konnten mittels einer knock-in-Strategie bzw. einem „inverter“-System Mausmodelle für MLL•AF4 entwickelt werden, in denen die Mäuse nach sehr langer Latenzzeit ein disseminiertes B-Zell-Lymphom aufwiesen. Ein neueres konditionales MLL•AF4 knock-in-Modell, in dem MLL•AF4 unter der Kontrolle des endogenen Zellzyklus-abhängigen MLL-Promotors steht, resultierte hingegen in einer ALL oder AML. Im Allgemeinen steht somit bislang das MLL•AF4-Fusionsprotein im Vordergrund der Erforschung des pathomolekularen Mechanismus der t(4;11) Translokation. Aufgrund der Tatsache, dass in der Regel jedoch neben dem MLL•AF4- ebenso ein AF4•MLL-Fusionstranskript nachgewiesen werden kann, befassten sich Studien unserer Arbeitsgruppe mit der Funktion des AF4•MLLFusionsproteins. Diese Untersuchungen zeigten, dass das AF4•MLL-Fusionsprotein in der Zelle akkumuliert und in der Entwicklung onkogener Effekte sowie der Wachstumstransformation der Zelle resultiert. Ergänzend belegten retrovirale Transduktions-/Transplantations-Experimente die Entwicklung einer akuten Leukämie im Mausmodell, wenn zuvor mit AF4•MLL bzw. mit AF4•MLL und MLL•AF4 transduzierte Stammzellen transplantiert wurden. Um nun die Funktion des AF4•MLL-Proteins sowie die molekularen Ursachen der beobachteten Eigenschaften besser verstehen zu können, wurde der AF4•MLL-Proteinkomplex mittels einer Strep-Tag-Affinitätschromatographie erfolgreich gereinigt und ein Molekulargewicht von ca. 2 MDa über Größenausschlusschromatographie bestimmt. Damit nicht nur ein Vergleich mit dem MLL- sondern auch mit dem AF4-Wildtyp- Proteinkomplex möglich war, wurden ebenfalls eine Größenbestimmung und eine Reinigung des AF4-Proteinkomplexes durchgeführt. Die folgenden Analysen der Komplexkomposition über Immunopräzipitationen, Western Blot-Analysen sowie massenspektrometrische Analysen zeigten, dass sich der AF4•MLL-Proteinkomplex aus Mitgliedern der beiden Wildtyp-Proteinkomplexe zusammensetzt; es wurden P-TEFb, HEXIM1, NFKB1, NPM1, DDX6 und das AF4-Wildtypprotein aus dem AF4-Komplex sowie ASH2L, RBBP5, WDR5, CREBBP, HCF-1 und HCF-2 aus dem MLL-Komplex nachgewiesen. Auf diese Weise werden im AF4•MLL-Proteinkomplex Eigenschaften bzw. Funktionen beider Wildtyp-Proteinkomplexe kombiniert. Um einen weiteren Hinweis auf die Funktion zu erhalten, wurde ergänzend ein in vitro Histon-Methyltransferase-Assay etabliert, der für beide gereinigten Proteinkomplexe eine Histonmethyltransferase-Aktivität zeigte. Basierend auf den vorliegenden Daten kann eine Konkurrenzsituation zwischen dem AF4•MLL-Proteinkomplex und den beiden Wildtyp-Proteinkomplexen um die entsprechenden Faktoren angenommen werden, welche die Assemblierung vollständiger und funktioneller Wildtyp-Proteinkomplexe verhindern könnte. Des Weiteren weisen die Ergebnisse auf Funktionen des AF4•MLL-Proteins in transkriptionellen Prozessen, Histonacetylierungen sowie der H3K4-Trimethylierung hin. Die Fehlregulation epigenetischer und transkriptioneller Prozesse durch die Anwesenheit des AF4•MLL-Proteinkomplexes spielt somit vermutlich eine entscheidende Rolle im pathomolekularen Mechanismus der t(4;11) Translokation.
Die benigne Prostatahyperplasie (BPH) bezeichnet die häufigste organische Obstruktion durch gutartiges Wachstum der Prostata, resultierend aus der Proliferation von sowohl stromalen als auch epithelialen Zellen in der Transitionalzone der Prostata. Die Prävalenz der ursächlich noch weitgehend ungeklärten, benignen Prostatahyperplasie steigt mit zunehmendem Alter kontinuierlich an, so dass in der 6. Lebensdekade etwa 50 Prozent und in der 9. Lebensdekade circa 90 Prozent der Männer bioptisch histologische Zeichen einer BPH zeigen. Die chronisch progressive Erkrankung, die bei Männern mit BPH entsteht, wird als benignes Prostatasyndrom (BPS) bezeichnet und durch die variable Ausprägung von Prostatavergrößerung, Symptomen des unteren Harntrakts (LUTS) und Blasenauslassobstruktion (BOO) charakterisiert. Eine symptomatische, behandlungsbedürftige BPH äußert sich üblicherweise durch irritative als auch durch obstruktive Symptome. Eine mögliche medikamentöse Therapie der symptomatischen BPH besteht in der Gabe von α-Blockern, die durch Blockade der prostatischen α-Adrenozeptoren zu einer Relaxierung der glatten Muskulatur der Prostata führen und somit sowohl irritative als auch obstruktive Symptome reduzieren. Im Rahmen der vorliegenden Arbeit wurde auf der Basis einer selektiven Literaturrecherche und einer per Email durchgeführten Befragung von Professor Caine die Einführung der α-Blocker in die urologische Therapie beschrieben. Die Einführung des ersten α-Blockers, Phenoxybenzamin, in die urologische Therapie ist im Wesentlichen der Pionierarbeit von Doktor Marco Caine et al. zu verdanken, die Anfang der 70er Jahre die pharmakologischen Rezeptoren im unteren Harntrakt von Tieren und etwa 1973 in der menschlichen Prostata bestimmten. Aus der Erkenntnis, dass sich menschliches Prostatagewebe durch Behandlung mit Norepinephrin kontrahierte, Vorbehandlung mit Phentolamin diese Kontraktion inhibierte und folglich der α-Adrenozeptor Mediator der Kontraktion der glatten Prostatamuskulatur sein musste, entwickelte Caine das „Konzept der zwei Komponenten“, nämlich einer statischen, mechanischen Komponente infolge der durch die vergrößerte Prostata bedingten, anatomischen Obstruktion und einer überlagerten, dynamischen Komponente, die, verursacht durch den Tonus der glatten Prostatamuskulatur, je nach Ausmaß der adrenergen Aktivität im Körper, variierte. Er folgerte, durch pharmakologische Blockade der prostatischen α-Adrenozeptoren eine Verringerung der dynamischen Komponente und infolgedessen eine Besserung der Symptome erreichen zu können. Es gelang ihm 1976 seine Hypothese zu bestätigen und in einer placebo-kontrollierten, 1978 publizierten Studie die klinische Effizienz einer Therapie mit Phenoxybenzamin nachzuweisen. In einer 1981 veröffentlichten in-vitro Studie konnte er auch für Prazosin, den ersten selektiven α1-Antagonisten, einen blockierenden Effekt auf die α-Rezeptoren im menschlichen Prostatagewebe demonstrieren. Mitte der 80er Jahre publizierte Caine erste Studienergebnisse, die den Nachweis einer funktionellen Dominanz prostatischer α1-Rezeptoren in der Vermittlung der Kontraktion der glatten Prostatamuskulatur erbrachten. Unabhängig davon identifizierten Doktor Herbert Lepor und Kollegen in ihren zur Charakterisierung von α1- und α2-Adrenozeptoren der menschlichen Prostata mit Hilfe von Radioligand-Rezeptor-Bindungsmethoden realisierten, 1984-1987 publizierten, innovativen Studien den α1-Adrenozeptor als den Mediator der Kontraktion der Prostatamuskulatur. Diese Erkenntnisse bildeten die wissenschaftliche Basis für die Anwendung von α1-Adrenozeptor-Antagonisten wie Terazosin und Doxazosin in der medikamentösen Therapie der BPH. In intensiven Langzeit-Studien konnte Lepors Forschungsgruppe Mitte der 90er Jahre die gute Wirksamkeit und Verträglichkeit von Terazosin nachweisen und Anfang des 21. Jahrhunderts den Nutzen einer Kombinationstherapie von Doxazosin mit einem 5α-Reduktase-Inhibitor wie Finasterid demonstrieren. Ferner erkannten Lepor et al. circa 1993 den dominanten α1a-Adrenozeptor-Subtyp als den Mediator der Muskelkontraktion der menschlichen Prostata und lokalisierten ihn durch Autoradiographie und Immunhistochemie im Stroma der Prostata. Dieser Nachweis forcierte die Erforschung subtyp-selektiver α1a-Blocker wie Tamsulosin, für den Lepor et al. in placebo-kontrollierten, doppelblinden Studien der späten 90er Jahre eine gute Langzeit-Wirksamkeit und Verträglichkeit ohne die für nicht subtypselektive α-Blocker typischen, blutdrucksenkenden Effekte belegen konnten, was dazu beigetragen hat, dass sich die Therapie der symptomatischen BPH mit Tamsulosin zu einem bis heute genutzten Goldstandard entwickelt hat.
Im Rahmen der vorliegenden Arbeit wurde anhand der Auswertung von persönlichen Fragebögen von TTP-Patienten und deren behandelnder Ärzte und der Sichtung stationärer und ambulanter Krankenakten der Krankheitsverlauf bei 67 TTP-Patienten zwischen 1982 und August 2004 retrospektiv untersucht. Neben der Beschreibung der wichtigsten klinischen Symptome und Begleiterkrankungen, möglicher Triggerfaktoren, dem Rezidivverhalten und der diversen Therapieverfahren wurden die Patienten hinsichtlich ihres Geschlechts gesondert betrachtet, da der weibliche Patientenanteil den männlichen deutlich übertrifft. Des Weiteren wurden die Patienten hinsichtlich ihres Rezidivverhaltens getrennt untersucht, da es in vielen Fällen noch immer unklar ist, wann und ob Rezidive auftreten. Das Verhältnis zwischen Frauen und Männern betrug annährend 3 : 1 und entspricht somit vielen aktuellen Literaturangaben. Der Median des Alters bei Erstmanifestation betrug insgesamt 35,0 Jahre (n=67), die insgesamt 49 weiblichen Patienten waren 31,0 Jahre alt (Median) und der Median des Alters der 18 männlichen Patienten betrug 47,0 Jahre. Dieser doch sehr große Altersunterschied zum Zeitpunkt der Erstmanifestation liegt höchstwahrscheinlich an hormonellen Einflüssen (Kontrazeptiva, Schwangerschaft), denen Frauen im gebärfähigen Alter ausgesetzt sind. Im Vergleich der Rezidivpatienten mit den Nicht-Rezidivpatienten zeigt sich einerseits eine deutliche Häufung der Erstmanifestation bei Rezidivpatienten in früheren Lebensabschnitten in beiden Geschlechtern und andererseits in beiden Gruppen ein höheres Manifestationsalter bei den männlichen TTP-Patienten. Auch bei diesen Beobachtungen könnten die bereits erwähnten hormonellen Einflüsse dafür verantwortlich gemacht werden. Der Median des Body-Mass-Index als Parameter des Ernährungszustandes betrug 25,9 (n=63). Bei den 46 weiblichen Patienten war der Median des BMI 26,0 und bei den 17 männlichen Patienten ergab sich ein Median von 25,6. Verglichen mit Daten der deutschen Normalbevölkerung kann in dieser Arbeit von einer geringfügig höheren präadipösen Patientengruppe ausgegangen werden. Inwieweit dies tatsächlich als Risikofaktor einzuschätzen ist, muss Gegenstand von Studien mit größeren Patientenzahlen sein. Im direkten Vergleich der Rezidivpatienten und der Patienten ohne Rezidiv zeigt sich eine erhöhter BMI bei Rezidivpatienten. Inwieweit eine vorbestehende Adipositas prädisponierend für eine TTP wirkt, müsste auch hier Gegenstand von Studien mit größeren Patientenzahlen sein. Unter den in dieser Arbeit untersuchten Triggerfaktoren konnten nur wenige Medikamente tatsächlich als Auslösefaktoren für eine TTP identifiziert werden. Darunter befanden sich Ticlopidin und Chinin. Andere genannte Medikamente konnten trotz intensiver Literaturrecherche nicht mit dem Auftreten einer TTP in Zusammenhang gebracht werden, zumal die Einnahme der Präparate nur bei jeweils einer Person erfolgte, und somit keine validen Aussagen getroffen werden können. Hier sollten Studien mit größeren Patientenzahlen folgen. Entzündliche Erkrankungen konnten, wie auch in der Literatur beschrieben, in dieser Arbeit als potentielle Triggerfaktoren gezeigt werden. Mehr als die Hälfte der untersuchten Patienten wiesen entweder einen grippalen oder gastrointestinalen Infekt auf. Eine weitere auffallende Triggerfaktorengruppe stellten östrogen- und/oder gestagenhaltige Hormonpräparate da, welche von 38,8% (19/49) der weiblichen Patienten angewandt wurden. Es konnte auch eine Assoziation von TTP mit dem Auftreten einer Schwangerschaft gesehen werden. Somit konnten bei insgesamt 53,1% der befragten Frauen (26/49) hormonelle Regulationsmechanismen als potentielle Auslösefaktoren verantwortlich gemacht werden. Im direkten Vergleich von Rezidivpatienten und Patienten ohne Rezidiv konnten keine relevanten Unterschiede hinsichtlich bestimmter Triggerfaktoren festgestellt werden. In dem untersuchten Patientenkollektiv wiesen 76,1% der Personen (51/67) eine neurologische Symptomatik auf. Es dominierten Cephalgie, Parästhesien, Paresen und Sprachstörungen bei den genannten Symptomen. Hinsichtlich der geschlechtsspezifischen Verteilung traten zum Teil unterschiedliche Verteilungsmuster auf, Ursachen hierfür konnten aufgrund der geringen Patientenzahl und der zum Teil retrospektiven Datenerhebung nicht festgestellt werden. Auch bei dem Vergleich der Rezidivpatientengruppe und der Gruppe der Nicht-Rezidivpatienten traten keine relevanten Unterschiede auf. Sonstige häufig gefundene Symptome waren Petechien, Hämatome, diverse Blutungserscheinungen (z.B. Epistaxis, Hypermenorrhoe oder Zahnfleischblutungen) und Allgemeinsymptome wie Blässe, Müdigkeit und Fieber. Auch hier fanden sich keine relevanten Unterschiede hinsichtlich der geschlechtsspezifischen Verteilung oder der Verteilung auf Rezidivpatienten und Patienten ohne Rezidiv. Als bestehende Grund- oder Begleiterkrankungen konnten als potentielle prädisponierende Faktoren bestehende Autoimmunerkrankungen, insbesondere ein SLE, diverse maligne Erkrankungen, eine gesteigerte Infektneigung und evt. eine bestehende Adipositas gesehen werden. Geschlechtsspezifische Unterschiede fanden wir nicht. Hinsichtlich der Differenzierung zwischen Rezidivpatienten und Nicht-Rezidivpatienten konnte eine gesteigerte Infekt- und Allergieneigung bei Patienten der letzteren Gruppe festgestellt werden. Des Weiteren traten maligne Erkrankungen in der Rezidivpatientengruppe häufiger auf. Bei Erstmanifestation betrieben 55,2% der Patienten (37/67) einen Nikotinabusus, und übertrafen somit deutlich den Anteil der rauchenden deutschen Gesamtbevölkerung. Ob das Rauchverhalten mit einem Auftreten einer TTP in Zusammenhang gebracht werden kann sollte Gegenstand von weiteren Untersuchungen sein. Geschlechtsspezifische Unterschiede fanden sich nicht. Rezidivpatienten hatten einen höheren Nikotinabusus als Nicht-Rezidivpatienten. Ein Zusammenhang zwischen Alkoholgenuss und TTP konnten in dem untersuchten Patientenkollektiv nicht gesehen werden, wobei Menge und Art des Alkohols in unserer Studie nicht genau differenziert wurden. Alle 67 Patienten dieser Arbeit erhielten FFP, 64 von 67 wurden mit eine Plasmapherese und 3 von 67 nur mit Plasmainfusion behandelt. Die Verträglichkeit der Plasmasubstitution war bei 91,0% der Patienten gut. Es gab keine nennenswerten Komplikationen. Die Katheter- / Shuntunverträglichkeit war bei ca. 75% der Patienten komplikationslos. Insgesamt erhielten 59,7% der Personen additiv Glucocorticoide. Immunsuppressiva wie z.B. Vincristin, Rituximab und Andere wurden bei insgesamt 46,3% der Befragten (31/67) angewandt. Weitere Therapieoptionen wurden nur bei einer sehr kleinen Patientenzahl angewandt, daher ergaben sich keine relevanten unterschiedlichen Untersuchungsbefunde. Hinsichtlich Geschlecht und Rezidivverhalten fanden sich keine größeren Unterschiede. 7,5% der befragten Patienten (5/67) litten an einer hereditären Form der TTP. Auffällig war, dass beide männliche Patienten relativ früh an TTP erkrankten, wohingegen die weiblichen Patienten deutlich später ihre Erstmanifestation erlitten. Es gab bezüglich der Triggerfaktoren, der Symptome, der Grundleiden, der Therapie und anderer Vergleiche keine Unterschiede zum restlichen Patientenkollektiv Die Rezidivhäufigkeit lag in dem befragten Patientenkollektiv bei 64,2% (43/67). Es fanden sich keine geschlechtsspezifischen Unterschiede. Die Mehrzahl der Patienten erlitten ein oder zwei Rezidive. Es zeigte sich in dieser Arbeit, dass Männer evt. zu mehr Rezidiven neigen. Von den 67 befragten Patienten konnten insgesamt 54 Fälle aufgrund einer ausreichend guten Dokumentation zur Untersuchung der rezidivfreien Intervalle herangezogen werden. Zwischen den TTP-Episoden lagen mindestens 4 Wochen, um eine Exazerbation der Erkrankung ausschließen zu können. Es blieben von dem untersuchten Patientengut 44,4 % (24/54) rezidivfrei. Der Median der Frauen mit 19 Monaten und der Median der Männer mit 26 Monaten unterschieden sich deutlich. Auch die Intervalle waren verschieden. Bei den weiblichen Patienten existierte eine deutlich längere Spannweite zwischen den einzelnen Rezidiven als bei den männlichen Patienten.
T-Lymphozyten spielen eine entscheidende Rolle in der Pathophysiologie der Rheumatoiden Arthritis. Sie fördern einerseits die perpetuierende Entzündung innerhalb der Membran und besitzen andererseits die Fähigkeit auf die Inflammationen regulativ bzw. suppressiv zu wirken. In der hier vorliegenden Arbeit wurde untersucht, ob entzündungsfördernde T-Zellprodukte und regulatorische T-Zellpopulationen innerhalb der Synovialmembran nachweisbar sind, und wie unstimulierte periphere TZellen auf Synovialmembranzellen "in vitro" reagieren. Innerhalb der Synovialmembran konnte eine Population von CD4(+)CD25(+) regulatorischen T-Zellen (Tregs) durchflusszytometrisch nachgewiesen werden. Immunhistochemische Analysen des Gewebes konnten eine Akkumulation dieser Zellen innerhalb von Sekundärfollikeln des Synovialmembrans nachweisen. Die ELISPOT-Analyse ausgewählter Zytokine resultierte in der Detektion immunsuppressiver (IL-10) und immunstimulatorischer Zytokine in Synovialmembranzellkultur. Hier konnte erstmalig eine autologe IFN-gamma Produktion auf Proteinebene nachgewiesen werden. Klinische Betrachtungen der IFN-gamma Produktion zeigten eine starke Assoziation mit dem Rheumafaktor. Zusätzlich findet sich eine tendenzielle Abnahme der immunstimulatorischen Kapazität mit der Dauer der Erkrankung. Eine Betrachtung der intrasynovialen IL-10 Produktion unter Berücksichtigung des klinischen Entzündungsparameter CRP, zeigt einen starken Zusammenhang zwischen den beiden Parametern. ELISPOT Analysen einer Co-Kultur zwischen autologen CD4(+) und CD8(+) PBMCs und Synovialmembranzellen ergaben eine Abnahme der autologen IFN-gamma Produktion ohne Zunahme der Interleukin- 10 Produktion. Eine Aktivierung der Zellkultur lässt diesen Effekt verschwinden. Durch Aufreinigung der PBMCs konnte der stärkste suppressive Effekt innerhalb der CD4(+)CD25(+) T-Zellfraktion nachgewiesen werden, welcher marginal durch Aktivierung der Zellkultur unterbrochen werden konnte. Regulatorische Effekte konnten auch innerhalb der CD8(+) T-Zellfraktion dokumentiert werden, welche sich aber durch spezifische anti-CD3 Ab und anti-CD28 Ab Aktivierung verliert. Die Beeinflussung der suppressiven Eigenschaften von T-Zellen bzw. ihrer spezialisierten T-Zellpopulationen könnte in Zukunft zu einer besseren Therapie der Rheumatoiden Arthritis führen.
Brustkrebs repräsentiert die häufigste Krebserkrankung bei Frauen. Der Estrogen Rezeptor α (ERα) ist hier als ein wichtiger prognostischer Marker für Mammakarzinome etabliert, der die Homonsensitivität des Tumors determiniert. Dieser impliziert den Einsatz von Anti-Estrogenen, die die wachstumsfördenden Funktionen von ERα blockieren können. Übergewicht erhöht deutlich das Risiko einer Brustkrebserkrankung bei postmenopausalen Frauen. Übergewicht geht generell mit einem erhöhten Serumleptinspiegel einher. Das Zytokinhormon Leptin ist ein zentraler humoraler Faktor bei der Wahrnehmung und Steuerung der körpereigenen Energiereserven im Gehirn, das darüber hinaus auch pleiotrope Funktionen in der Angiogenese, Hämatopoese, Reproduktion und im Immunsystem ausübt. Leptin bindet an den Transmembranrezeptor Ob-RL (Obese-Rezeptor, lange Isoform) und aktiviert unter anderem den Januskinase (Jak)- „signal transducer and activator of transcription“ (Stat)-Signalweg, der mit neoplastischen Veränderungen assoziiert ist. Weil der kausale Zusammenhang zwischen Übergewicht und Krebserkrankungen gut belegt ist, während die molekularen Mechanismen jedoch noch nicht vollständig aufgeklärt sind, sollte daher in der vorliegenden Arbeit die mögliche Wechselwirkung des leptininduzierten Jak-Stat-Signalwegs und des ERα´s untersucht werden. Ein Zusammenspiel der Ob-RL- und ERα-abhängigen Signalwege wurde einerseits mit Luziferase-Reporter-Konstrukten untersucht, die unter der Kontrolle eines Stat3-responsiven Elements standen. Dabei konnten zelltyp-spezifsche Unterschiede in der leptinabhängigen Stat3-Aktivierung beobachtet werden. Die endogen ERα-exprimierenden Brustkrebszellen MCF-7 wiesen eine wesentlich stärkere Stat3-Aktiverung und Phosphorylierung nach Leptinapplikation auf, als ERα-negative HeLa Zervixkarzinomzellen oder die Brustkrebslinie MDA-MB-231. Dieser Effekt konnte durch die Hemmung der ERα-Expression mittels siRNA in MCF-7 Zellen revertiert werden. Die ERα Überexpression in HeLa Zellen resultierte in einer verstärkten Stat3-Transaktiverung nach Leptinbehandlung. Diese Zunahme in der Stat3-Aktivierung konnte nicht durch eine Kostimulation der Zellen mit einem ERα-Agonisten oder Antagonisten beeinflusstwerden. Weiterhin konnte eine gesteigerte Zellviabilität nach Leptinstimulation in ERα-positiven Zellen detektiert werden. Durch Koimmunpräzipitationsstudien konnte direkte Interaktion von ERα, Jak2 und Stat3 nachgewiesen werden, was auf einen zytoplasmatisch lokalisierten Komplex hindeutet. Eine Mikroarray-Analyse von leptinstimulierten Zellen ergab eine differentielle Regulation von 133 Genen in Abhängigkeit ihres ERα-Expressionstatus. Von den 133 Zielgene sind 42 in der Literatur bereits in Zusammenhang mit malignem Wachstum beschrieben und könnten somit die erhöhte Viabilität der ERα-exprimierenden Zellen in Reaktion auf Leptin erklären. Die in dieser Arbeit gewonnen Erkenntnisse deuten auf eine entscheidende Rolle des ERα´s in der Verstärkung der leptininduzierten Stat3-Aktiverung hin. Diese Daten zur Interaktion von ERα mit einem wachstumsfördernden Signalweg können zur Entwicklung neuartiger Behandlungsmöglichkeiten in der Brustkrebstherapie von übergewichtigen Patientinnen beitragen.
Neurosphären-bildende Zellen mit dem Potential zur Selbsterneuerung, sowie zur vielseitigen Differenzierung, wurden bereits aus diversen peripheren und zentralen Geweben isoliert. Auch von der Neuralleiste abstammende NCSCs wurden in verschiedenen embryonalen und adulten, peripheren Geweben im Nager-Modell identifiziert und als Neurosphären (NS) kultiviert. In der vorliegenden Arbeit konnten nun erstmals auch aus Zellen des peripheren Nervensystems von Huhn-Embryonen NS gebildet werden. Zudem wurde das Selbsterneuerungspotential der NS-bildenden Zellen analysiert und über 10 Passagen, beziehungsweise mehrere Monate hinweg quantifiziert. Durch eine selektive Isolierung O4-positiver Gliazellen aus Huhn DRGs, konnte der Anteil NS-generierender Zellen gegenüber unsortierten DRG-Zellen signifikant erhöht werden. Aufgrund dieser Beobachtung können im Gewebe verbliebener NCSCs als Ursprung NS-generierender Zellen ausgeschlossen werden. Die von Gliazellen abstammenden NS-Zellen wurden im Weiteren auf ihr Entwicklungspotential hin untersucht. Sowohl über Antikörperfärbungen, als auch auf Nukleinsäurebasis in RT-PCR-Analysen, konnte für die NS-Zellen ein oligopotentes Differenzierungspotential nachgewiesen werden. Auch in klonalen NS-Kulturen wurde die Differenzierung zu Neuronen, Gliazellen und Melanozyte bestätigt. Aufgrund des Selbsterneuerungspotentials, sowie des oligopotenten Entwicklungspotentials O4-sortierter NS-generierender Zellen, wurden die in dieser Arbeit identifizierten und charakterisierten NS-bildende Zellen GDSCs (glial-derived stem cells) benannt. Die im Huhn-Modell beschriebenen NS-bildenden PNS-Zellen wurden anschließend auch im Nager-Modell nachgewiesen. NS-generierende Zellen sind in prä- und postnatalen Maus-DRGs vorhanden und zeigen ein Selbsterneuerungspotential, das für Stammzellen charakteristisch ist. In Zusammenarbeit mit Dr. Verdon Taylor (Freiburg) konnten die aus DRGs von transgenen EGFP-Mäusen gewonnene NS-Zellen in utero in die Hirnventrikel von E10.5 Mausembryonen injiziert werden. Die implantierten, grünfluoreszierenden Zellen wurden noch 5 Monate nach dem Eingriff in großer Zahl im Hirngewebe nachgewiesen und konnten als Neurone, Astrozyten und OLPs/Oligodendrozyten identifiziert werden. Die Entstehung neuraler ZNS-Zelltypen beruht hierbei vermutlich auf einer Änderung der regionalen Identität der Zellen durch die NS-Kultivierung. Obwohl sich einige implantierte Zellen auch 5 Monate nach dem Eingriff noch im Zellzyklus befanden, konnte in keinem der analysierten Gehirne hyperplastisches Gewebe oder tumorassoziiertes Wachstum beobachtet werden. Die in dieser Arbeit nachgewiesene Möglichkeit NS-bildende Zellen aus dem PNS zu gewinnen und durch eine selektive Sortierung für O4-positive Gliazellen zusätzlich anzureichern, stellt einen wichtigen Schritt in Richtung gezielter Generation diverser neuronaler und glialer Subtypen des peripheren Nervensystems dar. Zusammen mit der durch die Neurosphären-Kultivierung erzielten Änderung der regionalen Identität muriner NS-Zellen, könnte diese Arbeit außerdem einen wichtigen Grundstein für weiterführende Arbeiten in Richtung Stammzell-Therapien, z.B. in Multiple-Sklerose-Modellen darstellen.
Die vorliegende Arbeit befasste sich in erster Linie mit der Regulation des P2X2 Rezeptors (P2X2R) durch Phosphoinositide (PI). P2X Rezeptoren sind durch extrazelluläres ATP aktivierte Kationenkanäle, die ubiquitär unter Vertebraten, v. a. im zentralen wie peripheren Nervensystem exprimiert werden. Bis heute sind 7 verschiedene Untereinheiten dieser Rezeptorfamilie bekannt, die nach homo- oder heterotrimerer Assemblierung unterschiedliche funktionelle Phänotypen ausbilden. Die P2X Rezeptoren sind an einer Vielzahl von physiologischen und pathophysiologischen Prozessen beteiligt. Für ihre Beteiligung am zellulären Signalgeschehen wurde in der Vergangenheit der Begriff der purinergen Signaltransduktion geprägt. PI4,5P2 ist ein zelluläres, an der Innenseite der Plasmamembran verankertes Phospholipid, dem zahlreiche, essentielle Funktionen zukommen. Dass es auch Signalfunktion besitzen kann, wurde erst spät (1980) bekannt; dass es darüber hinaus zudem membranäre Transportsysteme reguliert, konnte erst in den letzten Jahren gezeigt werden. Die ersten Kanäle, für die eine Phosphoniositid (PI)-Beeinflussung nachgewiesen wurde, waren die einwärts gleichrichtenden K+-Kanäle. 2006 wurden die ersten vorläufigen Hinweise publiziert, dass auch die Kanalfunktion der P2X Rezeptoren durch Phosphoinositide beeinflusst werden kann. Darauf aufbauend wurde in der vorliegenden Arbeit der P2X2R nach Expression in Xenopus Oozyten elektrophysiologisch auf eine mögliche Regulation durch PIPns untersucht. Um die in der Oozyte vorliegenden PI-Level gezielt während der Messung ändern zu können, wurde die spannungsgesteuerte Phosphoinositid-Phosphatase Ci-VSP coexprimiert. Ci-VSP, die der PTEN-Phosphatase strukturell sehr ähnlich ist, wurde 2005 aus der Schlauchascidie Ciona intestinalis kloniert. In der veröffentlichten Klonierungsarbeit wurde bereits gezeigt, dass Ci-VSP in der Lage ist, bekannte PI4,5P2-sensitive Membrankanäle, wie z. B. bestimmte K+-Kanäle, spannungsabhängig zu inhibieren. Es konnte in TEVC-Experimenten gezeigt werden, dass die durch Depolarisation induzierte Aktivierung dieser Phosphatase den P2X2 Rezeptorstrom in seiner Desensibilisierung sowohl beschleunigt als auch verstärkt. Dieser Effekt war spannungsabhängig und nahm mit höherer Depolarisation zu. Die ermittelte Spannungsabhängigkeit stimmte dabei mit dem sensitiven Potentialbereich der spannungsgesteuerten Ci-VSP-Domäne, gemessen an ihren gating-Strömen, überein. Der „Ci-VSP-Effekt“ auf den P2X Rezeptor konnte nur in Anwesenheit von ATP, d.h. bei aktiviertem Rezeptor, beobachtet werden. Wurden die Oozyten mit Wortmannin, einem PI4-Kinase(PI4K)-Inhibitor, behandelt, zeigte sich eine vergleichbare Veränderung des Rezeptorstroms. Eine PI4K-Inhibition zielt demnach offensichtlich auf die gleichen Regulationsmechanismen wie die Ci-VSP-Aktivierung. In weiterführenden zellfreien Patch Clamp-Messungen an Oozytenmembranen wurden sowohl Einzelkanal- als auch makroskopische Ströme des P2X2R unter Einfluss verschiedener, intrazellulär verabreichter PIs und PI-beeinflussender Enzyme untersucht. Einzig die Zugabe von PI4,5P2 hatte einen deutlich aktivierenden Einfluss auf den makroskopischen Rezeptorstrom, andere getestete PIs (wie auch PI3-Kinase und PTEN-Phosphatase) zeigten keinerlei Wirkung. Vergleichbare Ergebnisse konnten in vorläufigen Einzelkanal-Messungen an diesem Rezeptor Subtyp beobachtet werden. Da die PI4-Kinase offensichtlich an der beobachteten Beeinflussung der P2X2R Desensibilisierung beteiligt ist, wurde die P2X2-Rezeptorsequenz auf potentielle - über sogenannte SH3-Epitope vermittelte - PI4K-Interaktionsbereiche hin untersucht. Diese SH3-Epitope kommen in vielen zellulären Proteinen vor, um Protein-Protein-Interaktionen zu vermitteln. Nach Sequenzanalyse des maßgeblich am Desensibilisierungsgeschehen beteiligten C-Terminus des P2X2R konnte im distalen Teil ein SH3-Bindungsmotiv lokalisiert werden, das daraufhin durch gerichtete Mutagenese (P2X2-P451A/P454A) unwirksam gemacht wurde. Dieser mutierte Rezeptor verhielt sich in seiner Desensibilisierung wie der Wildtyp nach Wortmannin-Behandlung, zeigte also eine intrinsisch verstärkte Desensibilisierung. Eine Wortmannin-Behandlung der Oozyten, die den mutierten Rezeptor exprimierten, führte hingegen zu keiner weiteren Beeinflussung des Rezeptorstroms. Somit konnte letztlich der Schluss gezogen werden, dass die PI4K, und das mit ihr in direkter Verbindung stehende PI4,5P2, einen maßgeblichen Einfluss auf das Desensibilisierungsverhalten des P2X2R hat. Auf Basis der erarbeiteten Befunde wurde ein kinetisches Reaktionsmodell des P2X2R erstellt, das bisher aufgestellte Modelle mit den Ergebnissen dieser Arbeit vereint, aber auch in teilweisem Gegensatz zu dem von FUJIWARA & KUBO [2006] steht. Des Weiteren wurde im Verlauf dieser Arbeit die reversible Inhibition des P2X2R durch eine Reihe von Aminoglykosid-Antibiotika untersucht. Durch Analyse der Dosis-Wirkungs-Beziehungen, der Spannungs- sowie wie ATP-Konzentrations-Abhängigkeit der Inhibition konnte gezeigt werden, dass es sich dabei um einen nicht-kompetitiven open pore block handelte. Durch weiterführende Untersuchungen an einer nicht-desensibilisierenden P2X2/1 Rezeptorchimäre wurde gezeigt, dass eine Aminoglykosid-Inhibition die ATP-Dissoziation von der Rezeptorbindungsstelle signifikant verlangsamte. Dieser Befund deutet auf eine im Vergleich zum geschlossenen Zustand erhöhte Affinität des offenen Zustands für ATP hin. Neben den hier untersuchten Aminglykosiden sind bislang keine weiteren Substanzklassen bekannt, die den P2X2R durch einen derartigen Mechanismus hemmen.
Die mechanischen Belastungen auf die einzelnen Implantatkomponenten sind durch die Zunahme von implantatgetragenen Einzelzahnversorgungen gestiegen. Die Erforschung von effizienten Implantat-Abutment-Verbindungen (IAV) gewinnt daher stetig an Bedeutung. Die Rotationssicherung des Abutments im Implantat, insbesondere unter exzentrisch einwirkender Kaukraft, stellt dabei einen möglichen Schwerpunkt dar. Viele Implantathersteller propagieren die Rotationssicherheit bzw. -stabilität der von ihnen produzierten Implantat-Abutment-Verbindungen. Veröffentlichungen zu diesem Forschungs-schwerpunkt liegen dagegen nur im geringen Maße vor. Daher sollte die vorliegende Arbeit zu diesem Aspekt einen Beitrag leisten. Zur Bewertung des Verhaltens von Implantat-Abutment-Verbindungen bezüglich ihrer Rotationsfestigkeit bei zentrischer und exzentrischer Belastung wurden 17 handelsübliche Implantatsysteme in die vorliegende Versuchsreihe einbezogen. Die Implantatsysteme werden nach ihrer Verbindungsgeometrie in konische, Stoß- und andersartige Verbindungen unterschieden. Insgesamt wurden sieben konische (Ankylos®, Astra Tech®, Bego®, ITI Straumann® Bone Level, ITI Straumann® Massiv Abutment, Nobel Biocare™ Nobel Active, Osstem Co. Ltd.), sechs Stoß- (Bredent medical, Camlog®, Nobel Biocare™ Replace Select, SICace® 4.0, SICace® 5.0 und Xive® S plus) und vier andersartige (Heraeus IQ:Nect®, ITI Straumann® synOcta® (Fräszylinder mit Oktagon), ITI Straumann® synOcta® (Fräszylinder ohne Oktagon)) Verbindungen getestet. Für jedes System sind fünf Prüfkörper hergestellt worden, um den bleibenden Versatz zwischen dem Implantat und dem Abutment bei insgesamt acht Kraftstufen zwischen 25N-200N zu ermitteln. Jeder der 85 Prüfkörper wurden mit speziell angefertigten Edelstahlrohren versehen. Auf diese Rohre wurde Reflektoren aus Kunststoff aufgebracht. Die Kaufunktion ist dabei mit einem zweidimensionalen Kausimulator imitiert worden. Der „Frankfurter Kausimulator“ wurde speziell für die Testung von Implantat-Abutment-Verbindungen konstruiert und gebaut. Die Simulation des exzentrischen Kraftvektors wurde durch das Verschieben von Krafteinleitungsstäben (KES) in der Horizontalebene simuliert. An die Zahnbreite (in mesiodistaler Richtung) eines menschlichen Prämolars angelehnt, ist eine Verschiebung der Krafteinleitungsstäbe bis maximal 3,5mm jeweils zu jeder Seite vorgenommen worden. Zwei Laserwegsensoren erfassten die Positionsänderung der Reflektoren. Insgesamt fanden pro Reflektor zwei Messungen statt. Die erste Messung erfolgte vor der Belastung, wohingegen die zweite Messung nach der Belastung vorgenommen wurde. Die Differenz beider Messungen ergab so den zurückgelegten Weg der Reflektoren. Daraus lässt sich dann der Winkel α ermitteln und durch Anwendung einer trigonometrischen Formel der bleibende Versatz in Grad bestimmen. Nach statistischer Auswertung der gewonnen Daten stellte sich heraus, dass die giebelförmige Implantat-Abutment-Verbindung des BPI®-Implantatsystems aus der Gruppe der andersartigen Verbindungen den kleinsten bleibenden Versatz (0,047°) zwischen dem Implantat und dem Abutment zeigte. Die konischen Implantat-Abutment-Verbindungen zeigten zwar einen größeren bleibenden Versatz (0,05°-0,373°), konnten sich dennoch von der schraubenlosen Verbindung des Heraeus IQ:Nect®-Systems (0,46°) und den Stoßverbindungen (0,471°-0,99°) abheben. Bei zwei Verbindungen (ITI Straumann® synOcta® (Fräszylinder mit Oktagon) und das ITI Straumann® synOcta® (Fräszylinder ohne Oktagon)) aus der Gruppe der andersartigen Implantat-Abutment-Verbindungen kam es bei allen Prüfkörpern zu einer Lockerung der Aufbauteile. Die Ergebnisse der Rotationsfestigkeit für die in dieser Untersuchung geprüften Implantat-Abutment-Verbindungen liegen innerhalb der von Binon 1996 formulierten Stabilitätsrichtwerte von bis zu 5° Rotationsfreiheit an der Implantat-Abutment-Verbindung. In der Publikation von Binon aus dem Jahre 1996 konnten bei genauerer Betrachtung aus methodischen Gründen Rotationsveränderungen erst ab einem Wert von 1,94° gemessen werden. Somit könnte eine Erklärung für den von Binon angegebenen Richtwert einer komplikationslosen Rotation von 2º, welche eine zusätzliche Stabilisierung des "screw joint" bewirke, vorliegen. Ein Fokus der Implantathersteller liegt seither auf der Weiterentwicklung der Konstruktionsprinzipien und Fertigungs-möglichkeiten für Implantat-Abutment-Verbindungen und implantatgetragenen Suprastrukturen. Eine rotationsfreie Verbindung scheint nach den Ergebnissen dieser Untersuchung dennoch bis heute nicht erreicht. Die geometrische Ausgestaltung des Implantat-Abutment-Komplexes ist für das Ausmaß des bleibenden Versatzes einer der entscheidenden Einflussgrößen. Der Konus als Grundgeometrie wirkt einem Verdrehen des Abutments effizienter entgegen als horizontal gefügte Flächen. Schlussfolgernd könnte, auch anhand der ermittelten Ergebnisse sowie nach weiterführenden Forschungen, in Betracht gezogen werden, dass die von Binon 1996 formulierten Richtwerte heute nicht mehr bindend sind.
Um die Bedeutung bestimmter Neurone oder Klassen von Neuronen innerhalb von Nervensystemen zu untersuchen, sind Methoden, die eine Manipulation der Aktivität der Neurone in vivo erlauben, besonders nützlich. Die bisher zur Verfügung stehenden Methoden haben jedoch Einschränkungen in beispielsweise der Zelltypspezifität, der zeitlichen Präzision, der Reversibilität oder der Anwendbarkeit in frei beweglichen Tieren. Im Rahmen dieser Arbeit wurden optogenetische, d.h. auf der Expression lichtempfindlicher Proteine basierende Methoden entwickelt, um eine präzise Manipulation des Membranpotentials definierter Neurone durch Licht zu ermöglichen. Die Techniken wurden daraufhin zur Untersuchung z.B. der Neurotransmission sowie der Funktion kleiner Netzwerke im Nervensystem des Nematoden Caenorhabditis elegans verwendet. Die zelltypspezifische heterologe Expression des lichtgesteuerten Kationenkanals Channelrhodopsin-2 (ChR2) aus der Grünalge Chlamydomonas reinhardtii ermöglichte es, Muskel- oder Nervenzellen der Nematoden durch blaue Beleuchtung innerhalb weniger Millisekunden zu depolarisieren. Dadurch ließen sich spezifische Verhaltensweisen in frei beweglichen Tieren auslösen. Dieser Ansatz wird in Zukunft die Untersuchung der Bedeutung einzelner Neurone innerhalb ihrer Schaltkreise deutlich erleichtern. So konnte hier gezeigt werden, dass die Photostimulation des propriorezeptiven Neurons DVA eine signifikante Erhöhung der mittleren Körperbiegungswinkel während der sinusförmigen Fortbewegung der Tiere zur Folge hatte. Außerdem wurde versucht, die Anwendbarkeit von ChR2 durch die gezielte Manipulation der subzellulären Lokalisation mittels Fusion mit speziellen Peptiden oder Proteinen zu erhöhen. Des Weiteren wurde eine zur Verwendung von ChR2 analoge Methode zur Hemmung von Neuronen durch Licht entwickelt. Hierfür wurde die lichtgetriebene Cl--Pumpe Halorhodopsin aus Natronomonas pharaonis (NpHR) zelltypspezifisch in C. elegans exprimiert. Durch Photoaktivierung von NpHR mit gelbem Licht war es möglich, Muskelzellen und cholinerge Neurone zu hyperpolarisieren und somit in ihrer Aktivität zu hemmen. Dies führte in frei beweglichen Tieren zu einer augenblicklichen Paralyse verbunden mit einer drastischen Reduktion der Schwimmfrequenz und einer Erhöhung der Körperlänge. Die Aktionsspektren von ChR2 und NpHR sind unterschiedlich genug, um eine unabhängige Photoaktivierung der beiden Proteine mit blauem und gelbem Licht zu ermöglichen. Dadurch konnte die Aktivität von Muskelzellen und cholinergen Neuronen nach Koexpression der beiden Proteine bidirektional kontrolliert werden. Es wurden somit Methoden entwickelt, die in vivo eine zeitlich äußerst präzise Manipulation des Membranpotentials definierter Neurone mit Licht verschiedener Wellenlängen ermöglichen. Die Beobachtung der dadurch induzierten Verhaltensänderungen erlaubt es, zuverlässige Aussagen über die Bedeutung einer Nervenzelle für die Ausprägung eines Verhaltens zu treffen und wird die Erforschung der Nervensysteme von C. elegans und anderen Modellorganismen deutlich vereinfachen. Schließlich wurden in dieser Arbeit optogenetische Methoden zur Untersuchung der synaptischen Übertragung an neuromuskulären Synapsen (neuromuscular junctions, NMJs) von C. elegans entwickelt. Hierfür wurde ChR2 in GABAergen oder cholinergen Neuronen exprimiert, um eine lichtgesteuerte Freisetzung des inhibitorischen Neurotransmitters GABA bzw. des exzitatorischen Neurotransmitters Acetylcholin (ACh) an NMJs zu erreichen. Die Methode wurde OptIoN getauft, ein Akronym für „Optogenetic Investigation of Neurotransmission“, also „optogenetische Untersuchung der Neurotransmission“. Die GABA-Freisetzung hatte ähnlich wie die NpHR-vermittelte Photoinhibition von Muskelzellen eine Reduktion der Schwimmfrequenz und Erhöhung der Körperlänge zur Folge. Die Ausschüttung von ACh verursachte hingegen starke Muskelkontraktionen verbunden mit einer Reduktion der Körperlänge. Die Änderungen der Körperlänge waren bei Mutanten mit verschiedenen Neurotransmissionsdefekten signifikant unterschiedlich im Vergleich zum Wildtyp. Außerdem kam es während längerer Beleuchtungsphasen in Mutanten mit defektem Recycling der synaptischen Vesikel (SV) zu einer verstärkten Abnahme der lichtinduzierten Effekte. OptIoN ermöglicht es dadurch erstmals, die Mechanismen des SV-Recyclings in C. elegans Verhaltensexperimenten zu untersuchen. In elektrophysiologischen Messungen ließen sich durch kurze Lichtpulse wiederholt und mit hoher Frequenz Neurotransmitter-spezifische postsynaptische Ströme evozieren. Diese Ströme waren in Mutanten mit gestörter SVExozytose reduziert und gingen bei wiederholter Stimulation in Mutanten mit defektem SVRecycling schneller zurück. Die Verwendung von OptIoN erleichtert die elektrophysiologische Untersuchung neuronaler Defekte und stellt erstmals eine Möglichkeit dar, Vorgänge der neuronalen Plastizität in dem genetischen Modellsystem C. elegans zu untersuchen. Das Potential von OptIoN zeigte sich unter anderem auch in der Identifizierung eines neuen, über metabotrope GABA-Rezeptoruntereinheiten vermittelten Mechanismus zur heterosynaptischen Hemmung cholinerger Neurone.
Ein bekanntes Beispiel für regulatorische RNA-Protein-Wechselwirkung stellt der Komplex der TAR-RNA von HIV-1 und dem viralen Protein Tat dar. Dieser Komplex ist wichtig für die effiziente Transkription des viralen Genoms. Essentiell für die Erkennung der Stem-Loop Struktur ist die Wechselwirkung des Tat-Proteins mit dem aus drei Nukleotiden bestehenden Bulge der TAR-RNA. Das Wissen über die Prinzipien der Erkennung von Tat zu TAR-RNA sollte es möglich machen, spezifische Liganden zu designen, die als antivirale Tat Antagonisten angreifen können. Das Ziel dieser Arbeit war die Synthese von RNA Liganden für die Festphasenpeptidsynthese (FPPS) basierend auf heteroaromatischen Bausteinen. Als Strategie wurde gewählt, die heteroaromatischen Reste über Amid-Bindungen an ein Fmoc geschütztes (2-Aminoethyl)glycin-Rückgrat einzufügen. Die peptidomimetischen Bausteine X konnten in der FPPS zur Synthese von Tripeptiden mit der allgemeinen Struktur Arg-X-Arg und Modifikationen mit Lysin eingesetzt werden. Die Bindungsaffinitäten der Tripeptide und kleinen Moleküle zur TAR-RNA von HIV-1 wurden über einen fluoreszenzbasierten Assay bestimmt. Der Assay verwendet ein doppelt endmarkiertes Tat-Peptid mit Fluorescein und Rhodamin als Farbstoff. Durch Verdrängung des Tat-Peptides durch einen konkurrierenden Liganden kommt es zur Konformationsänderung des Peptides, die zur Löschung der Lichtemmission führt. Dabei zeigen die Tripeptide H2N-(D)Arg-Lactam-(D)Arg-CONH2 (154) und H2N-(D)Arg-Amidin-(D)Arg-CONH2 (158) IC50-Werte von 2-3 mikroM, die auch durch Fluoreszenz Korrelations Spektroskopie (FCS) bestätigt wurden. In massenspektrometrischen Untersuchungen von 158 bzw. Tat-Protein mit TAR-RNA konnten bei beiden Peptiden 1:1 und 1:2-Komplexe beobachtet werden. 158 zeigt antivirale Eigenschaften (IC50 = 10-50 mikroM) in HeLa P4-Zellassays. Durch NMR-Untersuchungen und molekulardynamische Berechnungen war es möglich, eine Konformationsänderung der TAR-RNA durch eine Wechselwirkung mit Guanidinium-Gruppen festzustellen. Ein weiteres Ziel der Arbeit war daher ausgehend von den gewonnenen Daten die Untersuchung des Bindungskonzeptes von Diaminopyrazolen und Indazolen. Diaminopyrazole mit kleinen Resten und Triaminopyrazol übertreffen im protonierten Zustand den dikationischen Liganden Argininamid. In Übereinstimmung mit dem Bindungsmodell verhalten sich protonierte Aminopyrazole wie „Super-Guanidine“ hinsichtlich der TAR-RNA. Das Einfügen des Triaminopyrazols in ein Phenazin-Grundgerüst führt zu Verbindungen, die im protonierten und reduzierten Zustand zusätzliche Wasserstoffbrückenbindungen eingehen können und nicht planar, aber lipophil sind. Der Austausch von Stickstoff zu Sauerstoff im Phenazinring sollte den reduzierten Zustand stabilisieren. Die resultierende Struktur ist jedoch zersetzlich, so dass auf weitere Untersuchungen verzichtet wurde.
Es war das Ziel dieser Untersuchung, die Güte der Behandlung im Stammzelltransplantationszentrum Frankfurt a.M. zu eruieren. Besonderer Wert wurde auf die Analyse von Infektionen und TRM gelegt. Dabei sollten zwei Zeiträume miteinander verglichen werden. Es wurde gefunden, dass trotz Zunahme des Risikoprofils der Patienten sowie der Schwere der Erkrankungen im Zeitraum II die Inzidenz der Infektionen sowie die Rate an TRM stabil blieb. Die bei der Auswertung der Daten aufgetretenen Schwierigkeiten hinsichtlich der Erfassung der Daten und hinsichtlich der Vielfalt der erhobenen Daten zeigte uns, dass es eventuell sinnvoll ist, eine Studie mit ähnlichen Endpunkten anhand verschiedener, definierter Patientenkollektive zu erheben. Leider ist es nicht möglich gewesen, unser Patientenkollektiv zum Beispiel nach Erkrankungen zu separieren, weil die Fallzahlen für die Erkrankungen zu gering gewesen wären. Desweiteren war ja das Ziel der Studie, alle Patienten einzubinden und ein repräsentatives Bild der Transplantationen in Frankfurt am Main zu schauen. Wir haben in unserer Studie den Riskscore angewandt, um die Effizienz herauszufinden. Wir konnten zeigen, dass der Riskscore durch ein objektiviertes Verfahren eine realistische Einschätzung der Komplikationen und Überlebenswahrscheinlichkeiten bietet und in Zukunft für alle zu transplantierenden Patienten zur Risikostratifizierung eingesetzt werden sollte. Anhand des geschätzen Risikos lässt sich zum Beispiel das Verfahren der Konditionierung (intensivere Chemotherapie), des Monitorings oder der zusätzlichen Behandlungsmöglichkeiten (Prophylaxe,DLI, Immunmodulatoren) ändern. Außerdem erleichtert der Riskscore die Vergleichbarkeit mit anderen Studien.
Die mitochondriale Atmungskette und insbesondere die Cytochrom c Oxidase als deren terminales Enzym sind essentiell für den Energiestoffwechsel eukaryotischer Zellen. Die Assemblierung der mitochondrialen Cytochrom c Oxidase mit ihren bis zu 13 Untereinheiten ist noch nicht bis ins Detail aufgeklärt, aber es handelt sich um einen geordneten, stark regulierten Prozess, und Defekte der Assemblierung sind häufig Ursache für neurodegenerative und myopathische Erkrankungen. In Eukaryoten sind bisher mehr als 30 Proteine identifiziert worden, die an der Biogenese der Cytochrom c Oxidase beteiligt sind, darunter Surf1. Beim Menschen führt der Verlust von Surf1 zu einer letalen neurodegenerativen, als Leigh-Syndrom bezeichneten Krankheit, wobei die genaue Rolle von Surf1 bei der Assemblierung der Cytochrom c Oxidase unklar ist. Das Bodenbakteriums Paracoccus denitrificans kann als Modellorganismus für die mitochondriale Atmungskette dienen, da seine aeroben Atmungskettenkomplexe eine deutliche Homologie zu denen der Mitochondrien auf weisen. P. dentrificans besitzt zwei homologe Gene für Surf1, die in Operons mit terminalen Oxidasen assoziiert sind: surf1c ist im cta-Operon lokalisiert, das für Untereinheiten der aa3-Cytochrom c Oxidase kodiert, und surf1q im qox-Operon, das die Gene für die ba3-Ubichinoloxidase enthält. Vorrangiges Ziel dieser Arbeit war es, diese beiden Gene und ihre Translationsprodukte zu charakterisieren und auf ihre Funktion hin zu untersuchen. Chromosomale Einzel- und Doppeldeletionen beider surf1-Gene führten zu einem spezifischen Aktivitätsverlust der jeweiligen Oxidase in Membranen, wobei surf1c und surf1q unabhängig von einander für ihre korrespondierenden Oxidasen zuständig sind und keine überlappenden Funktionen besitzen. Dies war der erste experimentelle Hinweis, dass ein Surf1-Protein auch bei der Assemblierung einer Chinoloxidase eine Rolle spielt. Untersuchungen an aufgereinigter aa3-Cytochrom c Oxidase ergaben, dass der Hämgehalt im Fall der surf1c-Deletion stark vermindert ist. Diese Ergebnisse bestätigten frühere Vermutungen, dass Surf1 eine Rolle beim Häm-Einbau in UEI spielt. Diese Arbeit untersuchte zum ersten Mal aufgereinigtes Surf1-Protein und lieferte mit der Charakterisierung weitere Hinweise auf seine Rolle beim Häm a-Einbau in terminale Oxidasen. So konnte gezeigt werden, dass sowohl Surf1c und als auch Surf1q Häm a in vivo binden. Mit Hilfe spektroskopischer Methoden und der isothermen Titrationskalorimetrie konnte die Bindung von Häm a an apo-Surf1c und Apo-Surf1q quantifiziert werden. Beide Proteine binden Häm a mit submikromolaren Affinitäten in einer 1:1 Stöchiometrie. Ligandenbindungspektren wiesen weiterhin darauf hin, dass das Eisenatom des Häm a in Surf1 nur über fünf Liganden koordiniert ist. Über gerichtete Mutagenese konnte der konservierte Histidinrest His193 für Surf1c und His202 für Surf1q als möglicher fünfter Ligand des Eisenatoms identifiziert werden. Untersuchungen zur Wechselwirkung mit anderen Proteinen zeigten eine direkte Interaktion zwischen der Häm a Synthase und den beiden Surf1-Proteinen in vivo und in vitro, die zuvor noch für kein anderes Surf1-Homolog beschrieben war. Zusätzlich konnte ein Transfer von Häm von der Häm a Synthase auf Surf1c bzw. Surf1q in vitro erreicht werden. Für Surf1c ließ sich außerdem eine Interaktion mit Untereinheit I der Cytochrom c Oxidase nachweisen. Obwohl die Funktion von Surf1 im Rahmen der Biogenese der Cytochrom c Oxidase noch nicht abschließend geklärt werden konnte, liefern die Ergebnisse dieser Arbeit nichtsdestotrotz klare Hinweise auf eine direkte Beteiligung von Surf1 beim Einbau der Häm a-Kofaktoren, und ein neues Modell für die Funktion von Surf1 konnte erstellt werden.
Die vorliegende Arbeit beschäftigt sich mit den Auswirkungen von Feldenkrais-Bewegungsübungen auf ein Klientel, dass aus freien Stücken an Feldenkraiskursen eines niedergelassenen Feldenkraislehrers teilnimmt, wobei insbesondere gesundheitliche und psychosomatische Aspekte betrachtet werden. Feldenkrais formulierte die theoretischen Grundlagen der Methodik auf einem breiten wissenschaftlichen Fundament verschiedener Fachrichtungen, wie Medizin, Neurobiologie, Psychologie, Physik, Systemtheorie und Anthropologie und lieferte damit eine Erklärung, wie die von ihm entwickelte Bewegungsmethodik Ein uss auf die Entwicklung und die Lernfähigkeit eines jeden Individuums nehmen kann. Der Mensch wird dabei, im Gegensatz zur dualistischen Sichtweise, die in der klassischen Schulmedizin vorherrscht, als ein Ganzes gesehen, in dem die Bereiche Körper und Seele nicht zu trennen sind. Die moderne Neurobiologie bestätigt mit der Anwendung neuer Messmethoden, wie dem funktionellen Magnetresonanztomogramm bedeutende Aussagen der Theorie von Feldenkrais. Systemtheorie und Konstruktivismus sind dabei grundlegend für den feldenkrais'schen Denkansatz und für die heutige Psychosomatik, wie sie unter anderem von von Uexküll beschrieben wird. Der Mensch wird hier als autopoietisches System betrachtet, welches sich selbst ständig reguliert. Somit kann er sich wechselnden Umweltein flüssen anpassen und ist zur Selbstheilung fähig, worin Feldenkraislehrer, respektive Psychotherapeuten ihn unterstützen können. Zunehmend suchen Menschen zur Förderung der persönlichen Weiterentwicklung, wie gleichzeitig zur Bewältigung gesundheitlicher und insbesondere psychosomatischer Probleme Feldenkraiskurse auf. Vor diesem Hintergrund wurden in der Praxis eines niedergelassenen Feldenkraislehrers die Kursteilnehmer vor- und direkt nach der Teilnahme an zehn Feldenkraisstunden, sowie im Langzeitverlauf zu den Auswirkungen befragt. Die 82 erwachsenen Probanden der Studie waren zu 2/3 weiblich, bei einem Durchschnittsalter von 46 Jahren. Die Stichprobe glich in ihrem psychosomatischen Beschwerdestatus der durchschnittlichen Allgemeinbevölkerung, wohingegen ein überdurchschnittlich hohes Schulbildungs- und Berufsausbildungsniveau vorlag. Die Motivation der Kursteilnehmer lag gleichermaßen im Wunsch, die Fähigkeit der Körperwahrnehmung und die Beweglichkeit zu steigern, wie verschiedene Beschwerden und Erkrankungen zu verbessern. Anhand zweier standardisierter psychometrischer Fragebögen, dem Giessener Beschwerdebogen und der Symptom-Checkliste SCL-90-R konnte eine signifikante Verbesserung psychosomatischer und somit gesundheitlicher Beschwerden direkt nach dem Kurs, wie auch im Langzeitverlauf ein halbes Jahr nach Kursende beschrieben werden. Dazu zählen im Einzelnen Gliederschmerzen, Herzbeschwerden, Somatisierungstendenz, Zwanghaftigkeit, Depressivität, Aggressivität und die grundsätzliche psychische Belastung. Mithilfe des neu entwickelten Selbsteinschätzungsfragebogens des Verfassers ergaben sich weitere Hinweise auf die positiven Langzeitauswirkungen nicht nur im seelischen Bereich, sondern in weiteren zentralen Bereichen menschlichen Handelns, namentlich dem Wahrnehmungsbereich, dem kognitiven Bereich und der Beweglichkeit. Die Verbesserungen betrafen mehrere Lebensbereiche, den privaten, wie auch den beruflichen Bereich. Die Sicherheit der Feldenkraismethode gegenüber dem Auftreten unerwünschter Nebenwirkungen wurde ebenfalls dokumentiert. Anhand kontrollierter randomisierter Folgestudien sollten die Ergebnisse abgesichert werden. Der kreative Wissensaustausch von Neurobiologen mit moderner Messtechnik und wissenschaftlich arbeitenden Feldenkraislehrern, die zur Entwicklung spezieller Messmethodik einen Beitrag leisten können, kann zu neuen Erkenntnissen auf den Gebieten des Lernverhaltens, der Reifung und der Gesundheit des Menschen führen.
In dieser Arbeit sollte die Bindung von Tetrahydromethanopterinderivaten an zwei Enzyme des methanogenen, CO2-reduzierenden Energiestoffwechselweges strukturell charakterisiert werden. In jenem Stoffwechselweg verläuft die schrittweise Reduktion von CO2 über die Bindung an den C1-Carrier Tetrahydromethanopterin (H4MPT), ein Tetrahydrofolat-Analogon, welches unter anderem in methanogenen Archaeen zu finden ist. Die thermophilen bzw. hyperthermophilen Ursprungsorganismen der untersuchten Enzyme, Methanothermobacter marburgensis, Methanocaldococcus jannaschii und Methanopyrus kandleri, sind aufgrund ihrer Anpassung an extreme Habitate durch spezielle genomische, strukturelle und enzymatische Eigenschaften von strukturbiologischem Interesse. Beim ersten in dieser Arbeit untersuchten Enzym handelte es sich um den aus acht Untereinheiten bestehenden membrangebundenen N5-Methyl-H4MPT:Coenzym M-Methyltransferasekomplex (MtrA-H). Dieser katalysiert in einem zweistufigen Mechanismus den Methyltransfer von H4MPT zum Co(I) der prosthetischen Gruppe 5’-Hydroxybenzimidazolylcobamid (Vitamin B12a), um die Methylgruppe dann auf Coenzym M zu übertragen. Gleichzeitig findet ein der Energiekonservierung dienender vektorieller Natriumtransport über die Membran statt. Für den Mtr-Komplex aus M. marburgensis (670 kDa) lag bereits ein Protokoll zur Reinigung unter anaeroben Bedingungen vor. Dieses wurde im Rahmen dieser Arbeit verbessert, für die Isolierung und Reinigung unter aeroben Bedingungen vereinfacht und für die Erfordernisse der zur Strukturbestimmung verwendeten elektronenmikroskopischen Einzelpartikelmessung optimiert. Neben der Präparation des kompletten Komplexes MtrA-H wurde als Alternative die Präparation des Enzymkomplexes MtrA-G unter möglichst vollständiger Abtrennung der hydrophilsten Untereinheit MtrH gewählt. Mit der zu diesem Zweck entwickelten Methode konnte das Abdissoziieren von MtrH besser als im etablierten Protokoll kontrolliert und somit die Homogenität der Probe deutlich verbessert werden. Dies schafft zum einen die Vorraussetzungen für eine Kristallisation zur Röntgenstrukturanalyse, zum anderen war auch in bei der elektronenmikroskopischen Einzelpartikelmessung erkennbar, dass mit dem Mtr-Komplex ohne MtrH bessere Ergebnisse zu erzielen sind. Parallel zu den Untersuchungen am Gesamtkomplex sollten die den Cobamid-Cofaktor bindende Untereinheit MtrA sowie die H4MPT-bindende Untereinheit MtrH in für die Kristallisation und röntgenkristallographische Untersuchung ausreichender Menge und Qualität gereinigt werden. Hierfür wurden MtrA und MtrH aus oben genannten Organismen für die heterologe Expression in E. coli kloniert, die Expressionsbedingungen optimiert und Reinigungsprotokolle etabliert. Anschließend wurden die Untereinheiten umfangreichen Kristallisationsversuchen unterzogen. Die Untereinheit MtrA aus M. jannaschii konnte ohne die C-terminale Transmembranhelix als lösliches Protein in E. coli produziert und als Holoprotein bis zur Homogenität gereinigt werden. Bei M. kandleri MtrA gelang die Herstellung von geringen Mengen teilweise löslichen StrepII-Fusionsproteins ohne C-terminale Transmembranhelix in E. coli. Eine Produktion der Untereinheit MtrH in E. coli als lösliches Protein war bei keiner der in dieser Arbeit getesteten Varianten möglich. Mit dem in Einschlusskörperchen exprimierten Protein aus M. marburgensis wurde eine Reinigung und Rückfaltung versucht. Auch eine Co-Expression der Untereinheiten MtrA und MtrH, durch welche eine bessere Faltung und Löslichkeit erreicht werden sollte, war nur in Einschlusskörperchen möglich. Das zweite in dieser Arbeit untersuchte Enzym, die F420 abhängige N5,N10 Methylen-H4MPT-Dehydrogenase (Mtd), katalysiert den reversiblen, stereospezifischen Hydrid-Transfer zwischen reduziertem F420 (F420H2) und Methenyl-H4MPT+, welches hierbei zu Methylen-H4MPT reduziert wird. Die Reaktion verläuft über einen ternären Komplex bestehend aus Protein, Substrat (Methylen-H4MPT) und Cosubstrat (F420), welcher strukturell charakterisiert werden sollte. Das gereinigte, rekombinante Enzym aus M. kandleri wurde mit verschiedenen H4MPT- und F420-Derivaten co-kristallisiert, die Struktur des ternären Komplexes röntgenkristallographisch bestimmt und die Bindung von H4MPT und F420 analysiert. Methenyl-H4MPT+ und F420H2 sind in der in dieser Arbeit gelösten Kristallstruktur in katalytisch aktiver Konformation gebunden, jedoch kann bei einer Auflösung von 1,8 Å nicht beurteilt werden, ob Methylen-H4MPT und F420 oder Methenyl-H4MPT+ und F420H2 vorlagen. Ein Vergleich mit der Struktur von M. kandleri-Mtd (KMtd) ohne Substrat und Cosubstrat ergab nur äußerst geringe Abweichungen in der Proteinkonformation, sodass sich KMtd überraschenderweise als Beispiel für ein Enzym mit ungewöhnlich starrer, vorgegebener Bindetasche erwies.
Das photoneuroendokrine System der Vertebraten steuert die rhythmische Melatoninsynthese. Melatonin ist ein wichtiges Signal für circadiane und saisonale Rhythmen und für die Synchronisation der Föten mit dem mütterlichen Organismus. Bei Säugetieren besteht das photoneuroendokrine System aus den folgenden Komponenten: der Retina für die circadiane Lichtperzeption, dem endogenen Rhythmusgenerator im Nucleus suprachiasmaticus (SCN) und dem Pinealorgan als neuroendokrinem Effektor. Dieses System vermittelt, durch die nächtliche Abgabe des Hormons Melatonin vom Pinealorgan, Änderungen in den Belichtungsverhältnissen der Umgebung an den Körper. Bei der Synthese von Melatonin im Pinealorgan ist die Arylalkylamin Nacetyltransferase (AANAT) das geschwindigkeitsbestimmende Enzym. Die nächtlich erhöhte Expression von Aanat in Pinealozyten wird vor allem durch die Freisetzung des Neurotransmitter NA aus sympathischen Nervenendigungen angetrieben. NA bindet an adrenerge Rezeptoren in der Pinealozytenmembran und aktiviert den cAMP-Signaltransduktionsweg, der zur CRE-vermittelten gesteigerten Aanat Expression führt. In der Promoterregion von Aanat ist auch ein E-box Promoterelement vorhanden, das durch Uhrenproteine angesteuert werden kann. Bislang jedoch war die Rolle des molekularen Uhrwerkes für die Expression von Aanat noch unklar. Um zu untersuchen, wie sich eine Schwächung des negativen Regulatorkomplexes auf die Expression von Aanat im Pinealorgan und in anderen Geweben auswirkt, wurden Mäuse mit gezielter Deletion des Per1 Gen (Per1 KO) untersucht. Die Expression von Aanat im Pinealorgan von Per1 KO Mäusen, die in der Standardphotoperiode gehalten wurden, zeigte einen circadianen Rhythmus mit ähnlicher Dynamik, aber erhöhter Amplitude im Vergleich zum WT. AANAT Enzymaktivität und Melatoninkonzentration folgen dem gleichen Profil. Eine Verkürzung der Photoperiode hat bei Per1 KO Mäusen starke Auswirkungen auf dieendogene Periodenlänge der Aanat Expression, die sich gegenüber dem WT drastisch verlängert. Bei einer Verlängerung der Photoperiode kommt es zu einer Verzögerung im Rhythmus der Aanat Expression von ca. 8 h gegenüber dem WT. Dies zeigt, dass das molekulare Uhrwerk je nach Photoperiode Amplitude, Periodenlänge und Phasenlage modulieren kann. Um zu untersuchen, ob es sich dabei um Pinealorgan-intrinsische Effekte handelt, wurden in vitro Experimente durchgeführt. Im WT-Pinealorgan gibt es zum Zeitpunkt CT18 ein Sensitivitätsfenster für die NA-induzierte Aanat Expression. Überraschenderweise steigt die Aanat Expression im unstimulierten Per1 KO Pinealorgan in der Nacht signifikant gegenüber dem subjektiven Tag an. Eine weitere Induktion durch NA ist nicht möglich. Dies deutet darauf hin, dass ein abgeschwächter negativer Regulator Komplex (NRC), welcher über das E-box Element wirkt, dieselben Auswirkungen in der Per1 KO Maus hat, wie eine NA-Stimulation im WT. Im WT wird der inhibitorische Effekt des NRC offenbar durch die NA-abhängige Aktivierung von CRE überwunden. Untersuchung zur ektopischen Expression von Aanat zeigten, dass dieses Gen in der Hypophyse einen cicadianen Rhythmus aufweist, der unabhängig von einem intakten molekularen Uhrwerk abläuft. Im Gegensatz dazu findet sich in der Milz von Per1 KO Mäusen eine verstärkte Aanat Expression am subjektiven Tag im Vergleich zum WT. Offenbar hat das molekulare Uhrwerk auch einen Einfluss auf die Gewebespezifität der Aanat Expression. Weiterhin wurde in dieser Arbeit die ontogenetische Entwicklung des molekularen Uhrwerkes im SCN von Melatoninrezeptor1 und 2 defizienten (MT1,2 -/-) Mäusen untersucht. Im Gegensatz zu Mäusen mit intakten Melatoninrezeptoren, zeigen diese Mäuse im Fötalstadium noch keinen Rhythmus in der Anzahl mPER1- und mPER2-Ir Zellen. In diesem Stadium sind die einzelnen SCN-Neurone noch kaum durch Synapsen miteinander gekoppelt. Dies deutet darauf hin, dass das mütterliche Melatonin die rhythmischen Uhrengenexpression in den einzelnen fötalen SCN-Zellen synchronisiert. Erst im juvenilen SCN ist ein Rhythmus der Uhrenproteine identisch mit dem adulten Tier. Zu diesem Stadium sind die intrasuprachiasmatischen Kontakte vermutlich schon soweit ausgebildet, dass kein rhythmisches Eingangssignal für die Synchronisation der SCN-Zellen notwendig ist.
In Anbetracht der Bedeutung einer Metastasierung eines Mamma- Karzinoms in Hinblick auf Therapie und Prognose der Patientin ist es von Bedeutung, möglichst sensitive und spezifische Methoden zum frühzeitigen Nachweis von Metastasen anzuwenden. Nach wie vor stehen diesbezüglich radiologische Verfahren an erster Stelle, sind jedoch mit einer Reihe von Nachteilen behaftet. Aufgrund dieser Tatsache wurden in einer Vielzahl von Studien eine Reihe von Knochenmarkern bezüglich ihrer Aussagekraft beim metastasierten Mamma- Karzinom untersucht. Der Knochenmarker Prokollagen Typ I aminoterminales Propeptid wird im Rahmen der Kollagensynthese beim Knochenaufbau freigesetzt und erlaubt somit Rückschlüsse auf den Knochenstoffwechsel. Inwieweit die Werte von Prokollagen Typ I aminoterminales Propeptid einen veränderten Knochenstoffwechsel beim metastasierten Mamma- Karzinom repräsentieren, war Ziel dieser Studie. Zu diesem Zweck wurden die Serum Proben von 80 Patientinnen mit Mamma- Ca untersucht. Die Bestimmung der Werte für den Knochenmarker Prokollagen Typ I aminoterminales Propeptid erfolgte mit Hilfe des ElektroChemiLumineszenz Immuno Assay „ECLIA“ von Roche Diagnostics. Um die Aussagekraft des Markers weiter zu bestimmen, erfolgte eine Unterteilung des Patientenkollektivs in Patientinnen prä- und postmenopausal. Die Werte für Prokollagen Typ I aminoterminales Propeptid wurden nun bezüglich ihrer Relation zum Ausmaß der Metastasierung weiter untersucht. Im Rahmen dieser Studie konnte ein Zusammenhang zwischen der Höhe der Prokollagen Typ I aminoterminales Propetid Werte und einer Knochenmetastasierung aufgezeigt werden. Dennoch scheint der Knochenmarker Prokollagen Typ I aminoterminales Propeptid aufgrund unterlegener Spezifität und Sensitivität nicht geeignet, herkömmliche Methoden zum Nachweis von Knochenmetastasen zu ersetzen. Es ist jedoch denkbar, die Bestimmung von Prokollagen Typ I aminoterminales Propeptid als zusätzliche Methode zur Einschätzung und Überwachung der Entwicklung von Knochenmetastasen einzusetzen.
Das Ziel dieser Arbeit ist die Synthese von nicht-kovalenten supramolekularen Komplexen, um nachfolgend aus den Kristallstrukturen dieser Verbindungen bessere Einsichten über die H-Brückenwechselwirkungen zwischen den organischen Molekülen zu erlangen. Um an dieses Ziel zu kommen, wurde ein Konzept zur gezielten Synthese von supramolekularen Komplexen entwickelt. Die Steuerung des Co-Kristallisationsprozesses ist keine einfache Aufgabe, deshalb darf der Verlauf einer solchen Synthese von nicht-kovalenten Verbindungen nicht einfach dem Zufall überlassen werden. Der Start erfolgt mit einer gründlichen Auswahl der Verbindungen durch Intuition mit Hilfsmitteln (Chemikalienkataloge und chemische Datenbanken). In einem Selektionsabschnitt werden chemische Datenbanken, analytische Methoden und rechnergestützte Programme zu Hilfe genommen. Aussichtsreiche Kandidaten werden mit dem Programm SUPRA getestet; so zeigt sich, ob das gewünschte H-Brückenmuster prinzipiell realisierbar ist. Auch die verschiedenen Vorproben zum Test auf H-Brücken gebundene Komplexe (siehe Kapitel 8 und 9) liefern wertvolle Informationen. Mit den so ausgewählten Kandidaten wurden schließlich Kristallisationsversuche angesetzt. Falls möglich können Strukturvorhersagen der jeweiligen Komplexe mit Hilfe von Strukturvorhersageprogrammen getroffen werden (siehe Kapitel 7). Die erhaltenen Co-Kristalle werden anschließend am Einkristalldiffraktometer gemessen und darauf folgend die Kristallstrukturen gelöst. Um die Reaktionsbedingungen zur Bildung von bestimmten supramolekularen Komplexen kontrollieren zu können, wurden die Gitterenergie des Komplexes berechnet und die Schmelzpunkte bestimmt. Mit Kenntnis der Gitterenergie des Komplexes, der Edukte bzw. der Pseudokomplexe kann die Reaktionsbedingung so eingestellt werden, dass nur eine bestimmte Verbindung bei einer vorgegebenen Reaktionsbedingung auskristallisiert. Der Einfluss bzw. die Auswahl von Lösungsmitteln darf bei Co-Kristallisationsprozessen nicht vernachlässigt werden. Der erste Abschnitt dieser Arbeit befasst sich mit der Synthese von supramolekularen Komplexen aus Komponenten, die ausschließlich zwei Protonen-Akzeptoren bzw. zwei Protonen-Donoren (AA-DD-Muster) beinhalten. Die fehlgeschlagenen Experimenten passen zur Trefferquote dieser Verbindungsklasse in der CSD. Der Grund für diesen Misserfolg ist grundsätzlich auf die geometrische Anordnung der freien Elektronenpaare der Akzeptoren zurückzuführen. Sind Sauerstoffatome an solchen H-Brückenmustern als H-Akzeptoren beteiligt, ist es oft nicht möglich, eine lineare Anordnung der H-Donorengruppe mit diesen Sauerstoffatomen als Akzeptoren zu bewerkstelligen. Nach erfolglosen Bemühungen wandten wir uns Verbindungen zu, die mindestens drei Akzeptoren bzw. Donoren im jeweiligen Molekül aufweisen. Für dieses Experiment wurden zunächst starre, kleine organische Moleküle ausgesucht. Das AAA-DDD-Muster konnte im gesamten Verlauf dieser Arbeit nicht hergestellt werden. Es ist nicht leicht, eine Verbindung zu synthetisieren, bei der alle H-Akzeptorgruppen auf einer Seite benachbart angeordnet sind. Eine Literaturaussage, dass Verbindungen mit dem AAA-DDD-Muster die stabilsten aller dreifach gebildeten Wasserstoffbrückenbindungen sind, konnte daher nicht experimentell verifiziert werden. Unsere Gruppe hat daraufhin versucht, die bekannten H-Brückenmuster aus den Watson-Crick-Basenpaarungen (AAD-DDA) sowie das ADA-DAD-Muster nachzuahmen. Nur mit dem Muster ADA-DAD konnten Erfolge erzielt werden. Die entsprechenden Komplexe konnten nicht nur erfolgreich synthetisiert, sondern auch durch die Einführung sterisch anspruchsvoller Substituenten die Bildung von unerwünschten Wasserstoffbrückenmustern gezielt verhindert werden. Nachdem die Synthese von zahlreichen Komplexen gelang, sind wir zu pharmazeutischen Wirkstoffen übergegangen. Mit diesem Schritt soll eine Brücke zur Pharmazie geschlagen werden. Vier pharmazeutische Wirkstoffe mit definiertem Wasserstoffbrückenmuster wurden ausgesucht und anschließend mit den passenden Gegenstücken zur Kristallisation angesetzt. Nur für Trimethoprim konnten Co-Kristalle erhalten werden. Mit diesem Wirkstoff konnte anschließend gezeigt werden, wie sich Moleküle in bestimmten chemischen Umgebungen im Festkörper anpassen und ihre geometrische Anordnung ändern, um die bestmöglichen Wechselwirkungen zu erreichen. Sämtliche Kristallstrukturen von Trimethoprim, die in der CSD in neutraler Form aufzufinden sind, demonstrieren, wie flexibel diese Verbindung in Abhängigkeit von der Umgebung ihre Konformation ändert. In dieser Arbeit konnte auch gezeigt werden, wie Kristallisationsbedingungen verändert werden sollten, um den gewünschten Komplex herstellen zu können. Die Schmelzpunktbestimmung sowie die Kombination mit der Gitterenergie dienten dazu, für die gegebenen Verbindungen die passenden Bedingungen für den Kristallisationsprozess zu ermitteln. Die Schmelztemperaturen von drei in der Struktur ähnlichen Komplexen liegen jeweils zwischen den Schmelztemperaturen ihrer Ausgangsverbindungen, was zu der Annahme verleitet, dass bei höheren Temperaturen die Verbindungen mit höheren Schmelztemperaturen und somit stabileren Kristallgittern bevorzugt gebildet werden. Wird die Temperatur gesenkt, so könnten alle Formen von Kristallen (die der Edukte, Pseudokomplexe und der supramolekularen Komplexe) in einer einzigen Probe anfallen. Um die Gültigkeit dieser Annahme zu überprüfen, bedarf es der Durchführung von Pulveraufnahmen der gesamten Proben. Diese konnten aufgrund der geringen Mengen an Kristallsubstanz nicht realisiert werden. In Zukunft wird das Augenmerk besonders auf die Erforschung von supramolekularen Komplexen mit anspruchsvolleren Freiheitsgraden gelegt. Diese Komplexe sollen mehrere Rotationsfreiheitsgrade besitzen bzw. aus mehr als vier H-Brücken komplementär zusammengesetzt sein. Darüber hinaus ist unsere Gruppe immer noch bemüht, Komplexe zu co-kristallisieren, die am Ende die Muster bzw. die Konstellationen aufweisen, die von vornherein konzeptionell ausgearbeitet wurden.
Protein S-100B als Serummarker der zerebralen Schädigung bei pädiatrischen Schädel-Hirn-Verletzungen
(2009)
Protein S-100 ist ein Calcium-bindendes Protein, das die Aktivität seiner Zielproteine moduliert. Der Aufgabenbereich umfasst die Regulation von Zellwachstum und Zellstrukturbildung. Entdeckt wurde es im Jahre 1965 von B.W. Moore, der es erstmals aus Rinderhirn isolierte. Seinen Namen erhielt es aufgrund seiner Löslichkeit in 100% gesättigtem Ammoniumsulfat bei neutralem ph-Wert. Protein S-100 besteht aus mehreren Untereinheiten, von denen S-100B nur im Hirngewebe vorkommt, hauptsächlich im Zytosol von Gliazellen. Bei astroglialer Zerstörung und konsekutiver Störung der Blut-Hirn-Schranke können erhöhte Konzentrationen von Protein S-100B im Serum gemessen werden. Durch seine spezifische Herkunft besitzt Protein S-100B einen potentiellen Wert als biochemischer Marker einer strukturellen Hirnschädigung. Ziel dieser Studie ist die Überprüfung des posttraumatischen Protein S-100B Serumspiegels bezüglich seiner Korrelation mit dem Schweregrad kindlicher Schädel-Hirn-Verletzungen und deren Prognose. In Form einer prospektiven Studie wurden insgesamt 45 Kinder (23 Jungen und 22 Mädchen) zwischen 4 Monaten und 17 Jahren (Mittelwert 7,64 Jahre) mit Hirnverletzungen unterschiedlicher Schweregrade untersucht, bei denen innerhalb der ersten 20 posttraumatischen Stunden mittels eines immunoluminometrischen Assays die Protein S-100B Serumkonzentration bestimmt wurde. Der Normalbereich für Protein S-100B liegt bei < 0,15 µg/l. Werte zwischen 0,15 und 0,5 µg/l gelten als leichtgradig erhöht, Werte über 0,5 µg/l als deutlich erhöht. Die S-100B-Werte wurden mit den klinischen Daten und dem posttraumatischen Outcome (Nachbeobachtungszeit mindestens 6 Monate) korreliert. Die statistischen Signifikanzberechnungen erfolgten mittels des Fisher-Exact-Tests.Die gemessenen S-100B Werte lagen zwischen 0,05 und 3,05 µg/l (Mittelwert 0,46 µg/l). Die mittlere Latenzzeit der posttraumatischen Protein S-100B Bestimmung betrug 5 Stunden. 38 % der Kinder zeigten leichtgradige Erhöhungen (>= 0,2-0,5 µg/l), 29 % deutliche Erhöhungen (> 0,5 µg/l). Niedrige Punktwerte in der initialen Glasgow-Coma-Scale (GCS) bedeuteten im Mittel höhere Werte für Protein S-100B. Ein initialer GCS-Wert von unter 8 ging in allen Fällen mit S-100B Werten über 0,5 µg/l einher (p=0,005). In Fällen ohne Verlust des Bewusstseins, bzw. maximal einer leichten Eintrübung des Bewusstseins (Lange-Cosack I-II) lagen die S-100B Werte im Mittel niedriger als bei Vorliegen eines Bewusstseinsverlustes (III-IV). Ein Bewusstseinsverlust ging immer mit einem S-100B Wert von mindestens 0,2 µg/l einher (p=0,04), meist lag der Wert über 0,5 µg/l (p=0,015). 25 Kinder erhielten eine Computer- und /oder Magnetresonanztomographie. Hier zeigten sich erhöhte S-100B Werte vor allem bei schweren Kontusionen und Subduralblutungen. Den höchsten Wert (3,05 µg/l) wies ein Kind mit ausgedehnten diffusen axonalen Verletzungen auf. Bei 38 der 45 Patienten konnte nach einer durchschnittlichen Nachbeobachtungszeit von 27,5 Monaten das neurologische Outcome (Glasgow Outcome Scale, GOS) erhoben werden. 8 Kinder (21 %) wiesen neurologische Residuen auf, vor allem Koordinationsstörungen und Verlangsamungen im Sinne eines Psychosyndroms, 1 Kind verstarb im Akutverlauf an einem malignen Hirnödem. Die Kinder mit posttraumatischen Residuen / Behinderungen wiesen im Mittel tendenziell höhere Werte für Protein S-100B auf. Die unterschiedlichen Beschwerdebilder und Residualzustände nach leichten und schweren Schädel-Hirn-Verletzungen lassen sich anhand der etablierten klinischen, neurophysiologischen und neuroradiologischen Prognosemarker bislang nur bedingt vorhersagen. Die Ergebnisse dieser Untersuchung zeigen gute Korrelation des Serum S-100B Wertes mit der Schwere und Dauer der initialen Bewusstseinsstörung sowie dem Ausmaß der hirnparenchymatösen Läsionen. Die Aussagekraft bezüglich des posttraumatischen Outcomes ist aufgrund der Fallzahl und der zu einem großen Teil einbezogenen leichten Schädel-Hirn-Verletzungen begrenzt. Die Untersuchungsergebnisse unterstützen die bei Erwachsenen erhobenen Daten und zeigen, dass Protein S-100B auch im Kindesalter einen viel versprechenden Parameter zur Objektivierung einer akuten Hirnschädigung darstellt und bereits zu einem frühen posttraumatischen Zeitpunkt einen Beitrag zur Beurteilung des Schweregrades und der Prognose von Schädel-Hirn-Verletzungen leisten kann. Der posttraumatische Protein S-100B Serumwert bringt hier als biochemischer Marker eine zusätzliche Information und kann so bei der Einschätzung und Initiierung von diagnostischen, therapeutischen, rehabilitativen und Follow-up-Maßnahmen hilfreich sein.
In der vorliegenden Arbeit wurden zehn Substanzen, die im Rahmen des Projekts INTAFERE analytisch in verschiedenen Gewässersystemen des Hessischen Rieds nachgewiesen werden konnten, ökotoxikologisch charakterisiert. Neben der Bestimmung der Akut- und der chronischen Toxizität wurde auch das endokrine Potential mit Hilfe eines rekombinanten Hefe-Assays ermittelt.Die akute Toxizität zeigt zwischen den verschiedenen Substanzen große Differenzen. Die drei Organophosphate TCPP, TBEP und TCEP zeigen selbst bei hohen Konzentrationen keine oder nur sehr geringe Effekte, während 4-NP, 4-t-OP, BPA, TDCPP, AHTN und Terbutryn mit LC50-Werten bis zu 5 mg/l eine höhere Toxizität besitzen.Im Hefe-Assay kann in mehreren Versuchswiederholungen das östrogene Potential von 4-NP (MW: 6,71x10-6 M), 4-t-OP (MW: 7,16x10-6 M) und BPA (MW: 4,88x10-6 M), sowie die antiandrogene Wirkung des Bisphenols (5,29x10-5 M) bestätigt werden. Im Gegensatz dazu können im Yeast Antiestrogen Screen zum ersten Mal Hinweise auf die antiöstrogene Wirkung von TCPP (MW: 6,86x10-5 M), Terbutryn (MW: 3,99x10-5 M), TDCPP (MW: 2,65x10-6 M) und TBP (MW: 2,28x10-5 M) aufgezeigt werden.TBP und TDCPP führen auch in der chronischen Exposition bei Potamopyrgus antipodarum zu einer Reduktion in der Embryonenzahl (mehrfach beobachtete NOEC beider Substanzen: 6,25 mg/kg), ein Effekt, der zunächst nicht von einer toxischen Wirkung unterschieden werden kann. Allerdings scheint sich ein antiöstrogener Wirkmechanismus auf die Schnecken bei den Versuchen zur Mischtoxizität zu bestätigen, da die gleichzeitige Exposition gegenüber BPA und 4-tOP zu einer geringfügigen Aufhebung des Effekts führt. Potamopyrgus reagiert ebenfalls mit einer Reduktion der Embryonenzahl bei der Exposition gegenüber AHTN (mehrfach beobachtete NOEC: 2 mg/kg), zeigt sich aber insensitiv gegenüber der Belastung mit Terbutryn.Die Exposition von Chironomus riparius gegenüber den verschiedenen Substanzen führt bis auf eine Ausnahme zu keinen signifikanten substanzbedingten Beeinträchtigungen. Einzig das s-Triazin Terbutryn verursacht eine hohe Mortalität mit einer NOEC (28 d) von 250 μg/kg. Eine Toxizität auf den Anneliden Lumbriculus variegatus zeigt sich lediglich bei derExposition gegenüber BPA (NOEC: 10 mg/kg; Biomasse, 28 d) und 4-NP (EC10: 6,88 mg/kg; 95% KI: 3,97-11,9; Reproduktion, 28 d). Die durchgeführten Versuche zur Toxizität von Mischungen zeigen eine größere Gefährdung auf als bei Vorliegen der Einzelsubstanzen in Konzentrationen unterhalb ihres Schwellenwertes zu vermuten wäre. Allerdings lassen sich die mit dem Hefe-Assay erzielten Ergebnisse aufgrund großer Variabilitäten zwischen den einzelnen Versuchswiederholungen nicht immer eindeutig mit Hilfe des additiven oder des unabhängigen Modells beschreiben, zeigen dabei jedoch trotzdem ein gegenüber den Einzelsubstanzergebnissen verändertes Risiko auf. Um diesem in der Risikobewertung Rechnung zu tragen, wird ein Verfahrensvorschlag entwickelt, in dem durch zusätzliche Sicherheitsfaktoren für PNECs ein Überschreiten des risikoanzeigenden Werts von 1 des PEC/PNEC-Quotienten einer Mischung verhindert werden kann.
Mit der vorgelegten Dissertation wird ein Beitrag zur Diskussion um Beschäftigungssicherung unter veränderten globalen und betrieblichen Beziehungen geleistet. Aufgezeigt werden betriebliche Strategien im Umgang mit Beschäftigungskrisen in der Metall- und Elektroindustrie und der Beitrag einer aktiven Arbeitsmarktpolitik zur Sicherung von Beschäftigung. Hintergrund bilden die massiven Beschäftigungseinbrüche, insbesondere Anfang der 1990er Jahre, in der Metall- und Elektroindustrie. Veränderte wirtschaftliche Rahmenbedingungen im Verlauf des Strukturwandels führten zu einer Umorientierung bei den Unternehmens- und Managementstrategien, um auf veränderte Marktanforderungen und verschärfte Wettbewerbsbedingungen zu reagieren und auch weiterhin Gewinnspannen realisieren zu können. Neue Reorganisationskonzepte in den Unternehmen und der zunehmende Druck der von Shareholder Value-Strategien ausgeht, führen immer wieder zu unternehmerischen Anpassungsstrategien, die mit Stelleneinsparungen einhergehen. Am Ende betrieblicher Reorganisation steht häufig der Verlust von Arbeitsplätzen. Allein der Blick auf das Endresultat Personalabbau reicht allerdings nicht aus, um die Auswirkungen dieser Maßnahmen auf Betrieb, Beschäftigte und nicht zuletzt den Arbeitsmarkt erfassen zu können. Ziel der Arbeit ist es, anhand der Analyse von vier Fallstudien Ansatzpunkte dafür zu finden, wie Prozesse im Rahmen von Beschäftigungsabbau beeinflusst und gestaltet werden können. Dabei werden neben betriebsinternen Möglichkeiten der Beschäftigungssicherung ebenfalls Beschäftigungsperspektiven in der Region in den Blick genommen. Für diese Studie wurde ein disziplinenübergreifender Ansatz gewählt, in dem Elemente der Industriesoziologie und der Arbeitsmarktforschung integriert sind. Im Bereich der Industriesoziologie wird auf die Arbeitspolitik und damit einen handlungsorientierten Ansatz der Industriesoziologie zurückgegriffen. Aus dem Bereich der Arbeitsmarktforschung dient der segmentationstheoretische Ansatz als theoretische Grundlage, um die Strukturierung des Arbeitsmarktes und ihre Verfestigung aufzeigen zu können. Präventive Beschäftigungssicherung zu untersuchen setzt voraus, die Grenzen zwischen industriesoziologischen und arbeitsmarktpolitischen Fragestellungen zu überschreiten. Diese Forschungsperspektive ermöglicht es, den in der Regel zu engen Blick auf die Bestandssicherung der vom Abbau bedrohten Arbeitsplätze zu erweitern und ihn für die Beschäftigungsperspektiven im Unternehmen selbst und über das Unternehmen hinaus zu öffnen.
Die vorliegende Arbeit befasst sich mit den nichtlinearen Zusammenhangsstrukturen in Form von Moderator- und quadratischen Effekten, die einen aktuellen Gegenstand der Forschung darstellen. In der Arbeit wurden zunächst die theoretischen Grundlagen von Strukturgleichungsmodellen sowie die Problematik von manifesten und latenten nichtlinearen Modellen erläutert. Die komplexeren Strukturgleichungsmodelle, die neben einem Moderatorterm auch quadratische Termen enthalten, wurden besprochen und danach sowohl die Produktindikatorverfahren vorgestellt, die zur Parameterschätzung die Maximum-Likelihood-Methode verwenden, als auch die neu entwickelten verteilungsanalytischen Verfahren, nämlich LMS (Klein, 2000; Klein & Moosbrugger, 2000) und QML (Klein & Muthén, 2007) vorgestellt. Das Thema wurde zuerst aus theoretischer Perspektive analysiert und unter "Fragestellung 1" dargestellt. Bei der Analyse von Moderator- und quadratischen Termen in multiplen Regressionsmodellen kann es bei steigender Prädiktorkorrelation wegen des zunehmenden gemeinsamen Varianzanteils dieser beiden Terme zu einer Fehlspezifizierung der tatsächlich vorhandenen nichtlinearen Effekte kommen. Um eine zuverlässige Aufdeckung dieser Effekte zu ermöglichen, wurde daher in der Vergangenheit mehrfach empfohlen, grundsätzlich Moderator− und quadratische Effekte simultan zu untersuchen. Da psychologische Variablen jedoch selten messfehlerfrei erfasst werden können, erwiesen sich entsprechende Untersuchungen, die lediglich auf manifester Variablenebene durchgeführt worden waren und somit, von perfekt reliablen Messungen ausgingen, als methodisch problematisch. Zur weiterführenden Untersuchung der simultanen Analyse nichtlinearer Effekte empfiehlt sich daher der Einsatz latenter Strukturgleichungsmodelle, die den Messfehler manifester Variablen explizit berücksichtigen. Im Anschluss daran wurden die neu entwickelten verteilungsanalytischen Verfahren, LMS und QML vorgestellt. Diese neuen Verfahren berücksichtigen erstmals explizit die multivariate nichtnormale Verteilung der Indikatorvariablen, die aus nichtlinearen Modellen resultiert. Unter "Fragestellung 2“ wurde ihre Leistungsfähigkeit im Vergleich zu LISRELML-Verfahren überprüft. Die Voraussetzungen zur Anwendung der beiden Methoden ist die Normalverteilung der Indikatoren der latenten Prädiktorvariablen. Da in der empirischen Forschung zu psychologischen oder sozialwissenschaftlichen Fragestellungen normalverteilte Variablen sehr selten sind, wurde unter "Fragestellung 3" die Frage untersucht, wie robust beide Verfahren gegenüber der Verletzung der Verteilungsvoraussetzung sind. Es wurden zahlreiche Simulationsstudien durchgeführt, anhand derer die Robustheit der verteilungsanalytischen Verfahren bei variierender Schiefe und Kurtosis der Variablen nachgewiesen werden konnte. Auch unter weiteren praxisrelevanten Bedingungen, z.B. sehr komplexen Modellen mit bis zu sechs nichtlinearen Effekten und relativ kleinen Stichproben, zeigten beide Methoden sehr gute Schätzeigenschaften. Diese Ergebnisse sind für Anwender sehr ermutigend, da sie zeigen konnten, dass für die Untersuchung von multiplen nichtlinearen Effekten unter verschiedenen simulierten Bedingungen die verteilungsanalytischen Verfahren LMS und QML sehr zuverlässig sind und eingesetzt werden können. Beide Methoden wiesen unter den realisierten Bedingungen bezüglich der Güte der Parameterschätzungen keine bedeutsamen Unterschiede auf. Beide Verfahren lieferten unabhängig von der Komplexität der untersuchten Modelle erwartungstreue Parameterschätzungen und unverzerrte Standardfehlerschätzungen. Anschließend konnte neben dem Nachweis der erweiterten Leistungsfähigkeit der verteilungsanalytischen Verfahren anhand eines empirischen Beispiels aus der Burnout-Forschung gezeigt werden, dass die Analyse von multiplen nichtlinearen Effekten eine praktische Relevanz für die Weiterentwicklung von Theorien haben kann.
Um eine kardiale Ursache für den Zustand klinisch instabiler Patienten auszuschließen, gilt der Einsatz einer fokussierten Echokardiographie als aussagekräftige orientierende Untersuchungsmaßnahme. Auch während einer kardiopulmonalen Reanimation kann eine ALS-konforme Echokardiographie eingesetzt werden. Dafür benötigt der Notfallmediziner ein standardisiertes Training, welches spezielle Schwerpunkte beinhaltet. Dabei muss neben der Vermittlung von theoretischen Kenntnissen und der praktischen Anwendung der Echokardiographie auch besonders auf das Trainieren von visuell perzeptiven Fähigkeiten geachtet werden, da ein schnelles Erkennen von spezifischen Diagnosen elementar für die Prognose klinisch instabiler Patienten ist. Diese Arbeit befasst sich mit der Entwicklung und Anwendung eines computerbasierten Testverfahrens, der dem Erfassen des Lernerfolges im Rahmen des Stufe-1-Training für Notfallechokardiographie. Dabei wird vor allem in Hinblick auf die schnelle Identifikation von Blickdiagnosen geachtet, indem eine Zeitmessung erfolgte. Bei der Entwicklung wurden, basierend auf die aktuellen Empfehlungen für den Einsatz von Echokardiographie in der Intensiv-und Notfallmedizin, die 10 wichtigsten Echokardiographiediagnosen als Filmsequenzen dargestellt. Dazu gehören Befunde wie die PEA, der Perikarderguss, Asystolie, reduzierte Pumpfunktion und Rechtsherzbelastung. Zu jeder Filmsequenz, die je nach Version 5 Sekunden oder bis zu 60 Sekunden dauern, wurde eine Freitexteingabe gefordert und eine Multiple-Choice-Aufgabe gestellt. Ergebnisse wurden im Rahmen von drei Kurskonzepten für Stufe-1-Noallechokardiographie gesammelt. Damit einhergehend wurde die Validität des Simulationstests Notfallechokardiographie bewiesen. Bei der Betrachtung der Ergebnisse zeigt sich, dass es möglich ist, mit dem Test den Wissensstand der Teilnehmer aufzuzeigen. Dabei wurde deutlich, dass Befunde wie die PEA, der Perikarderguss und die hochgradig eingeschränkte Pumpfunktion von der Mehrzahl der Teilnehmer korrekt in Freitexteingabe und Multiple-Choice-Aufgabe benannt werden konnten. Schwächen im Erkennen bestimmter Befunde, allen voran des Normalbefundes, wurden anhand der Testanwendung aufgedeckt. Somit kann der Simulationstest Notfallechokardiographie zu einer Überarbeitung der Kursinhalte beitragen. Bei einer Erfassung der Zeit, die für die Identifikation der Befunde benötigt wird, wird ersichtlich, dass definierte Diagnosen innerhalb von 10 Sekunden erkannt werden können. Vor allem der Befund der PEA wurde nach dem Kurs schnell erkannt. Andere Diagnosen, wie das normale Herz, zeigen, dass es nach einem Kursprogramm weiterhin schwierig sein kann, bestimmte Befunde innerhalb von 10 Sekunden zu stellen. Die gewonnenen Ergebnisse werden durch die erhobenen Daten bei der Anwendung des Simulationstest Notfallechokardiographie in der 5-Sekunden-Version unterstrichen. Spannend ist, dass im Rahmen eines spezialisierten Trainings kein Unterschied in den Ergebnissen festzustellen war. Es spielte dabei keine Rolle, ob die Teilnehmer die Filmsequenzen 5 Sekunden oder 60 Sekunden sehen konnten. Aus diesen Ergebnissen lässt sich der Schluss ziehen, dass nach einem achtstündigen Kurs für ALS-konforme Echokardiographie definierte Blickdiagnosen dass definierte Befunde innerhalb 5 Sekunden erkannt werden können.
Regulation des matrizellulären Proteins SMOC-1 durch Zytokine und Stickoxid in Rattenmesangiumzellen
(2009)
Zytokine stimulieren in Mesangiumzellen die Produktion und die Freisetzung großer Mengen entzündlicher Mediatoren. In dieser Arbeit wurden mit Hilfe der RAP-PCR („RNA arbitrarily primed polymerase chain reaction“), einer auf mRNA basierenden „Differential display“-Methode, die Effekte von Interleukin-1β (IL-1β) auf das Genexpressionsmuster in glomerulären Rattenmesangiumzellen untersucht. Dabei wurde das matrizelluläre Glykoprotein „Secreted modular calcium-binding protein-1“ (SMOC-1) identifiziert, welches in Mesangiumzellen durch IL-1β herunterreguliert wird. SMOC-1 wird von verschiedenen Zelltypen exprimiert und sezerniert, doch seine biologische Funktion konnte bisher nicht aufgedeckt werden. Weitere Experimente bestätigten, dass die mRNA- und Proteinexpression von SMOC-1 durch proinflammatorische Zytokine, wie IL-1β und Tumornekrosefaktor-α (TNF-α) herunterreguliert wird. Dieser Effekt wird zu einem großen Teil durch die endogene Freisetzung von Stickoxid (NO) aufgrund der Aktivität der induzierbaren NO-Synthase (iNOS) und der nachfolgenden Aktivierung der löslichen Guanylatzyklase (sGC) vermittelt. Außerdem tragen auch reaktive Sauerstoffver-bindungen (ROS), deren Bildung durch die Zytokine verstärkt wird, zur Herunter-regulierung der SMOC-1-Expression bei. Durch In-situ-Hybridisierungsexperimente konnte ferner gezeigt werden, dass die Hemmung der NO-Synthese durch den spezifischen iNOS-Inhibitor L-NIL in einem Rattenmodell der anti-Thy1.1-Glomerulonephritis die SMOC-1-Expression deutlich erhöhte. Dies belegt somit auch in vivo die biologische Relevanz von NO in der Modulierung der SMOC-1-Expression. Die funktionelle Rolle von SMOC-1 in Mesangiumzellen wurde durch die Hemmung der SMOC-1-Expression mit Hilfe einer spezifischen siRNA untersucht. Dabei zeigte sich, dass die Hemmung von SMOC-1 eine deutliche Inhibierung der mRNA-Expression von „Transforming growth factor β1“ (TGF-β1) sowie dessen Gesamtproteinspiegel zur Folge hat. Auch die Aktivität von TGF-β1 wurde reduziert, wie anhand der verringerten Spiegel an aktivem TGF-β1-Protein und der verringerten mRNA-Expression bekannter TGF-β-regulierter Gene, wie „Connective tissue growth factor“ (CTGF), „Plasminogen activator inhibitor-1“ (PAI-1) und Biglykan gezeigt wurde. Diese Ergebnisse deuten auf eine Rolle von SMOC-1 bei der Modulierung des TGF-β1-Signalwegs hin. Zusammenfassend betrachtet scheint NO die SMOC-1-Expression in der akuten glomerulären Entzündung zu vermindern und dadurch die TGF-β-getriebenen profibrotischen Signalprozesse zu limitieren. Der zweite Aspekt dieser Arbeit befasst sich mit der Rolle von Peroxisomen-Proliferator-aktivierten Rezeptoren (PPAR) in der IL-1β-vermittelten Expression der induzierbaren NO-Synthase. PPARα-Aktivatoren steigern in Mesangiumzellen die IL-1β-induzierte Aktivität der iNOS, während die Hemmung von PPARα durch spezifische Inhibitoren oder siRNA die iNOS-Expression/-Aktivität deutlich reduziert. Die Ergebnisse von Promotor-studien zeigten die essentielle Rolle einer möglichen PPAR-Bindestelle im iNOS-Promotor. IL-1β scheint die Bildung eines endogenen PPAR-Liganden zu induzieren, wodurch die Bindung von PPAR-Proteinkomplexen an das regulatorische DNA-Element im iNOS-Promotor verstärkt und dessen Aktivität gesteigert wird. Daneben scheinen jedoch auch Nebeneffekte der PPAR-Aktivatoren, wie die Freisetzung von ROS, zur synergistischen Wirkung auf die IL-1β-induzierte iNOS-Expression beizutragen. Die Wirkung von dualen PPARα/γ-Aktivatoren auf entzündliche Prozesse wird seit längerem diskutiert, daher wurden die biologischen Effekte von neu synthetisierten möglichen dualen PPARα/γ-Aktivatoren auf Entzündungsparameter, wie z. B. die iNOS-Expression, in Mesangiumzellen untersucht. Alle untersuchten Aktivatoren steigerten in der Form von Esterverbindungen die IL-1β-induzierte Expression der iNOS sowie der sekretorischen Phospholipase A2 (sPLA2), während die entsprechenden freien Säuren wenig Effekte zeigten. Diese proinflammatorische Wirkung scheint jedoch weniger auf einer Aktivierung des PPAR-Rezeptors zu beruhen als auf der Freisetzung von ROS, die durch die Aktivatoren teilweise deutlich erhöht wurde. Weitere Experimente zur Charakterisierung der PPAR-spezifischen Wirkung der Aktivatoren sowie zur optimalen Wirkkonzentration sind nötig, bevor der Effekt dieser Aktivatoren auf die inflammatorische Genexpression genau bewertet werden kann.
Mit der vorliegenden Arbeit wurde die Nutzbarkeit morphologischer und anatomischer Merkmale aus den Bereichen des Fruchtknotens und der Samenanlangen für die Systematik und Taxonomie der Bromelioideae (Bromeliaceae) untersucht. Hierzu wurden 30 Merkmale im Bereich des Fruchtknotens und der Samenanlagen definiert und anhand anatomischer Schnittpräparate die Verteilung der Merkmalsausprägungen an 102 Arten aus 28 (von 32) Gattungen der Unterfamilie Bromelioideae sowie zwei Vertretern der Unterfamilie Pitcairnioideae als Vergleichgruppe ermittelt. Allein 41 Taxa entstammten der größten und als polyphyletisch anzunehmenden Gattung Aechmea mit Vertretern aus allen sieben Untergattungen. Die Auswertung der Merkmalsverteilung erfolgte einerseits im Hinblick auf eine funktionale Deutung beobachteter Kopplungen bestimmter Strukturen im ökologischen Kontext und zum anderen unter taxonomischen Gesichtspunkten im Hinblick auf Beantwortung der Fragen, wieweit derzeitige Gattungsumgrenzungen von den hier untersuchten Merkmalen unterstützt werden, bzw. wie weit Anregungen zur Abänderung bestehender Konzepte abgeleitet werden können, welche Beziehungen zwischen den Untergattungen von Aechmea und anderen Gattungen der Bromelioideae bestehen und wodurch sich basale Linien der Bromelioideae von den abgeleiteten Formen der „Eu- Bromelioideae“ im Sinne von SCHULTE (2007) unterscheiden lassen. Um diese Fragen zu beantworten, wurden zwei unterschiedliche Ansätze kombiniert. Die Verteilung der Merkmalszustände wurde einerseits auf Topologien geplottet, die aus publizierte Phylogenien mit genetischen Merkmalen als Datenquelle beruhen. Desweiteren wurden neue Parsimonieanalysen durchgeführt a) auf der Grundlage einer morphologischen Datenmatrix mit den 30 selbst erhobenen Merkmalen aus dem Fruchtknoten- und Samenbereich, b) einer weiteren Matrix, in die fünf weitere selbst erhobene Merkmale aus dem floralen Bereich eingehen und schließlich c) einem Datensatz, in den zusätzlich acht aus der Literatur entnommene Angaben zur Morphologie und Ökologie der untersuchten Pflanzen eingingen. Die aus den molekularen Analysen von SCHULTE et al. (2005) hervorgehende Gliederung der Unterfamilie in eine paraphyletische Gruppe von basalen Linien und der von SCHULTE (2007) als „Eu-Bromelioideae“ bezeichneten monophyletischen Gruppe abgeleiteterer Gattungen findet eine deutliche Entsprechung in Merkmalen des Fruchtknotenbereichs und der Samenanlagen. Die untersuchten Vertreter der basalen Linien besitzen alle ± rechtwinklig von der Fruchtknotenachse abspreizende Samenanlagen, diese sind auf mehr als 70% der Fruchtknotenachse verteilt und die Mikropyle ist stets relativ lang ausgebildet (>100 micro m). Eine der Kerninnovationen der Eu-Bromelioiden scheint die Entwicklung des chalazalen Samenanhängsels als Hilfsinstrument bei der Besiedlung glatter Oberflächen gewesen zu sein. Diese Struktur findet sich nur bei Eu-Bromelioideae und ist stets bereits an der Samenanlage vorgebildet. Sekundär scheint dieses chalazale Anhängsel innerhalb der Eu-Bromelioideae allerdings auch immer wieder verloren gegangen zu sein. Die Umgrenzung der meisten Gattungen sowohl der basalen Linien als auch der Eu-Bromelioideae konnten in ihrer jetzigen Form anhand der Merkmale des Fruchtknotenbereichs und der Samenanlagen nachvollzogen werden. Eine Ausnahme hiervon stellt lediglich die hochgradig polyphyletische Gattung Aechmea s.l. dar. Für keine der untersuchten Gattungen konnten synapomorphe Merkmalszustände erkannt werden, vielmehr gibt es jeweils gattungsspezifische Kombinationen von Merkmalen. Die Ausprägungen der Einzelmerkmale dagegen sind stets auch in anderen Verwandschaftsgruppen zu beobachten. Die hier untersuchten Merkmale unterstreichen das für die Bromelioideae seit langem bekannte Phänomen eines extrem hohen Homoplasiegrades in nahezu allen morphologischen Strukturen. Selbst für den Fruchtknoten lassen sich klare Abhängigkeiten der Merkmalsausprägungen von ökologischen Selektionsfaktoren erkennen. Insbesondere scheinen funktionale Notwendigkeiten im Kontext der Nektarsekretion und der Bestäubungsökologie für die Merkmalsausprägung des Fruchtknotens eine wichtige Rolle zu spielen. Die Samenanlage ist zwar zum Zeitpunkt der Anthese noch nicht direkten Selektionsdrücken ausgesetzt, ihre Merkmale sind aber nur dann zu verstehen, wenn die Funktion hier bereits angelegter Strukturen (wie z.B. der chalazalen Samenanhängsel) im Kontext mit den reifen Samen gedeutet wird.
Zur genomweiten Genexpressionsanalyse werden Microarray-Experimente verwendet. Ziel dieser Arbeit ist es, Methoden zur Präprozessierung von Microarrays der Firma Affymetrix zu evaluieren und die VSN-Methode für Experimente mit weniger als 1000 Zellen zu verbessern. Bei dieser Technologie wird die Expression jedes Gens durch mehrere Probessets gemessen. Jedes Probeset besteht aus einem Perfect-Match (PM) und einem dazugehörigen Mismatch (MM). Der Expressionswert pro Gen wird durch ein vierstufiges Verfahren aus den einzelnen Probe-Werten berechnet: Hintergrundkorrektur, Normalisierung, PM-Adjustierung und Aggregation. Für jeden dieser Schritte existieren mehrere Algorithmen. Dazu dienten die im affy-Paket des Bioconductor implementierten Methoden MAS5, RMA, VSN und die Methode sRMA von Cope et al. [Cope et al., 2006] in Kombination mit der Methode VSN von Huber et al. [Huber et al., 2002]. Den ersten Teil dieser Arbeit bildet die Reanalyse der Datensätze von Küppers et al. [Küppers et al., 2003] und Piccaluga et al. [Piccaluga et al., 2007] mit der VSN-Methode. Dabei konnte gezeigt werden, dass die VSN-Methode gegenüber Klein et al. [Klein et al., 2001] Vorteile zeigt. Bei beiden Datensätzen wurden zusätzliche Gene gefunden, die für die Pathogenese der jeweiligen Tumorarten wichtig sein können. Einige der zusätzlich gefunden Gene wurden durch andere wissenschaftliche Arbeiten bestätigt. Die Gene, die bisher in keinem Zusammenhang mit der untersuchten Tumorart stehen, sind eine Möglichkeit für die weitere Forschung. Vor allem der Zytokine/Zytokine Signalweg wurde bei beiden Reanalysen als überrepräsentiert erkannt. Da für einige Microarray-Experimente die Anzahl der Zellen und damit die Menge an mRNA nur begrenzt zur Verfügung stehen, müssen die Laborarbeit und die statistischen Analysen angepasst werden. Hierzu werden fünf Methoden für die Präprozessierung untersucht, um zu evaluieren, welche Methode geeignet ist, derartige Expressionsdaten zu verrechnen. Auf Basis eines Testdatensatzes der bereits zur Etablierung des Laborprozesses diente werden Expressionswerte durch empirische Verteilung, Gammaverteilung und ein linear gemischtes Modell simuliert. Die Simulation lässt sich in vier Schritte einteilen: Wahl der Verteilung, Simulation der Expressionsmatrix, Simulation der differentiellen Expression, Sortierung der Probes innerhalb des Probesets. Anschließend werden die fünf Präprozessierungsmethoden mit diesen simulierten Expressionsdaten auf ihre Sensitivität und Spezifität untersucht. Während sich bei den empirisch und gammaverteilt simulierten Expressionsdaten kein eindeutiges Ergebnis abzeichnet, hat sVSN bei den Daten aus dem linear gemischten Modell die größte Sensitivität und die größte Spezifität. Der in dieser Arbeit entwickelte sVSN-Algorithmus wurde zum ersten Mal angewendet und bewertet. Abschließend wird ein Teildatensatz von Brune et al. verwendet und hinsichtlich der fünf Präprozessierungsmethoden untersucht. Die Ergebnisse der sVSN-Methode wird im Detail weiter verfolgt. Die zusätzlich gefunden Gene können durch bereits veröffentlichte Arbeiten bestätigt werden. Letztendlich zeigt sich, dass neuere statistische Methoden (wie das im Rahmen dieser Arbeit entwickelte sVSN) bei der Analyse von Affymetrix Microarrays einen Vorteil bringen. Die sVSN und sRMA Methoden zeigen Vorteile, da die Probes nach der Normalisierung gewichtet werden, bevor diese aggregiert werden. Die MAS5-Methode schneidet am schlechtesten ab und sollte bei geringen Zellmengen nicht eingesetzt werden. Für die Analyse mit geringer Menge an mRNA müssen weitere Untersuchungen vorgenommen werden, um eine geeignete statistische Methode für die Analyse der Expressionsdaten zu finden.
Das NANOG2-Gen ist ein Genduplikat des nur in embryonalen Stammzellen exprimierten Stammzellfaktors NANOG1, der eine Schlüsselrolle bei der Pluripotenz und der Selbsterneuerung der Stammzellen und möglicherweise der Krebsstammzellen hat. Zur Analyse, ob NANOG2 die beschriebenen Funktionen von NANOG1 in Gewebestammzellen und Krebsstammzellen übernimmt und ursächlich für die Leukämieentstehung verantwortlich ist, wurden embryonale Zellen und primäre Leukämiezellen auf NANOG2-Expression durch RT-PCR-Experimente, Western Blot Analysen und ChIP Assays untersucht. Dabei konnte eine Methode zur Unterscheidung der NANOG1 und NANOG2-Transkripte etabliert, neue Genstrukturen dieser Gene charakterisiert und NANOG2-Transkripte in hämatopoetischen Stammzellen und in allen primären Leukämiezellen detektiert werden. Außerdem konnte mit Hilfe von Genexpressionsanalysen eine äquivalente Funktion von NANOG2 zu NANOG1 festgestellt werden.
Die Gentherapie bietet eine interessante alternative Behandlungsoption bei der Therapie der HIV-Infektion und könnte langfristig die Standardmedikation mit antiretroviralen Substanzen ergänzen oder ersetzen. Antivirale Genprodukte, die frühe Schritte im HIV-Replikationszyklus hemmen, bevor sich das Virus in das Genom der Zielzelle integriert hat, sind dabei besonders vielversprechend. Hierzu zählen insbesondere die von der C-terminalen heptad repeat Region des HIV-Hüllglykoproteins gp41 abgeleiteten C-Peptide, die hochwirksame Inhibitoren des Viruseintritts sind. Während des HIV-Eintrittsprozesses interagieren sie mit den viralen gp41 N-Helices und verhindern somit die Ausbildung des zur Fusion von viraler und zellulärer Membran erforderlichen Sechs-Helix-Bündels. Die Sekretion antiretroviraler C-Peptide durch genmodifizierte T-Lymphozyten in vivo birgt großes therapeutisches Potential: Nach Freisetzung in den extrazellulären Raum können die Peptide nicht nur genmodifizierte sondern auch unbehandelte Nachbarzellen vor HIV-Infektion schützen (Bystander-Effekt). Somit könnte selbst mit den heute zur Verfügung stehenden Methoden, mit denen lediglich ein Teil aller potentiellen HIV-Zielzellen modifiziert werden kann, die Virusreplikation effektiv unterdrückt werden. Im Rahmen der vorliegenden Arbeit wurden daher C-Peptid-basierte in vivo sezernierte antivirale Eintrittsinhibitoren (iSAVE) für die HIV-Gentherapie entwickelt. Kurze Peptide, wie die antiviralen C-Peptide, werden von eukaryotischen Zellen aufgrund von Größenbeschränkungen beim Eintritt in den Sekretionsweg jedoch nur schlecht sezerniert. Um die effiziente Sekretion von iSAVE-Peptiden durch genmodifizierte humane Zellen zu erreichen, wurde das C-Peptid daher verlängert. Hierbei wurde das therapeutische Peptid einerseits um nicht antiviral aktive Gerüstelemente ergänzt. Andererseits wurden Concatemer-Konstrukte generiert, in denen zwei C-Peptide jeweils über einen flexiblen oder proteolytisch spaltbaren Linker verbunden sind. Die unterschiedlichen iSAVE-Peptid-Varianten wurden in vitro in transfizierten und transduzierten Zelllinien und in primären humanen T-Lymphozyten charakterisiert. Hierbei wurden Sekretionseffizienz und Prozessierung sowie antivirale Aktivität und Bystander-Inhibition der sezernierten Peptide untersucht. Dabei zeigte sich, dass die Effizienz der C-Peptidsekretion stark mit der Peptidlänge korreliert, so dass durch Sequenzverlängerungen die Sekretion deutlich gesteigert werden konnte. Darüber hinaus waren N-Glykane für die effiziente Sekretion der C-Peptide unerlässlich. Die antiretrovirale Aktivität hingegen reduzierte sich mit zunehmender Peptidlänge dramatisch und wurde auch durch N-Glykane leicht beeinträchtigt, so dass weder die durch Gerüstelemente verlängerten C-Peptide, noch die ungespaltenen C-Peptid-Concatemere antiretrovirale Wirkung zeigten. Durch die Generierung proteolytisch spaltbarer C-Peptid-Concatemere konnten die strukturellen Erfordernisse für effiziente Sekretion mit hoher inhibitorischer Aktivität vereinbart werden. Die Prozessierung der Concatemere durch die Proprotein-Convertase Furin war allerdings nicht einfach zu erreichen. Nur das Einfügen eines flexiblen Linkers mit optimierter Furinerkennungssequenz zwischen den beiden C-Peptiden erlaubte die effiziente Spaltung in monomere Peptide mit hoher antiretroviraler Aktivität. Therapeutisch wirksame Peptidkonzentrationen dieser optimierten iSAVE-Peptide wurden sowohl von transfizierten und transduzierten Zelllinien als auch von primären humanen T-Zellen sezerniert. Nach Freisetzung in den extrazellulären Raum konnten die Peptide nicht nur genmodifizierte sondern auch unbehandelte Nachbarzellen in vitro vor HIV-1 Eintritt und Infektion schützen. Die generierten iSAVE-Peptide bilden damit eine hervorragende Grundlage für die weitere präklinische und klinische Entwicklung eines neuen Gentherapieansatzes zur Behandlung der HIV-Infektion.
Breitbandige Beamforming-Algorithmen zur Erfassung von Audiosignalen mit kompakten Mikrofon-Arrays
(2009)
Mikrofon-Arrays erlauben die selektive Erfassung und Trennung von Audiosignalen aus einer akustischen Umgebung. Typische Anwendungen sind z.B. die Ortung einzelner Schallquellen, die räumliche Kartierung eines Schallfeldes ("akustische Kamera") oder der gerichtete Empfang einer bestimmten Schallquelle bei gleichzeitiger Unterdrückung von Umgebungs- oder Störschallen. Vielkanalige Verfahren und Filter, die sich dieser Aufgabe widmen, werden als Beamforming bzw. Beamformer bezeichnet. In dieser Dissertation werden bekannte und eigene Beamforming-Ansätze im Hinblick auf ihre Eignung für die hochwertige Übertragung von Audiosignalen untersucht. Diese erfordert neben einer möglichst großen Abdeckung des relevanten Frequenzbereichs (Breitbandigkeit) auch die Frequenzunabhängigkeit der Richtcharakteristik, um spektrale Verzerrungen zu vermeiden. Es wird ein Algorithmus vorgestellt, der diese Anforderungen mit sehr kompakten Arrays erfüllt. Eine klassische Möglichkeit, eine frequenzinvariante Charakteristik (Beampattern) mithilfe eines Delay-and-Sum-Beamformers zu erhalten, ist eine frequenzabhängige Gewichtung der Mikrofone, welche die effektive Apertur des Arrays proportional zur Schallwellenlänge einstellt. Diese Methode funktioniert jedoch nur bei Wellenlängen, die kleiner sind als die Ausdehnung des Arrays, und erfordert bei Frequenzen unter 100Hz Arrays von mehreren Metern Größe. Ein gänzlich anderes Verhalten zeigen differentielle Mikrofonarrays, welche Differenzen aus Signalen benachbarter Mikrofone bilden: In Kombination mit Integratorfiltern erzeugen sie Beampattern, die auch bei sehr kleinen Frequenzen, d.h. bei Wellenlängen, die groß gegen das Array sind, unverändert bleiben (sog. Superdirektivität). Aus diesem Prinzip wurde in dieser Arbeit das Konzept des Multipol-Beamformers entwickelt, der ein gegebenes Soll-Beampattern durch eine Reihenentwicklung nach Sinus- und Kosinusfunktionen (zweidimensionaler Fall) oder Kugelflächenfunktionen (dreidimensionaler Fall) approximiert. Der Multipol-Beamformer erzielt eine hervorragende Richtwirkung bei kleinen Frequenzen, ist jedoch nur über einen sehr begrenzten Bereich frequenzinvariant und erweist sich insbesondere in drei Raumdimensionen als analytisch aufwändig. Flexibler und in zwei wie in drei Raumdimensionen gleichermaßen einfach in der Formulierung ist demgegenüber das in der Literatur zu findende Verfahren des modalen Subraum-Beamformings (Modal Subspace Decomposition, MSD). Dieser Ansatz bestimmt zu einer beliebigen Sensorgeometrie einen Satz orthogonaler Eigen-Beampattern, die dann zu einer Reihenentwicklung des Soll-Beampatterns herangezogen werden. Ähnlich dem erwähnten Delay-and-Sum-Beamformer jedoch erfordert auch dieser Ansatz bei großen Wellenlängen entsprechend groß dimensionierte Arrays und ist nicht superdirektiv. In dieser Arbeit wurde deshalb eine eigene, neue Ausprägung des MSD-Algorithmus formuliert, welche die Superdirektivität des Multipol-Beamformers mit der Flexibilität und Einfachheit des MSD-Verfahrens vereint. Diese als "superdirektives MSD-Beamforming" bezeichnete Methode besitzt - wie das bereits bekannte MSD-Verfahren auch - die interessante Eigenschaft, daß die Eigen-Beampattern für ein frei zu wählendes Entwurfs-Frequenzband berechnet werden, so daß das Verhalten des Beamformers über ein ganzes Frequenzintervall kontrolliert werden kann. Dies eröffnet auch die Möglichkeit eines sehr breitbandigen Beamformings durch Kombination mehrerer Beamformer, die individuell auf benachbarte Frequenzbänder abgestimmt werden. Mit beispielsweise einem hexagonalen Array von nur 6cm Durchmesser und sieben Mikrofonen erreicht der superdirektive Ansatz so ca. 20-30dB Störabstand über einen Frequenzbereich von 100Hz bis 6kHz, was für Sprache eine sehr hohe Übertragungsqualität darstellt. Zur experimentellen Verifikation der untersuchten Algorithmen wurde im Rahmen dieser Arbeit eine vielkanalige Echtzeit-Signalverarbeitungsumgebung unter Windows XP erstellt, welche die Erfassung, Verarbeitung, Analyse und Ausgabe vielkanaliger Audio-Daten erlaubt. Auch eine Simulation idealer Freifeldmessungen an Mikrofonarrays ist damit möglich, indem die Ausbreitung des Schalls von der Schallquelle zu den Mikrofonen durch zeitdiskrete Fractional-Delay-Filter simuliert wird. Dieser Filtertypus wurden im Rahmen dieser Arbeit ebenfalls eingehend untersucht: Für zwei aus der Literatur bekannte Entwurfsverfahren wurden Erweiterungen gefunden, die bei gleicher Filterordnung eine höhere nutzbare Bandbreite erzielen. Für Messungen an realen Arrays wurde die Akustik-Messkammer des Instituts durch zusätzliche Dämmauskleidung für Freifeld-Messungen nutzbar gemacht. Die Messergebnisse belegen, daß die untersuchten Algorithmen in der Praxis erwartungsgemäß funktionieren und daß der gefundene superdirektive MSD-Algorithmus mit sehr kompakten Arrays eine gute breitbandige Erfassung und Trennung von Audiosignalen ermöglicht.
Durch die vorliegende Arbeit wird die Genese von Nyong- und Ntem-Einzugsgebiet seit der Öffnung des Südatlantiks unter Berücksichtigung neotektonischer Vorgänge nachgezeichnet. Die Ergebnisse unterstützen die Identifikation geeigneter Sedimentfallen als Proxydatenarchive zur Paläoumweltrekonstruktion. Mithilfe von Fernerkundung und Geländearbeit wird der Formenschatz in den Einzugsgebieten hinsichtlich ihrer Morphogenese untersucht. Vier Formengesellschaften werden unterschieden: (1) Rumpfflächen und Inselberge, (2) ‚demi-oranges’ und ‚bas-fonds’, (3) anastomosierender Flusslauf und (4) Rumpfstufe mit Inselgebirge und Kerbtälern. Sie werden morphodynamisch-genetisch interpretiert. (1) Ein Pisolithhorizont unter einer hillwash-Decke wird als Ferricretresiduum einer Paläooberfläche gedeutet und als Ergebnis der Pedimentierung gewertet. Die Morphogenese eines Inselbergs ergänzt die Diskussion zur Einrumpfung. Die Entwicklung zweier Altarme zeigt einen dritten Prozess, der vermutlich LGM-zeitlich die Region veränderte. Die Kuppe eines Inselbergs gibt ein ehemaliges Flächenniveau wieder. Durch die rückschreitende Verlagerung einer Stufe wurde er herauspräpariert. (2) In den oberen Einzugsgebieten liegen zwischen polykonvexen Hügeln breite Auen. Es wird angenommen, dass sich der Formenschatz durch Lateralerosion nach einer initialen Eintiefung gebildet hat. Flussanzapfungen reduzieren das obere Einzugsgebiet des Nyong. Eine Klassifikation in drei Klassen ist anhand der Überformung der Anzapfungen möglich: Die erste ist durch eine Talwasserscheide und Anzapfungsknie definiert. Bei der zweiten ist das Erscheinungsbild überprägt, die Orientierung zum ehemaligen Vorfluter ist jedoch eindeutig zu erkennen. Die dritte Klasse lässt nur noch aufgrund der Flussbettphysiognomie eine Anzapfung vermuten. (3) Im Ntem-Binnendelta wurden weitflächig Schotter und Gesteinsbruchstücke abgelagert und durch Mangan- und Eisenoxid zu einem Fanglomerat ausgehärtet. Das Gewässernetz bildet die geologischen Strukturen ab. Es wird angenommen, dass sich das Binnendelta primär durch eine gestaffelte Abschiebung entlang E-W verlaufender Brüche gebildet hat. Die Sedimentfallen wurden vom Ntem mit spätpleistozänen bis holozänen Sedimenten verfüllt. Ein ursprünglich flächenhaft ausgebildetes Ferricret wurde durch E-W verlaufende Brüche unterteilt. (4) Unterhalb des Binnendeltas überwindet der Ntem in einem Kerbtal entlang einer NNE-SSW-Struktur mit zwei linearen Störungen die Rumpfstufe. Es erinnert an einen Graben mit zwei Transformstörungen. Entlang des Tals wurden weitflächig Gesteinsbruchstücke und Schotter abgelagert, die zu einem Fanglomerat aushärteten. Gesteinsschnitte geben verschiedene Prozesse wieder, die die Bildung des Kerbtals als Graben belegen. Ergänzend wird eine Lineamentanalyse durchgeführt. Es werden vier Cluster herausgearbeitet, die die linearen Einheiten primär der panafrikanischen Orogenese zuordnen. Archaische Strukturen konnten nicht eindeutig zugewiesen werden. In der Synthese wird versucht, die Einzelergebnisse auf die Fläche zu extrapolieren. Die Arbeit bietet einen breiten Einblick in die tropische Geomorphologie mit der genetischen Diskussion unterschiedlicher Formengesellschaften. Es werden primär die strukturellen Richtungen N-S, E-W und NE-SW hervorgehoben, entlang derer eine neotektonische Remobilisation stattfand. Hebungen, die sich seit dem Miozän verstärkt haben, sind Auslöser für geomorphologische Modifikationen und Extensionsbrüche. Die Nähe zur aktiven Cameroon Volcanic Line und die Kompression des Kongokratons durch Riftprozesse lösen die tektonischen Ereignisse aus. Die wiederholte tektonische Erneuerung durch Hebungen des zentralafrikanischen Hinterlands führte zu einer Umgestaltung des Drainagenetzes.
Ziel dieser Nachuntersuchung war es zu zeigen, ob Patienten mit einer rheumatischentzündlichen Grunderkrankung und rein degenerativ veränderten Hüftgelenken im Langzeitverlauf von einer Hüft-Totalendoprothese über den dorsalen Zugang profitieren. Zugrunde lag ein Kollektiv von 109 degenerativ veränderten Patienten- Hüften (108 Patienten) und 22 rheumatische Patientenhüften (21 Patienten), die in den Jahren 1995 bis 1998 in der orthopädischen Universitätsklinik von einem einzigen Operateur eine Hüft-Totalendoprothese über den dorsalen Zugang erhielten. Der Untersuchungszeitraum beläuft sich auf durchschnittlich 9,2 Jahre. Neben der klinischen Untersuchung mittels des Harris-Hip-Scores wertete die Arbeitsgruppe radiologische Beckenübersichtsaufnahmen und Lauensteinaufnahmen der endoprothetisch versorgten Hüftgelenke aus. Hierfür eignete sich der Mayo-Hip- Score mit dem das Ablöseverhalten der Prothese vom Knochen in Form einer Saumbildung ermittelt wurde. Es wurden 42 rein degenerativ veränderte Patienten-Hüften klinisch nachuntersucht, von denen 23 radiologische Bilder ausgewertet werden konnten. Bei Patienten aus dem rheumatischen Formenkreis lagen von zehn klinisch nachuntersuchten Patienten sechs radiologische Bilder vor. Ein gutes Ergebnis (84%) wird für die Gruppe der Patienten mit einer rein degenerativen Hüftgelenkserkrankung (Arthrose) und ein mittleres Ergebnis (78%) für Patienten aus dem rheumatischen Formenkreis evaluiert. Der Zusammenhang zwischen einer besseren Funktionsfähigkeit und geringeren Schmerzen nach 10 Jahren post operationem bei einem minimalinvasiven dorsalen Zugang kann nicht nachgewiesen werden. Dennoch erscheint es früh-postoperativ einige Vorteile für das Verwenden des minimal-invasiven Zugangs zum Hüftgelenk zu geben: Laut o. a. Studien liegt der intraoperative Blutverlust unter den Mengen von konventionellen Schnitten und die mögliche frühere Rehabilitationsfähigkeit bei kleineren Zugängen spricht ebenfalls für das Verwenden eines minimal-invasiven Zugangs. Insgesamt sind 92% der Patienten mit dem heutigen postoperativen Ergebnis zufrieden. Eine kleine Operationsnarbe, die weit dorsal liegt, könnte laut Patientinnen-Angaben sehr gut durch die Badebekleidung verdeckt werden, was bei antero-lateralen Zugängen nicht der Fall zu sein scheint. Dies erhöht eindeutig die Lebensqualität von Patientinnen, insbesondere von jungen Rheumatikerinnen. In Folge einer Nachbeobachtungszeit von durchschnittlich 9,2 Jahren lässt sich sagen, dass die Implantation einer Hüft-Totalendoprothese über den dorsalen Zugang sowohl bei degenerativ veränderten als auch bei rheumatisch-entzündlichen Hüftgelenken eine gute Alternative zu den Operationstechniken über den anterioren oder antero-lateralen Zugang darstellt. Die anfänglich beschriebene Ablehnung den dorsalen Zugang zu nutzen - weil über einen dorsaler Zugang das stützende Gewebe traumatisiert und damit die dorsale Luxationstendenz auf lange Sicht begünstigt werden und zu einer chronischen Instabilität des Hüftgelenkes führen könnte – konnte in unserer Studie nicht nachgewiesen werden. Zwar traten Luxationen auf, die dann teilweise operativ korrigiert werden mussten, aber es kam in keinem Fall während der Nachbeobachtungszeit zu einer Revision aufgrund einer Luxation und folgender Instabilität. Aufgrund dieser Daten- und Informationslage kann der dorsale Zugang zur Implantation einer Hüft-Totalendoprothese bei Patienten mit Arthrose und Patienten des rheumatischen Formenkreises als gute und sichere Alternative betrachtet werden.
Ezrin gehört zur Gruppe der Actin-Zytoskelett-bindenden ERM-Proteine und ist in seiner Funktion für Leukozyten gut beschrieben, wo es in Zusammenhang mit der interund intrazellulären Induktion von Apoptose gebracht wurde. Im Kontext der Astrozytenbiologie ist seine Expression mit astrozytärer Aktivierung, der Malignität von Astrozytomen und der Apoptose von Neuronen bei HIV-Encephalitis assoziiert. Die vorliegende Studie untersucht die Expression von Ezrin in Astrozyten bei verschiedenen Demenzerkrankungen mit der Frage nach krankheitsspezifischen astrozytären Aktivierungsphänomenen und einem möglichen Zusammenhang mit neuronaler Apoptose. Hierzu wurden 51 Gehirne von Demenzpatienten und 17 Gehirne von Normalkontrollen des Neurologischen Instituts (Edinger Institut) der Johann Wolfgang Goethe-Universität Frankfurt am Main histopathologisch untersucht. An Schnitten von jeweils 4-6 in Paraffin eingebetteten Gehirnarealen pro Fall wurden eine modifizierte Silberimprägnationsfärbung nach Bielschowsky und immunhistochemische Färbeverfahren für Ezrin, GFAP, HLA-DR, hyperphosphoryliertes Tau-Protein und Ubiquitin angefertigt und semiquantitativ evaluiert. Zur Darstellung von apoptotischen DNA-Strangbrüchen wurde die TUNEL-Methode verwendet. Die hier untersuchte Stichprobe entspricht in Hinsicht auf die Verteilung verschiedener Demenztypen weitgehend der neueren Literatur: Die häufigste Demenzerkrankung war die Alzheimersche Erkrankung mit 84% (N=43), gefolgt von der Demenz mit Lewy-Körperchen mit 35% (N=18), der vaskulären Demenz mit 18% (N=9) und der Frontal–Lobe-Dementia mit 6% (N=3). 47% der Fälle litten an einer Kombination von zwei Demenzerkrankungen. Die astrozytäre Ezrin-Expression zeigt keine signifikante Differenz zwischen verschiedenen Demenzformen. Dies trifft sowohl für singuläre Demenzerkrankungen als auch für Kombinationsdemenzerkrankungen zu. Die astrozytäre Ezrin-Expression korreliert hochsignifikant mit dem Schweregrad der Alzheimerschen Erkrankung, gemessen an der Dichte neuritischer Plaques in Anlehnung an die Klassifikation nach CERAD. Die astrozytäre Ezrin-Expression korreliert hochsignifikant positiv mit der Apoptose von Neuronen unabhängig vom Erkrankungstyp. Im Unterschied zur Ezrin-Immunoreaktivität, die nahezu ausschließlich bei Demenzfällen mit neuronaler Apoptose eine deutliche Erhöhung aufwies, zeigte sich die GFAP- und HLA-DR-Immunoreaktivität bei Demenzfällen generell im Vergleich zu Kontrollfällen deutlich erhöht. Zusammenfassend trägt die Untersuchung der astrozytären Ezrinexpression nicht zur Differentialdiagnose von Demenztypen bei, ist jedoch mit dem Schweregrad von Demenzerkrankungen korreliert. Ezrin fungiert offenbar als Indikator eines spezifischen astrozytären Aktivierungszustandes, der eine Assoziation mit schwerem Gewebeschaden in Form neuronaler Apoptose aufweist. Dieser Aktivierungszustand erwies sich in der vorliegenden Untersuchung als unabhängig vom Krankheitstyp, was für die These spricht, dass eurodegenerative Erkrankungen pathophysiologische Gemeinsamkeiten teilen könnten. Darüber hinaus weisen die Ergebnisse der Studie darauf hin, dass die Aktivierung von Astrozyten kein homogenes Phänomen darstellt, sondern in distinkten Formen assoziiert mit progressiver Gewebsschädigung des ZNS auftreten kann.
Ziel dieser Arbeit war es, zu prüfen, in welcher Art und Weise Kinder mentale Repräsentationen beim Lesen von Texten konstruieren. Ausgangspunkt der Konzeption dieser Arbeit war das Konstruktions-Integrations-Modell von Kintsch, das zu den am meisten rezipierten Textverstehensmodellen zählt. Ein zentraler Aspekt dieses Modells ist die Annahme der simultanen Speicherung von Textmaterial auf drei hierarchisch voneinander verschiedenen Ebenen mentaler Repräsentation. Genauer sind dies eine Oberflächenrepräsentation, in welcher der genaue Wortlaut und die exakte Struktur eines Textes abgebildet wird, eine propositionale Repräsentation, welche die im Text enthaltene Bedeutung wiedergibt, und schließlich die tiefste Art der Verarbeitung, das Situationsmodell. Hier wird die Textinformation mit relevantem Weltwissen verknüpft wird. Trotz der großen Akzeptanz des Modells und seiner Bedeutung im Bereich auch schulischer Textverstehensforschung, liegen Aussagen zu differentiellen Effekten nur in sehr begrenztem Umfang vor. Erste Hinweise auf entwicklungsabhängige Unterschiede, wie auch Unterschiede in Abhängigkeit von Eigenschaften der Person oder des Textes selbst liegen vor, bedürfen aber einer Erweiterung und erneuter Prüfung um zu einem stabilen und kohärenten Bild interindividueller Unterschiede zu gelangen. Die vorliegende Arbeit untersuchte drei Fragestellungen. Die erste Fragestellung bezog sich auf eine entwicklungsabhängige Veränderung in der relativen Nutzung der einzelnen Ebenen. Die zweite Fragestellung umfasste angenommene Effekte eines Zeitverlaufs auf die Stärke der Repräsentationen sowie die Möglichkeit einer Beeinflussung dieser Veränderungen durch den Einsatz einer behaltensfördernden Instruktion. Die dritte Fragestellung bezog sich auf den Effekt einer Auswahl personenbezogener Variablen auf die Ausprägung der Repräsentationsebenen. Insgesamt wurden die Fragestellungen mit zwei unterschiedlichen Textsorten, einem narrativen Text und einem Sachtext geprüft, um Unterschiede aufzudecken, die sich aus der Verarbeitung unterschiedlicher Textgenres ergeben. Die Fragestellungen wurden in einer Hauptuntersuchung geprüft. Zwei Vorstudien (Vorstudie 1: N = 56; Vorstudie 2: N = 133) dienten der Materialentwicklung und Erprobung erster Zusammenhänge. An der Hauptstudie nahmen 418 Schüler dritter, vierter und fünfter Jahrgangsstufen teil. Die Ergebnisse zeigten insgesamt eine Präferenz der situativen Repräsentation mit nur geringen altersabhängige Veränderungen. Auf eine Oberflächenrepräsentation ließ sich aufgrund der Ergebnisse nur bei einer Teilstichprobe der Viertklässler schließen. Insgesamt fiel es den Schülern erwartungsgemäß leichter, ein Situationsmodell für den narrativen Text im Vergleich zum Sachtext aufzubauen. Dieser Vorteil blieb auch über Zeitintervalle von 20 Minuten bzw. drei Tagen stabil, während sich eine erwartete Veränderung innerhalb der Ebenen nicht abbildete. Von erneutem Lesen konnten die Kinder kurzfristig für den Aufbau aller Ebenen beim Bearbeiten des Sachtextes profitieren. Als ein Prädiktor, der die Ausprägung der situationalen Ebene neben der Textsorte vorhersagen konnte, war der Wortschatz der Kinder. Allgemeine Leseverständiskompetenz zeigte positive Zusammenhänge zur propositionalen Verarbeitungsebene.
Gegenstand dieser Arbeit sind Galoisoperationen auf quasiplatonischen Riemannschen Flächen mit einer Automorphismengruppe isomorph zu PSL(2,F(q)). Quasiplatonische Riemannsche Flächen werden durch torsionsfreie Normalteiler N in einer Dreiecksgruppe D uniformisiert, d.h. N ist die universelle Überlagerungsgruppe und die Flächen, die man auch als algebraische Kurven beschreiben kann, sind isomorph zu N\U, wenn U die obere Halbebene bezeichnet. Bzgl. der Größe der Automorphismengruppen bilden die quasiplatonischen Kurven die lokalen Maxima im Modulraum. Die absoluten Maxima liegen bei den Hurwitz-Kurven; hier hat die Automorphismengruppe die maximale Größe von 84(g-1), wenn g>1 das Geschlecht der Kurve ist. Der Normalisator in PSL(2,R) der Überlagerungsgruppe N ist dann die Dreiecksgruppe mit Signatur (2,3,7). Macbeath hat die Bedingungen dafür gefunden, wann PSL(2,F(q)) eine Hurwitz-Gruppe ist. Von besonderem Interesse ist dabei der Fall, dass q=p eine Primzahl kongruent +-1 mod 7 ist. Hier hat man drei nicht-isomorphe Kurven, die jedoch alle galoiskonjugiert zueinander sind. In der Arbeit werden Bedingungen angegeben, unter denen sich dieses Resultat auf Dreiecksgruppen D mit einer Signatur der Form (2,m_1,m_2) verallgemeinern lässt. Dabei gehen einerseits Ergebnisse von Frye ein, der die Anzahl der verschiedenen torsionsfreien Normalteiler N<D mit Quotienten PSL(2,F(q)) über die Spurtupel der Erzeugenden von D bestimmt hat. Andererseits wird eine Methode von Streit verwendet, mit der man die Galoisoperation auf den Kurven anhand des Verhaltens der Multiplikatoren der Erzeugenden in der Automorphismengruppe nachvollziehen kann. Es zeigt sich, dass sich Spur- und Multiplikatortupel entsprechen, woraus man die Anzahl und Länge der Galois-Orbits erhält. Außerdem lässt sich der Definitionskörper der Kurven bestimmen. Offen bleibt das genaue Verhalten bei Signaturen (m_0,m_1,m_2) mit m_i ungleich 2 für alle i. Hier gibt es zu jedem Multiplikatortupel zwei verschiedene Spurtupel. Kann man die Kurven durch die Multiplikatoren beschreiben, dann erhält man Projektionen D->>PSL(2,F(q)) auch über die Quaternionenalgebra, die die Dreiecksgruppe über ihrem Spurkörper erzeugt. Die Normalteiler erweisen sich dann als Schnitt der Dreiecksgruppe mit einer Hauptkongruenzuntergruppe nach einem Primideal P|char(F(q)) in der Norm-1-Gruppe einer Ordnung der Quaternionenalgebra. Dabei ist das Spurtripel in PSL(2,F(q)) gerade das Spurtripel aus D modulo P. Ändert man P, so erhält man ein anderes Spurtripel in PSL(2,F(q)), also auch einen anderen Normalteiler. Bilden die zugehörigen Kurven eine Bahn unter der Galoisoperation, dann ergeben sich alle Normalteiler auf diese Weise. Die Galoisoperation auf den Tripeln der Multiplikatoren, also die Galoisoperation auf den Kurven, ist verträglich mit der Operation, die die Primideale P|char(F(q)) permutiert. Wir erhalten also eine natürliche Korrespondenz zwischen der Galoisoperation auf den Kurven einerseits und der Operation auf den Primidealen andererseits.
Channelrhodopsin-2, or ChR2, is a light-gated inward rectifying cation channel. Ever since its first characterisation (Nagel et al., 2003), it has been used extensively in the light-activated control of neural cells in culture as well as in living animals like mice, Caenorhabditis elegans and Drosophila melanagaster. Despite its broad application in the field of neuroscience, little is known about the properties of this ion channel. The aim of this thesis is to elucidate the single channel conductance under different conditions using stationary noise analysis on whole cell recordings of a HEK293 cell line that stably expresses the truncated ChR2 (amino acids 1-315), which behaves identically to the full length protein (Nagel et al., 2003). Stationary noise analysis is based on the fact that the ion channel noise due their opening and closing has a characteristic form of a plateau at low frequency points and a following decrease of power with 1/f² in difference power spectra, which are composed of the difference of fast Fourier transformed (FFT) stationary whole-cell recordings with and without illumination. From the parameters yielded by an approximation of the power spectra with a Lorentzian function the single channel conductance can be estimated. The single channel conductance of ChR2 was determined at -60 mV applied for different cations, yielding values of 91 ± 25 fS (Guanidine+), 42 ± 7 fS (Na+), 61 ± 18 fS (Li+) and 37 ± 14 fS (Methylammonium+). With 200 mM Guanidine+ outside of the cells and measurements between 0 mV and -60 mV applied, it could be shown that the inward rectification is still present on the scale of the single channel. Noise Analysis with concentrations between 40 and 200 mM Guanidine+ showed a saturation of the single channel conductance with high Guanidine+ concentrations with a maximal conduction of 129 ± 9 fS (Michaelis Menten approximation: Km = 82 ± 14 mM). Activation Energies of the rate constants k (2πfc, with fc = corner frequency of the Lorentzian function) and koff (1/τoff, with τoff = closing time of the channel at -60 mV) were determined to be 75 ± 23 kJ/mol and 64 ± 11 kJ/mol, respectively, which are similar to the value determined for the Channelrhodopsin-1 closing times (~60 kJ/mol; Nagel et al., 2002). The activation energy of the ChR2 single channel conductance was determined to be 21.2 ± 20.8 kJ/mol, which also is similar to the activation energy of the ChR1 current amplitude (20 kJ/mol; Nagel et al., 2002). The amount of active ChR2 channels in the membrane (160,000 or 226 ChR2/μm²) as well as the single channel current (-7.5 ± 0.6 fA) could be determined by variation of the light intensity (0.05 mW mm-2 to 5.3 mW mm-2). In the course of this thesis, the single channel parameters of the ChR2 mutant H134R were also determined. H134R had been previously published as a “gainof- function” mutant (Nagel et al., 2005a). The increased macroscopic current amplitude of H134R could be explained by an increased lifetime of the channel in comparison to the wildtype ChR2. Within the margin of error both single channel conductances in the presence of 200 mM Guanidine+ of the wildtype (91.1 ± 24.9 fS) and the H134R (89.4 ± 30.7 fS) are the same. In the presence of 200 mM Lithium+ values of 60.6 ± 17.8 fS for the wildtype ChR2 and 50.8 ± 9.6 fS for the H134R mutant were determined. This thesis marks the first in depth analysis of the single channel conductance of ChR2. Using stationary noise analysis the single channel conductance of Channelrhodopsin-1 as well as interesting Channelrhodopsin-2 mutants can also be analysed in the future.
In der Neurochirurgie sind temporäre externe Ableitungen von Liquor cerebrospinalis häufige Eingriffe zur Behandlung von Liquorabflußstörungen. Besonders bei externen Ableitungen besteht eine unmittelbare Kommunikation zwischen Liquorraum und Hautoberfläche. Infektionen durch den Katheterweg sind häufige Komplikationen. Ziel der vorliegenden Arbeit war es, die Wirksamkeit silberhaltiger EVD Katheter in vivo zu objektivieren. Dazu wurde die Infektionshäufigkeit konventioneller unbeschichteter EVD Katheter mit dem seit 2004 eingeführten antimikrobiellen silberhaltigen EVD Katheter verglichen. Mit einer statistischen Erfassung der Infektionsparameter aller Patienten die im Studienzeitraum eine externe Ventrikel-Drainage erhielten, wurde überprüft ob eine signifikante bzw. klinisch relevante Senkung der Infektionshäufigkeit vorlag. Hierzu wurden 231 Patienten in der Klinik für Neurochirurgie der Johann Wolfgang Goethe-Universitätsklinik retrospektiv untersucht. Von 231 Patienten wurden nach Anwendung der Ausschlußkriterien 164 in die statistische Analyse aufgenommen. In der Studiengruppe mit silberhaltigen EVD Kathetern befanden sich 74 Patienten, 90 in der Kontrollgruppe. In beiden Patientenkollektiven bestanden keine statistisch relevanten Unterschiede bezüglich der klinischen Charakteristika. Besonders die Verteilung von Antibiotika und Glukokortikoiden war annähernd gleich in beiden Gruppen. In unserer Studie ist der Einsatz silberhaltiger EVD Katheter zur Behandlung chronischer oder akuter Liquorabflußstörungen hinsichtlich des primären Endpunktes positive Liquorkulturen, Katheterkolonisierungen oder erhöhten Zellzahlen im Liquor, mit einer statistisch signifikanten Abnahme der Häufigkeit von positiven Infektionsparametern gegenüber herkömmlichen EVD Kathetern assoziiert (18,9 verglichen mit 33,7%; p=0,04 Chi-Quadrat-Test). Da externe Ventrikeldrainagen die Eintrittspforte für fakultativ pathogene Keime sein können, ist die Anwendung silberhaltiger EVD Katheter im Sinne einer lokalen Infektionsbarriere sinnvoll. Das Risiko katheterassoziierter Infektionen bei neurochirurgischen Patienten kann so gesenkt werden.
Die Wirbelkörperfraktur stellt eine der Hauptkomplikationen bei Osteoporose dar, welche die Kosten der Erkrankung um ein Vielfaches steigen lassen. Hinzukommen neurologische Defizite, sowie akute und chronische Schmerzen bei Belastung und in Ruhe, welche die Mobilität des Patienten deutlich einschränken und eine fortführende, bewegungsfördernde Behandlung erschweren. Die Perkutane Vertebroplastie stellt hier eine kostengünstige Behandlungsform dar, betroffene Wirbelkörper in minimal invasiver Technik zu versorgen. Über einen para- oder transpedikulären Zugang wird der frakturierte Wirbelkörper wird mit PMMA-Zement aufgefüllt, sodass ein intravertebraler Zementbolus den Wirbelkörper gleichmäßig stützt. Der Zugang zum intravertebralen Raum wird entweder ein- oder beidseitig mittels zweier Hohlnadeln gewählt, welche von dorsal transpedikulär eingebracht werden. Die Position der Vertebroplastiekanülen wurde während der gesamten Intervention mittels Computertomografie und Fluoroskopie kontrolliert. Die angestrebte Endposition der Kanülen wurde entsprechend den aktuellen Untersuchungen angestrebt. Ausgewertet wurden das Auftreten von Zementleckagen, sowie die intravertebrale Verteilung des applizierten Zementes. Im Zeitraum vom 01.01.2004 bis zum 01.08.2008 wurden dazu 92 Patienten an insgesamt 117 Wirbelkörpern behandelt. In insgesamt 44 Fällen traten Zementleckagen auf, welche klinisch asymptomatisch blieben und keine weitere Intervention erforderten. In den Kontrolluntersuchungen wurden davon 35 Leckagen als diskret, 8 Leckagen als mittelgradig und eine Leckage als deutlich klassifiziert. Die allgemeine Zementleckagerate betrug 37,6 %. Es zeigte sich jedoch, dass bei erfolgreicher Platzierung der Vertebroplastiekanülen entsprechend der angestrebten Lage, die Leckagerate um bis zu 5 % zunimmt. Unabhängig von Hinterkantenbeteiligung, Ausgangshöhe des frakturierten Wirbelkörpers oder Positionierung der Vertebroplastiekanülen zeigte sich eine Häufung der Typ-S-Zementleckagen über die Segmentvenen. An zweiter Stelle trat die Typ-C-Zement-leckage in Erscheinung. Eine Typ-B-Zementleckage konnte nur in wenigen Einzelfällen nachgewiesen werden. Die angestrebte gleichmäßige intravertebrale Verteilung des Zementbolus wiederum zeigte eine Abhängigkeit von der Platzierung der Vertebroplastiekanülen. Bei korrekter Positionierung der Vertebroplastiekanülen konnte in 87,1 % der Fälle eine seitengleiche Verteilung des Zementbolus erreicht werden. Im Gegensatz dazu konnte in nur 70,8 % der Fälle bei abweichender Kanülenlage eine entsprechende seitengleiche Zementapplikation nachgewiesen werden. Die Perkutane Vertebroplastie ist ein sicheres Verfahren, um die osteoporotisch bedingte, sowie die pathologische Wirbelkörperfraktur minimal invasiv zu versorgen. Bei Platzierung der Vertebroplastiekanülen am Kreuzungspunkt zwischen ventralem und medialem, sowie lateralem und medialem Wirbelkörperdrittel wird eine seitengleiche Verteilung des intravertebralen Zementbolus erreicht. Die Abstützfunktion des Zementbolus im frakturierten Wirbelkörper kann auf diese Weise verbessert werden. Im Gegensatz dazu hat sich die Leckagerate bei korrekter Kanülenpositionierung um 5 % erhöht. Bezug nehmend auf die Abstützfunktion sollte nun überprüft werden, ob das Auftreten von Anschlußfrakturen durch die konsequente genaue Platzierung der Vertebroplastiekanülen unter computertomografischer Kontrolle gemindert werden kann.
Katheterinterventioneller Verschluss des persistierenden Foramen ovale mit neuem Okklusionssystem
(2009)
Der perkutane Katheterverschluss des persistierenden Foramen ovale ist mittlerweile zum Standardeingriff bei Patienten mit erlittener paradoxer Embolie geworden. Die derzeit zur Verfügung stehenden Verfahren zum PFO- Verschluss beruhen auf der Implantation eines Schirmchens in der Vorhofscheidewand und hinterlassen Fremdmaterial im rechten und linken Vorhof, woraus Komplikationen im Verlauf resultieren können. Das PFXVerschlusssystem dagegen ist ein neues nicht- implantierbares System. Das Okklusionssystem schweißt mithilfe monopolarer Hochfrequenzenergie das Septum primum und Septum secundum des PFOs zusammen und bewirkt somit den Verschluss des persistierenden Foramen ovale. Ziel dieser Arbeit war die Beurteilung der Wirksamkeit und Sicherheit dieses neuen Systems, angewandt bei Patienten mit kryptogenem Schlaganfall oder transienter ischämischer Attacke. Von April bis Oktober 2005 wurde bei 30 Patienten (w: 15, m: 15) mit einem diagnostizierten PFO und kryptogenem Schlaganfall oder peripherer arterieller Embolie ein kathetertechnischer Verschluss des Defektes mittels des neuen PFX- 15 Okklusionssystems vorgenommen. Das PFX- System besteht aus einem Katheter mit einer Metallelektrode an seinem distalen Ende und einem elastischen Gummisauger, der die Elektrode umfasst. Der Sauger führt die beiden Septa des PFO zusammen und hält sie während des Schweißvorgangs in Position. Zum Verschweißen des PFO wird monopolare Hochfrequenzenergie verwendet. Die Nullelektrode wird in Form eines Klebepflasters auf dem Rücken des Patienten angebracht. Bei 27 der 30 Patienten gelang eine korrekte Positionierung des PFX-15 Katheters (90%). Bei den restlichen 3 Patienten konnte in gleicher Sitzung erfolgreich ein implantierbares Okklusionssystem eingesetzt werden. Die durchschnittliche Eingriffszeit von Punktion der Leistenvene bis zum Entfernen des Systems betrug 52± 26,4 min (27 bis 90 min). Die PFX- Katheter Zeit, definiert als die Zeit vom Einführen des Katheters in die Vena femoralis bis zur Entfernung des Systems aus der Vene, betrug im Mittel 26± 12,9 min (11 bis 55 min). Die mittlere Durchleuchtungszeit betrug 12± 7,2 min. Die primäre Verschlussrate direkt nach dem Eingriff, ermittelt durch ein Kontrastmittel-TEE, lag bei 60% (18 von 30 Patienten). Von den 27 Patienten, bei denen eine Energieapplikation stattfand, konnten 16 PFOs (59,3%) erfolgreich verschlossen werden. Von den Patienten, die einen implantierbaren Schirm erhielten, wies ein Patient direkt nach dem Eingriff noch einen Restshunt auf. Die durchschnittliche Dauer des stationären Aufenthalts zum PFO- Verschluss betrug in der Gesamtgruppe 25,7± 11,4 Stunden. Die Patienten wurden im Mittel 5,8 Monate nachbeobachtet. 9 der 14 Patienten, deren PFO durch den ersten Eingriff nicht verschlossen werden konnte, gaben ihr Einverständnis für einen erneuten Eingriff mit dem PFX- 15 Katheter. 2 der Patienten erhielten während des zweiten Eingriffs ein implantierbares Okklusionssystem, nachdem die erneute Energieapplikation nicht zu einem Verschluss des PFO führte. 6 der restlichen 7 Patienten wiesen zum Zeitpunkt der 30 Tage- Nachuntersuchung keinen Restshunt mehr auf. Nimmt man die Erst- und Zweiteingriffe zusammen, fand in 36 Eingriffen eine Energieapplikation statt. Die sekundäre Verschlussrate, das heißt der erfolgreiche PFOVerschluss durch den Erst- oder Zweiteingriff, lag bei 63% (19 von 30). Alle 30 Patienten (100%) waren während der Nachuntersuchungszeit frei von schwerwiegenden unerwünschten Ereignissen. Es traten keine mit dem PFXVerschlusssystem oder dem PFO in Zusammenhang stehende Komplikationen auf. Eine an der Punktionsstelle entstandene arterio- venöse Fistel führte zu einer Verlängerung des Krankenhausaufenthalts. Andere Komplikationen waren ein Leistenhämatom, eine Infektion der Einstichstelle, eine transiente ST- Hebung, 2 transiente supraventrikuläre Bigemini und eine gastrointestinale Blutung, die auf die Einnahme von ASS zurückzuführen war, welches daraufhin abgesetzt wurde. Außerdem erlitt ein Patient, dessen PFO nach dem Eingriff noch einen großen Restshunt aufwies eine TIA. Keines der Ereignisse führte zu Folgeschäden für die Patienten. Die Arbeit zeigt, dass der PFO- Verschluss ohne Implantation eines permanenten Systems technisch möglich ist. Die primären und sekundären Verschlussraten lagen zwar unter denen von implantierbaren Verschlusssystemen, potentielle Vorteile liegen aber in der Tatsache, das kein Fremdmaterail im Körper verbleibt und somit Komplikationen wie Device assoziierte Thrombusformationen oder Device- Brüche nicht vorkommen und möglicherweise auch Vorhofflimmern weniger häufig auftritt. Die bedeutendsten periinterventionellen Komplikationen waren nicht mit dem PFXKatheter selbst oder der Energieapplikation assoziiert, sondern mit der Notwendigkeit der Verwendung einer 16 French Schleuse. Im Großen und Ganzen waren die Komplikationen vergleichbar mit denen anderer großer Studien über implantierbare Verschlusssysteme. Sobald die primären Verschlussraten durch technische Modifikationen verbessert wurden, werden randomisierte Studien folgen, die das Okklusionssystem mit implantierbaren Systemen vergleichen werden.
Einführung: Den Hauptgrund für das mittel- und langfristige Versagen von Kunststoff-Prothesenshunts stellt die zunehmende Stenosierung im Bereich der venösen Anastomose dar. Das Problem besteht in der Anpassung der Vene an die unphysiologische Dauerbelastung durch die Arterialisierung mit der Folge einer erhöhten transmuralen Spannung, einem erhöhten endothelialen "shear stress" und daraus resultierender Intimahyperplasie. Zielsetzung: Vergleich der kumulativen Offenheitsraten von carbonisierten ePTFE (expended polytetrafluoroethylene) Gefäßprothesen MIT versus OHNE Cuff-Anastomose als Hämodialyseshunt bei terminal niereninsuffizienten Dialysepatienten. Die Modelle unterscheiden sich lediglich durch den, ursprünglich von Scholz H handgefertigten, Patch an der Venaflo™-Prothese am Übergang vom Shunt zur venösen Anastomose. (Hersteller: Fa. BARD PERIPHERAL VASCULAR). Die Cuff-Anastomose soll die Hämodynamik im Bereich des venösen Abflusses günstig beeinflussen, so dass es zu einer Reduktion der Stenoserate kommt. Material und Methodik: Die DIVA-Studie war prospektiv, randomisiert und multizentrisch nicht doppelblind angelegt; hierfür wurden 418 Patienten (m:139, w:228) im Alter von 64,5 + 13,26 Jahre, über einen 24 monatigen Zeitraum hinsichtlich der Primären und Sekundären Offenheitsrate beobachtet. Die Studie wurde regelrecht durchgeführt, d.h. nur studiengerechte Prothesen wurden verwandt, die Ein- und Ausschlusskriterien wurden strikt eingehalten, die „lost to follow-up-Rate“ war nicht höher als zuvor erwartet (25% pro Jahr). Die von den Prüfzentren übermittelten Daten wurden durch den Monitor auf deren Plausibilität geprüft. Nach ITT (intention-to-treat) – Analyse verblieben von 359 Patienten (Standard:173, Venaflo™: 186) validen Ergebnisse, verteilt auf 19 Studienzentren. Die Rekrutierung erfolgte randomisiert. Um ein möglichst homogenes Kollektiv zu erhalten, müssen verschiedene Ein- und Ausschlusskriterien, wie eine terminale dialysepflichtige Niereninsuffizienz, der Durchmesser der drainierenden Vene und zuführenden Arterie, eine dauerhafte Hyper- bzw. Hypotonie, Antikoagulantientherapie und weitere, beachtet werden. Zwischen den Behandlungsgruppen besteht kein wesentlicher Unterschied in Hinsicht auf die demographischen Daten, die vorausgegangenen Nierenerkrankung oder die nachfolgenden Dialysebehandlungen. Als Endpunkte unterscheidet man Primäre und Sekundäre Offenheitsraten, die sich im jeweiligen Wiederherstellungseingriff wie Thrombektomie, Korrektur der venösen Anastomose oder gar vollständiger Shuntneuanlage unterscheiden. Zulässige Formen der Shuntanlage sind der Unterarm-Loopshunt, Oberarm(OA)-Loopshunt, OA-Straight und OA-Curvedshunt. Es stehen 6- und 7mm-Modelle zur Verfügung. Ergebnisse: Ungeachtet der Shuntform, des Implantationsorts und des Durchmessers, zeigt die Venaflo™-Gefäßprothese stets bessere Offenheitsraten. Primäre Offenheit (ITT) nach zwei Jahren - Venaflo™: 54,1% , Standard: 48,9% (p=0,348), Sekundäre Offenheit - Venaflo™: 70,7%, Standard: 63,1% (p=0,112). Zudem haben der Durchmesser von 7mm, sowie die Straightshunts einen positiven Effekt gezeigt. Die intra- und perioperative Komplikationsrate ist nahezu gleichverteilt. So gab es beispielsweise 4 Sofortverschlüsse in der Standard-Gruppe und 5 in der Venaflo™-Gruppe. Beträchtlich hingegen ist der Unterschied bei Studienende. Die Venaflo™-Gruppe hat deutlich mehr reguläre Studienabschlüsse (Standard:58, Venaflo™:75), weniger Shuntneuanlagen (Standard:16, Venaflo™: 14) und weniger Prothesenverlängerungen (Standard: 27, Venaflo: 13) zu verzeichnen. Schlussfolgerung: Die Venaflo™-Cuff-Prothese belegt im klinischen Einsatz den positiven Einfluss der bulbusförmig konfigurierten venösen Anastomose. Die durchschnittliche Funktionsdauer kann durch den Einsatz einer ePTFE-Prothese MIT Patch deutlich verlängert werden. Für den betroffenen Patienten bedeutet dies ein Zugewinn an Lebensqualität durch eine Verlängerung des interventionsfreien Zeitraums um mehrere Monate.
Bei dieser Studie wurde die antivirale Effektivität, sowie die Verträglichkeit von einem selektiven NS3/4A Protease-Inhibitor als Monotherapie und in Kombination mit Peginterferon alfa-2a über einen Behandlungszeitraum von 14 Tagen evaluiert. Bezüglich der Hepatitis unvorbehandelte Patienten mit einer Genotyp 1 Infektion wurden in unterschiedliche Therapiearme randomisiert: (i) Placebo und Peginterferon alfa-2a (n=4), (ii) Telaprevir Monotherapie (n=8) oder (iii) Telaprevir in Kombination mit Peginterferon alfa-2a (n=8). Telaprevir wurde in oraler Tablettenform mit jeweils 750 mg alle 8 Stunden verabreicht und Peginterferon alfa-2a wurde einmal wöchentlich 180 μg subkutan injiziert. Bei der Studie zeigte sich ein medianer Abfall der HCV RNA von Beginn der Therapie bis zu letztem Behandlungstag 15 von -1.09 log10 (Bereich: -2.08 log10 und -0.46 log10) in der Placebo und Peginterferon alfa-2a-Gruppe; -3.99-log10 (Bereich: -5.28 und -1.26) in der Telaprevir-Gruppe, und -5.49-log10 (Bereich: -6.54 und -4.30) in der Kombinations- Gruppe mit Telaprevir plus Peginterferon alfa-2a. Bei 4 Patienten, die mit Telaprevir und Peginterferon alfa-2a behandelt wurden, war die HCV RNA an Tag 15 nicht mehr nachweisbar und bei einem Patienten, der initial mit Telaprevir behandelt wurde. Insgesamt kam es unter der Therapie zu keinem viralen Durchbruch unter der Kombination mit Telaprevir und Peginterferon alfa-2a während der 14-tägigen Behandlung innerhalb der Studie. Die meisten Nebenwirkungen waren von milder Intensität und es kam zu keinen schwerwiegenden Nebenwirkungen oder vorzeitigen Therapieabbrüchen. Die Studie zeigte eine potente antivirale Wirksamkeit von Telaprevir als Monotherapie und bei der Kombination mit Peginterferon alfa-2a kam es zu einer gesteigerten antiviralen Aktivität. Bereits aufgrund dieser Ergebnisse initiierte, größere Studien werden nun evaluieren, ob Telaprevir in Kombination mit Peginterferon alfa und Ribavirin die dauerhaften antiviralen Ansprechraten verbessern kann.
Charakterisierung der Amyloidplaque-assoziierten Entzündungsreaktion in APP23 transgenen Mäusen
(2009)
Ein charakteristisches Merkmal der Alzheimer-Krankheit ist die Ablagerung von Amyloid-beta (A beta) Protein im Gehirn. Die Proteinaggregate bilden Plaques, in deren Umgebung eine chronische Entzündungsreaktion nachgewiesen werden kann. Welche Rolle diese plaqueassoziierte Inflammation für die Pathogenese der Alzheimerschen Krankheit spielt, ist unklar. Es wird diskutiert, dass es sich um einen Versuch des Immunsystems handelt, A beta durch Prozessierung und Phagozytose aus dem Gehirn zu entfernen. Durch die dadurch entstehende chronische Entzündung könnten Nervenzellen in der Umgebung von Plaques geschädigt werden ("bystander attack"). Ein Schritt zu einem besseren Verständnis der plaqueassoziierten Entzündungsprozesse und ihrer pathogenetischen Bedeutung ist die Aufklärung der zugrunde liegenden molekularen Mechanismen. Daher beschäftigt sich die vorliegende Arbeit mit drei zentralen Fragen: (1) Welche Moleküle sind an der plaqueassoziierten Entzündungsreaktion beteiligt? (2) Sind ausgewählte Kandidatenmoleküle (Toll-like Rezeptoren, SOCS) in der Umgebung von Plaques reguliert? (3) Welche Rolle spielen Entzündungsmediatoren aus Endothelzellen in der Nähe von Plaques? Die plaqueassoziierten Entzündungsprozesse wurden im Gehirn von alten APP23 transgenen Mäusen, einem Modell der Alzheimer-Erkrankung, untersucht. Plaques, plaquenahes Gewebe und plaquefreies Gewebe wurden mittels Laser Mikrodissektion ausgeschnitten und anschließend mit Hilfe von Mikroarrays und quantitativer RT-PCR analysiert. Dazu wurden zwei methodische Ansätze gewählt: Im ersten Teil der Arbeit wurden in einem hypothesenfreien Ansatz neue regulatorische Kandidatenmoleküle identifiziert, unter ihnen der Rezeptor Trem2. Dabei konnten sowohl eine erhöhte plaqueassoziierte mRNA als auch eine erhöhte Protein Expression von Trem2 sowie dessen Lokalisation auf Mikrogliazellen nachgewiesen werden. Trem2 spielt anscheinend eine Rolle bei der Herbeiführung eines mikroglialen Aktivierungsstatus, der die Phagozytose unterstützt, während die Entstehung von proinflammatorischen Zytokinen unterdrückt wird. Im zweiten Teil der vorliegenden Arbeit wurde mit einem hypothesenbasierten Ansatz die plaqueassoziierte mRNA Expression von Molekülen untersucht, die bereits in anderen Untersuchungen mit der Alzheimer-Erkrankung in Zusammenhang gebracht wurden. Dabei konnte eine erhöhte plaqueassoziierte mRNA Expression der Toll-like Rezeptoren Tlr2, 4 und 9 sowie einzelner SOCS in APP23 transgenen Mäusen nachgewiesen werden. Tlr2 und 4 sind in der Lage, Mikrogliazellen und andere phagozytierende Zellen zu aktivieren und werden mit der Aufnahme und Beseitigung von Amyloid-beta in Verbindung gebracht. Im dritten Teil der Arbeit wurde ebenfalls mit einem hypothesenbasierten Ansatz die mRNA Expression von plaqueassoziiertem Endothelgewebe überprüft. Dabei konnte eine erhöhte mRNA Expression von MIP-1 alpha und CXCL10, zwei Entzündungsmediatoren aus der Familie der Chemokine, in plaqueassoziiertem Endothelgewebe gezeigt werden. Es kann daher davon ausgegangen werden, dass auch das Endothelgewebe an der Entzündungsreaktion beteiligt ist. Die Ergebnisse dieser Arbeit tragen zu einem besseren Verständnis der plaqueassoziierten Entzündungsreaktion im Rahmen der Alzheimer-Erkrankung bei. Die Aufklärung der Pathogenese der Alzheimer-Erkrankung ist entscheidend, um in den nächsten Jahren und Jahrzehnten neue und effektive Medikamente zur Behandlung dieser schweren Demenzerkrankung zu entwickeln.
Die schwere Sepsis ist trotz verbesserter Therapiemethoden der modernen Intensivmedizin mit einer erheblichen Mortalität behaftet und septische Erkrankungen verursachen in Deutschland Schätzungen zufolge ca. 60.000 Todesfälle pro Jahr. Im Falle der gram-negativen Sepsis wird durch die Freisetzung von bakteriellen Zellwandbestandteilen wie LPS über die Bindung an Toll-like Rezeptoren, insbesondere TLR-4, eine systemische Immunreaktion ausgelöst. Diese kann dann über verschiedene Mechanismen zu systemischer Hypotension, Organversagen und schließlich zum Tod im Zuge der schweren Sepsis führen. Es hat sich allerdings herausgestellt, dass LPS auch in der Lage ist protektive Effekte auszulösen. So schützt die Gabe einer niedrigen Dosis LPS den Organismus vor verschiedenen Schädigungen, die in einem späteren Zeitintervall folgen. Beschrieben sind protektive Effekte in Modellen von Ischämie/Reperfusion, direktzellschädigenden Agenzien und auch gegenüber hochdosierter LPS-Gabe. In letztgenanntem Fall wird der gezeigte Effekt als LPS-Toleranz bezeichnet. In der vorliegenden Arbeit sollte nun untersucht werden, ob niedrige Dosen von LPS einen protektiven Effekt bei einem folgenden LPS-Schock vermitteln können, wobei insbesondere Effekte auf die Leber, mit ihrer herausragenden Rolle in der Elimination von LPS aus dem Organismus, im Fokus der Experimente standen. Des Weiteren sollte eine mögliche Rolle der Häm-Oxygenase 1 (HO-1) im Zuge dieser Protektion untersucht werden, da verschiedene Arbeiten der letzten Jahre gezeigt haben, dass HO-1 in der Lage ist eine Protektion gegen verschiedene Arten der Zellschädigung zu vermitteln. Für die Untersuchungen wurde ein Tiermodell an der Ratte gewählt. Als wesentliche Ergebnisse sind festzuhalten, dass die Gabe von 1 mg / kg KG LPS (intraperitoneal) 24h vor Auslösen eines LPS-Schocks mit 6 mg / kg KG (intravenös) zu einer signifikanten Verbesserung der Kreislaufparameter und zu einer Verringerung der Leberzellschäden führt, gemessen am mittleren arteriellen Blutdruck bzw. an GOT und GPT im Serum der Tiere. Außerdem zeigt sich, dass die Gabe von niedrig dosiertem LPS zu einem Anstieg der HO-1 Konzentration der Leber im 24h Zeitverlauf führt und dass in den Lebern der Tiere, die eine Protektion durch LPS-Vorbehandlung erfahren haben, die HO-1 Menge signifikant gegenüber den nicht vorbehandelten Tieren erhöht ist. Dieses Ergebnis legt nahe, dass die HO-1 eine wichtige Rolle in der Leberprotektion im Rahmen der LPS-Toleranz durch Vorbehandlung mit niedrig dosiertem LPS spielt. Das in dieser Arbeit verwendete Modell des LPS-Schocks stimmt dabei in vielen Bereichen mit den pathophysiologischen Veränderungen während einer gramnegativen Sepsis überein. Die Ergebnisse dieser Arbeit im Einklang mit den Untersuchungen anderer Arbeitsgruppen zeigen also, dass durch eine gezielte Modulation der Immunantwort, z.B. über eine Induktion der HO-1 Produktion, eine Protektion des Organismus gegen einen im Intervall folgenden septischen Schock möglich sein könnte. Eine zeitlich abgestimmte und gezielte Modulation der inflammatorischen Prozesse bei Hochrisikopatienten, z.B. vor geplanten großen operativen Eingriffen oder Organtransplantationen, könnte daher in Zukunft helfen das Überleben dieser Patienten zu verbessern.
Die vorliegende Studie führte einen Vergleich zwischen Lokalanästhesie (LA) und Allgemeinanäthesie (GA) hinsichtlich der Entwicklung früher postoperativer kognitiver Dysfunktion (POCD) nach Carotis-Thrombendarterektomie (Carotis- TEA) durch. Es handelt sich hierbei um eine prospektive, extern randomisierte Studie, die als Teil einer Subgruppenanalyse der europaweiten GALA-Studie (General Anaesthesia versus Local Anaesthesia) durchgeführt wurde. Es wurden insgesamt 40 Patienten in die Studie eingeschlossen (GA n = 23, LA n = 17). Die kognitive Leistungsgeschwindigkeit wurde mittels Zahlen-Verbindungs-Tests (ZVT) und die Befindlichkeit wurde durch die Befindnisskalierung durch Kategorie und Eigenschaftswörter (BSKE(EWL)) zu jeweils vier Messzeitpunkten (MZP) (am Vorabend der Operation, 5, 29 und 77 Stunden postoperativ) bestimmt. Das Ausmaß der neuronalen Schädigung wurde mittels des biochemischen Markers Protein S-100b zu drei MZPs bestimmt (präoperativ, vor Unclamping der A. carotis interna und am Ende der Operation). Die Geschwindigkeit im ZVT nahm in der GA-Gruppe postoperativ signifikant ab (p = 0,0001). Sowohl fünf (p = 0,023) als auch 29 Stunden (p = 0,043) postoperativ zeigten sich signifikante Gruppenunterschiede. Die S-100b-Konzentration zeigte in der GA-Gruppe am zweiten MZP einen signifikanten (p < 0,001) Anstieg von 0,086 ± 0,038 mikro g/l, im Vergleich zum Ausgangswert von 0,061 ± 0,024 mikro g/l. Signifikante Gruppenunterschiede konnten wir hier am Ende der Operation messen (p = 0,006). Bei der Befindlichkeitsskalierung waren keine signifikanten Gruppenunterschiede messbar. Anhand unserer Ergebnisse können wir eindeutig die Thesen widerlegen, dass das verwendete Anästhesieverfahren keinen Einfluss auf die Entwicklung früher POCD hat und dass es nicht das Ausmaß der neuronalen Schädigung beeinflusst. Wir schließen daraus, dass die Lokalanästhesie einen positiven Effekt auf die Entwicklung früher POCD und das Ausmaß der neuronalen Schädigung hat. Eingeschränkt wird die Aussagekraft dieser Ergebnisse durch eine kleine Fallzahl, ein kurzes Follow-up und ein nicht standardisiertes Neuromonitoring und Shunting unter Allgemeinanästhesie.
Humane endogene Retroviren (HERVs) sind Relikte von Infektionen der Keimzellen von Primatenvorläufern mit exogenen Retroviren vor 40 Millionen Jahren. Die meisten HERV Elemente sind defekt durch die Akkumulation von Mutationen, Deletionen und Rearrangements. Lediglich einige Proviren der HERV-K/HML-2 Familie enthalte noch offenen Leserahmen für alle retroviralen Proteine. Die Expression repetitiver endogener Elemente wird in somatischen Zellen unterdrückt. Transkription und Translation von HERV-K Genprodukten tritt in Keimzelltumoren, Melanomen und Eierstockkrebs auf. In der vorliegenden Arbeit wurde die HERV-K exprimierende Melanomlinie UKRV Mel 2-C9 etabliert und charakterisiert. Es konnte gezeigt werden, dass die HERV-K Expressionen durch die dominante Aktivität des Provirus 108 bedingt ist. Die Expression und korrekte Prozessierung der viralen Proteine konnte nachgewiesen werden. Durch Elektronenmikroskopie wurde bestätigt, dass HERV-K 108 virale Partikel mit charakteristischen Strukturen der Hüllproteine produziert. Diese Partikel enthalten virale Volllängen RNA-Genome. Da HERV-K 108 in der Linie UKRV Mel 2-C9 eine Mutation im aktiven Zentrum der Reversen Transkriptase zeigt, sind die Partikel nicht infektiös. Um Einblicke in die der HERV-K Expression in Keimzelltumoren und Melanomen zu Grunde liegenden transkriptionellen Regulationsmechanismen zu erhalten, wurden mittels 5’ und 3’ RACE (rapid amplification of cDNA ends) der Transkriptionsstart und die Terminationsstelle bestimmt. Es konnte gezeigt werden, dass der HERV-K Promotor in den untersuchten Zelllinien TATA-unabhängig agiert obwohl die HERV-K LTR (long terminal repeat) ein TATA-Motiv aufweist. Die transkriptionelle Aktivität des HERV-K Promotors ist abhängig von einer GC-Box in unmittelbarer Nähe zu einem Initiatorelement am Startpunkt der Transkription. Das GC-Sequenzmotiv ist die Bindestelle für die Transkriptionsfaktoren SP1 (specific protein) und SP3. Mutationen des Bindemotivs führten zu einem drastischen Abfall der Promotoraktivität im Luziferaseassay. Durch Proteinknockdown mittels spezifischer siRNA gegen SP1 und SP3 konnte die Promotoraktivität ebenso deutlich reduziert werden. Elektrophoretic mobility shift assays und Chromatinimmunopräzipitationen bestätigten eine Bindung von SP1 und SP3 an die HERV-K LTR. Die Transkriptionsfaktoren SP1 und SP3 sind an der Initiation der basalen Transkription von HERV-K maßgeblich beteiligt.
Das kolorektale Karzinom gehört weltweit zu den häufigsten Krebserkrankungen. Die Leber ist der am häufigsten betroffene Ort für extralymphatische Metastasen. 35-60% der Patienten entwickeln Metastasen in der Leber (4). In 17% bis 25% der Fälle werden bereits bei der Diagnose des Primärtumors synchrone Lebermetastasen festgestellt (5). Etwa 80-85% der Lebermetastasen befinden sich in einem primär irresektablen Zustand (7). Somit ist bei einem großen Teil der Patienten der Goldstandard, dass heißt die Resektion, schon zum Zeitpunkt der Diagnose nicht mehr anwendbar. Da Lebermetastasen die Haupttodesursache beim kolorektalen Karzinom darstellen, versucht man, neben der systemischen Chemotherapie neue Verfahren für deren gezielte Behandlung zu entwickeln. In der hier vorliegenden monozentrischen Phase I-II Studie wurde die Sicherheit und Wirksamkeit Irinotecan beladener DC Beads Microspheres bei der Behandlung von inoperablen Lebermetastasen des kolorektalen Karzinoms mittels transarterieller Chemoembolisation (TACE) untersucht. Bei den DC Beads (Firma Biocompatibles UK Limited) handelt es sich um Hydrogel-Mikrosphären aus einem mit Sulfonatgruppen modifizierten Polyvinylalkohol. Sie können Irinotecan über einen Ionen-Austauschmechanismus aufnehmen und wieder abgeben. Es wurden 10 Patienten mit insgesamt 38 Chemoembolisationen behandelt und dabei Einzeldosen zwischen 21 mg und 143 mg Irinotecan appliziert. Hierbei traten ausschließlich Nebenwirkungen auf, die im Rahmen einer Chemoembolisation zu erwarten waren. Es wurden keine für Irinotecan typischen Nebenwirkungen wie Diarrhoe und Neutropenie beobachtet. Im Vergleich zu ähnlichen Studien, waren die Nebenwirkungen durchschnittlich seltener und schwächer. Das Tumoransprechen wurde gemäß der RECIST-Kriterien ausgwertet. Zum Studienende (objective response rate) hatten 2 Patienten einen Partial Response, 2 Patienten Stable disease und 6 Patienten Progressive Disease. Betrachtet man das beste in der Studie aufgetretene Ansprechen (best overall response), so gab es 2 Patienten mit Partial Response und 8 Patienten mit Stable Disease. Es wurde somit ein Ansprechen von 20% erreicht. Zwischen den CEA-Werten und dem endgültigen Studienausgang (objective response rate) nach RECIST gab es eine weitgehende Übereinstimmung. Bei vier Patienten konnte durch die Studienbehandlung ein Downstaging erreicht werden, wodurch eine laserinduzierte Thermotherapie (LITT) mit besserer Prognose möglich wurde. Die pharmakokinetische Untersuchung zeigte nach der Chemoembolisation mit Irinotecan beladenen DC Beads im Vergleich zur intravenösen Gabe von Irinotecan eine niedrigere Plasmakonzentration an Irinotecan aber eine höhere für den aktiven Metaboliten SN-38. Auch bei der Bewertung der Durchführbarkeit der Chemoembolisation traten im Umgang mit den DC Beads keine Komplikationen auf. Es konnte in dieser Studie gezeigt werden, dass Chemoembolisationen mit Irinotecan beladenen DC Beads technisch problemfrei, sicher und mit guter Wirksamkeit durchführbar sind. Auf Grund der guten Ergebnisse sollte die Studienbehandlung in weiteren Untersuchungen mit einem größeren Patientenkollektiv überprüft werden, um so statistisch signifikantere Daten zu erhalten.
Die genetische Information innerhalb einer Zelle kodiert nicht nur die spezifische Struktur und Funktion von Proteinen, sondern auch die Entstehung dieser Struktur durch den Prozess der Proteinfaltung. Aus zahlreichen experimentellen und theoretischen Studien wurde offensichtlich, dass Faltung und Entfaltung von Proteinen in vielen zellulären Prozessen eine entscheidende Rolle spielt. Diese Beobachtungen führten zu der zwangsläufigen Erkenntnis, dass das Unvermögen von Proteinen sich korrekt zu falten oder korrekt gefaltet zu bleiben der Auslöser für viele verschiedene Arten biologischen Fehlverhaltens ist und infolgedessen unterschiedliche Krankheitsformen mit sich bringt. Die strukturelle und dynamische Charakterisierung von nicht-nativen Proteinzuständen ist daher eine wichtige Grundlage einerseits zur Erforschung der krankheitsauslösenden Prozesse, andererseits aber auch zum generellen Verständnis der Proteinfaltung an sich. Allein hochauflösende NMR-Experimente können detaillierte Informationen über Struktur und Dynamiken solcher Zustände auf atomarer Ebene liefern. In der vorliegenden Arbeit wurde die C-terminale Domäne des humanen Prionenproteins [hPrP(121-230)] unter Bedingungen untersucht, bei denen dieses Protein permanent in einem nicht-nativen Zustand vorliegt. Dies wurde durch die Verwendung einer hochmolaren Harnstofflösung (8 M, pH 2,0) erreicht. Zur Untersuchung dieses nicht-nativen Zustands mittels NMR wurde das PrP(121-230) in E.coli-Zellen isotopenmarkiert exprimiert und in Mengen von einigen Milligramm aufgereinigt. Nach der sequentiellen Zuordnung der 13Ca-, 13Cb-, 13CO-, 1Ha- und 1HN-Resonanzen konnte aus den sekundären chemischen Verschiebungen auf Regionen innerhalb der Polypeptidkette geschlossen werden, die erhöhte b-faltblattartige Konformationsanteile enthalten. Heteronukleare Relaxa-tionsraten wurden zur Untersuchung der konformationellen Dynamik herangezogen. Auch hier konnten Regionen verminderter Mobilität (hydrophobe Cluster) nachgewiesen werden, die mit den zuvor entdeckten Bereichen aus der Analyse der chemischen Verschiebungen übereinstimmten. Die Messung von R1r-Relaxationsraten erbrachte zudem keine Hinweise auf konformationellen Austausch auf der μs-ms-Zeitskala. Weiterhin wurde der Einfluss der Disulfidbrücke auf Konformation und Dynamik des hPrP(121-230) untersucht. Dies wurde durch die Reduktion der Disulfidbrücke und die anschließende Methylierung der beiden Cysteine erreicht. Im Gegensatz zu der Analyse der chemischen Verschiebungen zeigte die Auswertung der konformationellen Dynamiken dramatische Unterschiede zwischen den oxidierten und reduzierten Zuständen des hPrP(121-230). Insbesondere im Bereich um die beiden Cysteine konnten große Unterschiede festgestellt werden; im reduzierten Zustand führte die zusätzliche Bewegungsfreiheit zu erhöhten Dynamiken und gab den Blick auf zusätzliche hydrophobe Bereiche frei, die im oxidierten Zustand durch hohe Relaxationsraten verdeckt geblieben waren. Ein weiterer wesentlicher Unterschied zwischen dem oxidierten und dem reduzierten Zustand des hPrP(121-230), der mit Hilfe des Fluoreszenzfarbstoffes Thioflavin T beschrieben werden konnte, bestand in der Fähigkeit Fibrillen auszubilden; während das oxidierte hPrP diese Eigenschaft besaß, führte der Verlust der intakten Disulfidbrücke zu einer Proteinkonformation, die nicht mehr zur Bildung von fibrillären Strukturen im Stande war. Im weiteren Verlauf der Arbeit wurden die strukturellen, dynamischen und kinetischen Charakteristika des hPrP(121-230) mit denen des murinen Prionenproteins mPrP(121-232) sowohl im oxidierten als auch im reduzierten Zustand verglichen. Auf der Basis der chemischen Verschiebungen und der heteronuklearen Relaxationsdaten konnte gezeigt werden, dass beide Proteine in den jeweiligen komplementären Zuständen (oxidiert bzw. reduziert) sehr ähnliche strukturelle und dynamische Eigenschaften besitzen. Aufgrund einiger Aminosäureaustausche in den beiden Proteinsequenzen kommt es jedoch zu kleineren Unterschieden, die jedoch nur in lokalen Bereichen der Polypeptidkette zum Tragen kommen. Somit konnte gezeigt werden, dass das mPrP(121-232) als ein geeignetes Modellsystem für das humane Prionenprotein dienen kann. Abschließend wurde der Einfluss von insgesamt zwölf verschiedenen Punktmutationen, die beim Menschen mit Prionenerkrankungen assoziiert sind, auf das Aggregationsverhalten des mPrP(121-232) untersucht. Dabei fiel zum einen auf, dass die Aggregation mit zunehmender Proteinkonzentration schneller verlief, zum anderen aber auch, dass es insbesondere bei geringen Proteinkonzentrationen zu signifikanten Unterschieden in der Aggregationsgeschwindigkeit der verschiedenen mutierten Proteinkonstrukte kommt. Zusammenfassend ist festzustellen, dass in dieser Arbeit strukturelle und dynamische Eigenschaften der nicht-nativen Zustände von hPrP(121-230) und mPrP(121-232) sowohl im oxidierten als auch im reduzierten Zustand durch die Verwendung von NMRspektroskopischen Experimenten charakterisiert werden konnten. Zudem konnte mit Hilfe von Fluoreszenzspektroskopie das Aggregationsverhalten der einzelnen Proteinzustände beschrieben und in einem ersten Schritt der Einfluss von verschiedenen Punktmutationen auf die Aggregationsgeschwindigkeit ermittelt werden.
Da BNP und NT-proBNP hauptsächlich im linken Ventrikelmyokard sezerniert werden, hat man herausgefunden, dass diese beiden Peptidhormone die linksventrikulären Funktionen besser reflektieren als andere neurohumorale Faktoren. Die Einführung von vollautomatisierten, schnellen Bioassays für die Bestimmung der BNP-Werte und des aminoterminalen Teils seines Prohormons (NT-proBNP) machte es möglich den Test auch in der Notaufnahme zu verwenden. In dieser Studie zeigte sich, dass der NT-proBNP Wert bei Patienten mit chronischer Herzinsuffizienz bedeutend höher lag, als bei Patienten die keine Anzeichen von Herzinsuffizienz aufwiesen. Weiterhin korrelierte NT-proBNP positiv mit dem enddiastolischen und endsystolischen Volumen, der Wandspannung, Herzmasse und dem Alter. Eine negative Korrelation bestand zur Ejektionsfraktion. Außerdem zeigte sich eine positive Korrelation zur NYHA-Klassifikation. Damit spiegelt NT-proBNP den Schweregrad der Erkrankung wieder. Sowohl BNP als auch NT-proBNP erlauben als kardiale Marker durch einen Bluttest mit guter Sensitivität und Spezifität die Diagnosestellung einer Herzinsuffizienz. Allerdings müssen die Plasmakonzentrationen von BNP und NT-proBNP immer im Zusammenhang mit Patientenalter, Geschlecht und möglicher renaler oder pulmonaler Erkrankungen beurteilt werden, da diese Faktoren Einfluss auf die Werte nehmen. In dieser Studie konnte gezeigt werden, dass ein Plasmaspiegel oberhalb des Medianwertes sowie in höheren Quartilen mit einer signifikanten Zunahme der Mortalität einhergehen. Oft ist es schwierig zwischen kardialen und extrakardialen Ursachen einer Dyspnoe zu unterscheiden, besonders dann wenn physische Zeichen einer Herzinsuffizienz wie z. B. dritter Herzton oder Ödeme fehlen. Beide natriuretischen Peptide sind bedeutend für die Diagnostik in der Kardiologie. Zur Diagnosestellung sollten BNP und NT-proBNP behutsam und in Anbetracht der klinischen Umstände interpretiert werden und niemals als alleinige Marker genutzt werden. Vielmehr sollten sie dazu dienen eine Diagnosestellung zu bekräftigen. Beide Peptide scheinen äqivalente diagnostische und prognostische Marker zu sein, obwohl mehr klinische Erfahrung für BNP existiert. Obwohl NT-proBNP von Faktoren wie Alter und renaler Dysfunktion nachteilig beeinflusst wird, weist NT-proBNP deutliche Vorteile gegenüber BNP auf. NT-proBNP hat eine längere Halbwertszeit, höhere Plasmakonzentrationen, sowie eine bessere Probenstabilität und spiegelt gut Veränderungen der Hämodynamik wieder. Ein weiteres Einsatzgebiet für NT-proBNP ist das Therapiemonitoring zur optimalen Anpassung der pharmakologischen Therapie. Es hat sich gezeigt, dass NT-proBNP als Marker für Herzinsuffizienz BNP ebenbürtig ist. NT-proBNP hat als Biomarker die Forschungsphase schnell verlassen und sich zum klinisch nützlichen Test entwickelt.
In der vorliegenden Arbeit wurden die Angaben von 355 Patientinnen ausgewertet, die zwischen Januar 2000 und September 2007 aufgrund eines metastasierten Brustkrebses im onkologischen Fachzentrum Frankfurt Nord-Ost behandelt worden sind. Die 5-JÜR nach Kaplan-Meier liegt im untersuchten Kollektiv bei 76 %. Die Wahrscheinlichkeit, fünf Jahre nach Erstdiagnose einer Metastasierung überlebt zu haben beträgt 50 %. Die mittlere Überlebenszeit ab Metastasierung liegt bei 7,4 Jahren. Die Wahrscheinlichkeit für metastasenfreies Überleben nach fünf bzw. zehn Jahren beträgt 60 % bzw. 44 %. Im univariaten Log-Rank-Verfahren weisen Patientinnen mit folgenden Charakteristika eine bessere Prognose hinsichtlich der Gesamtüberlebenswahrscheinlichkeit auf: Prämeno-pausaler Status bei ED, Ablatio mammae, CMF-Chemotherapie sowie operative und antihormonelle Therapie der Fernmetastasen. Als prognostisch ungünstig gelten: Positiver Nodalstatus, niedriger Differenzierungsgrad, invasiv duktaler oder lobulärer Tumortyp, höheres UICC-Stadium, Stadium > 2 der St. Gallener Risikoklassifikation, First-Line-Chemotherapie, R1-resezierte Tumoren, adjuvante Chemotherapie, > 3 verschiedene Metastasenorte und zytostatische Metastasentherapie. Die Lokalisation der Fernmetastasen ermöglicht eine differenziertere prognostische Einschätzung: Viszerale Metastasen, vor allem in der Leber und im ZNS, beeinflussen die Überlebenszeit negativ. Im Verlauf auftretende Metastasen im Abdomen/ Peritoneum gehen ebenfalls mit einer schlechteren Prognose einher. Bei ossärer Metastasierung hingegen kann mit einem benigneren Krankheitsverlauf gerechnet werden, ebenso bei Erstmanifestation der Metastasen in der Haut und/oder den Weichteilen. In der multivariaten Cox-Analyse übt die Leber als primärer Metastasierungsort den größten negativen Einfluss auf die Überlebens-wahrscheinlichkeit aus. Auch eine hohe Anzahl befallener Lymphknoten, Metastasen an > 3 verschiedenen Lokalisationen sowie ein positiver Resektionsrand führen zu signifikant schlechteren Überlebensraten. Bessere Prognosen besitzen Patientinnen, die zum Diagnosezeitpunkt prämenopausal gewesen sind und deren Metastasen im Verlauf antihormonell therapiert werden konnten. In der Cox-Regressionsanalyse erwiesen sich das Grading und der Nodalstatus als unabhängige Prognoseparameter hinsichtlich des metastasenfreien Überlebens. Demnach gilt: Je schlechter der Differenzierungsgrad eines Tumors und je mehr Lymphknoten befallen sind, desto niedriger ist die Wahrscheinlichkeit nach zehn Jahren metastasenfrei überlebt zu haben.
Zielsetzung: Schizophrenie ist eine psychische Erkrankung, die mit den strukturellen und funktionellen Veränderungen in Gehirn zusammen hängt. Die Mehrheit der kernspintomographischen Studien konnte hippocampale Veränderungen bei den schizophrenen Patienten finden, obgleich diese Veränderungen nicht immer bei der Early-Onset Schizophrenie repliziert werden konnten. Frühere Studien weisen jedoch darauf hin, dass Volumenreduktion der Hippocampi entweder während der Adoleszenz oder während des Übergangs zu einer akuten Phase auftritt. Außerdem bleibt das funktionelle Korrelat hippocampaler Struktur unklar. Das Ziel unserer Arbeit besteht darin, zu überprüfen, ob strukturelle Veränderungen bereits bei den Patienten mit einer Early-Onset Schizophrenie nachzuweisen sind und ob ein Zusammenhang zwischen dem Volumen der Hippocampi und den neurokognitiven Funktionen und der Psychopathologie besteht. Methode: Mittels Magnetresonanztomographie wurden die Volumina des rechten und des linken Hippocampus, der grauen und weißen Substanz sowie der zerebrospinalen Flüssigkeit bei 26 Patienten mit einer Early-Onset Schizophrenie und 26 gematchten gesunden Probanden untersucht. Es wurden 1mm dicke MRT Schnitte angefertigt. Die neurokognitive Funktionstüchtigkeit wurde in beiden Gruppen mit Wisconsin Card Sorting Test (WSCT), Trail Making Test-A (TMT-A), Trail Making Test-B (TMT-B) und Mehrfach Wortschatz Intelligenztest–B (MWT-B) verglichen. Die Beurteilung der psychopathologischen Symptomatik erfolgte mit dem Structured Clinical Interview: Positive and Negative Syndrom Scale (PANSS). Zudem wurde mittels Korrelationsanalysen berechnet, inwieweit eine Übereinstimmung zwischen neurokognitivem Funktionsniveau, der Psychopathologie und Volumengröße von Hippocampi gegeben ist. Ergebnisse: Jugendliche mit einer Early-Onset Schizophrenie wiesen im Vergleich zu gesunden Kontrollprobanden signifikant kleinere Hippocampi rechts auf und zeigten eine tendenzielle Verkleinerung der Hippocampi links. Das Volumen der grauen Substanz war bei Patienten ebenfalls signifikant reduziert und das CSF Volumen signifikant erhöht. Das Volumen der weißen Substanz zeigte in beiden Gruppen keine signifikanten Unterschiede. Bei Patienten zeigte sich eine signifikant bedeutsame höhere Perseverationsrate (WSCT) im Vergleich zu gesunden Probanden. Es fand sich eine signifikant negative Korrelation zwischen den negativen Symptomen und dem Volumen des rechten Hippocampus. Die Volumengröße der Hippocampi korrelierte jedoch nicht mit dem neuropsychologischen Funktionsniveau, dem Alter bei der Untersuchung, dem Alter bei Erkrankungsbeginn und Erkrankungsdauer. Schlussfolgerung: Unsere Ergebnisse deuten darauf hin, dass hirnstrukturelle Veränderungen bereits bei den Patienten mit einer Early-Onset Schizophrenie nachweisbar sind. Sie unterstützen somit die Hypothese der gestörten Hirnentwicklung.
Untersuchung der Bedeutung von Kombinationstherapien bei triple-negativen Mammakarzinomzellen
(2009)
Das Mammakarzinom umfasst eine heterogene Gruppe von Tumoren und lässt sich bei prognostischen Aussagen und der Auswahl von Therapiestrategien an spezifischen Kriterien wie dem Tumorgrad, dem Hormonrezeptorstatus und der Expression von HER2/neu-Rezeptoren klassifizieren (Schindler, 2008). Die so genannten “triple-negativen” Mammakarzinome tragen weder Östrogen-, noch Progesteron-, noch HER2/neu-Rezeptoren. Sie stellen aufgrund ihrer besonders aggressiven Wachstumsrate, ihrer verhältnismäßig ungünstigen Prognose sowie dem Fehlen zielgerichteter Therapien eine große klinische Herausforderung dar. Kombinierte Chemotherapien versprechen bis dato die größten Erfolgsaussichten. Allerdings gibt es bis heute noch keine spezifische systemische Therapie für triple-negative Mammakarzinome (Cleator et al. 2007). Demzufolge muss es das Ziel der aktuellen Forschung sein, die bestehenden Therapiekonzepte zu optimieren bzw. weitere Methoden für neue zielgerichtete Therapien zu entwickeln. In der aktuellen molekularbiologischen Forschung ist es mit Hilfe von neuartigen Strategien wie der RNA-Interferenz (RNAi) möglich, gezielt die Expression eines bestimmten Gens zu unterdrücken, wodurch dann beispielsweise das Wachstumsverhalten von Tumorzellen gehemmt werden kann. Wie vorausgegangene Studien gezeigt haben, fällt Polo-like Kinase 1 (Plk1) in Zellen mit hohem mitotischem Index und einer dadurch verstärkten Proliferation eine besondere Bedeutung zu. So liegt Plk1 in nahezu allen humanen Tumorarten überexprimiert vor (Strebhardt et al. 2006). Zudem besteht ein Zusammenhang zwischen Überexpression von Plk1 und einem Schutz der Tumorzellen vor Apoptose (Cogswell et al. 2000). Im Rahmen der hier vorgelegten Promotionsarbeit wurden diese Erkenntnisse aufgegriffen und mögliche Therapieformen geprüft. Dabei wurde die Applikation von siRNA zur Hemmung der Expression von Plk1 bei der bislang wenig untersuchten triple-negativen Mammakarzinomzelllinie EVSA-T getestet. Darüber hinaus wurde nach eventuellen synergistischen Effekten von siRNA in Kombination mit bereits etablierten Therapeutika, wie Paclitaxel oder Carboplatin gesucht. Synergistische Effekte könnten für die Krebstherapie von höchster Relevanz sein. Bei der Einzelbehandlung der triple-negativen EVSA-T-Zelllinie sowohl mit siRNA4 gegen Plk1, als auch mit Paclitaxel oder Carboplatin, wurde die Zellproliferation signifikant inhibiert. Mittels FACS-Analyse konnte einhergehend mit verminderter Plk1-Expression ein deutlich erhöhter Anteil von Zellen in der G2/M-Phase festgestellt werden. Desweiteren wurden für Apoptose typische Ereignisse, wie DNA-Kondensation, ein Schrumpfen der Zellsomata und die Aktivierung der Procaspasen 3 und -9 festgestellt. Im Vergleich zur Wirkung der Einzelsubstanzen wurden durch kombinierte Applikation von siRNA4 mit Paclitaxel oder Carboplatin synergistische Effekte bezüglich einer Hemmung der Zellproliferation beobachtet (CI < 1). Auch die Untersuchung der Zellzyklusverteilung ergab eine synergistische Verstärkung des G2/M-Arrest durch Kombination von siRNA4 mit Paclitaxel (CI < 1). Dies liefert wichtige Erkenntnisse für die Weiterentwicklung und Optimierung von Kombinationstherapien. So könnten potentielle Nebenwirkungen minimiert werden, indem statt einer definierten Konzentration einer Einzelsubstanz, zwei Therapeutika in geringeren Konzentrationen verabreicht werden. Weiterhin läßt sich anhand der durchgeführten Experimente der Schluss ziehen, dass in triplenegativen Brusttumoren eine tumorintrinsische Wachstumsregulation durch Plk1 stattfindet und dass siRNA4, welche gegen Plk1 gerichtet ist, in vitro in der Lage ist, die Proliferation triple-negativer Tumorzellen zu inhibieren. Um Plk1 als potentes Zielgen für die Therapie des triple-negativen Mammakarzinoms nachhaltig zu bestätigen und die Innovation von Kombinationstherapien voranzutreiben, müssten in weiterführenden Untersuchungen zunächst im Rahmen von Zellkulturexperimenten alternative triple-negative Zelllinien verwendet werden. Um die in vitro beobachteten Effekte auf die in vivo-Situation übertragen zu können, sollte ein Xenograft-Mausmodell etabliert werden. Nach erfolgversprechenden und quantitativ ausreichenden Tierexperimenten sowie vorklinischen Studien könnten beschriebene Therapieformen anschließend in klinischen Studien angewendet werden. Besonders positiv fällt dabei ins Gewicht, dass bis auf siRNA alle hier verwendeten Therapeutika bereits eine klinische Zulassung besitzen.
Im Rahmen dieser Arbeit wurde das Protein CtaG aus Paracoccus denitrificans eingehend charakterisiert. Es wurde überprüft, ob dieses 21 kDa große Membranprotein als Kupferchaperon und Assemblierungsfaktor für die Untereinheit I der Cytochrom c Oxidase, das heißt für die Biogenese des CuB-Zentrums, in Frage kommt. Eine bioinformatische Analyse zeigte zunächst, dass CtaG, ein Homolog des eukaryotischen Proteins Cox11, zu den am stärksten konservierten Assemblierungsfaktoren der Cytochrom c Oxidase gehört. Interessanterweise sind diese Proteine alle an der Biogenese der redoxaktiven Metallzentren beteiligt, und nur sie sind auch in Paracoccus denitrificans konserviert. Somit stellt Paracoccus ein ideales Modellsystem dar, um die essentiellen Schritte der Biogenese der Cytochrom c Oxidase zu untersuchen. Ein lösliches Fragment von CtaG (CtaGLF) wurde heterolog in E. coli exprimiert und mit Hilfe eines spaltbaren His6-tags aufgereinigt. Es wurde ein Protokoll entwickelt, mit dessen Hilfe die Aggregation des löslichen Fragments minimiert und das Protein in hochreiner, aggregatfreier Form isoliert werden kann. Rekonstitutionsversuche zeigten, dass CtaGLF ein spezifisch Cu(I)-bindendes Protein ist. Nach der heterologen Expression in E. coli ist CtaGLF kofaktorfrei. Ein Protokoll zur in vitro Rekonstitution mit Kupferionen wurde entwickelt, mit welchem ein stöchiometrisches Kupfer/Protein-Verhältnis erreicht wird. Gelfiltrations- und ICP-MS-Analysen zeigten, dass CtaGLF Kupferionen ausschließlich als Dimer bindet. Rekonstitutionen bei denen Cu(I), Cu(II), Co(II), Fe(II), Mn(II), Mg(II) und Ni(II) sowohl einzeln als auch simultan angeboten wurden, führten zwar zu wenig reproduzierbaren absoluten Stöchiometrien, bestätigten aber, dass CtaGLF bevorzugt Cu(I) bindet. Mutagenesestudien bewiesen einerseits, dass drei Cysteinreste maßgeblich für die Kupferbindung verantwortlich sind und deuteten andererseits darauf hin, dass zwei identische, punktsymmetrische Bindungsstellen des CtaGLF-Dimers die Kupferionen koordinieren. Mit Hilfe einer Multiseq-Analyse wurden zunächst hochkonservierte Oberflächenreste von CtaG identifiziert. Eine Auswahl dieser Aminosäuren wurde per gerichteter Mutagenese ersetzt und der Effekt dieser Mutationen auf Stöchiometrie, Affinität und Dimerisierung von CtaGLF wurde untersucht. Die Affinitäten wurden dabei mit Hilfe von Kompetitionsexperimenten mit dem Cu(I)-spezifischen Chelator BCA analysiert. Insgesamt vier mögliche Szenarien für die Kupferbindung von CtaG wurden postuliert und anhand der Datenlage diskutiert. Das Szenario III, welches die Datenlage am besten zu erklären vermag, sieht eine trigonale Koordination der Kupferionen vor, an welcher die Cysteine des hochkonservierten CFCF-Motivs einer Polypeptidkette ein gemeinsames Koordinationsfeld mit dem nahe der Transmembranhelix gelegenen Cystein 38 der jeweils anderen Polypeptidkette bilden. Mit Hilfe von UV/Vis-spektroskopischen Messungen wurde gezeigt, dass die Bindung von Kupferionen an CtaGLF zu einer Absorption bei 358 nm führt. Diese kann mit einem Extinktionskoeffizienten von E delta 358 nm = 936 M-1cm-1 zur Beobachtung des Kupfertransfers von CtaGLF auf einen Akzeptor verwendet werden. Um eine Beteiligung von CtaG bei der Insertion des CuB-Ions in die Untereinheit I der Cytochrom c Oxidase (UE I) zu beweisen, wurden zwei Arbeitshypothesen aufgestellt und empirisch untersucht: Die erste Hypothese geht von einer posttranslationalen Kupferinsertion aus. Die UE I wird laut dieser Hypothese zunächst vollständig exprimiert und in die Membran inseriert, bevor das Kupferion über einen Kanal in das 13 Å unterhalb der Membranoberfläche gelegene aktive Zentrum der Oxidase inseriert wird. Drei Ansätze wurden zur empirischen Überprüfung dieser Hypothese verfolgt: Erstens wurde ein in vitro Transferassay etabliert, bei dem heterolog exprimierte, kofaktorfreie UE I als Akzeptor für Kupferionen von CtaGLF diente. Zweitens wurden bioinformatische Analysen durchgeführt um potentielle Interaktionsflächen zwischen CtaG und UE I zu identifizieren. Und drittens wurde mit Hilfe koaffinitätschromatographischer Versuche eine Interaktion zwischen CtaG und kofaktorfreier UE I untersucht. Die Ergebnisse dieser Untersuchungen sprechen allesamt gegen eine posttranslationale CtaG-vermittelte Insertion von Kupferionen in die UE I der Cytochrom c Oxidase. Die zweite Hypothese geht davon aus, dass die prosthetischen Häm- und Kupfergruppen bereits vor der vollständigen Membraninsertion, das heißt kotranslational auf die UE I übertragen werden. Um diese Hypothese zu überprüfen, wurden ebenfalls mehrere Ansätze verfolgt: Erstens wurde die UE I in Gegenwart und Abwesenheit von CtaG heterolog in E. coli exprimiert und anschließend aufgereinigt. In Abwesenheit weiterer Assemblierungsfaktoren ist CtaG in diesem System nicht dazu in der Lage den Kupfergehalt der UE I zu erhöhen. Zweitens wurde mit Hilfe von Blau-Nativ Gelen und Crosslinking-Versuchen im nativen Wirt Paracoccus denitrificans nach einer Wechselwirkung zwischen CtaG und UE I gesucht. Insbesondere die Ergebnisse der Crosslinking-Versuche deuten auf einen Assemblierungskomplex hin, der sowohl CtaG als auch die UE I der Cytochrom c Oxidase enthält. In einem dritten Ansatz wurde ein zellfreies Expressionssystem etabliert, welches direkten Zugang zu naszierenden Ketten der UE I ermöglicht. Dieses System erscheint vielversprechend und dient derzeit als Basis für weitere Biogenesestudien. Die Ergebnisse der vorliegenden Arbeit zeigen, dass CtaG ein spezifisch Cu(I)-bindendes Protein ist, das im Zuge der Kupferbindung dimerisiert und in Paraoccus denitrificans in einem hochmolekularen Komplex gemeinsam mit UE I vorliegt. Die gegenwärtige Datenlage spricht dafür, dass CtaG als Kupferchaperon an der Biogenese der Cytochrom c Oxidase beteiligt ist und das CuB-Ion in einem kotranslationalen Mechanismus in die UE I der Cytochrom c Oxidase inseriert.
Im adulten Säugerhirn findet Neurogenese in der SVZ der Seitenventrikel kontinuierlich statt. Eine Vielzahl von Signalsystemen steuert in komplexer Weise zelluläre Antworten und reguliert die Proliferation, Differenzierug und Wanderung NSZ. Gegenwärtig ist nur wenig über die zugrundeliegenden Signalwege bekannt. Zunehmend gibt es Hinweise darauf, dass Nukleotide an diesen Prozessen beteiligt sind. Frühere Untersuchungen unserer Arbeitsgruppe zeigten, das die Nukleotide ADPbetaS und UTP in kultivierten NSZ der adulten SVZ einen schnellen Kalziumeinstrom induzieren und die Wachstumsfaktor-vermittelte NSZ-Proliferation steigern. In der vorliegenden Arbeit wurde ein System zur Kultivierung adhärenter adulter NSZ etabliert. Die Untersuchungen zeigen, dass adulte NSZ eine Vielzahl an P2Y- und P2X-Rezeptoren, sowie die Nukleotid-hydrolysierenden Enzyme NTPDase2 und TNAP exprimieren. Untersuchungen der ADPbetaS-, UTP- und EGF-vermittelten Signalwege zeigen, dass alle drei Agonisten eine ERK1/2- und CREB-Phosphorylierung induzieren, wobei sich die zeitlichen Charakteristika zwischen den Nukleotiden und EGF unterscheiden. Inhibierungsexperimente geben Einblicke in die dabei aktivierten Signalkaskaden und weisen auf eine ADPbetaS-induzierte Transaktivierung des EGF-Rezeptors hin. Während UTP über den P2Y2-Rezeptor wirkt, übt ADPbetaS seine Funktion über den P2Y1- und P2Y13-Rezeptor aus. Die Daten implizieren zudem, dass Nukleotide und EGF gleiche Zielproteine über verschiedene Signalwege induzieren und dass sie das Potenzial besitzen, bei der Kontrolle der Zellproliferation in der adulten Neurogenese synergistisch zu agieren. Vergleichende Analysen mit kultivierten NSZ aus Wildtyp-, P2Y1- und P2Y2-Rezeptor-Knockout-Mäusen belegen ein verändertes Antwortverhalten in Gegenwart von ADPbetaS, UTP und EGF und lassen kompensatorische Mechanismen vermuten. Die Resultate dieser Arbeit demonstrieren zudem, dass ATP, ADPbetaS, UTP und EGF die Migration von NSZ induzieren. Parallel dazu konnten Veränderungen des Aktinzytoskelletes, wie die Zunahme an F-Aktin, die Bildung von Stressfasern und eine Veränderung der Zellmorphologie gezeigt werden. Diese Prozesse gehen mit einer Aktivierung der Proteinkinasen Akt und FAK einher. Die Daten weisen darauf hin, dass Nukleotide und EGF für die Zytoarchitektur der SVZ und die Wanderung von Neuroblasten zum OB eine wichtige Rollen spielen könnten.
Ziel der vorliegenden Arbeit ist es, Erkenntnisse über die Beeinflussung der Überlebensraten von Patienten mit Nierenzellkarzinom durch verschiedene Faktoren wie Tumorstadium und Tumorgröße, Differenzierungsgrad, Metastasierung und histologischer Subtyp zu gewinnen. Insbesondere soll die Frage geklärt werden, inwiefern die Prognose der Patienten von der Art der Diagnosestellung, also inzidentell oder symptomatisch, abhängt. Zu diesem Zweck wurden die Daten aller Patienten, die zwischen dem 01.01.1997 und dem 31.12.2005 in der urologischen Universitätsklinik in Frankfurt am Main mit der Verdachtsdiagnose eines Nierenzellkarzinoms radikal nephrektomiert bzw. teilreseziert worden sind, retrospektiv erhoben und analysiert. Die Patienten wurden entweder der asymptomatischen Gruppe zugeteilt, bei denen der Nierentumor zufällig diagnostiziert werden konnte oder der Gruppe bei der die Diagnose erst aufgrund einer auf den Nierentumor oder seine Metastasen hinweisenden Symptomatik gefunden werden konnte. Die mediane Nachbeobachtungszeit betrug 50 Monate (1 bis 112 Monate). Insgesamt konnte die Diagnose Nierenzellkarzinom bei 246 (68,72 %) Patienten zufällig gestellt, nur 112 (31,28 %) präsentierten sich mit darauf hinweisender Symptomatik. Inzidentelle Tumoren waren signifikant kleiner als Symptomatische (4,8cm versus 6,8cm) und wiesen signifikant häufiger ein niedriges Tumorstadium (p<0,001) und eine günstigere Differenzierung auf (p<0,001). Zusätzlich kam es seltener zu Fernmetastasen sowie zum Befall regionaler Lymphknoten. Hinsichtlich der Verteilung von Alter und Geschlecht ergaben sich keine Unterschiede zwischen den beiden Gruppen. Therapeutisch ergaben sich in bezug auf die durchführbare Operationsart signifikante Unterschiede. Während bei immerhin 36,18% aller Patienten mit inzidentellen Tumoren eine Teilresektion durchgeführt werden konnte, war solch ein nierenerhaltendes Vorgehen nur bei 6,25% aller Patienten mit symptomatischen Tumoren möglich. Die Überlebenswahrscheinlichkeit erwies sich als signifikant besser für Patienten mit inzidentell diagnostizierten Tumoren (p<0,001), genauso wie für Tumoren mit besserem Differenzierungsgrad (p<0,001), günstigerem Staging (p<0,001) sowie geringerer Größe (p<0,001). In multivariater Analyse bestätigten sich nur Diagnoseart, Differenzierungsgrad und das Vorhandensein bzw. Nichtvorhandensein von Metastasen als unabhängige prognostische Variablen. Patienten, bei denen der Tumor zufällig anhand einer Routineuntersuchung in völlig asymptomatischem Stadium gefunden werden kann, haben demnach eine signifikant bessere Überlebenswahrscheinlichkeit. Aus diesem Grund sowie aus der Tatsache heraus, dass bisherige Ergebnisse systemischer Therapien die Langzeitüberlebensrate der Patienten mit fortgeschrittenen Nierenzellkarzinomen meist nicht verbessern können, bleibt die Frage der Notwendigkeit einer Screeninguntersuchung weiter bestehen. Jede Möglichkeit einer frühzeitigen Diagnose sollte genutzt werden. Hier bietet sich insbesondere die Sonographie als kostengünstigstes und nicht invasives Verfahren an. Inwieweit die Empfehlung einer generellen und flächendeckenden Screeningmaßnahme sinnvoll ist, wird allerdings weiterhin anhand ihrer Kosteneffizienz beurteilt und kann deshalb beim Nierenzellkarzinom aufgrund der doch vergleichsweise geringen Prävalenz nicht ausgesprochen werden. Doch erscheint die Forderung sinnvoll, die Nieren im Rahmen abdominaler Sonographien aus nichturologischen Gründen immer mit zu untersuchen. Die kurze Zeit, die dies für den geübten Untersucher in Anspruch nimmt, ist tolerierbar; vor allem im Hinblick auf den Benefit, den diese Untersuchung für den Patienten haben kann. Ebenso sinnvoll und realistisch erscheint, dass jeder Urologe zumindest bei seinen Patienten in regelmäßigen Abständen die Nieren schallt oder es Ihnen zumindest als entgeltliche IGeL Leistung anbietet. Die Entdeckung eines Nierentumors in einem frühen asymptomatischen Stadium erscheint sowohl hinsichtlich der Therapie als auch ihrer Prognose am günstigsten zu sein.
In der vorliegenden Arbeit wurde in einer Fall-Kontroll-Studie mit 295 Fällen und 327 Kontrollen das Gonarthroserisiko beim Heben und Tragen schwerer Lasten im Beruf untersucht. Dabei ergab sich eine statistisch signifikante Risikoerhöhung durch das kumulative Heben und Tragen schwerer Lasten. Ebenso ergab sich eine statistisch signifikante Risikoerhöhung durch die kumulative Dauer von Tätigkeiten im Knien/Hocken oder Fersensitz in Kombination mit dem kumulativen Heben und Tragen schwerer Lasten. Eine Dosis-Wirkungs-Beziehung war nachzuweisen, was für eine kausale Verknüpfung der Ereignisse spricht. Die Ergebnisse dieser Arbeit verweisen darauf, dass erhöhte BMI-Werte mit einem erhöhten Gonarthroserisiko assoziiert sind. Die Daten wurden deshalb für den BMI adjustiert. Bestimmte sportliche Tätigkeiten gehen mit einem erhöhten Verschleiss der Kniegelenke einher. Die Ergebnisse gaben diskrete Hinweise darauf, dass das Joggen oder die Leichtathletik den Kniegelenksverschleiss begünstigen. Deshalb wurden die Daten hinsichtlich dieser Ergebnisse adjustiert, und diese sportlichen Belastungen wurden als Störvariablen, confounder, behandelt. In der vorliegenden Arbeit konnte jedoch ein doppeltes Gonarthroserisiko bereits ab einem kumulativen Heben und Tragen von schweren Lasten im gesamten Berufsleben von über 5120kg*h aufgezeigt werden. Bei der Kombination von der kumulativen Dauer von Tätigkeiten im Knien/Hocken oder Fersensitz zwischen 4757 - <10800 Stunden oder dem kumulativen Heben und Tragen von schweren Lasten zwischen 5120 - <37000 kg*h konnte ein mehr als doppeltes Gonarthroserisiko dargestellt werden. Die vorliegende Arbeit liefert die Evidenz für die Annahme eines erhöhten Gonarthroserisikos beim Heben und Tragen schwerer Lasten.
Der Gestationsdiabetes steht in Zusammenhang mit einer erhöhten Morbidität für Mutter und Kind. Die maternale Hyperglykämie führt zur Erhöhung der kindlichen Blutglukose mit der Konsequenz eines fetalen Hyperinsulinismus. Die Folgen des erhöhten fetalen Insulinspiegels sind das Auftreten von prä- und postnatalen Komplikationen, wie z.B. Makrosomie, postpartalen Hypoglykämien sowie Atemstörungen. Angesichts dieser Tatsache liegt es nahe, diagnostische und therapeutische Strategien zu entwickeln, die es ermöglichen diese Stoffwechselstörung in ihrer Entstehung zu erkennen und überwachen zu können. Im Zentrum dieser Studie steht die pränatale Beurteilung der Dopplerindizes. Der Resistance-Index (RI-Wert) wird als möglicher prädiktiver Parameter für die maternale Stoffwechsellage und der Entwicklung des Kindes untersucht. In dieser Studie wurde nachgewiesen, dass bei den diätetisch eingestellten Gestationsdiabetikerinnen ein signifikant reduzierter RI-Wert, verglichen mit den Gesunden, bzw. Insulin-behandelten Gestationsdiabetikerinnen, zu verzeichnen ist. Die erhobenen Daten beziehen sich auf die letzten vorgeburtlich gemessenen RI-Werte. Bei den diätetisch eingestellten Gestationsdiabetikerinnen sinkt der RI Wert und zeigt eine statistische Signifikanz von p=0,002 zum gesunden Kollektiv. Die Indizes der mit Insulin behandelten Schwangeren unterscheiden sich hingegen nicht signifikant von denen der gesunden Frauen. Dies könnte auf bislang nicht untersuchte Insulinwirkung oder auf ein noch nicht näher charakterisiertes Kollektiv mit pathologischer Gen-Stoffwechselstörung zurückzuführen sein. Der Abfall des RI-Wertes zeigt in dieser Arbeit eine signifikante Korrelation mit der maternalen Stoffwechselsituation. Während sich ein gut eingestellter Gestationsdiabetes in der Doppler-Untersuchung nicht wesentlich von einer gesunden Schwangerschaft unterscheidet, können erniedrigte RI-Werte in Anbetracht der Ergebnisse dieser Studie als Hinweis auf eine Stoffwechselstörung gewertet werden. Die Änderung des Dopplerparameters (hier des RI-Wertes) kann im Sinne einer Prädiktion für eine Therapieeinleitung bzw. –änderung genutzt werden oder eine überwachende Funktion in der pränatalen Betreuung einnehmen. Dabei ist die Darstellung der fetalen Hämodynamik mit Hilfe der Indizes ein Bild für die Gefäßsituation des Kindes und seine Reaktion auf den mütterlichen Blutzuckerspiegel. In unserer Studie waren die Parameter der sonographischen Biometrie bei den stoffwechselerkrankten Müttern hinsichtlich der makrosomalen Tendenz deutlich verändert. Sowohl bei den diätetisch eingestellten, als auch den Insulin therapierten Schwangeren wurde eine Erhöhung des abdominalen Umfangs verzeichnet. Das postpartale Gewicht der Kinder bei diätetisch eingestellten Frauen lag signifikant höher (p=0,001) als bei den Neugeborenen der gesunden Mütter. Das Insulin-therapierte Kollektiv hingegen unterschied sich im Gewicht nicht von der Kontrollgruppe. Eine Korrelation zwischen dem RI-Wert und dem Geburtsmodus stellten wir nur bei dem Kontrollkollektiv (p=0,024) unterhalb der 40. SSW fest. Hier fanden wir eine signifikante Erhöhung der primären Sectiorate bei erhöhten RI-Werten. Die postpartale Blutzuckerkontrolle der Neugeboren brachten keine signifikanten Unterschiede zu Tage, ebenso wenig die Auswertung der 5 Minuten APGAR Werte. In dieser Studie konnten wir die Diagnostik und das Management des Gestationsdiabetes um einen möglicherweise prädiktiven Wert (RI-Index) erweitern. Desweiteren bestätigen unsere Daten bereits vorliegende Erkenntnisse wie z.B. die Tendenz zur Makrosomie. Ein neuer Aspekt dieser Arbeit ist die Korrelation des RI-Wertes mit der mütterlichen Stoffwechsellage sowie die positive Wirkung des Insulins auf das fetale Outcome. Mit den erarbeiteten Ergebnissen aus dieser Arbeit wird vorgeschlagen, dass die signifikante Senkung des RI-Wertes mit einer möglichen Störung der mütterlichen Stoffwechsellage in Zusammenhang gebracht werden kann.
Mikropumpeffekt an dynamisch belasteten Implantat-Abutment-Verbindungen : in vitro Untersuchung
(2009)
In der implantat-prothetischen Therapie vollzieht sich eine Weiterentwicklung und die Erforschung effizienter Implantat-Abutment-Verbindungen (IAV) gewinnt dabei stetig an Bedeutung. Mehrere In-vitro Untersuchungen haben festgestellt, dass sich ein Mikrospalt zwischen der prothetischen Plattform des Implantats und dem Boden des Abutments ausbildet. Ein Zusammenhang zwischen der konstruktiven Umsetzung der Implantat-Abutment-Verbindung und der Größe des Mikrospaltes konnte dabei eindeutig hergestellt werden. Die beschriebene Mikrospaltbildung und ein persistierendes entzündliches Infiltrat auf der Höhe des Implantat-Abutment-Interfaces werden als auslösende Faktoren für das Phänomen der krestalen Knochenresorption angesehen. Die genauen Mechanismen, wie es dazu kommt, sind bisher allerdings nicht aufgedeckt worden. In diesem Zusammenhang entsteht die Frage, ob die Mikrobeweglichkeit und damit der sich zyklisch öffnende und schließende Mikrospalt ein Einschwemmen des Speichels in das Implantatinnere ermöglicht. Zur Aufklärung dieser Frage wurde folgende These aufgestellt. Das Öffnen des Spaltes unter angelegter Kaubelastung führt zu einer Volumenänderung der Hohlräume im Inneren des Implantatkörpers. Diese Vergrößerung des Volumens erzeugt einen Unterdruck, der einen Ansaugmechanismus für den umgebenden Speichel auslöst. Das Nachlassen der Belastung bewirkt das Schließen des Spaltes und damit eine Verkleinerung des intraimplantären Volumens. Ein Rückstrom der Flüssigkeit in Richtung periimplantäres Gewebe ist dadurch möglich. Die erneute Belastung und damit das wiederholte Öffnen und Schließen des Spaltes setzt den vermuteten Mechanismus erneut in Gang. Diese Vorgänge erinnern an die Arbeitsweise einer Pumpe, daher wurde der Begriff eines "Mikropumpeffekts an der Implantat-Abutment-Verbindung" geprägt. Zur Überprüfung, ob ein solcher Effekt an der Implantat-Abutment-Verbindung existiert, wurden sechs handelsübliche Implantatsysteme in die vorliegende Untersuchung einbezogen. Die Implantatsysteme werden nach ihrer Verbindungsgeometrie in konische Verbindungen und Stoßverbindungen unterschieden. Getestet wurden drei konische Implantat-Abutment-Verbindungen (Ankylos®, Astra Tech®, Bego®, ITI Straumann® Bone Level) und drei Stoßverbindungen (Camlog®, SICace®, Xive® S plus). Für jedes System wurden fünf Prüfkörper hergestellt. Jeder Prüfkörper simulierte eine implantatgestützte Molarenkrone im Oberkiefer. Die umgebende Schleimhaut an der Implantat-Abutment-Verbindung wurde durch ein Polyether-Abformmaterial nachgeahmt. Im Inneren der künstlichen Schleimhaut wurde ein Flüssigkeitszugang geschaffen und ein speziell dafür entwickeltes speichelähnliches Röntgenkontrastmittel eingebracht. Während der Belastung in einem zweidimensionalen Kausimulator durchstrahlte ein konstanter und divergierender Röntgenstrahl die Prüfkörper. Durch die Umwandlung der Röntgenstrahlung in sichtbares Licht konnten mit einer Highspeed Digitalkamera Röntgenvideos aufgezeichnet werden. Deren Bewertung sollte Aufschluss darüber geben, ob ein Mikropumpeffekt am Implantat-Abutment-Interface entsteht. Die Auswertung der erstellten Röntgenvideos wurde insgesamt von drei Personen mit praktischer implantat-prothetischer Erfahrung unabhängig voneinander durchgeführt. Es hat sich herausgestellt, dass am Implantat-Abutment-Komplex keiner der hier getesteten Konusverbindungen ein Mikropumpeffekt nachgewiesen werden konnte, wohingegen bei allen hier einbezogenen Stoßverbindungen ein solcher Effekt sichtbar wurde. Bemerkenswert war dabei die Wechselwirkung zwischen dem sichtbaren Mikropumpeffekt und einem durch Mikrobeweglichkeit ausgelösten Mikrospalt am Implantat-Abutment-Interface. Ein Mikropumpeffekt konnte nur dann ausgelöst werden, wenn zuvor ein sichtbarer Mikrospalt zwischen dem Implantat und dem Abutment detektiert wurde. Somit kann der Mikropumpeffekt als eine direkte Konsequenz des Mikrospalts am Implantat-Abutment-Interface angesehen werden. Ein weiterer Aspekt beim Auftreten der beschriebenen Flüsigkeitsströmung an der Implantat-Abutment-Verbindung stellte die angelegte Kraft dar. Während bei dem SICace®-System ein Mikrospalt und ein Mikropumpeffekt ab einer Belastung von 50N auftrat, konnte dieser für das Camlog®-Implantatsystem erst bei einer angelegten Kraft von 75N nachgewiesen werden. Darüber hinaus zeigte das Xive®-System plus einen Mikropumpeffekt ab einer Belastung von 125N. Die konstruktive Umsetzung des Implantat-Abutment-Komplexes und die Höhe der angelegten Kaubelastung scheint demnach für das Auftreten bzw. Ausbleiben eines Mikropumpeffekts eine entscheidende Rolle zu spielen. Unter Berücksichtigung des aktuellen wissenschaftlichen Kenntnisstandes und den Ergebnissen dieser In-vitro Studie erscheint das Erklärungsmodell, nach dem der Mikropumpeffekt eine Ursache von krestaler Knochenresorption ist, als wahrscheinlich. Die Veränderung des periimplantären Gewebes, insbesondere ein Knochenabbau gilt als pathologisches Zeichen, das bis zum Implantatverlust fortschreiten kann. Auch im Hinblick auf Versorgungen in ästhetisch kritischen Kieferregionen und den ästhetisch anspruchsvolleren Patienten sorgt der Erhalt des krestalen Knochens als Grundlage für stabile Weichgewebsverhältnisse für eine höhere Erfolgswahrscheinlichkeit in der Weichgewebsästhetik. Erkenntnisse aus dieser und weiteren Grundlagenuntersuchungen sollten bei der Neu- und Weiterentwicklung des Implantat-Abutment-Komplexes angemessen berücksichtigt werden.
In einer retrospektiven Analyse wurden Patienten mit akuter myeloischer Leukämie, die in der Abteilung Hämatologie in der Universitätsklinik in Frankfurt am Main zwischen 1996 bis 1999 behandelt wurden und im Rahmen dieser Behandlung fieberhafte Infektionen entwickelt hatten, ausgewertet. Es wurden insgesamt 402 Episoden von 135 Patienten (76 Frauen und 59 Männer) mit AML auf geschlechtsspezifische Unterschiede im Infektionsverlauf untersucht. Hierbei wurde neben den Patientencharakteristika die Inzidenz der verschiedenen Infektionsklassifikationen, das Erregerspektrum (gram-positiv, gram-negativ, Pilzinfektion), die Therapie und das Therapieergebnis analysiert. Als Erfolgskriterien wurden die Entfieberung, sowie die Rückbildung von Infektionslokalisationen definiert. Die Therapieerfolge wurden eingeteilt in komplettes, partielles und fehlendes Ansprechen. In der vorliegenden Analyse wurden für den Infektionsverlauf wichtige Faktoren wie der Remissionsstand der Grunderkrankung, antibiotische Prophylaxe, G-CSF und die Neutropeniedauer untersucht, wobei sich hierbei keine signifikanten Unterschiede ergaben. Bei den Infektionsklassifikationen fiel auf, dass Männer signifikant mehr Pneumonien hatten und dass bei Frauen häufiger primäre Bakteriämien nachweisbar waren. Gram-positive Erreger traten insgesamt signifikant mehr bei Männern, gram-negative Erreger signifikant mehr bei Frauen auf. Nachgewiesene invasive Pilzinfektionen waren bei beiden Geschlechtern in ähnlichen Anteilen zu finden. Wegen der höheren Rate an Pneumonien bei männlichen Patienten (32,6 % versus. 18,1 %) haben diese mehr Amphotericin B und 5-Flucytosin erhalten, da bei Pneumonien ein hohes Risiko für Fadenpilzinfektionen besteht und dieses entsprechend in der empirischen Therapie berücksichtigt wurde. Eine endgültige Entfieberung trat bei insgesamt 95,5 % aller Episoden auf, wobei es keinen Unterschied zwischen männlichen und weiblichen Patienten gab. Der Anteil bei den weiblichen Patienten, die einen Rückgang der Infektlokalisation hatten, war signifikant höher verglichen mit den männlichen (90,9 % versus 52,5 %, p < 0,0001). Auch ein kompletter Rückgang der Infektlokalisation war in höherem Anteil bei Frauen als bei Männern zu verzeichnen (41 % vs 20,3 %). Insgesamt 12,7 % aller Infektepisoden führte zu einer Verlegung auf die Intensivstation, ein geschlechtsspezifischer Unterschied wurde nicht gefunden. In der Gesamtbeurteilung des Verlaufs der Infektionsepisoden war das komplette Ansprechen (82,3% vs 67,4%; p < 0,001) sowie die Ansprechrate insgesamt (komplett und partiell; 93% vs 79%; p < 0,0005) bei den weiblichen Patienten signifikant höher.
Ausgangspunkt dieser Dissertation ist die Frage: „Was ist fundamentaler als die Raum-Zeit?“ Nach Immanuel Kant sind aber Raum & Zeit als reine Formen der sinnlichen Anschauung „a priori“ aller Erfahrung und allen Denkens und konstituieren somit die „Bedingungen, unter denen Erfahrung erst möglich ist“. Im Jahre 1941 hat Konrad Lorenz diese Apriori biologisch interpretiert und damit das Konzept einer Evolutionären Erkenntnislehre formuliert. Deren Hauptthese lautet: „Unser Erkenntnis-Apparat ist ein Ergebnis der Evolution. Die Subjektiven Erkenntnisstrukturen passen auf die Welt, weil sie sich im Laufe der Evolution in Anpassung an eben diese reale Welt herausgebildet haben. Sie stimmen mit den realen Strukturen (teilweise) überein, weil nur eine solche Übereinstimmung das Überleben ermöglichte.“ Wendet man dies auf die Erfahrung von Raum & Zeit an, so gelangt man zur Kognitionswissenschaft von Raum & Zeit. Das Ergebnis der Analyse der Kognition von Raum & Zeit lässt sich wie folgt zusammenfassen. Im Kognitiven System des Menschen gibt es mehrere Informationsrepräsentationssysteme. Ein Sprachlichlogisches Repräsentationssystem, ein Nonverbales Repräsentationssystem zur Speicherung von Multimodalen Spatiotemporalen Informationen und ein Internes Repräsentationssystem zur Speicherung von Subjektiven Informationen über interne Körperzustände. Das Multimodal-Spatiotemporale Repräsentationssystem lässt sich dann weiter in Modalitätsspezifische Repräsentationssysteme für die einzelnen Sinnesmodalitäten und ein Amodales Repräsentationssystem für Spatiotemporale Information untergliedern. Letzteres ist weiter in Amodale Repräsentationssysteme für Reinräumliche Informationen, Spatiotemporale Informationen & Reinzeitliche Informationen untergliedert. Mit dem Reintemporalen Repräsentationssystem hat dieses Amodale Repräsentationssystem auch Anteil am Internen Körperrepräsentationssystem. Für die Kognition der Zahlen kommt nur noch ein Zahlenrepräsentationssystem für die Zahlen 1-3 als eigenständiges Repräsentationssystem hinzu. Alle anderen Zahlenrepräsentationen benutzen das Räumliche oder das Sprachlichlogische Repräsentationssystem. Alle diese Repräsentationssysteme sind das Ergebnis von Phylogenetischen, Ontogenetische & Psychogenetischen Entwicklungsprozessen. Aus diesen Erkenntnissen wird anschließend untersucht, naturphilosophische Konsequenzen für die Raum-Zeit-Physik ergeben. Insbesondere geht es um die Frage von Gerhard Vollmer, die lautet: „Nach der Evolutionären Erkenntnistheorie sind die subjektiven Strukturen des Erkenntnis-Apparates für die Erkenntnis konstitutiv. Gilt dies für alle Stufen des Erkenntnis-Prozesses?“ Das Ergebnis dieser Analyse ist, dass das Visuospatiotemporale Informationsrepräsentationssystem die Kognitive Basis der Physikalischen Theorien mit Klassischem Materiekonzept bildet, mit dessen Hilfe das Visuell-Nonverbale Sensomotorische System diese Theorien mit Hilfe von Kognitionsprozessen aus Interaktionen mit der Physikalischen Außenwelt konstruiert hat. Darüber hinaus beruhen diese Theorien auch auf dem Sprachlichlogischen Informationsrepräsentations-System als Kognitiver Basis und sind das Produkt von Kognitiven Math. Basisfähigkeiten, mit deren Hilfe sie ebenfalls aus Interaktionen mit der Physikalischen Außenwelt abgeleitet wurden. Dabei dominiert das Visuospatiotemporale Informationsrepräsentationssystem in der Kognitiven Basis gegenüber dem Sprachlichlogischen Informationsrepräsentationssystem eindeutig! Auch die Quantenmechanik hat diese beiden Informationsrepräsentationssysteme als Kognitive Basis. Allerdings dominiert hier das Sprachlichlogische Informationsrepräsentationssystem gegenüber dem Visuospatiotemporalen Informationsrepräsentationssystem! Da das Sprachlichlogische Informationsrepräsentationssystem aber ein Symbolisches Informationsrepräsentationssystem ist, bedarf es zu seiner Funktionsfähigkeit der Abbildung seiner Symbole auf Informationsstrukturen des Multimodalen Spatiotemporalen Informationsrepräsentationssystems, damit die mit seiner Hilfe repräsentierten Sprachlichlogischen Informationen überhaupt Teil des Informationellen Modells der Außenwelt des Kognitiven Systems sein können. Damit lässt sich die oben gestellte Frage wie folgt beantworten: Ja, diese Kognitiven Strukturen sind nicht nur für die Ebenen der Wahrnehmungs- & Erfahrungserkenntnis konstitutiv, sondern für alle Stufen des Erkenntnisprozesses. Das heißt: „Auch die Wissenschaftliche Erkenntnis ist biologisch/genetisch determiniert!“
Tumoren epithelialen Ursprungs weisen häufig eine vermehrte Expression und/oder Mutationen des epidermalen Wachstumsfaktor-Rezeptors (EGFR) auf. Durch die übermäßig starke bzw. permanente Vermittlung von Überlebens- und Proliferationssignalen an die betroffene Zelle trägt dies direkt zum Voranschreiten der Tumorerkrankung bei. Für eine Reihe von Tumorentitäten ist bekannt, dass eine abnorme Expression von EGFR mit einer schlechteren Prognose für den Krankheitsverlauf und die mittlere Überlebenszeit betroffener Krebspatienten korreliert. Begleitend zur systemischen Chemotherapie solcher Tumoren wird eine gerichtete Therapie zur Eindämmung der EGFR-vermittelten Signaltransduktion durch den Einsatz von Tyrosinkinase-Inhibitoren (TKI) oder EGFR-spezifischer monoklonaler Antikörper (mAb) erzielt. Bei der therapeutischen Anwendung monoklonaler anti-EGFR Antikörper wurden in einigen Fällen lediglich milde Nebenwirkungen wie z.B. Hautausschläge beobachtet, wobei das Auftreten dieser Effekte mit dem Therapieerfolg korrelierte. Eine Reihe von monoklonalen Antikörpern, die gegen ErbB Rezeptor-Tyrosinkinasen gerichtet sind, sind mittlerweile zur Tumortherapie zugelassen, darunter der chimäre anti-EGFR Antikörper Cetuximab (Erbitux®, ImClone/BMS/Merck) zur Behandlung von metastasierenden Kolonkarzinomen sowie Karzinomen des Kopf- und Halsbereichs, der humane anti-EGFR Antikörper Panitumumab (Vectibix®, Amgen) bei metastasierenden Kolonkarzinomen, und der humanisierte anti-ErbB2 Antikörper Trastuzumab (Herceptin®, Genentech/Roche) bei Brustkrebs. Weitere Antikörper befinden sich derzeit in fortgeschrittenen Phasen der klinischen Entwicklung, darunter der humanisierte anti-EGFR Antikörper Matuzumab (Merck/Takeda). Klinische Daten zeigen, dass Patienten mit EGFR positiven Tumoren, die gegenüber etablierter Chemotherapie resistent sind, von der Behandlung mit anti-EGFR Antikörpern profitieren. Durch aktivierte EGF-Rezeptoren induzierte mitogene Signale werden vermindert bzw. blockiert, indem die Antikörper mit hoher Affinität an ErbB Rezeptoren auf der Zelloberfläche binden und die Ligandenbindung bzw. die Dimerisierung verhindern, die zur Bildung aktivierter Rezeptor Dimere nötig ist. Auf diese Weise wird die mitogene Signalübertragung aktivierter ErbB-Rezeptor Dimere verhindert und die Proliferation der Tumorzelle wird verlangsamt oder kommt zum Stillstand. Es gibt Hinweise, dass darüber hinaus sekundäre Effektormechanismen des Immunsystems wie die antikörperabhängige zellvermittelte Zytotoxizität (ADCC) oder die komplementabhängige Zytotoxizität (CDC) gegen Antikörper-markierte Tumorzellen die anti-tumorale Wirksamkeit dieser Antikörper noch verstärken. Die lebensverlängernde Wirkung der Behandlung mit diesen Antikörpern ist ein Beispiel für die erfolgreiche Anwendung einer zielgerichteten Krebstherapie durch passive Immuntherapie. Zu Beginn dieser Arbeit waren die genauen Bindungsstellen der therapeutischen anti-EGFR Antikörper Cetuximab und Matuzumab noch unbekannt. Die Kenntnis der Lage der Epitope auf dem EGFR Molekül könnte wichtige Hinweise zur Aufklärung der Wirkungsmechanismen dieser Antikörper liefern und Ansätze zur weiteren Optimierung dieser Therapeutika aufzeigen. Aus vorangegangenen Experimenten war bekannt, dass Cetuximab und Matuzumab Epitope auf dem EGFR erkennen, die eine intakte Raumstruktur des Rezeptors voraussetzen. Diese Beobachtungen konnten in dieser Arbeit bestätigt werden, ferner konnte die Lage der Epitope auf die EGFR Ektodomäne III/L2 eingegrenzt werden. Da sowohl Cetuximab als auch Matuzumab nicht-lineare, konformationelle Epitope erkennen, wurde eine Variante der Phage Display Methode zur Identifizierung von Peptiden gewählt, die mit den hypervariablen Regionen (CDR) dieser Antikörper interagieren, welche die Bindungsspezifität der Antikörper vermitteln. Ziel dieser Experimente war die Identifizierung von Peptiden, welche die konformationellen Epitope von Cetuximab bzw. Matuzumab in linearer bzw. zyklisch restringierter Form nachbilden. Die Aminosäuresequenzen solcher sogenannter Mimotope könnten zur Identifizierung entsprechender Oberflächenstrukturen am EGFR Molekül herangezogen werden. In der vorliegenden Arbeit wurden aus kommerziell erhältlichen Bibliotheken genetisch modifizierter M13 Bakteriophagen, die randomisierte lineare bzw. zyklische Peptide als N-terminale Fusion am Oberflächenprotein pIII exponieren (M13KE), unter Anwendung der „Delayed Infectivity Panning“ (DIP) Methode Peptide angereichert, die von Cetuximab bzw. Maztuzumab erkannt werden. Zur Anreicherung von M13KE Bakteriophagen mit CDR-spezifischen Fusionspeptiden mittels DIP wurde zunächst ein „single-chain“ Antikörperfragment aus der cDNA von Matuzumab konstruiert und in den bakteriellen Expressionsvektor pIB-Tx kloniert. Mit dem resultierenden Konstrukt pIB-Tx-scFv(E72K) bzw. dem bereits vorhandenen analogen Konstrukt pIB-Tx-scFv(225), welches das „single-chain“ Antikörperfragment von Cetuximab enthält, wurden E. coli HB101 Bakterien transformiert, um die bakterielle Oberflächenexpression dieser Antikörperfragmente zum Einsatz in DIP Experimenten zu erreichen. In alternierenden positiven und negativen Selektionsrunden wurden unter Einsatz dieser scFv-exprimierenden E. coli HB101 Bakterien in Biopanning Experimenten Phagen mit solchen Fusionspeptiden angereichert, die selektiv an die „single-chain“ Antikörperfragmente von Cetuximab bzw. Matuzumab binden. Phagen ELISA Experimente mit M13KE Einzelklonen zeigten, dass aus allen eingesetzten Bibliotheken Phagen mit Fusionspeptiden isoliert werden konnten, die an den jeweiligen parentalen Antikörper des zur Selektion eingesetzten „single-chain“ Antikörperfragmentes binden. Ein Teil der Phagenklone wies eine zumindest partielle Kreuzreaktivität zu dem entsprechenden anderen anti-EGFR Antikörper auf, obwohl sie auf Bindung an diesen nicht selektioniert worden waren. Die Sequenzanalyse der Fusionspeptide lieferte keine gemeinsame Consensus Sequenz, es konnten jedoch kurze, gemeinsame Sequenzmotive identifiziert werden. In MTT-Zytotoxizitätsassays wurden diese Klone als mögliche Kompetitoren der Bindung des gegen EGFR gerichteten Immuntoxins scFv(225)-ETA in MTT-Zytotoxizitätsassays eingesetzt. Ein Teil der selektionierten Fusionspeptide war in der Lage, die Bindung der aus dem „single-chain“ Antikörperfragment von Cetuximab scFv(225) bestehenden Zellbindungsdomäne des Immuntoxins scFv(225)-ETA an EGFR exprimierende Zellen zu kompetieren. Auch für einige Fusionspeptide, die zunächst nur auf Bindung an Matuzumab selektioniert worden waren, wurde dies beobachtet. Peptide, welche die Bindung des Immuntoxins an EGFR kompetieren, weisen in ihren pIII-Fusionspeptiden laut Sequenzanalyse die gemeinsamen Sequenzmotive KTL bzw. YPLG auf. Nach einem Abgleich der Sequenzen der kompetierenden, kreuzreaktiven Peptide mit KTL bzw. YPLG Motiven wurden zwei Peptide ausgewählt und zur Immunisierung von Kaninchen eingesetzt. In MTT-Zytotoxizitätsassays wurde zunächst bestätigt, dass die synthetischen Peptide in der Lage sind, durch Kompetition spezifisch die Bindung des gegen EGFR gerichteten Immuntoxins scFv(225)-ETA und dessen zytotoxische Wirkung auf EGFR exprimierende Zellen zu verhindern. Kaninchenseren und aus diesen affinitätsgereinigte anti-Peptid Antikörper zeigten in ELISA Experimenten konzentrationsabhängige Bindung an die immobilisierten synthetischen Peptide. Die Bindung der anti-EGFR Antikörper Cetuximab und Matuzumab an die synthetischen Peptide konnte ebenfalls bestätigt werden. In einer Reihe von Experimenten wurde untersucht, ob die Immunisierung mit potentiellen Mimotopen der anti-EGFR Antikörper eine endogene humorale Immunantwort gegen den humanen EGFR bewirkt hatte. Die Bindung der affinitätsgereinigten anti-Peptid Antikörper an den Rezeptor auf der Oberfläche EGFR-exprimierender Tumorzellen wurde zunächst in Durchflusszytometrie (FACS) Experimenten analysiert. Für die gereinigten anti-Peptid Antikörper wurde spezifische Bindung an murine Renca-lacZ/EGFR Zellen sowie an humane A431 Vulvakarzinomzellen detektiert, die den humanen EGFR auf der Oberfläche exprimieren. Die Bindung an A431 konnte durch Vorinkubation der Antikörper mit einem Überschuss der entsprechenden synthetischen Peptide vollständig verhindert werden. In einer weiteren Serie von FACS Experimenten konnte gezeigt werden, dass die Bindung der Antikörper Cetuximab und Matuzumab an EGFR durch eine Vorinkubation von Renca-lacZ/EGFR Zellen mit den gereinigten anti-Peptid Antikörpern deutlich reduziert werden konnte. Dies ist ein Beweis für die Fähigkeit der in Immunisierungsexperimenten generierten anti-Peptid Antikörper, die Bindungsstellen von Cetuximab und Matuzumab am EGFR zumindest teilweise zu besetzen. Diese Beobachtungen zeigen, dass durch Immunisierung mit den hier ausgewählten synthetischen Peptiden in Versuchstieren die Bildung von Antikörpern mit ähnlichen Eigenschaften wie Cetuximab bzw. Matuzumab und somit eine endogene Immunantwort gegen den humanen EGFR ausgelöst werden konnte. In Immunfluoreszenz Experimenten wurde die Bindung der anti-Peptid Antikörper an Renca-lacZ/EGFR Zellen erneut überprüft und mittels konfokaler Laser Scanning Mikroskopie (CLSM) visualisiert. In diesen Experimenten wurde für gereinigte anti-Peptid Antikörper (KTL Motiv bzw. YPLG Motiv) Bindung an die Zelloberfläche bzw. membrannahe intrazelluläre Strukturen beobachtet, die der Lokalisierung der Bindungssignale der parallel getesteten anti-EGFR Antikörper Cetuximab, Matuzumab und dem murinen anti-EGFR Antikörper R-1 entsprach. Die Bindung der anti-Peptid Antikörper konnte durch Zugabe eines Überschusses der jeweiligen synthetischen Peptide verhindet werden. In einer weiteren Serie von Immunfluoreszenz Experimenten wurde der humane EGFR auf Renca-lacZ/EGFR Zellen gleichzeitig mit anti-KTL bzw. anti-YPLG Peptid Antikörpern aus Kaninchen sowie dem murinen anti-EGFR Antikörper R-1 detektiert. Durch eine Überlagerung der Signale konnte eindeutig eine Kolokalisation nachgewiesen werden. Dies ist ein Beweis dafür, dass es sich bei der Bindung der anti-Peptid Antikörper an die Oberfläche von Renca-lacZ/EGFR um Bindung an den humanen EGFR handelt. In Lysaten von EGFR exprimierenden Zelllinien konnte mit gereinigten anti-Peptid Antikörpern ein Protein detektiert werden, dessen Größe dem humanen EGFR entspricht. Die durch Stimulation des humanen EGFR mit dem natürlichen Peptidliganden EGF hervorgerufene Autophosphorylierung des Rezeptors in A431 Zellen konnte durch Zugabe von anti-Peptid Antikörpern teilweise inhibiert werden, allerdings nicht in dem gleichen Ausmaß, wie dies für die als Positivkontrollen eingesetzten anti-EGFR Antikörper Cetuximab und Matuzumab beobachtet wurde. In MTT-Zytotoxizitätsassays konnte darüber hinaus eine teilweise Kompetition der Bindung des rekombinanten Toxins TGF!-ETA an EGFR-exprimierende A431 Zellen, und somit eine teilweise Kompetition des natürlichen Peptidliganden TGF! an EGFR durch Vorinkubation mit anti-Peptid Antikörpern nachgewiesen werden. Zur näherungsweisen Quantifizierung der Affinitäten der anti-Peptid Antikörper und der anti-EGFR Antikörper Cetuximab und Matuzumab für die synthetischen Peptide (KTL Motiv und YPLG Motiv) bzw. für die gereinigte extrazelluläre Domäne des humanen EGFR (sEGFR) wurden ELISA Bindungstests durchgeführt. Die aus den Bindungskurven berechneten Affinitätswerte zeigen, dass die anti-Peptid Antikörper an sEGFR im nanomolaren Bereich binden und damit ca. 200-fach niedrigere Affinitäten für den Rezeptor besitzen als die affinitätsoptimierten anti-EGFR Antikörper Cetuximab bzw. Matuzumab. Die Affinitäten der anti- Peptid Antikörper für die synthetischen Peptide liegen ebenfalls im nanomolaren Bereich, während Cetuximab und Matuzumab lediglich mikromolare Affinitäten für die Peptide besitzen. Durch „Epitope Mapping“ in silico vorhergesagte mögliche Oberflächenstrukturen auf EGFR, welche die Peptidmimotope mit KTL bzw. YPLG Motiven nachbilden, sind direkt benachbart zu den mittlerweile publizierten Bindungsstellen von Matuzumab und Cetuximab bzw. EGF in der Ektodomäne III/L2 von EGFR (Li et al., 2005; Schmiedel et al., 2008) und zeigten im Falle des Peptides mit KTL Motiv Übereinstimungen mit Teilen beider Epitope. Möglicherweise ist dieses Peptid in der Lage, alternative Strukturen mit KTL bzw. KTI Motiven an der Oberfläche von EGFR nachzubilden, die Gemeinsamkeiten mit beiden Epitopen von Cetuximab bzw. Matuzumab besitzen und daher von beiden Antikörpern erkannt werden können. Eine endgültige Klärung der Bindung der hier identifizierten Peptide an Cetuximab bzw. Matuzumab bzw. der Bindung der anti-Peptid Antikörper an EGFR könnte in nachfolgenden Untersuchungen mittels Röntgenkristallographie bzw. NMR strukturell aufgeklärt werden – die hierzu nötigen Peptide bzw. Proteine liegen bereits in gereinigter Form vor. Eine Optimierung der hier identifizierten Mimotope zur Steigerung der Affinitäten der induzierten anti-Peptid Antikörper für EGFR könnte zur Entwickung von Vakzinen führen, die eine Alternative zur wiederholten, kostenintensiven passiven Immunisierung von Patienten mit EGFR-exprimierenden Tumoren mit monoklonalen Antikörpern darstellen könnte.
Die Entzündung ist eine grundlegende und lebensnotwendige Reaktion unseres Immunsystems. Leukozyten wandern aus der Blutbahn an die Orte des entzündlichen Geschehens. Für diesen Prozess der Extravasation sind Adhäsionsmoleküle notwendig, die den gesamten Vorgang vom ersten Kontakt mit dem Endothel bis zur Transmigration durch die Basalmembran vermitteln. Eines dieser Moleküle ist das Junctional adhesion molecule-B (JAM-B), ein Immunglobulin-ähnliches Adhäsionsmolekül. JAM-B ist an der Transmigration von Leukozyten beteiligt, es bindet an T-Lymphozyten und speziell das Integrin VLA-4 (alpha4beta1) unter Beteiligung des verwandten JAM-C. JAM-B befindet sich bevorzugt im Bereich der lateralen Zellmembran von Endothelzellen, kann aber nach Stimulation mit TNFalpha auch auf der apikalen Membranseite gefunden werden. Diese Arbeit behandelt die Fragestellung, ob JAM-B auch in der frühen Phase der Extravasation mit T-Lymphozyten in Kontakt treten kann. Zuerst wurde untersucht, ob JAM-B unter dynamischen Bedingungen mit T-Lymphozyten in Kontakt treten kann. Die T-Lymphozyten wurden aus Leukozytenkonzentraten extrahiert. Sie wurden über eine mit JAM-B Protein beschichtete Glasoberfläche perfundiert und die Anzahl der rollenden Zellen, deren Geschwindigkeit und die Zahl der adhärenten Zellen bestimmt. Als Negativkontrolle diente ein mit unspezifischem Protein (BSA) beschichtete Oberfläche. Um die Rolle des möglichen Bindungspartners VLA-4 zu charakterisieren, wurden die T-Lymphozyten mit monoklonalen Antikörpern gegen VLA-4 oder der beta1 Untereinheit dieses Integrins oder JAM-C inkubiert. Von allen Antikörpern wurden zudem entsprechende Isotypkontrollen durchgeführt. In diesen Versuchen konnten bereits publizierte Beobachtungen reproduziert werden: So adhärierten die T-Lymphozyten bevorzugt auf JAM-B im Vergleich zur Kontrolle mit unspezifischem BSA. Antikörper gegen VLA-4 und beta1 Integrin vermochten die Zahl adhärenter Zellen signifikant zu senken. Es zeigte sich außerdem, dass auf JAM-B vermehrt Zellen rollten und deren Geschwindigkeit im Durchschnitt niedriger war. Damit fanden sich erstmals Hinweise darauf, dass JAM-B auch unter dynamischen Bedingungen an T-Lymphozyten bindet. Antikörper gegen VLA-4 oder beta1 Integrin führten das Rolling auf das Niveau der Kontrolle zurück. Ein JAM-C Antikörper hatte keinen Effekt, sodass JAM-B vermitteltes Rolling und Adhäsion möglicherweise unabhängig von JAM-C sind. In weiteren Experimenten wurde die Relevanz dieser Interaktionen in einer Flusskammer mit Endothelzellbeschichtung untersucht. Auf einem speziellen Objektträger mit Flusskanal wurden humane Endothelzellen (HUVEC) angezüchtet und vor Versuchsbeginn mit TNFalpha inkubiert. Anschließend wurde ein monoklonaler Antikörper gegen JAM-B aufgebracht und T-Lymphozyten durch die Flusskammer perfundiert. Die Auswertung erfolgte anhand der Parameter aus dem ersten Flusskammerexperiment. Der JAM-B Antikörper verminderte das Rolling signifikant im Vergleich zur Leerkontrolle und führte zur Erhöhung der Rollgeschwindigkeit dieser Zellen. Die Zahl adhärenter Zellen vermochte er nicht zu senken. Wenn JAM-B durch Stimulation auf der Oberfläche von Endothel exprimiert wird, kann es also an der Extravasation von T-Lymphozyten beteiligt sein. Die Daten zeigen, dass JAM-B mit T-Lymphozyten unter dynamischen Bedingungen interagieren kann und deuten darauf hin, dass es an der Extravasation beteiligt ist. Die Antikörper konnten bei Einzelgabe die Zahl adhärenter Zellen nicht senken. Möglicherweise ist dies Folge der kompensatorischen Wirkung anderer Adhäsionsmoleküle. In vivo Experimente unterstützen die These von der Beteiligung des JAM-B an der Entzündungsreaktion. Ein monoklonaler Antikörper konnte das entzündliche Infiltrat in einem Mausmodell von Kontakthypersensitivität vom Spättyp reduzieren. Da in der vorliegenden Arbeit der Antikörper die Zahl adhärenter Zellen nicht verringern konnte, kommen möglicherweise andere Mechanismen in Betracht. Für JAM-C wurden ähnliche Daten erhoben, hier lag die Ursache der milderen Entzündungsantwort nicht in einer verringerten Zahl eingewanderter Zellen. Die Blockade führte vielmehr zur vermehrten Rückwanderung der Zellen aus dem Entzündungsgebiet. Möglicherweise liegt bei JAM-B ein ähnlicher Mechanismus vor. JAM-B erfüllt als phylogenetisch altes Molekül verschiedene Aufgaben bei der Extravasation. Sein Expressionsmuster auf Endothel, besonders der lymphatischen Gefäße, macht es als Ziel für innovative anti-inflammatorische Therapieansätze interessant.
Das Ziel dieser Dissertation war die Suche nach Drogenkonzentrationen, ab denen ein signifikanter Anstieg der Unfallraten im Straßenverkehr zu beobachten ist. Hierüber sollte die Grenzwertforschung für Drogen vorangetrieben werden, um für diese in Zukunft einen Grenzwert analog dem des Alkohols zu finden. Dies galt in besonderem Maße der Droge Cannabis, da diese zweifelsfrei die am häufigsten konsumierte illegale Substanz darstellt. Auswertungsgrundlage bildete dabei ein großes Kollektiv von 20.458 auffällig gewordenen Verkehrsteilnehmern, welche seit dem Jahre 1995 vom Institut für Forensische Toxikologie der Johann Wolfgang Goethe-Universität Frankfurt am Main registriert und seit 1997 in einer Datenbank verzeichnet worden waren. Diese Personen sollten auf diverse Parameter, wie beispielsweise Alter, Geschlecht und Art des begangenen Deliktes bei Vorliegen bestimmter Konzentrationen berauschender Substanzen untersucht werden. ... Dabei war auf sämtliche allgemein bekannten Drogen wie beispielsweise Cannabis, Kokain, Opiate und Amphetamine, sowie einige Medikament hin untersucht worden. Vorteil dieses Datenmaterials war die Fähigkeit zur Abbildung der Realität, was drogenassoziierte Ereignisse im Straßenverkehr betrifft. Nachteil war ein mangelndes nüchternes Vergleichskollektiv, das in der Lage gewesen wäre, die nüchtern am Verkehr teilnehmende Allgemeinheit abzubilden, da sämtliche Personen der Selektion durch die Polizei aufgrund des Merkmals „Verkehrsauffälligkeit“ unterlegen hatten. Als statistische Auswertungsmethode bot sich aufgrund der Beschaffenheit des Datenmaterials die so genannte Konfigurationsfrequenzanalyse (KFA) an, welche als komplexe Erweiterung der Kreuztabellenanalyse aufgefasst werden kann. Hierüber war aber zusätzlich eine Identifizierung einzelner, statistisch signifikant über- oder unterfrequentierter Werte möglich. Weiterhin wurden die unterschiedlichsten Risikoanalysen mittels Berechnung des Odds Ratio durchgeführt, um bestimmte stärker gefährdete Gruppen bzw. den Verkehr stärker gefährdende Drogen identifizieren zu können. Die Datenlage dieser Arbeit wies stellenweise große Ähnlichkeiten zu Ergebnissen anderer Studien auf. Andererseits kollidierten einige Befunde mit bisher bekannten Ansichten. Bei einer insgesamt von 14 bis 94 Lebensjahren reichenden Spanne, waren doch die meisten verzeichneten Personen zwischen 18 und 34 Jahre alt, wobei insgesamt der Männeranteil mit 93 % deutlich überwog. Allerdings wiesen Frauen bzgl. des Gesamtkollektivs eine größere Assoziation mit Unfallgeschehen auf. Dagegen war dieses Verhältnis in der Gruppe der Cannabiskonsumenten eindeutig umgekehrt. Eine Assoziation zu Unfällen zeigten sich darüber hinaus bei Betrachtung der Gesamtdatenbank, besonders bei Personen über 34 Jahren. Bei Vergleichsanalysen des Unfallrisikos bestimmter Drogen und Alkohol, konnte keine Droge das ermittelte Risiko des Alkohols auf den Verkehr übertreffen. Besonders der Vergleich zu Cannabis könnte nun aber vorschnell zu dem Schluss führen, dass von diesem keine Gefährdung des Straßenverkehrs ausgeht, da hier im Vergleich zu den übrigen Substanzen die geringste Assoziation zu Unfällen vorlag. Allerdings gilt hier erneut zu betonen, dass aufgrund des fehlenden nüchternen Vergleichskollektivs eine Aussage über die Gefährlichkeit von Cannabis im Straßenverkehr nur im Vergleich zu anderen berauschenden Mitteln möglich war. Eine Kalkulation des absoluten Risikos einer Droge war somit nicht möglich. Nach den vorliegenden Daten ereignet sich der typische Drogenunfall relativ unabhängig vom Alter, abhängig vom männlichen Geschlecht, nicht selten unter Mischkonsum diverser Substanzen und vor allem bei Nacht. Grundsätzlich fiel im Verlauf der Datenanalyse, trotz des ursprünglich auf Drogen – vornehmlich Cannabis - fokussierten Interesses, regelmäßig der Alkohol durch seinen starken Zusammenhang mit Verkehrdelikten auf. Während der Analysen zeichneten sich darüber hinaus bezüglich einiger Substanzen erstaunliche Ergebnisse ab, welche häufigere Unfallraten bei niedrigeren Drogenkonzentrationen demonstrierten. Es ergab sich ein bislang in der Forschung wenig beachteter Gedankenansatz, der zur These führte, dass möglicherweise drogennaive Personen aufgrund einer kaum ausgebildeten Toleranz gegenüber den konsumierten Substanzen, eher in Verkehrsdelikte wie Unfälle involviert sind, als drogenadaptierte Dauerkonsumenten. Fraglich ist aber, wie mit dieser Information in der Praxis umgegangen werden könnte. Es ergäbe sich folgendes Dilemma: für die Bewertung der tatsächlichen Leistungseinbußen eines Fahrers unter dem Einfluss von Drogen, müsste auch sein Konsummuster berücksichtigt werden. Diese Rechtsprechung existiert allerdings derzeit für kein berauschendes Mittel, ebenfalls nicht für Alkohol, obwohl hier ebenfalls von geringeren Leistungseinbußen durch Toleranzentwicklung ausgegangen werden kann. Das Dilemma bestünde somit in der Kollision von Wissenschaft und Ethik. Wissenschaftlich wäre es also sicher richtig einen Gelegenheitstrinker mit einer bestimmten Alkoholkonzentration im Blut als weniger fahrtüchtig zu erachten, als einen toleranten Alkoholiker mit gleicher BAK. Doch neben ethischen Bedenken und Fragen nach Gerechtigkeit findet dieser Gedanke seine Grenze schon allein bei der Vorstellung nach der praktischen Durchführbarkeit. So sollte diese Arbeit nicht als Schlusswort in der Diskussion um Alkohol und Drogen im Straßenverkehr angesehen werden, sondern vielmehr zu weiteren Untersuchungen in dieser Richtung anregen. Diese Notwendigkeit ergibt sich allein aus den Tatsachen, dass Drogen im Straßenverkehr präsent und Unfälle mit diesen assoziiert sind. Weiterhin konnte bisher stets nach Einführung gesetzlicher Regelungen, wie beispielsweise den Promillegrenzen beim Alkohol, ein Rückgang der Verkehrstoten verzeichnet werden. Da sich bei den Personen des Kollektivs dieser Arbeit die meisten Unfälle vor allem im Bereich legaler Alkoholisierungen ereignet hatten, sollten weitere Überlegungen und Untersuchungen prüfen, ob nicht konsequenterweise die Einführung einer 0,0 Promillegrenze gerechtfertigt, wenn nicht sogar notwendig ist, um die Sicherheit auf den Straßen ein weiteres Stück voran zu treiben.
Im Rahmen der vorliegenden Studie wurde zunächst eine sensitive Nachweismethode für HPV aus Biopsien etabliert. Auch der Nachweis aus Abstrichen ist möglich, hierbei muss aber darauf geachtet werden, dass genügend Zellmaterial gewonnen wird. Hierzu eignen sich Bürstenabstriche, von Abstrichen mit Wattetupfern sollte Abstand genommen werden, da die Zellausbeute zu gering ist (siehe 4.1). Des Weiteren wurde das Vorkommen von HPV bei Tonsillitis, Tonsillen-CA und klinisch unauffälligen Tonsillen in unserem Patientengut verglichen. Aufgrund der geringen Patientenzahlen ist eine statistische Aussage nicht möglich, es zeigt sich aber, dass in jeder der Gruppen HPV nachgewiesen werden kann. Vergleicht man die beurteilbaren Ergebnisse der Gelelektrophorese, so zeigen sich 33% der Tumorproben HPV-positiv, bei den klinisch unauffälligen Tonsillen sind 60% positiv, bei den Tonsillitiden sogar fast 70%. Diese Ergebnisse zeigen, dass HPV nicht erst in Tumoren nachweisbar ist, sondern bereits in klinisch unauffälligen Geweben. Auch deuten die Ergebnisse darauf hin, dass die Infektion mit HPV wohl schon im Kindesalter erfolgt.
Ein zentrales Ergebnis dieser Studie war, dass viele Patienten ein hohes Maß an Lebens-qualität zeigten. Verglichen mit anderen hämatologisch-onkologischen Kollektiven lag die Lebensqualität der Patienten dieser Studie deutlich näher bei den Werten der gesunden Normalbevölkerung. Als signifikant negative Einflussfaktoren auf die verschiedenen Dimensionen der Lebensqualität zeigte sich die allogene Stammzelltransplantation und ein Alter > 55 Jahren. Stammzelltransplantierte und ältere Patienten waren nicht nur häufiger durch Begleiterkrankungen belastet, sondern auch signifikant stärker in ihrer körperlichen und Rollen-Funktion eingeschränkt. In beiden Gruppen fanden sich zudem eine signifikant stärkere Fatigue-Ausprägung und größere finanzielle Schwierigkeiten. Während die globale Lebensqualität älterer Patienten signifikant schlechter war, hatte die Stammzelltransplantation interessanterweise keinen negativen Einfluss auf die Lebensqualität. Die Lebensqualität von SZT-Patienten korreliert also anscheinend nicht zwingend mit einem schlechteren Gesundheitszustand. Der individuelle Umgang mit der Erkrankung (Coping), sowie neue Sinn- und Wertevorstellungen scheinen somit unabhängig vom Gesundheitszustand eine zentrale Rolle in der Bewertung der eigenen Lebensqualität zu spielen. Dies zeigte sich auch im gesamten Kollektiv, z.B. bei in Freitextkommentaren der Patienten. Die Erfahrung der potenziell tödlichen Erkrankung schien für viele Patienten den Blick auf die Gegenwart verändert zu haben (intensiveres Leben, kleine Ziele, stärkere Wahrnehmung von Glück, Erkennen von wichtig und unwichtig). Sehr viele Patienten waren der Meinung, dass das Verhältnis zu Freunden und Familie durch die Erkrankung an Bedeutung gewonnen habe. Als negativ wurde überwiegend die verminderte körperliche und vor allem geistige Leistungsfähigkeit genannt. Einige körperliche Einschränkungen wurden mit Spätfolgen der Leukämieerkrankung bzw. –therapie in Verbindung gebracht (z. B. Gelenknekrosen, Haarausfall). Andere Erkrankungen, wie z.B. Hypertonus, Diabetes und kardiopulmonale Erkrankungen konnten dagegen nicht im Zusammenhang mit der Erkrankung gebracht werden und waren - verglichen mit der Normalbevölkerung - auch nicht häufiger. Bei rund der Hälfte aller Patienten mit Kinderwunsch konnte dieser auch erfüllt werden. Allerdings galt dies nur für Patienten nach Chemotherapie. Patienten nach allogener Stammzelltransplantation waren nahezu alle infertil. Insgesamt zeigten die meisten Patienten trotz oft Schwerbehinderung ein hohes Maß an beruflicher Reintegration. Ein dauerhaft hoher Grad an Behinderung (> 50%) ging jedoch deutlich häufiger mit Arbeitslosigkeit oder (Früh-)Berentungen einher. Ein wichtiges Ziel für die Zukunft ist die systematische, prospektive Erfassung von Lebensqualität und medizinischen Spätfolgen bei Patienten mit akuter lymphatischer Leukämie im Rahmen der GMALL-Studien. Neben der Lebensqualität soll auch ein systematisches Nachsorgeprogramm - analog den bereits existierenden Programmen für Kinder (z. B. LESS ) entwickelt werden. Dabei sollte besonders die Gruppe der älteren Patienten > 55 Jahren, und die allogen stammzelltransplantierten Patienten berücksichtigt werden. Für prospektive Untersuchungen ist zudem eine gezielte Untersuchung der Fatigue-Symptomatik geplant. Für prospektive Studien ist es essenziell, die erhobenen Daten - insbesondere während der Therapie - zeitnah auszuwerten. So kann ein Verlauf erfasst werden und es besteht die Möglichkeit, bereits während Therapie Hilfsangebote - z. B. psychosoziale Unterstützung - anzubieten. Ebenso können die Daten zur Lebensqualität genutzt werden, um in Therapieentscheidungen - z. B. vor Transplantation - miteinbezogen zu werden. Patienten kann zudem ein realistischer Ausblick auf das Leben nach der Therapie gegeben werden.
Diese nach den Richtlinien der Good Clinical Practice durchgeführte, multizentrische, randomisierte Phase III Studie wurde am 1. September 2003 initiiert. Die hohe Teilnahme, sowohl bei der Anzahl der Studienpatienten als auch bei den teilnehmenden Zentren, zeigen das rege Interesse, das an dieser Untersuchung besteht. Die Studie „Bendamustin plus Rituximab versus CHOP plus Rituximab“ baut auf den Ergebnissen einer in-vitro Studie und einer Phase II Studie der gleichen Arbeitsgruppe auf, die synergistische Effekte der beiden Substanzen bei gleichzeitig sehr guter Verträglichkeit des Regimes zeigen konnten [7,8]. In die vorliegende Auswertung gingen in den Therapiearm mit Bendamustin plus Rituximab 104 Patienten und in den mit CHOP plus Rituximab 103 Patienten ein. Bei einem ausgeglichenen Risikoprofil der beiden Patientenkollektive stellen sich Therapieerfolge und Komplikationen als gut miteinander vergleichbar dar. Mit einer ORR von 96% bei B-R gegenüber 94% bei CHOP-R unterschied sich das Gesamtansprechen in den beiden Therapiearmen nur geringfügig. Auffällig war je doch eine signifikant höhere Rate an kompletten Remissionen im Bendamustin-Arm (55% vs. 38%; p=0,0180). Die Beobachtung, dass mit der Kombination von Bendamustin und Rituximab, bei vergleichbarem Gesamtansprechen, ein höherer Anteil an kompletten Remissionen erreicht wurde, lässt sich bei ausreichenden Fallzahlen auch innerhalb der einzelnen Entitäten nachvollziehen. Bei den 22 Patienten mit Mantelzell Lymphom im Bendamustin-Arm wurde ein Gesamtansprechen von 91% erreicht, eine komplette Remission erreichten 50% der Patienten. Auch bei dieser prognostisch ungünstigeren Untergruppe ließen sich mit dem Bendamustin-Rituximab Regime also ausgezeichnete Ergebnisse erzielen. Die in zahlreichen Untersuchungen beschriebene gute Verträglichkeit der Substanz Bendamustin konnten wir mit unserer Studie für die Kombination mit Rituximab bestätigen. Die Anzahl der an die Studienzentrale gemeldeten Severe Adverse Events unterschied sich mit 32 bei CHOP-R versus 13 bei B-R signifikant (p=0.0013). Außer einem Patienten mit anaphylaktischem Schock nach Rituximab-Erstgabe traten keine lebensbedrohlichen Komplikationen im Studienkollektiv mit Bendamustin auf. In einigen wenigen Fällen wurde die Dosis reduziert, nur in einem Fall musste die Therapie ganz abgebrochen werden. Bei diesem Patienten bestand nach dem 1. Zyklus der Verdacht auf eine medikamentös-toxische Alveolitis. Der Patient erholte sich im Verlauf und wurde mit CHOP-R weiterbehandelt. Die Haupttoxizität im B-R-Arm bestand in der Leukozytopenie mit 12 % Ereignissen mit WHO Grad 3 und 4 (41% bei CHOP-R). Annähernd parallel dazu verhielten sich die Werte für die Granulozyten. Der Unterschied der beiden Therapiearme in der Anzahl der Zyklen mit höhergradiger Leukozytopenie ist von statistischer Signifikanz (p<0,0001). Diese deutliche Überlegenheit von Bendamustin im Bereich der Hämatotoxizität wirkte sich auf die Anzahl und Schwere der infektiösen Komplikationen aus, die im Therapiearm mit CHOP-R deutlich höher lag als im Prüfarm. Die „typischen“ Nebenwirkungen einer Chemotherapie wie gastrointestinale Beschwerden, Stomatitis, Abgeschlagenheit ect. wurden unter B-R ebenfalls, jedoch in geringerem Ausmaß beobachtet. Gelegentlich kam es zu milder bis mäßiger Alopezie. Häufiger als im Kontrollarm kamen unter Bendamustin allergische Reaktionen vor, die auch für andere Kombinationen und die Monotherapie bereits beschrieben wurden [41,53]. Die Zusammenschau der Daten unserer Studie zur Therapietoxizität zeigt klar, dass Bendamustin in Kombination mit Rituximab die besser verträgliche und sicherere Therapieoption darstellt. Es gab keine therapieassoziierten Todesfälle im Prüfarm, schwerwiegende Komplikationen und Hospitalisationen waren seltener und bei signifikant weniger hochgradigen Leukozytopenien kam es seltener zu Infektionen. Für die Untersuchungsbereiche Remissionsausmaß und Therapietoxizität lässt sich damit in unserer Studie nicht nur eine Gleichwertigkeit des Bendamustin-Rituximab Regimes gegenüber dem Polychemotherapieregime CHOP-R feststellen, sondern partiell eine Überlegenheit, die für den Anteil an kompletten Remissionen, die Anzahl der Zyklen mit höhergradiger Leukozytopenie und die Anzahl der gemeldeten SAE Signifikanzniveau erreicht. Auch der Vergleich mit Ergebnissen anderer Chemotherapieregimes, die Rituximab enthalten, lässt die bei uns mit dieser Kombination erzielten Resultate durchaus in einem vorteilhaften Licht erscheinen [4,5,29,44,48,50]. Das Fehlen des Anthrazyklins, das in den meisten Polychemotherapie-Regimen enthalten ist, scheint keine Nachteile mit sich zu bringen. Es fällt damit eine nebenwirkungsreiche Medikamentengruppe weg, die unter anderem in hohem Maß für die kardiotoxischen Komplikationen verantwortlich ist. Ob durch die Ergänzung eines Anthrazyklins noch bessere Ansprechraten oder eine längere Remissionsdauer erzielt werden könnte ist fraglich. Andere klinische Studien lassen Zweifel daran aufkommen und auch der antagonistische Effekt der zwischen Bendamustin und Doxocyclin bzw. Mitoxantron in in-vitro Studien beobachtet wurde legt eine solche Kombination nicht nahe [38,52]. Die wesentliche Frage, die sich angesichts der ausgesprochen guten Therapieergebnisse im B-R-Arm stellt, ist die nach der Qualität der Remission, also der Remissiondauer und den eventuellen Auswirkungen auf das Gesamtüberleben. Das mediane ereignisfreie bzw. progressionsfreie Überleben ist in beiden Armen bisher nicht erreicht. In der unserer Untersuchung zugrunde liegenden Pilotstudie verzeichneten Rummel et al. eine mediane PFS von 24 Monaten [8]. Zu erwarten ist, dass diese in unserer Phase III Studie, mit einem nicht vorbehandelten Patientenkollektiv, deutlich überschritten wird. Aktuell leben im Bendamustin-Arm noch 82% der Patienten in Remission, während es im CHOP-Arm nur noch 71% sind. Das Overall Survival lag bei 95% mit B-R und bei 93% mit CHOP-R. Die zum Auswertungszeitpunkt verfügbaren Daten deuten also auch hier auf eine Gleichwertigkeit, für die remissionsfreie Überlebenszeit möglicherweise sogar auf eine Überlegenheit des B-R-Regimes hin. Da die mediane Nachbeobachtungszeit mit 29 Monaten kurz und der Anteil der Patienten mit Erkrankungsprogredienz relativ zu klein ist, kann man von mehr als einer Tendenz jedoch bisher noch nicht sprechen. Eine Auswertung zu einem späteren Zeitpunkt mit längeren Follow-up Zeiten und der kompletten – mehr als doppelt so hohen – Patientenzahl, wird zeigen, ob sich die ersten optimistisch stimmenden Ergebnisse bestätigen. Die Resultate dieser weiteren Auswertungen werden mit Spannung erwartet. Eine Gleichwertigkeit in Bezug auf das Gesamtüberleben wäre ein Ergebnis von hoher klinischer Relevanz, da der Einsatz von CHOP-R als Standardtherapie in diesem Fall in Frage gestellt werden müsste.
1. Der Abgleich der Genprodukte von PA0119, PA0120 und PA0121 ergab, dass PA0119 68%ige Ähnlichkeit mit dem DctA-Transporter von S. meliloti besitzt. Das Genprodukt PA0120 zeigt eine 46%ige Ähnlichkeit mit dem Transkriptionsregulator LctR von E. coli und trägt konservierte Domänen der GntR- sowie der FCDSuperfamilie. Das Genprodukt PA0121 weist eine 44%ige Ähnlichkeit mit einem hypothetischen Transkriptionsregulator von Streptomyces ambofaciens auf. 2. Es konnte gezeigt werden, dass die drei offenen Leserahmen (ORFs) PA0119, PA0120 und PA0121 von P. aeruginosa in mRNA transkribiert werden und somit Gene sind. In den späten CF-Isolaten M25 und M26 ist deren Transkriptmenge im Vergleich zum frühen CF-Isolat M1 sowie zum Referenzstamm P. aeruginosa PAO1 um das 14fache erhöht. 3. Mit Hilfe von RT-PCR Analysen konnte gezeigt werden, dass die drei Gene PA0119, PA0120 und PA0121 eine Transkriptionseinheit bilden und somit in einem Operon P0119-PA0121 organisiert sind. Die angrenzenden ORFs PA0118 und PA0122 konnten dieser Transkriptionseinheit nicht zugeordnet werden. 4. Analysen der Promotor-Reportergenfusion führten zu dem Schluss, dass die Strukturgene PA0119, PA0120 und PA0121 des Operons von einer stromaufwärts von PA0119 lokalisierten Promotorsequenz transkribiert werden. Der Promotor liegt ca. 237 bp vor dem Start von PA0119. Darüber hinaus konnte eine FadR-ähnliche Bindestelle in der Promotorregion P119-121 abgeleitet werden. 5. Der Promotor P119-121 zeigt in mit Dicarboxylaten supplementiertem Minimalmedium M9 eine 2-3fach erhöhte Promotoraktivität gegenüber dem mit Glukose supplementierten Minimalmedium M9. In Gegenwart von Dicarboxylaten erfährt der Promotor P119-121 somit eine Induktion bzw. durch Glukose eine Repression. 6. Der Promotor P119-121 wird wachstumsphasenabhängig reguliert. Die Abhängigkeit der Promotoraktivität von RhlI, RhlR und RpoS indiziert eine Quorum Sensingsowie RpoS-abhängige Regulation des Promotors P119-121. 7. Eine mit PA0119 durchgeführte heterologe Komplementation einer DctA-Mutante von S. meliloti führte zu einer partiellen Wiederherstellung der Fähigkeit der DctAMutante, auf den Dicarboxylaten Succinat und Fumarat wachsen zu können. Dieser Befund indiziert zusammen mit den vier konservierten Motiven, die bisher in charakterisierten Dicarboxylat-Transportern gefunden wurden, dass PA0119 potentiell einen Dicarbonsäure-Transporter in P. aeruginosa darstellt. 8. Mutantenstudien mit den generierten Mutanten ΔPA0119Ω, PA0120Ω und ΔPA0121Ω zeigten im Vergleich zum Wildtyp allerdings kein abweichendes Kulturwachstum; weder in den nährstoffreichen Medien ASM und LB noch im Minimalmedium M9, das jeweils mit 40 mM Succinat bzw. Glutamat supplemiert wurde. Dies wurde durch MicroArrayTM-Analysen mit den Biolog-Platten PM1 und PM2 bestätigt. Daraus wird deutlich, dass keine der hier angebotenen C-Quellen (siehe Anhang) ausschließlich von PA0119 transportiert wird. Auch die Verwertung dieser C-Quellen wird nicht durch die in den Mutanten PA0120::Ω und ΔPA0121::Ω ausgeschalteten Genprodukte beeinflusst. 9. In der Biolog-Platte PM10a schien ΔPA0119::Ω gegenüber PAO1 in den Kavitäten C1 (pH5.5, Methionin) und C10 (pH 5.5, Ornithin) eine leicht abweichende Stoffwechselaktivität zu besitzen. Dies indiziert eine mögliche pH-Abhängigkeit des potentiellen PA0119-Transporters. 10. Im Minimalmedium M9, supplemiert mit Glutamat, zeigt die Mutante ΔPA0119::Ω unter unter erhöhten osmotischen Bedingungen gegenüber dem Wildtyp PAO1 eine reduzierte Wachstumsrate. Dies indiziert, dass PA0119 unter erhöhten osmotischen Bedingungen am Transport von Dicarboxylaten, wie Glutamat, in die Zelle beteiligt sein könnte. 11. Biofilmbildung stellt die bevorzugte Wachstumsform von P. aeruginosa in der CF-Lunge dar. Das Genprodukt PA0120 zeigt zudem eine Ähnlichkeit mit dem Regulator LctR, und es wurde gezeigt, dass eine LctR-Mutante von E. coli in ihrer Fähigkeit zur Biofilmbildung beeinträchtigt ist. Die Untersuchung der ΔPA0119::Ω- und der PA0120::Ω-Mutanten zeigt im Vergleich zum Wildtyp im LB-Medium eine Beeinträchtigung in der Anheftung an Mikrotiterplatten. Dies indiziert, dass sowohl der potentielle Transporter PA0119 als auch der potentielle Transkriptionsregulator PA0120 an der Biofilmbildung von P. aeruginosa beteiligt sind. 12. Die Messung der Promotoraktivität in der ΔPA0119::Ω-Mutante zeigt eine Repression des Promotors an. In der PA0120::Ω-Mutante dagegen findet sich eine zweifache Induktion des Promotors vor PA0119-PA0121. Dies Ergebnis wird durch die Ergebnisse der Real-Time-PCR-Analysen untermauert, da in der PA0120::Ω-Mutante signifikant erhöhte Transkriptmengen des PA0119-Gens detektiert wurden. Bei der ΔPA0121::Ω-Mutante liegt die Promotor-Aktivität im Bereich von PAO1. Diese Ergebnisse lassen den Schluss zu, dass das Genprodukt von PA0119 auf den Promotor P119-121 aktivierend wirkt, während das PA0120-Genprodukt die P119-121- Promotoraktivität negativ reguliert. 13. Zur Identifizierung weiterer PA0120-regulierter Gene wurde eine Transkriptomanalyse der PA0120::Ω-Mutante durchgeführt. Diese ergab, dass neben PA0119 vier weitere Gene, und zwar PA0656, PA0810, PA1852 und PA5261, signifikant hoch reguliert wurden. Vermutlich sind diese Genprodukte zusammen mit dem Regulator PA0120 Teile eines regulatorischen Netzwerks zur Anpassung von P. aeruginosa an die CF-Lunge.
Im Rahmen dieser Arbeit wurden die 5´- und 3´-Enden 23 ausgewählter Transkripte des halophilen Archaeons Halobacterium salinarum bestimmt. Die Daten wurden dazu verwendet, die Längen der untranslatierten Bereiche zu ermitteln, Konsensussequenzen für die Transkriptionsinitiation und -termination abzuleiten und die Rolle haloarchaealer UTRs bei der Translationsinitiation und -regulation zu untersuchen. Der experimentelle Ansatz wurde mit einer bioinformatischen Analyse des Genoms von H. salinarum vervollständigt. Dabei konnten die Konsensussequenzen der basalen Promotorelemente genauer definiert werden und ein neues Promotorelement konnte entdeckt werden. Weiterhin wurde ein Konsensusmotiv gefunden, welches wahrscheinlich für die Termination der Transkription wichtig ist. Alle 23 analysierten Transkripte hatten eine 3´-UTR mit einer durchschnittlichen Länge von 48 Nukleotiden und ihre 3´-Enden waren nicht posttranskriptionell modifiziert. Die experimentellen Ergebnisse und bioinformatischen Daten ergaben, dass die Mehrheit der haloarchaealen Transkripte keine 5´-UTR besitzt. Die meisten Transkripte mit 5´-UTRs enthielten unerwarteterweise keine Shine-Dalgarno (SD)-Sequenz. Die Analyse des H. salinarum Genoms machte deutlich, dass weniger als 10% aller Gene eine SD Sequenz vorrausgeht und dass sogar bei Genen, die distal im Operon liegen, meistens keine SD-Sequenz zu finden ist. Weiterhin wurde der Einfluss einer ausgewählten 5´-UTR ohne SD-Sequenz und einer 3´-UTR auf die Transkriptstabilität und die Translationseffizienz untersucht. Das Transkript mit 5´ UTR ohne SD-Sequenz wurde in H. salinarum effizient translatiert. In einer Studie an H. volcanii konnte das Gleiche für verschiedene 5´ UTRs ohne SD-Sequenz in Verbindung mit einem Reportergen gezeigt werden (Brenneis et al., 2007). An diesen Transkripten kann die Translation also nicht über den „bakteriellen“ Mechansimus durch Basenpaarung mit dem 3´-Ende der 16S rRNA initiiert werden. Im weiteren Verlauf der Arbeit wurde untersucht, ob es sich bei dem Mechanismus der Translationsinitiation an Transkripten mit 5´-UTR ohne SD-Sequenz um einen Scanning-Mechanismus wie bei Eukaryonten oder um einen neuen Mechanismus handelt. Für die Experimente wurde das zuvor erwähnte Reportergensystem aus H. volcanii verwendet. Neben AUG wurden GUG und UUG effizient als Startkodons an einem Transkript mit 5´-UTR genutzt, wohingegen AUG das einzige funktionierende Startkodon bei einem Transkript ohne 5´-UTR war. Verschiedene Deletionsversionen der 20 Nukleotide langen 5´-UTR wurden im Gegensatz zur kompletten 5´-UTR nur sehr ineffizient translatiert. Das Einfügen zusätzlicher AUGs stromaufwärts des natürlichen Startkodons hatte keinen Einfluss auf die Translationseffizienz am internen AUG. Ein zusätzliches AUG am 5´-Ende im gleichen Leseraster des natürlichen AUGs führte zur gleichzeitigen Nutzung beider Startkodons auf derselben mRNA. Eine stabile Haarnadelstruktur am 5´-Ende inhibierte die Translation nur am ersten AUG und hatte keinen Einfluss auf die Translationseffizienz am internen AUG. Zusammenfassend konnte durch die erhaltenen Ergebnisse ausgeschlossen werden, dass der Mechanismus der Translationsinitiation an Transkripten mit 5´-UTR ohne SD-Sequenz ein Scanning-Mechansimus wie bei Eukaryonten ist. Neben der Translationsinitiation an Transkripten ohne 5´-UTR und an Transkripten mit SD-Sequenz existiert also noch ein dritter, bis jetzt unbekannter Mechansimus zur Translationsinitiation in Haloarchaea. In initialen Versuchen zur genaueren Charakterisierung der drei verschiedenen Translationsinitiationsmechanismen, wurden Konstrukte hergestellt, bei denen alle drei verschiedenen Startkodons auf einer mRNA vorhanden sind. Es wurden erste Hinweise darauf gefunden, dass Stressbedingungen einen Einfluss auf die unterschiedlichen Initiationsmechansimen haben. Anders als erwartet führte die Mutation einer natürlichen SD-Sequenz nicht zu einer verminderten Translationseffizienz am entsprechenden Startkodon. Die Bestimmung des 5´-Endes eines Transkripts mit in silico vorhergesagter SD-Sequenz offenbarte, dass das Transkript keine 5´-UTR und somit auch keine SD-Sequenz besaß. Beide Ergebnisse machen deutlich, dass SD-Sequenzen eine noch viel geringere Rolle bei der haloarchaealen Translationsinitiation spielen, als anhand der Sequenz und UTR Analysen angenommen werden konnte.
In vielen Tumorzellen kommt es zu einer Überexpression des Hypoxie-induzierbaren Faktor 1alpha (HIF-1alpha), was zu einer verbesserten Anpassung des Tumors an die intratumorale Hypoxie sowie zu einer Resistenz gegen Strahlen- und Chemotherapie führt. Je nach Tumor kann HIF-1alpha auf verschiedenen Wegen induziert werden. Eine Möglichkeit ist die Hemmung des Abbaus von HIF-1alpha über das 26S-Proteasom, wie z.B. beim van Hippel-Lindau (VHL)-Syndrom aufgrund einer Mutation im VHL Gen. Patienten mit VHL-Syndrom entwickeln häufig renal clearcell carcinomas (RCCs). In diesen Karzinomen kann HIF-1alpha nicht über den klassischen Weg über das 26S-Proteasom abgebaut werden. Um das Verständnis für alternative Regulationsmechanismen von HIF-1alpha zu erweitern, wurde mit RCC4-Zellen gearbeitet. Im ersten Teil der vorliegenden Arbeit konnte gezeigt werden, dass in RCC4-Zellen das HIF-1alpha-Protein unter Hypoxie, in Kombination mit NO, durch die Ca2+-abhängige Protease Calpain abgebaut wird. Unter Hypoxie kam es zu einem Anstieg der Produktion von reaktiven Sauerstoffspezies (ROS) in den Mitochondrien, die mit NO zu Peroxynitrit und weiteren reaktiven Stickstoffintermediaten (RNI) reagierten. Die kombinierte Stimulation der Zellen mit NO und O2- unter Normoxie löste ebenfalls einen Anstieg des intrazellulären Ca2+-Gehaltes und der Calpain-Aktivität aus, was gleichzeitig zu einem reduzierten HIF-1alpha-Proteingehalt führte. Der Calpain-vermittelte HIF-1alpha-Abbau konnte auch in Zellen mit funktionellem VHL-Protein (pVHL) durch NO und O2- ausgelöst werden, wenn der proteasomale Abbau gehemmt war. Diese Ergebnisse beschreiben einen neuen Regulationsmechanismus für das HIF-1alpha-Protein, der unabhängig vom Sauerstoffgehalt und vom 26S-proteasomalen Abbau durch NO/O2- und Calpain erfolgt. Bisher war noch nicht bekannt, dass HIF-1alpha anders als über das 26S Proteasom abgebaut werden kann. In der vorliegenden Arbeit konnte gezeigt werden, dass der Calpain-vermittelte Abbau neben dem proteasomalen Abbau zur Regulierung von HIF 1 beiträgt. In Tumorgeweben stellt nicht nur HIF-1, welches in den Tumorzellen aktiviert ist, einen Selektionsvorteil für die Zellen des Tumorgewebes dar. Ebenso tragen die Zellen des Tumorstromas, darunter die Makrophagen, die in den Tumor einwandern, zur Progression des Tumors durch die Anpassung an die hypoxischen Umgebung bei. Daher wurde im zweiten Teil dieser Arbeit die Regulation von HIF-1alpha in den durch konditioniertes Medium von apoptotischen Zellen (KMAZ) aktivierten Makrophagen und der Bedeutung der daraus resultierenden HIF-1-Aktivierung untersucht. Makrophagen, die durch apoptotische Zellen (AZ) aktiviert werden, stellen einen anti-inflammatorischen, pro-angiogenetischen Phänotyp dar, der vergleichbar mit dem der Tumor-assozierten Makrophagen (TAMs) ist. TAMs infiltrieren in das Tumorgewebe und sind essentiell am Übergang von einem avaskulären zu einem invasiven, vaskularisierten und malignen Tumor beteiligt. Unsere Arbeitsgruppe konnte in Vorarbeiten zeigen, dass Makrophagen zunächst Tumorzellen abtöten, wodurch die apoptotischen Tumorzellen Mediatoren (u.a. Sphingosin-1-Phosphat (S1P)) freisetzen, die eine Polarisierung zu einem alternativen, TAM-ähnlichen-Phänotyp der Makrophagen bewirken. Die Inkubation der Makrophagen mit KMAZ führte zu einer Induktion der HIF-1alpha-mRNA und des -Proteins unter Normoxie, was unabhängig von der Proteinstabilität auf eine gesteigerte Proteinsynthese zurückgeführt werden konnte. Weiterhin führte die Induktion von HIF-1alpha zu einer gesteigerten HIF-1-Aktivität. Die Differenzierung von Stammzellen zu CD31+-Endothelzellen wurde durch die Überstände von den durch KMAZ polarisierten Makrophagen HIF-1-abhängig hervorgerufen und ist ein Indiz für die Ausbildung des HIF 1-vermittelten pro-angiogenetischen Phänotyps der Makrophagen. Als Mediatoren, die von den AZ freigesetzt wurden und an der HIF-1alpha-mRNA-Induktion beteiligt sind, konnten S1P und transforming growth factor-beta (TGF-beta) identifiziert werden. Des Weiteren kommt es zu einer Aktivierung des nuclear factor of activated T-cells (NFAT), der an den HIF-1alpha-Promotor bindet und die Transkription induziert. Aufgrund der verstärkten Synthese kommt es zur Akkumulation von HIF-1alpha und zur Aktivierung von HIF-1. Bisher ist die Aktivierung von HIF-1 in TAMs durch die Lokalisation in hypoxischen Arealen erklärt und nicht weiter untersucht worden. Die Erkenntnisse über die Regulierung von HIF-1 durch AZ beschreiben einen neuen Mechanismus, der zur HIF-1-Aktivierung auch unter Normoxie führt. Dabei vermitteln AZ statt der beschriebenen hypoxischen Stabilisierung des HIF-1α-Proteins eine Induktion der HIF-1alpha-mRNA. Weiterhin zeigen die Ergebnisse eine Möglichkeit auf, wie TAMs bereits unter Normoxie zur Angiogenese Induktion in Tumoren beitragen können und erweitern damit das Verständnis, wie die Tumor-unterstützende Wirkung der TAMs vermittelt wird.
Die vaskuläre NADPH-Oxidase ist eine wichtige Quelle für reaktive Sauerstoff-Spezies (ROS). Viele dieser Daten wurden unter Verwendung des Inhibitors Apocynin (4'-Hydroxy-3' methoxyacetophenon) erhoben, dessen Wirkungsweise jedoch nicht bekannt war. In dieser Arbeit wurde der Mechanismus der Hemmung der vaskulären NADPH-Oxidase näher untersucht, sowie nach weiteren Inhibitoren gesucht. In HEK293-Zellen wurden die NADPH-Oxidase-Isoformen Nox1, Nox2, Nox4, Duox1 oder Duox2 überexprimiert und die von den Zellen produzierten Radikale durch verstärkte Chemilumineszenz gemessen. Hierbei wurde festgestellt, dass Apocynin die Produktion von Superoxidanionen nicht hemmt, aber die Detektion von Wasserstoffperoxid- oder Hydroxylradikalen beeinflusst. Wenn die Radikale durch Xanthin/Xanthin-Oxidase oder nicht-enzymatische Systeme generiert wurden, beeinflusste Apocynin direkt die Peroxid-, aber nicht die Superoxid-Detektion. In Leukozyten ist Apocynin ein Pro-Pharmakon, das durch Myeloperoxidase (MPO) aktiviert werden kann. Dieser Prozess führt zur Bildung eines Apocyninradikals, das zu einem Dimer umgewandelt wird. Allerdings kann man aufgrund der hohen Reaktivität des Radikals nur das Dimer nachweisen. Endothelzellen und glatte Muskelzellen sind nicht in der Lage dieses Dimer zu bilden und können daher Apocynin nicht aktivieren. In Nox-überexprimierenden HEK293-Zellen konnte die Dimer-Bildung gezeigt werden, wenn MPO zugegeben wurde. Apocynin kann ohne MPO-Zugabe nur die NADPH-Oxidase in Leukozyten hemmen und wirkt in vaskulären Zellen als Antioxidans. Tatsächlich wurde in vaskulären glatten Muskelzellen die Aktivierung der redoxsensitiven Kinasen p38-MAP-Kinase, Akt und Erk1/2 durch Wasserstoffperoxid und durch den intrazellulären Radikal-Generator Menadion in Anwesenheit von Apocynin verhindert. Des Weiteren wurde untersucht, ob Cyclooxygenase 2 (COX-2), die eine ähnliche Peroxidase-Domäne wie MPO besitzt, mit Apocynin interagiert. Die COX-2-Aktivität wurde durch Apocynin gehemmt. In COX-2 überexprimierenden HEK293- Zellen wurden die Superoxidanion- sowie die Wasserstoffperoxid-Bildung durch Apocynin völlig gehemmt. Allerdings konnte durch die Peroxidaseaktivität von COX-2 Apocynin nicht aktiviert und somit kein Dimer nachgewiesen werden. Diese Beobachtung unterstützt ferner die unspezifische Natur der Nox-Hemmung durch Apocynin.Intravenös appliziertes Apocynin in Mäusen und Schweinen führte zu einer Aktivierung von Apocynin. In vivo wirkt Apocynin somit als möglicher Nox2-Inhibitor und als Antioxidans. Flavonoide, insbesondere die des Katechol-Typs, in dem der B-Ring monomethyliert ist, haben eine ähnliche Struktur wie Apocynin. Daher wurde in dieser Arbeit auch das Potenzial der Flavonoide Epicatechin, 3'-O-Methyl-Epicatechin, Procyanidin B2 und Isorhamnetin als Inhibitoren der NADPH-Oxidase analysiert. Nox-überexprimierende HEK293-Zellen (Nox1, Nox2 sowie Nox4) wurden mit verschiedenen Flavonoiden inkubiert und die ROS-Bildung mittels verstärkter Chemilumineszenz gemessen. Epicatechin und Procyanidin B2 hemmten die Radikal-Detektion der verschiedenen Nox-Isoformen in allen Detektionssystemen. Isorhamnetin hemmte die Radikal-Detektion durch Nox1 nur leicht, allerdings wurde die Bildung der Radikale durch Nox4 und Nox2 fast komplett blockiert. 3'-O-Methyl-Epicatechin wies die schwächste antioxidative Wirkung auf. Es hemmte zwar die Wasserstoffperoxidbildung, jedoch kaum die Nox1- und Nox2-abhängige Superoxidanion-Bildung. Keine der getesteten Substanzen konnte den „respiratorischen Burst“ in mit Phorbolmyristatacetat stimulierten Leukozyten blockieren. Diese Daten deuten darauf hin, dass Apocynin und Katechine potente Antioxidantien für Wasserstoffperoxid, aber keine spezifischen NADPH-Oxidase- Hemmer in vaskulären Systemen sind.
Benzodiazepine stehen in den Medikamentenmissbrauchslisten an erster Stelle und sind deswegen auch von Interesse in der Kriminalistik. Grundlage der vorliegenden Arbeit war die Analyse sämtlicher Benzodiazepin-Fälle, die in den Jahren 1998 bis 2003 im Institut für Forensische Toxikologie, Zentrum der Rechtsmedizin der Johann Wolfgang Goethe Universität in Frankfurt am Main untersucht wurden. Zur Auswertung kamen insgesamt 2695 Fälle, wobei das Hauptaugenmerk auf die 410 Personen gelegt wurde, bei denen Flunitrazepam nachgewiesen werden konnte. Anhand der gesammelten Daten war es möglich, Flunitrazepam unter verschiedenen Gesichtspunkten zu betrachten: 1. Welche Bedeutung hat Flunitrazepam in der Gruppe der Benzodiazepine und kann man im Laufe der Jahre Änderungen im Konsummuster feststellen? 2. Wie ist die Geschlechtsverteilung? 3. Gibt es im Untersuchungszeitraum monokausale Flunitrazepam – Todesfälle? 4. Lassen sich anhand des Vergleichs zwischen Flunitrazepam und Diazepam Unterschiede im Beigebrauch feststellen? 5. Lassen sich anhand des Vergleichs zwischen Flunitrazepam und Benzodiazepinen-Gesamt Unterschiede in der Deliktart feststellen? 6. Gibt es einen Zusammenhang zwischen Konzentration und Deliktart? 7. Welche Bedeutung hat Flunitrazepam in der Drogenszene? Die Auswertung der Daten erbrachte folgende Resultate: 1. Der Pharmakonzern Hofmann La-Roche führte an seinem Produkt Rohypnol® einige Veränderungen durch, um den zunehmenden Missbrauch zu verhindern. 1994 wurde die Darreichungsform von 2 mg auf 1 mg reduziert und 1998 wurde der Farbstoff Indigocarmin hinzugefügt. Von Interesse bei der Analyse der Daten war, ob sich diese Änderungen auf den Konsum von Flunitrazepam auswirkten. Aus diesem Grund wurde zusätzlich noch eine Auswertung über die Benzodiazepinverteilung der Jahre 1993 bis 1997, in denen insgesamt 1630 Benzodiazepin-Fälle registriert wurden, durchgeführt. Bei der Analyse der Benzodiazepinverteilung konnte in den Jahren 1993 bis 1997 und 1998 bis 2003 ein ständiger Zuwachs der Gesamtbenzodiazepin-Fälle festgestellt werden. Dieser Zuwachs ist auf den Anstieg der Untersuchungszahlen im Institut zurückzuführen. Jedoch ließen sich bei den Flunitrazepam-Fällen, gerade in den Jahren 1994 und 1998, Abweichungen im Konsumverlauf feststellen, welche auf die Veränderungen des Pharmakonzerns zurückzuführen sein könnten. Bei den Fragebögen, die mit 15 Schwerstabhängigen aus der Frankfurter Drogenszene durchgeführt wurden, kam es zu folgenden Ergebnissen: nach 1994 wurde der Konsum erhöht, nach 1998 gab es bei den meisten entweder gar keine Veränderung oder die Tabletten wurden anfangs vermehrt oral konsumiert. 2. Aufgrund der Kriminalitätsrate mit überwiegend männlicher Beteiligung lag der Frauenanteil der erfassten Personen bei nur etwa 1/5 (Benzodiazepine-Gesamt: 21,8%, Flunitrazepam: 15,9%). 3. Während des Untersuchungszeitraums konnten keine „reinen“ Flunitrazepam –Todesfälle festgestellt werden. 4. Im Vergleich der Cobefunde waren die Substanzen THC, Morphin, Codein und Methadon in der Diazepam-Gruppe häufiger anzutreffen als in der Flunitrazepam-Gruppe. Lediglich Kokain wurde in der Flunitrazepam-Gruppe vermehrt konsumiert. 5. Als führende Deliktart konnten in der Flunitrazepam-Gruppe die Eigentumsdelikte ermittelt werden. In der Benzodiazepin-Gruppe kam es am häufigsten zu Verkehrsdelikten. 6. Die höchsten Flunitrazepam - Konzentrationen im Blut wurden ebenfalls bei den Eigentumsdelikten gefunden. 7. Aufgrund seiner stärkeren euphorisierenden und hypnotischen Wirksamkeit steht Flunitrazepam in der Frankfurter Drogenszene an erster Stelle unter den Benzodiazepinen. Das Erleben eines Rauschzustandes als Euphorie, als ein unendliches und allumfassendes Glücksgefühl, ist ein - vorrangig bei uns Menschen - bestehendes Phänomen. Den Drang dieses Gefühl zu erleben und beizubehalten gab es seit jeher und wird es auch immer geben werden. Übermäßiges Verlangen und das Nachgeben dieses Impulses führen zu Abhängigkeit und Sucht. Die aus diesem Zustand resultierenden sozialen Auswirkungen äußern sich in Dissozialität und Kriminalität. „Ein süchtig gewordener hat nur eine fixe Idee: das Gift! Seine Sucht treibt ihn zur Unehrlichkeit und zu Verbrechen“ (Georg Siegmund, 1962). Sucht und Abhängigkeit sind Tatsachen die sich nicht verleugnen lassen. Um den Missbrauch eines Medikamentes verhindern zu können, genügt es nicht, nur seine Form zu verändern, es bedarf vielmehr einer umfangreicheren Aufklärung und einer generell bewussteren Umgangsweise mit potentiell suchterzeugenden Substanzen.
Zahlreiche physikalische Prozesse, wie Bremsstrahlung, Synchrotronstrahlung oder Radiative Rekombination verursachen die Emission linear hochpolarisierter Röntgenstrahlung. Dennoch wird technisch nutzbare hochpolarisierte Röntgenstrahlung derzeit fast ausschließlich von einigen wenigen hochspezialisierten Synchrotronlichtquellen oder Freie Elektronen Lasern zur Verfügung gestellt. In der vorliegenden Arbeit wurde der Radiative Einfang in die K-Schale von nacktem Xenon verwendet, um erstmals eine Quelle einstellbarer, monoenergetischer sowie hochpolarisierter Röntgenstrahlung (97%) in einer Speicherringumgebung zu realisieren. Zum Nachweis der Polarisation der Strahlung wurde erstmals auch ein neuartiger orts-, zeit- und energieauflösender Si(Li) Streifendetektor als Röntgenpolarimeter eingesetzt, mit dem die Beschränkungen traditioneller Compton - Polarimeter umgangen werden können. Der gemessene Grad hoher linearer Polarisation, der mit den Vorhersagen durch die Theorie übereinstimmt, ist durchaus bemerkenswert, da die hochpolarisierte Röntgensstrahlung in einem Stoßprozess zwischen einem unpolarisierten Ionenstrahl und einem unpolarisierten Gasjet zustande kam. Dies bedeutet, dass der Radiative Elektroneneinfang ein ideales Werkzeug darstellt, um hochpolarisierte, energetisch frei wählbare Röntgenstrahlung in einer Speicherringumgebung zu erzeugen. Die Entwicklung der neuen 2D Detektortechnologie eröffnet auch Möglichkeiten zur experimentellen Untersuchung der Details atomphysikalischer Vorgänge. So konnte im Rahmen dieser Arbeit durch die Kombination des verwendeten Detektors und der Beschleunigereinrichtung der GSI erstmals experimentell die lineare Polarisation der Strahlung des Radiativen Elektroneneinfangs in die energetisch partiell aufgelösten L-Unterschalen von nacktem Uran bestimmt werden. Zudem wurden neue und präzisere Werte für die Polarisation der Einfangstrahlung in die K-Schalen von nacktem und wasserstoffähnlichem Uran gemessen. Die theoretischen Vorhersagen zeigten eine starke Sensitivität von Messungen linearer Polarisation der bei dem Radiativen Elektroneneinfang emittierten Strahlung auf den Einfluss der insbesondere bei Schwerionen - Atom - Stößen zu berücksichtigenden höheren Ordnungen der Multipolentwicklung. Während die Effekte bei der Messung von Winkelverteilungen des Radiativen Elektroneneinfangs gerade bei den kleineren Winkeln im Bezug auf die Ionenstrahlachse im Laborsystem vergleichsweise gering ausfallen, ist hier ein sehr ausgeprägter Effekt der Depolarisation zu beobachten. Hier liegt der wesentliche Unterschied zwischen den in dieser Arbeit vorgestellten Messungen der linearen Polarisation der Strahlung des Radiativen Einfangs in Xenon sowie in Uran. Das Auftreten der starken Depolarisation veranschaulicht die starke Abhängigkeit der Polarisationscharakteristik des REC-Prozesses von der Kernladungszahl des Projektils. Abschließend sei der Schritt zu der erstmals für diese Arbeit verwendeten Messtechnik mit einem hochaufgelösten Streifendetektor hervorgehoben. Im Gegensatz zu früheren Polarisationsmessungen mit grob dimensionierten Pixeldetektoren waren zu der Gewinnung der hier vorgestellten Messungen praktisch keinerlei zusätzliche Annahmen oder Simulationen zu der Interpretation der gewonnenen Winkelverteilungen notwendig. So konnte mit dem System bereits während des Experimentes eine erste Abschätzung der linearen Polarisation der beobachteten Strahlung durchgeführt werden. Diese Tatsache wird es in naher Zukunft ermöglichen, das für die niederenergetische Röntgenstrahlung weitgehend neue ”Fenster” polarimetrischer Messungen für weitere atomphysikalische Prozesse zu öffnen.
Diese Arbeit untersuchte die Epidemiologie und den Einfluss verschiedener Faktoren (Grunderkrankung, empirische Therapie, Schweregrad der Sepsis und Erreger mit Resistenz) auf das Überleben von Patienten mit Septikämien. Die häufigsten Grunderkrankungen dieses Kollektivs waren Leukämien (33%), solide Neoplasien (14%) sowie kardiale Vorerkrankungen (14%). Knapp die Hälfte der Patienten erwarb die Septikämie im Krankenhaus (47%). ...
Bayessche Methoden zur Schätzung von Stammbäumen mit Verzweigungszeitpunkten aus molekularen Daten
(2009)
Ein großes Ziel der Evolutionsbiologie ist es, die Stammesgeschichte der Arten zu rekonstruieren. Historisch verwendeten Systematiker hierfür morphologische und anatomische Merkmale. Mit dem stetigen Zuwachs an verfügbaren Sequenzdaten werden heute verstärkt Methoden entwickelt und eingesetzt, welche die Rekonstruktion auf Basis von molekularen Daten ermöglichen. Im Fokus der aktuellen Forschung steht die Anwendung und Weiterentwicklung Bayesscher Methoden. Diese Methoden besitzen große Popularität, da sie in Verbindung mit Markov-Ketten-Monte-Carlo-Verfahren eingesetzt werden können, um einen Stammbaum zu vorgegebenen Spezies zu schätzen und dessen Variabilität zu bestimmen. Im Rahmen dieser Dissertation wurde die erweiterbare Software TreeTime entwickelt. TreeTime bietet Schnittstellen für die Einbindung von molekularen Evolutions- und Ratenänderungsmodellen und stellt neu entwickelte Methoden bereit, um Stammbäume mit Verzweigungszeitpunkten zu rekonstruieren. In TreeTime werden die molekularen Daten und die zeitlichen Informationen, wie z.B. Fossilfunde, in einem Bayes-Verfahren simultan berücksichtigt, um die Zeitpunkte der Artaufspaltungen genauer zu datieren. Für die Anwendung Bayesscher Methoden in der Rekonstruktion von Stammbäumen wird ein stochastisches Modell benötigt, das die Evolution der molekularen Sequenzen entlang den Kanten eines Stammbaums beschreibt. Der Mutationsprozess der Sequenzen wird durch ein molekulares Evolutionsmodell definiert. Die Verwendung der klassischen molekularen Evolutionsmodelle impliziert die Annahme einer konstanten Evolutionsgeschwindigkeit der Sequenzen im Stammbaum. Diese Annahme wird als Hypothese der molekularen Uhr bezeichnet und bildet die Grundlage zum Schätzen der Verzweigungszeiten des Stammbaums. Der Verzweigungszeitpunkt, an dem sich zwei Spezies im Stammbaum aufspalten, spiegelt sich in der Ähnlichkeit der zugehörigen molekularen Sequenzen. Je älter dieser Verzweigungszeitpunkt ist, desto größer ist die Anzahl der unterschiedlichen Positionen in den Sequenzen. Häufig ist jedoch die Annahme der molekularen Uhr verletzt, so dass in gewissen Teilbereichen eines Stammbaums eine erhöhte Evolutionsgeschwindigkeit nachweisbar ist. Falls die Verletzung konstanter Evolutionsgeschwindigkeiten nicht ausgeschlossen werden kann, sollten schwankende Mutationsraten in der Modellierung explizit berücksichtigt werden. Hierfür wurden verschiedene Ratenänderungsmodelle vorgeschlagen. Bisher sind nur wenige dieser Ratenänderungsmodelle in Softwarepaketen verfügbar und ihre Eigenschaften sind nicht ausreichend erforscht. Das Ziel dieser Arbeit ist die Entwicklung und Bereitstellung von Bayesschen Modellen und Methoden zum Schätzen von Stammbäumen mit Verzweigungszeitpunkten. Die Methoden sollten auch bei unterschiedlichen Evolutionsgeschwindigkeiten im Stammbaum anwendbar sein. Vorgestellt wird ein neues Ratenänderungsmodell, eine neue Möglichkeit der Angabe von flexiblen Beschränkungen für die Topologie des Stammbaums sowie die Nutzung dieser Beschränkungen für die zeitliche Kalibrierung. Das neue Raten Änderungsmodell sowie die topologischen und zeitlichen Beschränkungen werden in einen modularen Softwareentwurf eingebettet. Durch den erweiterbaren Entwurf können bestehende und zukünftige molekulare Evolutionsmodelle und Ratenänderungsmodelle in die Software eingebunden und verwendet werden. Die vorgestellten Modelle und Methoden werden gemäß dem Softwareentwurf in das neu entwickelte Programm TreeTime aufgenommen und effzient implementiert. Zusätzlich werden bereits vorhandene Modelle programmiert und eingebunden, die nicht in anderen Softwarepaketen verfügbar sind. Des Weiteren wird eine neue Methode entwickelt und angewendet, um die Passgenauigkeit eines Modells für die Apriori-Verteilung auf der Menge der Baumtopologien zu beurteilen. Diese Methode wird zur Auswahl geeigneter Modelle benutzt, indem eine Auswertung der beobachteten Baumtopologien der Datenbank TreeBASE durchgeführt wird. Anschließend wird die Software TreeTime in einer Simulationsstudie eingesetzt, um die Eigenschaften der implementierten Ratenänderungsmodelle zu vergleichen. Die Software wird für die Rekonstruktion des Stammbaums zu 38 Spezies aus der Familie der Eidechsen (Lacertidae) verwendet. Da die zugehörigen molekularen Daten von der Hypothese der molekularen Uhr abweichen, werden unterschiedliche Ratenänderungsmodelle bei der Rekonstruktion verwendet und abschließend bewertet. ........
Die Analyse der Phosphorylierung mittels Massenspektrometrie stellt in vielerlei Hinsicht große Anforderungen an die Analysenmethoden, die eingesetzt werden. Durch die substöchiometrische Modifzierung einer Aminosäure mit einem Phosphatrest ist die grundlegende Herausforderung der Sensitivtät an anzuwendende Analysetechniken gegeben. Die Biomassenspektrometrie hat mit den weichen Ionisierungmethoden ESI und MALDI zwar die Techniken zur Verfügung gestellt, die eine routinemäßige Identifzierung von vorher per MS nicht zugänglichen Proteinen über die Untersuchung der enzymatischen Spaltpeptides ermöglicht, gleichwohl ist der Aufwand, der für die massenspektrometrische Charakterisierung eines bestimmten Proteins besteht, um ein vielfaches höher. Wegen des in vivo variablen und potentiell sehr geringen Phosphorylierungsgrades ist die genaue Identifizierung der Phosphorylierungstelle allein durch das Vermessen der Probe in einem modernen Massenspektrometer nicht zu bewerkstelligen. Die sich in der Probe befindlichen Phosphopeptide stehen nach einem Verdau des entsprechenden Proteins einer mengenmäßig großen Zahl unphosphorylierter Peptide gegenüber. Auch die hohe Sensitivität von modernen Massenspektrometern reicht in der Regel nicht aus, um das entsprechende Phosphopeptid zu analysieren. Soll die exakte Phosphorylierungstelle des untersuchten Phosphopeptids bestimmt werden, so müssen ausreichende Mengen an Analyten für eine MS/MS-Analyse generiert werden. Bei realen Proben kann der Phosphorlyierungsgrad nicht erhöht werden, somit ist auch die Menge an vorhandenen Phosphopeptiden begrenzt. Somit kommt man an eine Anreicherung von Phosphopeptiden bzw. Abreicherung von unmodifzierten Peptiden nicht vorbei. Im Rahmen dieser Arbeit wurden verschiedene Anreicherungstechniken für Phosphopeptide hinsichtlich ihrer Sensitivität und Spezifität untersucht. Hierfür wurden verschiedene Affinitätstechniken (Graphit, IMAC und TiO¬¬2) hinsichtlich Empfindlichkeit und Selektivität untersucht. Von diesen drei Methoden zeigte sich Graphit aufgrund zu geringer Wechselwirkung zwischen Analyt und Medium als ungeeigneteste Methode. IMAC zeigt bei verbesserter Sensitvität eine höhere Spezifität, gleichwohl saure Peptide nicht von Phosphopeptiden zu trennen sind. Von den drei genannten Methoden zeigte TiO¬¬2 die höchste Sensitivität und Selektivität. Da das TiO¬¬2 als Goldstandard in der Anreicherung von Phosphopeptiden angesehen wird, sollte im Rahmen dieser Dissertation eine neuartige Methode entwickelt werden, die dieser Technik sowohl im Hinblick auf Spezifität und Selektivität überlegen sein sollte. Im Rahmen dieser Arbeit wurden MALDI-Probenteller erstmals mit Hilfe von SAMs (Self Assembled Monolayers) mit Phosphonatgruppen modifiziert, aus denen durch Beladen mit vierwertigem Zirkonium eine neue funktionelle Oberfläche für die Anreicherung von Phoshopeptiden hergestellt werden kann, die der Titandioxid-Methode überlegen ist. Anhand von reproduzierbaren Modellsystemen von bekannten Phosphoproteinverdaus (z.B. Ovalbumin) konnte gezeigt werden, dass diese neue Technik Analyten im niedrigen Femtomol-Bereich auch vor einem großen nicht-phosphorlyierten Hintegrund selektiv anreichern kann. Um zu demonstrieren, dass die Phosphonat-Oberfläche auch bei realen Proben die massenspektrometrische Phosphorylierungsanalyse ermöglicht, wurden in der vorliegenden Arbeit zum einen die Mitogen Activated Protein Kinase 1 (MAPK-1) aus einem in-Lösungs-Verdau und das Heat Shock Protein (HSP), welches aus einem 2-D-Gel stammt, untersucht. Mit der neu etablierten Phosphonat-Oberfäche konnten die Phosphopeptide aus den Proben angereichert und mittels MALDI-MS/MS die Phosphatgruppe eindeutig der modifizierten Aminosäure zugeordnet werden. Neben dem Komplex der Anreicherungstechniken wurden im Rahmen dieser Dissertation noch andere relevante Fragestellungen für die Phosphoproteomanalytik untersucht. So konnte gezeigt werden, dass für phosphorylierte Peptide keine Suppression der Signale im MALDI-Gerät stattfindet, was eine noch weit verbreitete Meinung in vielen Arbeitsgruppen ist. Auch Versuche zur MALDI-Matrix und deren Kombination mit der Säurekomponente wurden durchgeführt. Es stellte sich heraus, dass es neben DHB in Kombination mit Phosphorsäure momentan keine bessere Matrix-Kombination gibt. Im Hinblick auf die Quantifizierung der Phosphorlyierung eines Proteins konnte exemplarisch am Ovalbumin als Modellsystem eine einfache und valide Quantifizierungsmethode mit Hilfe der Dephosphorylierung entwickelt werden, die nicht die Nachteile von sonst häufig eingesetzten Derivatisierungsreagenzien besitzt.
Im Forschungsgebiet des Wissensmanagements ist der Teilbereich des Wissenstransfers von großer Bedeutung, jedoch gleichzeitig auch mit vielen Problemen verbunden, die es auf dem Weg zu einem erfolgreichen Wissenstransfer zu identifizieren und zu lösen gilt. Die vorliegende Arbeit stellt einen Ordnungsrahmen vor, mit dessen Hilfe ein detailliertes Gesamtbild des Wissenstransfers innerhalb einer beliebigen Organisation erstellt werden kann. Der Ordnungsrahmen bildet Rollen, Objekte und Handlungen des Wissenstransfers ab und setzt diese miteinander in Beziehung. Diesen Konstrukten des Ordnungsrahmens sind potentielle Probleme zugeordnet, die im Rahmen einer Literaturrecherche identifiziert werden und die einen reibungslosen Ablauf des Wissenstransfers innerhalb von Organisationen behindern können. Eine für den Ordnungsrahmen entwickelte Handlungsanleitung beschreibt, wie dieser als Basis für die konkrete Untersuchung der aktuellen Situation des Wissenstransfers in Organisationen eingesetzt werden kann. Im Rahmen der Forschungsarbeit wird anhand von mehreren Praxisfällen gezeigt, dass der Ordnungsrahmen mit Hilfe der Handlungsanleitung dazu eingesetzt werden kann, den Ist-Zustand des Wissenstransfers in Organisationen zu erheben sowie vorhandene Probleme im Wissenstransfer aufzudecken. Das Vorgehen der Forschung ist an den Grundsätzen des Design Science ausgerichtet. Der Beitrag zur Forschung als Ergebnis des Design Science-Prozesses ist der Ordnungsrahmen, dessen Validität und Relevanz anhand mehrerer Kriterien gezeigt wird.
Mechanistische Untersuchungen zur Modulation der zytosolischen Phospholipase A2 durch Hyperforin
(2009)
Aus der Familie der Phospholipasen A2 nimmt die zytosolische Phospholipase A2 (cPLA2) in der Bereitstellung von Arachidonsäure (AA) für die Produktion von entzündungsfördernden Eikosanoiden und Lysophospholipiden eine Schlüsselrolle ein. Inwieweit die Modulation dieses Enzyms zum antientzündlichen Wirkspektrum von Hyperforin beiträgt, war Gegenstand dieser Arbeit. Hyperforin als Bestandteil des Johanniskrauts greift auf vielfältige Art und Weise in Entzündungsprozesse ein und hemmt unter anderem die Aktivität der 5-Lipoxygenase und Cyclooxygenase-1 in mikromolaren Konzentrationen. Zur Erforschung der cPLA2 als weitere potentielle Zielstruktur wurden die Effekte Hyperforins auf frisch isolierte humane polymorphkernigen Leukozyten (PMNL) und Thrombozyten untersucht. Dabei ergaben sich erstaunlich widersprüchliche Ergebnisse. Während in PMNL die A23187- und Thapsigargin-induzierte AA-Freisetzung potent unterdrückt wurde (IC50 = 1,5 bis 1,9 µM), konnte Hyperforin die cPLA2-Aktivität in Thrombozyten nach A23187-Stimulation nicht und nach Thrombin-Induktion nur leicht beeinträchtigen. Hingegen resultierte aus der Behandlung von Thrombozyten mit 10 µM Hyperforin eine 2,6- bzw. 8,1-fache Steigerung der AA-Freisetzung und 12-Hydro(pero)xyeikosatetraensäure(H(P)ETE)-Produktion, die von einer Translokation der cPLA2 an die Plasmamembran begleitet war. In PMNL wurde eine Aktivierung der cPLA2 nicht beobachtet. Diese widersprüchlichen Befunde führten zu näheren mechanistischen Untersuchungen. Insbesondere der Einstrom von Ca2+, wie auch die Aktivierung von mitogenaktivierten Proteinkinasen (MAPK) tragen in PMNL und Thrombozyten zur cPLA2-Aktivierung bei. Allerdings konnte eine Beeinträchtigung dieser Signaltransduktionswege durch Hyperforin ausgeschlossen werden. In PMNL wird der durch A23187- oder Thapsigargin-induzierte Ca2+-Einstrom nicht inhibiert und die Aktivierung der entsprechenden MAPK konnte durch Hyperforin (bis zu 10 µM) nicht vermindert werden. In Thrombozyten wurde die Translokation der cPLA2 sowie die AA- und 12-H(P)ETE-Produktion durch die Chelatierung von extra- und intrazellulärem Ca2+ nicht gehemmt. Auch die Unterbindung der Phosphorylierung der cPLA2 durch Hemmung der MAPK-Aktivierung konnte die Aktivierung der cPLA2 nicht verhindern. In zellfreien Untersuchungen an aufgereinigtem Enzym zeigte Hyperforin weder hemmende noch aktivierende Effekte, wenn Liposomen aus 1-Palmitoyl-2-arachidonoyl-sn-glycerol-3-phospatidylcholin (PAPC) eingesetzt wurden. Nach Einbau von Dipalmitoylphosphatidylinositol-4,5-diphosphat, 1-Palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycerol und Cholesterol in PAPC-Liposomen sowie gegenüber Lipid-Raft-Adaptionen (PAPC/Sphingomyelin/Cholesterol 1:1:1) zeigte Hyperforin allerdings inhibitorisches Potential (IC50 = 13,2 µM, 7,6 µM, 5,5 µM und 4,4 µM). Aktivierende Effekte des Hyperforins konnten in Abwesenheit von Ca2+ beobachtet werden, wenn cholesterolhaltige, Lipid-Raft-artige- oder 1-Palmitoyl-2-arachidonoyl-sn-glycerol-3-phospatidylethanolamin(PAPE)-Vesikel eingesetzt wurden. 10 bis 30 µM Hyperforin erhöhten die AA-Freisetzung 3,3- bis 7,3-fach, wobei die Bindung des Enzyms an Liposomen mit Cholesterol und Lipid-Raft-Strukturen, aber nicht gegenüber dem PAPE-Substrat verstärkt war. Alle Effekte konnten durch die Zerstörung der Membranoberfläche und –struktur nach Zugabe von Triton-X-100 aufgehoben werden, wodurch die Bedeutung der Struktur der Lipidaggregate für die Hyperforinwirkung in den Vordergrund tritt. Darüber hinaus konnte die essentielle Rolle der vinylogen Carbonsäurestruktur des Hyperforins gezeigt werden, da ein O-Methylester des Hyperforins weder die Hemmung der cPLA2 in PMNL noch deren Aktivierung in Thrombozyten reproduzieren konnte und im Liposomenassay nur eine unspezifische Aktivierung der cPLA2 unabhängig von der Membranstruktur bewirkte. Neben der cPLA2-Aktivität wurde auch die Dichte der Liposomen abhängig von der Membranstruktur durch Hyperforin moduliert, allerdings konnten Änderungen der Membrandichte nicht mit Einflüssen auf die Enzymaktivität korreliert werden. Weiterhin wurden in Zusammenarbeit mit der Arbeitsgruppe Prof. Glaubitz, Universität Frankfurt, 1H-MAS-NMR-NOESY-Spektren von Liposomen aus 1-Palmitoyl(D31)-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphatidylcholin mit integriertem Hyperforin aufgenommen. Das sich aus der Analyse der Spektren ergebende Modell postuliert die Lokalisation des sauerstoffreichen Bizyklus des Hyperforins im Kopfgruppenbereich der Lipide und eine Penetration der Isoprenylgruppen in die hydrophobe Schicht der Membranen. Die Ergebnisse dieser Arbeit in intakten Zellen und zellfreien Systemen verweisen somit auf komplexe Zusammenhänge, bei denen Interkalationen von Hyperforin mit speziellen Membranstrukturen im Vordergrund stehen. Die unspezifische Einlagerung der lipophilen Substanz Hyperforin in zelluläre Membrankompartimente könnte somit unter Umgehung der regulären Signaltransduktionswege zelltypabhängig die cPLA2-Aktivität modulieren.
Identifizierung und Charakterisierung neuartiger 5-Lipoxygenase-Inhibitoren – in silico und in vitro
(2009)
Ziel dieser Arbeit war die Identifizierung und Charakterisierung neuer potenter 5-LO-Inhibitoren unter Verwendung sowohl computergestützter als auch experimenteller Methoden. Ausgangspunkt war ein ligandenbasiertes virtuelles Screening unter Verwendung der ladungsbasierten Deskriptoren Charge3D und TripleCharge3D. Hierbei konnten zwei neue direkte 5-LO-Inhibitoren identifiziert werden. Jede dieser beiden Substanzen diente als Startpunkt weiterer virtueller Screenings mit dem Ziel, die Potenz der Substanzen zu verbessern bzw. eine SAR der Substanzklasse zu erhalten. Dabei zeigte sich für die Klasse der Thiazolinone, dass eine hohe Toleranz gegenüber unterschiedlichen Substituenten am Grundgerüst bezüglich der Auswirkung auf die Aktivität vorliegt: insbesondere werden relativ große Substituenten toleriert. Des Weiteren scheint der 2-Phenylsubstituent für die 5-LO-inhibitorische Aktivität essentiell zu sein, da Derivate, die einen Heterozyklus an dieser Position aufweisen, inaktiv sind. Eines der aktivsten Derivate dieser Klasse, C06 (Substanz 12), konnte weiter molekular-pharmakologisch charakterisiert werden. Die Substanz zeigt keine offensichtlichen zytotoxischen Effekte, ist unabhängig vom Stimulus der 5-LO-Aktivierung und zeigt nanomolare inhibitorische Aktivität sowohl in intakten PMNL (IC50-Wert 0,65 ;M) als auch in PMNL-Homogenaten (IC50-Wert 0,66 ;M) sowie in zellfreiem PMNL-S100 (IC50-Wert 0,26 ;M) und am gereinigten Enzym (IC50-Wert 0,3 ;M). C06 ist selektiv für die 5-LO, da andere arachidonsäurebindende Proteine (PPARs, cPLA2 und 12- und 15-LO) nicht beeinflusst werden. Auch Nager-5-LO (aus der Ratte und der Maus) wird inhibiert mit IC50-Werten im nanomolaren Bereich. Allerdings zeigte sich die Substanz inaktiv in einem menschlichen Vollblutassay in Gegenwart von Serum. C06 scheint nicht an die für die Interaktion der 5-LO mit der Membran verantwortliche C2-ähnliche Domäne der 5-LO zu binden. Ebenso hat der Membranbestandteil Phosphatidylcholin keinen bzw. nur geringen Einfluss auf das inhibitorische Potential von C06. Aktivitätstests mit steigender Substratkonzentration deuten auf einen allosterischen Bindemodus von C06 hin. Diese experimentellen Daten flossen in die Identifizierung des putativen Bindemodus an der 5-LO ein. Hierzu wurde zunächst ein Homologie-Modell der 5-LO unter Verwendung der kürzlich neu veröffentlichten Daten der Röntgenkristallstruktur der Kaninchen-15-LO (PDB-Code: 2p0m [Choi et al., 2008]) erstellt. Durch eine Bindetaschenvorhersage mit dem Programm PocketPicker und einer pseudorezptorbasierten Auswahl der potentiellen Bindetasche mit anschliessendem Liganden-Docking konnten zwei Bindebereiche postuliert werden, beide an einer Oberflächenbindetasche der 5-LO ausserhalb des aktiven Zentrums. Dies ist im Einklang mit der SAR der Substanzklasse, die zeigt, dass relativ große Substituenten toleriert werden. Erste Mutationsstudien deuten darauf hin, dass die Bindung von C06 in einer Bindetasche um die Aminosäure Y558 erfolgt. In der zweiten postulierten Bindetasche konnten zwei Aminosäuren identifiziert werden, die für die Aktivität der 5-LO essentiell sind: Mutationen von F169 und F177 zu Alanin führten zu einer abgeschwächten Produktivität der 5-LO (12% bzw. 32% der Aktivität der wt-5-LO) sowie zu einem veränderten Produktspektrum. Bei der zweiten Klasse der 5-LO-Inhibitoren, die in der ersten virtuellen Screeningrunde mit den Deskriptoren Charge3D und TripleCharge3D identifiziert werden konnten, handelt es sich um Pyridin-Imidazole. In einem dreistufigen virtuellen Screening konnte die Potenz dieser Substanzklasse von 10 ;M (Substanz 10) in PMNL-S100 auf 0,3 ;M (Substanz 80) verbessert werden. Bei einer der aktivsten Substanzen aus der zweiten Screeningrunde, B02 (Substanz 68), die weiter charakterisiert wurde, handelt es sich um einen direkten 5-LO-Inhibitor mit nanomolarer inhibitorischer Aktivität, der an die C2-ähnliche Domäne bindet. Es wurde ein Bindemodus durch Bindetaschenvorhersage, pseudorezeptorbasierte Bindetaschenlokalisierung und Liganden-Docking postuliert. Ein Problem dieser Substanzklasse ist jedoch ihre Zytotoxizität. Im letzten Teil dieser Arbeit wurde durch ein Protein-Protein-Docking eine mögliche Konformation eines Dimers der 5-LO modelliert. Die postulierten Modelle zeigen bevorzugt eine Konformation, bei der beide Untereinheiten des Dimers eine „head-to-tail“-Orientierung einnehmen. Diese Dimer-Modelle können als Startpunkt genutzt werden, um Modulatoren der Protein-Protein-Interaktion als neuartige Inhibitoren der 5-LO zu entwerfen.
Identifizierung und Charakterisierung neuartiger 5-Lipoxygenase-Inhibitoren – in silico und in vitro
(2009)
Ziel dieser Arbeit war die Identifizierung und Charakterisierung neuer potenter 5-LO-Inhibitoren unter Verwendung sowohl computergestützter als auch experimenteller Methoden. Ausgangspunkt war ein ligandenbasiertes virtuelles Screening unter Verwendung der ladungsbasierten Deskriptoren Charge 3D und TripleCharge3D. Hierbei konnten zwei neue direkte 5-LO-Inhibitoren identifiziert werden. Jede dieser beiden Substanzen diente als Startpunkt weiterer virtueller Screenings mit dem Ziel, die Potenz der Substanzen zu verbessern bzw. eine SAR der Substanzklasse zu erhalten. Dabei zeigte sich für die Klasse der Thiazolinone, dass eine hohe Toleranz gegenüber unterschiedlichen Substituenten am Grundgerüst bezüglich der Auswirkung auf die Aktivität vorliegt: insbesondere werden relativ große Substituenten toleriert. Des Weiteren scheint der 2-Phenylsubstituent für die 5-LO-inhibitorische Aktivität essentiell zu sein, da Derivate, die einen Heterozyklus an dieser Position aufweisen, inaktiv sind. Eines der aktivsten Derivate dieser Klasse, C06 (Substanz 12), konnte weiter molekular-pharmakologisch charakterisiert werden. Die Substanz zeigt keine offensichtlichen zytotoxischen Effekte, ist unabhängig vom Stimulus der 5-LO-Aktivierung und zeigt nanomolare inhibitorische Aktivität sowohl in intakten PMNL (IC50-Wert 0,65 =M) als auch in PMNL-Homogenaten (IC50-Wert 0,66 =M) sowie in zellfreiem PMNL-S100 (IC50-Wert 0,26 =M) und am gereinigten Enzym (IC50-Wert 0,3 =M). C06 ist selektiv für die 5-LO, da andere arachidonsäurebindende Proteine (PPARs, cPLA2 und 12- und 15-LO) nicht beeinflusst werden. Auch Nager-5-LO (aus der Ratte und der Maus) wird inhibiert mit IC50-Werten im nanomolaren Bereich. Allerdings zeigte sich die Substanz inaktiv in einem menschlichen Vollblutassay in Gegenwart von Serum. C06 scheint nicht an die für die Interaktion der 5-LO mit der Membran verantwortliche C2-ähnliche Domäne der 5-LO zu binden. Ebenso hat der Membranbestandteil Phosphatidylcholin keinen bzw. nur geringen Einfluss auf das inhibitorische Potential von C06. Aktivitätstests mit steigender Substratkonzentration deuten auf einen allosterischen Bindemodus von C06 hin. Diese experimentellen Daten flossen in die Identifizierung des putativen putativen Bindemodus an der 5-LO ein. Hierzu wurde zunächst ein Homologie- Modell der 5-LO unter Verwendung der kürzlich neu veröffentlichten Daten der Röntgenkristallstruktur der Kaninchen-15-LO (PDB-Code: 2p0m [Choi et al., 2008]) erstellt. Durch eine Bindetaschenvorhersage mit dem Programm PocketPicker und einer pseudorezptorbasierten Auswahl der potentiellen Bindetasche mit anschliessendem Liganden-Docking konnten zwei Bindebereiche postuliert werden, beide an einer Oberflächenbindetasche der 5-LO ausserhalb des aktiven Zentrums. .....
Beteiligung der Sphingosinkinasen 1 und 2 bei Zellwachstum und Apoptose in Nierenmesangiumzellen
(2009)
Seit einigen Jahren ist bekannt, dass Sphingolipide neben ihrer Funktion als Plasmamembranbestandteile auch als intra- und extrazelluläre Botenstoffe in zelluläre Signalwege eingreifen können. So haben das Lysosphingolipid S1P und sein Vorläufermolekül Ceramid wichtige regulatorische Funktionen in der Regulation von Zelltod- und wachstum. Dabei agiert Ceramid als proapoptotisches und wachstumshemmendes Lipid, während S1P zellprotektive und wachstumfördernde Funktionen in der Zelle hat und dadurch als „Gegenspieler“ von Ceramid wirkt. Durch die zwei Enzymklassen der Ceramidasen und Sphingosinkinasen wird in der Zelle ein sogenanntes „Sphingolipid-Gleichgewicht“ durch die stete Interkonvertierbarkeit der Lipide aufrechterhalten. Das zu einem bestimmten Zeitpunkt in seiner Konzentration dominierende Sphingolipid entscheidet so über das Schicksal der Zelle, ob es zum Zelltod oder zum Wachstum kommt. In dieser Arbeit wurde die Beteiligung der beiden Sphingosinkinasen 1 und 2 bei Zellwachstum und Apoptose in Nierenmesangiumzellen untersucht. Dafür wurden aus SK1(-/-)- und SK2(-/-)-Mäusen Mesangiumzellen isoliert. Obwohl beide Sphingosinkinasen dasselbe Produkt S1P generieren, zeigen die beiden „knock-out“-Zelllinien unterschiedliches Apoptose- und Wachstumsverhalten. In einem ersten Kapitel wurde gezeigt, dass eine Depletion der SK1 in einer Desensitivierung der Mesangiumzellen gegenüber dem apoptotischen Stimulus Staurosporin und in einer drastischen Wachstumsverlangsamung im Vergleich zu den Wt-Zellen resultierte. Im Gegensatz dazu führte eine Depletion der SK2 zu einem Schutz vor Apoptose und zu einer erhöhten Wachstumsrate. In einem zweiten Kapitel wurden mögliche molekulare Mechanismen untersucht, die für diese gegensätzlichen Zellantworten verantwortlich sind. Nachdem eine vermehrte Prozessierung der Caspase 3 in SK1(-/-)-Zellen und eine verminderte Prozessierung in SK2(-/-)- Zellen festgestellt wurde, ergaben weitere Westernblot-Analysen eine Beteiligung der beiden Signalkaskaden PKB/Bad sowie MEK/ERK1/2 im Apoptosemechanismus der Mausmesangiumzellen. SK1(-/-)-Zellen zeigen eine verminderte Phosphorylierungsrate der involvierten Enzyme PKB, MEK1/2 und ERK1/2, wohingegen die Signalkaskaden von SK2(-/-) durch vermehrte Phosphorylierung dieser Kinasen konstitutiv aktiviert sind. Daneben scheint auch der antiapoptotische Faktor Bcl-xL am Vorgang der mesangialen Apoptose beteiligt. Eine Depletion der SK1 führt zu einer reduzierten Bcl-xL-Proteinexpression, wohingegen SK2(-/-)- Zellen eine drastisch erhöhte Expressionsrate dieses antiapoptotischen Faktors aufweisen. Als zentraler Regulator des Zellwachstums zeigt sich das Retinoblastoma-Protein (Rb) in den SK1(-/-)- und SK2(-/-)-Zellen antagonistisch reguliert. Während keine basale Phosphorylierung des Proteins in SK1(-/-)-Zellen gefunden werden konnte, ist Rb in SK2(-/-)-Zellen hyperphosphoryliert. Anschliessend konnte in SK1(-/-)- und SK2(-/-)-Zelle eine Beteiligung von weiteren zellzyklus-regulierenden Enzymen, die Rb-Protein vorgeschaltet sind, gefunden werden. So ist die cyklinabhängige Kinase CDK6 in hyperproliferierenden SK2(-/-)-Zellen auf Proteinebene vermehrt exprimiert. SK1(-/-)-Zellen zeigen eine erhöhte Proteinexpression des Zellzyklushemmers p27. In einem dritten Kapitel konnte gezeigt werden, dass eine Depletion der SK2 auch in Mausfibroblasten, die aus der Lunge von SK2(-/-)-Mäusen isoliert worden waren, zu einer vermehrten DNA-Synthese führt; die Funktion des Enzyms scheint also nicht zellspezifisch zu sein. Ein viertes Kapitel machte deutlich, dass Mausmesangiumzellen, die eine humane Variante der SK1 überexprimieren, vor stimulusinduzierter Apoptose geschützt sind. Darüberhinaus ist die DNA-Synthese der hSK1-transgenen Mausmesangiumzellen im Vergleich zu Wt- Zellen erhöht. Zusammenfassend kann man sagen, dass die Sphingosinkinasen 1 und 2 in den primären Mausmesangiumzellen zelluläres Wachstum und Apoptose in entgegengesetzterweise regulieren: die SK1 wirkt mitogen und zellprotektiv, die SK2 hingegen wachstumshemmend und proapoptotisch
Seit jüngster Vergangenheit erleben dentale Implantate aus Keramik eine Renaissance, da durch die mit Yttrium verstärkte Zirkoniumdioxid-Keramik erstmals stark verbesserte Materialeigenschaften für einen keramischen Werkstoff erreicht wurden. In dieser Studie wurde das vollkeramische Implantatsystem „Z-Look“ der Firma ZSystems ® (Oensingen, Schweiz) hinsichtlich verschiedener klinischer Parameter untersucht. Dazu zählten Basisparameter wie der Approximalraumplaqueindex (API), der Sulkusblutungsindex (SBI) und die Ermittlung der Parameter Sondierungstiefe, Attachmentlevel und Creeping/Rezession an Implantaten und Zähnen. Außerdem erfolgte zur Beschreibung der periimplantären Morphologie der Papillen die Erhebung eines Papillenindex. Um dislozierende Wirkungen des periimplantären Weichgewebes auf das Implantat auszuschließen, wurde die Breite der keratinisierten Gingiva ebenfalls dokumentiert. Unter Verwendung des Periotest-Verfahrens konnte die Festigkeit der Implantate in ihrer knöchernen Umgebung bestimmt werden. Darüber hinaus wurden bei jedem Patienten mikrobiologische Proben mit einer sterilen Papierspitze aus dem Sulkus der Implantate und der natürlichen Zähne entnommen und ausgewertet. Nach Auswertung der bakteriellen Proben konnte die Bakterienmenge für 20 verschiedene Arten als relative Zahl (SNR-Wert) angegeben und zwischen Implantaten und Zähnen verglichen werden. Jeder Patient wurde gebeten, einen speziell für diese Studie konzipierten Fragebogen auszufüllen. Dieser beinhaltete Fragen zur Ästhetik der prothetischen Versorgung und der Handhabung und Ästhetik der für die Ruhigstellung der Implantate während der Einheilphase notwendigen Schutzschiene. Außerdem wurden Fragen zum chirurgischen Eingriff und der Patientenzufriedenheit gestellt. Insgesamt wurden 106 Implantate bei insgesamt 38 allgemeinanamnestisch unauffälligen Patienten untersucht. Der jüngste Patient war 33 Jahre, der älteste Patient 74 Jahre alt. Das Durchschnittsalter betrug 56 Jahre und 3 Monate. Von den 38 untersuchten Patienten waren 18 männlich und 20 weiblich. Ziel dieser Studie war es, anhand der beschriebenen Parameter die Eigenschaften eines vollkeramischen Implantat-Systems zu beschreiben. Von einem vollkeramischen Implantat-System versprach man sich durch die bisherigen Kenntnisse der Literatur bereits im Vorfeld eine sehr geringe Plaqueanlagerung, was ein besonders gutes Weichgewebsmanagement und geringe periimplantäre Entzündungszeichen versprach. Es sollte gezeigt werden, dass Zirkoniumdioxid-Implantate eine ähnliche Festigkeit im Knochen aufweisen können, wie Implantat aus Titan dieses vermögen. Ein besonderes Augenmerk wurde dabei auf den Vergleich von aus dem Sulkus der Implantate und der natürlichen Zähne gewonnen Bakterienproben und die Patientenzufriedenheit gelegt. Es galt unter anderem zu klären, ob die während der Einheilphase der Implantate zu tragende Schutzschiene die Patienten hinsichtlich der Ästhetik oder der Handhabung stört. Die Auswertung der Ergebnisse zeigte, dass der Plaquebefall an den Keramik-Implantaten statistisch signifikant geringer war, als an den natürlichen Zähnen. Das Bluten auf Sondieren trat jedoch im Vergleich mit dem natürlichen Zahn vermehrt am Implantat auf. Allerdings war in diesem Fall keine statistische Signifikanz nachweisbar. Die Implantate dieser Studie wiesen überwiegend geringe, nicht pathologische Sondierungstiefen im Bereich von 2 und 3 mm auf, was auf eine stabile periimplantäre Situation hindeutete. Ein Creeping der Gingiva an den Implantaten konnte nur selten beobachtet werden. Die Implantate wiesen durchschnittlich neun Monate nach prothetischer Versorgung in lediglich 13,2 % der Fälle eine optimale Papillenmorphologie (Index-Wert 3) auf. Allerdings sei darauf hingewiesen, dass vor der Abdrucknahme für die prothetische Versorgung regelmäßig eine Freilegung des Implantats mittels Gingivektomie erfolgen musste. Das Implantatmaterial ist also nicht allein für die ästhetische Morphologie der Gingiva verantwortlich, vielmehr spielen hier andere Faktoren, wie beispielsweise der Abstand zum benachbarten Implantat oder Zahn, sowie der Abstand des Kontaktpunktes der prothetischen Versorgung zum Kieferknochen eine wichtige Rolle. Bei 87 % der Implantate betrug die Breite der keratinisierten Gingiva 2 mm oder mehr, was für eine stabile periimplantäre Situation der Implantate sorgte. Die keramischen Implantate aus Zirkoniumdioxid wiesen unter Verwendung des Periotest-Verfahrens ähnliche Festigkeitswerte auf, wie herkömmliche Implantate aus Titan. Die Verwendung einer Schutzschiene für den Zeitraum der Einheilphase wurde vom überwiegenden Teil der Patienten hinsichtlich Ästhetik und Handhabung problemlos akzeptiert. Der Großteil der Probanden trug die Schutzschiene wie empfohlen. Trotz der vermeintlichen Nachteile, wie die transgingivale Einheilung und dem damit verbundenem Tragen der Schutzschiene, waren die Patienten insgesamt mit dem Behandlungskonzept zufrieden und würden diese sogar weiterempfehlen. Obwohl die Implantate einen deutlich geringeren Plaqueindex als die natürlichen Zähne aufwiesen, war die bakterielle Belastung an den untersuchten Implantaten hinsichtlich der Bakterienmenge (SNR-Wert) im Durchschnitt höher als an den natürlichen Zähnen. Ein vollkeramisches Implantat-System vermag es also nicht, trotz einer geringeren Plaqueakkumulation, eine dem natürlichen Zahn vergleichbare Bakterienlast aufzuweisen. Man kann basierend auf den Ergebnissen dieser Studie aber auch sagen, dass die untersuchten Zähne und Implantate keine grundlegend verschiedene Mikroflora aufwiesen. Das Ziel von ergänzenden oder sich anschließenden Studien könnte es sein, die Mikrobiologie von Titan-Implantaten mit der mikrobiologischen Flora der natürlichen Zähne zu vergleichen. So ließe sich feststellen, ob sich dentale Implantate aus Titan hinsichtlich der mikrobiologischen Flora ähnlich verhalten, wie das hier untersuchte vollkeramische System. Besonders interessant wäre diese Untersuchung im Split-Mouth-Verfahren. Außerdem sollten anschließende Untersuchungen klären, ob zweiteilige Systeme aus Zirkoniumdioxid bereits ähnliche Erfolgsquoten aufweisen, wie das hier untersuchte einteilige System.
LINE-1-Retrotransposons sind für die Entstehung von über 35 % des menschlichen Genoms verantwortlich. Während ihre Aktivität entscheidend zur Evolution von Säugetieren allgemein und des Menschen im Speziellen beigetragen hat, kann die L1-Expression und die L1-vermittelte Retrotransposition schädigende Auswirkungen für die Wirtszelle haben (Goodier und Kazazian, 2008). Die Liste der dokumentierten, durch L1-Aktivität hervorgerufenen Erkrankungen umfasst gegenwärtig ca. 65 Fälle von genetischen bzw. Tumorerkrankungen und wird immer länger. Um die Anzahl schädigender L1-Retrotranspositionsereignisse zu minimieren, hat der menschliche Organismus Strategien entwickelt, um die L1-Retrotransposition zu kontrollieren. Eine dieser Strategien ist die Inhibition der L1-Aktivität durch Mitglieder der APOBEC-Proteinfamilie, wobei deren jeweilige Mechanismen der L1-Inhibition gegenwärtig noch nicht aufgeklärt sind. Es war daher das Ziel dieser Arbeit, Einblicke in die Mechanismen der Hemmung der L1-Retrotransposition durch Mitglieder der Familie der humanen APOBEC3-Proteine zu bekommen, wobei eine Fokussierung auf den durch APOBEC3C vermittelten Mechanismus vorgenommen wurde. Aufbauend auf kürzlich publizierte Daten zur Hemmung der L1-Retrotransposition durch die APOBEC3-Proteine A3A, A3B, A3C und A3F (Bogerd et al., 2006; Chen et al., 2006; Muckenfuss et al., 2006) wurde eine Arbeitshypothese entwickelt, welche die L1-Inhibition durch APOBEC3-vermittelte Deaminierung von Cytosinen der L1-cDNA unter der Beteiligung von Faktoren des „Base Excision Repair“-Weges erklärt. Diese Arbeitshypothese steht im Einklang mit der Abwesenheit nachweisbarer G-zu-A-Hypermutationen von L1-Kopien wie sie für die APOBEC3-spezifische Deaminaseaktivität charakteristisch sind, sowie mit der Existenz 5’-verkürzter genomischer L1-Kopien. Die Ergebnisse aus in silico-Analysen der 5’-Enden von 38 L1-Neuinsertionen aus Zellkulturexperimenten, die in Anwesenheit von endogen exprimiertem A3B, A3C und A3H retrotransponiert waren, sowie von 885 genomischen, endogenen L1-Kopien waren in Übereinstimmung mit unserer Arbeitshypothese, da in beiden Fällen Guanin als erste fehlende L1-Nukleobase am L1-5’-Ende statistisch signifikant überrepräsentiert vorliegt. Während für die Inhibition von L1 durch A3A dessen Deaminaseaktivität notwendig ist, wurde gezeigt, dass A3C die L1-Retrotransposition über einen deaminaseunabhängigen Mechanismus hemmt. Die L1-Inhibition durch A3C erforderte sowohl eine funktionelle Dimerisierungsdomäne als auch eine intakte RNA-Bindedomäne. Die Identifizierung von A3C und L1-ORF1p in derselben Saccharosegradientenfraktion sowie die Kolokalisation beider Proteine im Zytoplasma von HeLa- bzw. 143B-Zellen sprechen für eine Interaktion von A3C mit L1-ORF1p bzw. L1-RNPs. Da eine direkte Interaktion von A3C und L1-ORF1p mittels Immunopräzipitation nicht nachgewiesen werden konnte, spricht dies dafür, dass die Interaktion nicht auf einen direkten Kontakt zwischen A3C und L1-ORF1p beruht. Eine direkte Interaktion zwischen A3A und L1-ORF1p konnte ebenfalls nicht nachgewiesen werden. Vielmehr spricht die Abhängigkeit der A3C-vermittelten Hemmung von der intakten RNA-Bindedomäne, experimentelle Daten, welche eine Interaktion mit L1-RNPs vorschlagen, sowie die Kolokalisation von A3C und L1-ORF1p im Zytoplasma für eine Sequestrierung der L1-RNPs, die Behinderung des nukleären Imports der L1-RNPs oder aber eine Blockierung der TPRT-Initiation als mögliche Mechanismen der A3C-vermittelten Hemmung der L1-Retrotransposition.
In der vorliegenden retrospektiven Studie wurde der Zusammenhang zwischen Knochenstoffwechsel und Frakturrate von Nierentransplantierten Patienten untersucht. Aus einem Patientenkollektiv von 1600 Patienten des Kuratoriums für Dialyse und Nierentransplantation Frankfurt am Main wurden 122 Patienten ausgewählt, die nach Dialyse und anschließender Nierentransplantation sich einer Knochendichtemessung unterzogen haben. Stattgefundene pathologisch zu wertende Frakturen wurden in Zusammenhang mit epidemiologischen Faktoren, Medikamenteneinnahme und Blutparametern gesetzt. Die statistische Auswertung erfolgte mit SPSS 13, wobei ein p< 0,05 als statistisch signifikant gewertet wurde. Die Daten wurden auf bis zu fünfzehn Jahre nach Transplantation untersucht, als Untersuchungszeitpunkt möglicher Zusammenhänge verschiedener Parameter untereinander wurde der Zeitpunkt zwei Jahre post Tx gewählt, da hier die Datenlage am besten war. Betrachtet man das untersuchte Patientengut, so sind trotz teilweise langer Dialysezeit, Immunsuppression und eingeschränkter Lebensweise die meisten Blutparameter weniger pathologisch als erwartet bzw. im Rahmen der eingeschränkten Nierenleistung erklärlich. Beachtenswert ist das Parathormon: die signifikant positive Korrelation mit der Alkal. Phosphatase ist ein deutlicher Hinweis dafür, dass gerade in den ersten 24 Monaten nach Transplantation der Einfluß auf den Knochenstoffwechsel massiv zu sein scheint. Im Laufe der Zeit findet allerdings eine Entkoppelung statt, sodass ein weiterhin hoher Parathormonwert nicht mehr gleichbedeutend für einen starken Knochenkatabolismus ist. Die Knochendichte ist im Verhältnis zu gesunden Dreißigjährigen vermindert, aber im Vergleich zu Gleichaltrigen nur diskret reduziert. Eine Knochendichtemessung kann hinweisend auf eine Osteoporose sein, läßt aber nicht eine schlechte, frakturgefährdete Knochenqualität bei mäßiger bis guter Dichte erkennen. Zwischen Knochendichte und Frakturen fanden wir keine signifikante Korrelation, und somit gewinnt wieder die Klinik der Patienten an Gewicht: Knochenschmerzen, stattgefundene pathologische Frakturen ohne adäquates Trauma, Minderung der Körpergröße weit über die 97. Perzentile hinaus etc. scheinen weitaus bedeutungsvoller und folglich eine Indikation für eine medikamentöse knochenprotektive Therapie zu sein. Doch wie funktioniert eine solche Therapie? Calcium und Vitamin D3 verbessern bei geringen Nebenwirkungen, Medikamenten-Interaktionen und Kosten zwar nachweislich die Dichtewerte, allerdings nicht evident die Frakturrate. Die hier verabreichten Dosen könnten allerdings deutlich zu niedrig sein, neuere Studien zeigen jedenfalls Optimierungsmöglichkeiten im Sinne einer positiven Beziehung zwischen Dosis und sinkender Frakturrate auf. Anders sieht es mit den Bisphosphonaten aus, bei denen zukünftig nochmals das Wirkungs-Nebenwirkungs-Verhältnis in prospektiven Studien eruiert werden sollte. Es gilt als bewiesen, betrachtet man die BMD als quantitativen Erfolgsparameter, dass diese effizient bezüglich der Behandlung einer Steroid-induzierten Osteoporose sind, allerdings stehen die Nachfolger anderer Wirkungsgruppen schon parat, gekoppelt an ein anderes Nebenwirkungsspektrum. Eine rein protektive Dosis an Risikopatienten zum Zwecke einer niedrigen BMD, die allerdings nicht zwangsläufig ein damit verbundenes Frakturrisiko beinhaltet, ist fraglich. Die Glukokortikoide wirken interindividuell stark unterschiedlich, können allerdings bereits in sehr geringen Mengen knochenschädigend sein (tägliches Prednisolonäquivalent von 2,5mg). Hier scheint also die Dauer der Gabe im Verhältnis zur Gesamtdosis deutlich einflussreicher zu sein. Tatsache ist, dass wir keine Korrelation der Glukokortikoidgabe mit der BMD, der Frakturrate oder des PTH nachweisen konnten. Dennoch könnte ein Verzicht dieser und somit der Bisphosphonate bei entsprechender Alternative eine Gewinn-Situation für den Patienten darstellen. Die zur Einsparung verwendeten Immunsuppressiva gelten als ein weiterer Unsicherheitsfaktor, da kaum verwertbare Studien am Menschen bezüglich deren Auswirkungen auf den Knochenstoffwechsel existieren. Aus Gründen des häufigen Therapieregime-Wechsels ließen sich keine Daten erheben. Beachtlich ist die signifikante Korrelation des Serum-Eiweiß/Albumin-Spiegels bezüglich der Frakturen. Ein niedriger Wert hängt offensichtlich mit einer erhöhten Frakturzahl zusammen, was ernährungsphysiologische sowie endokrinologische Einflüsse stärker unterstreichen könnte. . Eine bessere Ernährung und die Vermeidung von Eiweißverlusten könnten langfristig hilfreich sein, ebenso wie die konsequente Therapie des Hyperparathyreoidismus v.a. in den ersten Monaten nach Transplantation mit (höheren) Vitamin-D- sowie gegebenenfalls Cinacalcet-Applikationen. Der Zeitpunkt einer medikamentösen knochenprotektiven Therapie scheint wichtiger als die Gesamtdauer zu sein, wobei Arzt und Patient stets die Multikausalität des bis heute noch nicht vollständig verstandenen Krankheitsbildes bedenken sollten.