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Lebermetastasen treten im Verlauf vieler Tumorerkrankungen auf und sind maßgeblich für eine Verschlechterung der Prognose verantwortlich [5, 6, 91]. Viele Erfahrungen liegen zu Lebermetastasen des kolorektalen Karzinoms vor. Mehr als die Hälfte aller Patienten mit kolorektalem Karzinom entwickeln im Verlauf hepatische Metastasen, bei der Hälfte dieser Patienten bleibt die Metastasierung auf die Leber beschränkt, ohne weitere extrahepatische Manifestationen [4]. Das Überleben bei Leberbefall ist kurz, die medianen Überlebenszeiten beim unbehandelten Verlauf liegen zwischen 3 und 11 Monaten [92, 93]. Durch eine systemische Chemotherapie mit Zytostatika wie Irinotecan [94, 95] oder Oxaliplatin [96] können mediane Überlebenszeiten von 15 bis 17 Monaten erreicht werden. Bei Patienten mit isoliertem Leberbefall bietet die chirurgische Resektion einen potentiell kurativen Ansatz mit medianen Überlebenszeiten von 31 bis 42 Monaten und 5-Jahresüberlebensraten von bis zu 37 % [30-33, 97, 98]. Allerdings kommt eine chirurgische Resektion nur für Patienten mit isolierter Lebermetastasierung in Frage. Bilobulärer Befall, schwierige Lokalisation oder generelle Kontraindikationen für eine Operation sind Gründe gegen eine Operation. Zudem treten intrahepatische Rezidive nach Resektion von Lebermetastasen in bis zu zwei Dritteln der Patienten auf, eine wiederholte Leberteilresektion ist selten möglich. Minimal-invasive interventionell-radiologische Verfahren bieten hier eine Alternative. Die magnetresonanztomographisch gesteuerte laserinduzierte interstitielle Thermotherapie (LITT) ist ein Verfahren, welches sich in den letzten 12 Jahren bei über 1700 Patienten mit Leber-oder Lungenmetastasen unterschiedlicher Primarien im klinischen Einsatz bewährt hat. Die MRTBildgebung bietet eine optimale Weichteildarstellung der Leberherde. Durch thermosensitive MRT-Sequenzen mit kurzer Akquisitionszeit ist ein Monitoring der Therapie nahezu in Echtzeit möglich. So kann die Ablation des Tumors mit entsprechendem Sicherheitsabstand nachverfolgt werden, unter Schonung vulnerabler Strukturen und gesunden Leberparenchyms. Dies erscheint im Zusammenhang mit tierexperimentellen Untersuchungen interessant. So war das Wachstum residueller Tumorzellen nach Leberresektion bei Mäusen oder Ratten beschleunigt [99-102]. Beim Vergleich von LITT mit der chirurgischen Resektion zur Behandlung von implantierten Tumorzellen eines kolorektalen Karzinoms in Rattenlebern, zeigte sich bei mit LITT behandelten Tieren ein reduziertes Wachstum residueller Tumorzellen [103] sowie eine bessere Immunantwort [104]. Mittels LITT können zentral liegende Herde in schwieriger Lokalisation, sowie multiple disseminierte Herde abladiert werden. Bei intrahepatischen Rezidiven ist eine wiederholte Anwendung möglich. Schließlich ist die LITT ein komplikationsarmes Verfahren mit einer Mortalitätsrate im Promillebereich und wird in einem ambulanten Setting durchgeführt. Patienten mit Lebermetastasen eines kolorektalen Karzinoms machen etwa die Hälfte unseres Kollektivs aus. In früheren Untersuchungen unserer Arbeitsgruppe konnten wir mediane Überlebenszeiten von 34,8 Monaten bei 1-, 3- und 5-Jahresüberlebensraten von 86, 49 und 33 % beobachten [18]. In dieser Untersuchung (Gruppe 1a) zeigten sich eine mediane Überlebenszeit von 27,1 Monaten und 1- und 3- Jahresüberlebensraten von 80 und 49 %. Diese Ergebnisse sind mit den Resultaten der chirurgischen Resektion vergleichbar. Ziel dieser Arbeit war, die Effektivität der MR-gesteuerten LITT bei Patienten mit Lebermetastasen des Magenkarzinoms zu bewerten. Hier ist die Ausgangssituation schlechter als beim kolorektalen Karzinom, welches häufig hämatogen in die Leber metastasiert und oft auf die Leber beschränkt bleibt [4]. Das Magenkarzinom hingegen metastasiert ins Peritoneum, in Lymphknoten oder in den Magenstumpf nach potentiell kurativer Gastrektomie. Drei Studien zur chirurgischen Resektion von Lebermetastasen des Magenkarzinoms bezifferten den Anteil der Patienten mit Lebermetastasen an allen Patienten, die wegen eines Magenkarzinoms behandelt wurden auf 4 bis 11 %, wobei hiervon nur 10 bis 21 % für eine chirurgische Resektion in Frage kamen [16, 17, 35]. Andererseits wurden in Untersuchungen zu Rezidivmustern nach potentiell kurativer Gastrektomie bei 19 bis 34 % der Patienten Lebermetastasen beobachtet, wovon 54 bis 78 % initial isoliert auftraten [8-11]. Hier könnte ein größerer Anteil von Patienten durch Nachsorgeuntersuchungen für Leber fokussierte Therapien in Frage kommen. Das metastasierte Magenkarzinom hat eine schlechte Prognose. Bei bestmöglicher palliativer Pflege überleben die Patienten im Median nur 3 bis 5 Monate [12-14]. Palliative Kombinationschemotherapien, beispielsweise ECF (Epirubicin, Cisplatin, 5-Fluorouracil) können dies auf 9 Monate verlängern [49, 50]. Neuere Substanzen wie Irinotecan, Oxaliplatin, Paclitaxel, Docetaxel oder orale Fluoropyrimidine (Tabelle 13, Tabelle 14, Tabelle 15) zeigen viel versprechende mediane Überlebenszeiten von 11 bis 14 Monaten. Kwok et al. beobachten mediane Überlebenszeiten von 4,3 Monaten bei bilobulärem und 7,8 bei unilobulärem Befall der Leber [105]. Ist dieser Befall auf die Leber beschränkt, kann bei einem Teil dieser Patienten eine chirurgische Resektion der Lebermetastasen angestrebt werden. Hier zeigten sich mediane Überlebenszeiten zwischen 9 und 21 Monaten, bei 3- Jahresüberlebensraten von 20 bis 38 % und 5-Jahresüberlebensraten von 0 bis 38 % (Tabelle 10) [15- 17, 38-40]. Eine weitere Therapiemöglichkeit bei ausschließlich hepatischem Befall bietet die hepatisch-arterielle Infusion (HAI) mit medianen Überlebenszeiten von 9 bis 23 Monaten [86, 87, 89, 90] (Tabelle 16). In dieser Untersuchung wurden 25 Patienten mit Lebermetastasen des Magenkarzinoms (Gruppe 2) mittels LITT behandelt. Sie überlebten im Durchschnitt 24,1 Monate beziehungsweise 15,1 Monate im Median ab dem Zeitpunkt der ersten Laserung und drei von ihnen waren 35,7, 62,8 und 70,9 Monate danach noch am Leben. Die kumulativen 1-, 3- und 5- Jahresüberlebensraten ab diesem Zeitpunkt betrugen 62 %, 25 % und 12 %. Als ungünstiger prognostischer Faktor konnte ein fortgeschrittener Lymphknotenbefall identifiziert werden. Patienten mit Stadium N2 und N3 hatten gegenüber solchen mit N0 oder N1 signifikant kürzere durchschnittliche Überlebenszeiten (11,7 versus 29,9 Monate, p = 0,029 im Log Rank -Test) (Abbildung 41). T-Stadium, zeitliches Auftreten der hepatischen Metastasierung, Geschlecht, Alter, Indikation zur LITT, initiale Metastasenzahl und Metastasengröße hatten keinen statistisch signifikanten Einfluss auf die Überlebenszeit. Damit zeigt die LITT bei der Ablation von Lebermetastasen des Magenkarzinoms Ergebnisse, die sich mit der chirurgischen Resektion oder der hepatisch-arteriellen Infusion (HAI) messen lassen. Im Vergleich zur palliativen Chemotherapie zeigen mit LITT behandelte Patienten eine längere mediane Überlebenszeit, wobei zu bedenken gilt, dass die LITT nur bei Patienten mit einem isolierten hepatischen oligolokulärem Befall zum Einsatz kommt, während in Studien zur palliativen Chemotherapie auch Patienten mit extrahepatischem Befall oder hepatischem multilokulärem disseminiertem Befall behandelt wurden. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass die LITT ein komplikationsarmes minimal-invasives Verfahren zur Ablation von Lebermetastasen darstellt und bei einigen Primarien, wie dem kolorektalen Karzinom durchaus einen kurativen Ansatz bietet. Im Fall von Leberfiliae des Magenkarzinoms kommt die LITT nur bei einigen wohl ausgesuchten Patienten als Therapieoption in Frage, liefert jedoch ähnliche Ergebnisse wie andere auf die Leber gerichtete Verfahren und vermag einigen Patienten ein Langzeitüberleben zu ermöglichen.
The relation between reality and language, the instability of language as a signification system, the representation crisis, and the borders of interpretation are the controversial issues that have engaged not only philosophers, but also many authors, translators, and literary critics. Some philosophers like Derrida accuse Western thinking of being obsessed with binary oppositions. In Derrida's view, Western tradition resorts to external references as God, truth, origin, center and reason to stabilize the signification system. Since these concepts lack an internal sense and there is no transcendental signified that can fix these signifiers, language turns to an instable system by means of which no fixed meaning can be created. Many authors like Beckett, Stoppard, and Caryl Churchill also noticed this impossibility of language. While Derrida's deconstructive approach to this crisis has an epistemological nature, these playwrights present an aesthetic solution by turning the deconstructive potential of language against itself in text and performance. This dissertation aims at exploring their performing methods and dramatic texts to demonstrate how their delogocentric strategies work. By analyzing their plays, I will examine if their use of signifiers that have no references in reality, intentional misconceptions, disintegrated subjectivities, decentered narratives, and experimental performances can help them undermine the prevailing logocentrism of Western thought. The examination of the change in aesthetic strategies from Beckett, who belongs to earlier stages of post modernism, to Caryl Churchill, who should perform in a globalized world with increasing dominance of speed and information, is another aim of this research. In my view,Beckett's obsession with unspeakable, absurdity, and disintegration of subjectivity develops to Stoppard's language games, metadrama, and anti-representation and culminates in Churchill's anti-narrative texts and pluralistic performances. The monophony of Beckett's dramatic texts is replaced by the polyphony of Churchill's performances, which are a mixture of theater, dance and music. However, all explored dramatic texts in this dissertation have something in common: they are language games, which have no claim on a faithful representation of reality or transcendental truth.
The reggie protein family consists of two homologous members, reggie-1 and reggie-2, also termed flotillin-2 and flotillin-1, respectively, that are ubiquitously expressed and evolutionarily well conserved, suggesting an important but so far ill-defined function. In various cell types, both reggies have been found to be constitutively associated with lipid rafts by means of acylation modifications and oligomerization. Lipid rafts are glycosphingolipid- and cholesterol-rich membrane microdomains which have been implicated in several cellular processes including membrane transport and signal transduction through growth factor receptors. However, the molecular details of these processes are still poorly understood. With the observation that reggies colocalize with activated glycosylphosphatidylinositolanchored proteins (GPI-APs) and Fyn kinase in rafts, a role for these proteins in signaling events has been suggested. In agreement with that, we have previously shown that reggie-1 becomes multiply tyrosine phosphorylated by Src kinases in response to epidermal growth factor (EGF) stimulation, pointing to a function for reggie-1 in growth factor signaling. Furthermore, overexpression of reggie-1 enhances spreading on fibronectin substrate in a tyrosine-dependent manner, thus revealing a role for reggie-1 in regulation of actin cytoskeleton through growth factor receptors. Due to the similarity shared by reggie proteins at amino acid level and to their ability to form hetero-oligomeric complexes, the first aim of this study was to analyze the putative tyrosine phosphorylation of reggie-2 in growth factor stimulated cells. Similarly to reggie-1, reggie-2 was found to be multiply tyrosine phosphorylated by Src kinase and to exist in a molecular complex with Src, with the degree of co-immunoprecipitation dependent on the activity of Src. Recent studies from us have also shown that administration of EGF results in the endocytosis of reggie-1 from the plasma membrane into endosomes, which is in line with a proposed role for reggies in membrane trafficking processes. In order to characterize in detail the endocytic mechanism that mediates the uptake of reggie-1, the dependency of reggie-1 endocytosis on clathrin and dynamin was investigated by means of overexpressing a variant form of Eps15 or a dominant negative form of dynamin-2. In either case the translocation of reggie-1 into endosomes in response to EGF was not affected, and this, together with the results that reggie-1 colocalized with cholera toxin (CTX) but not with transferrin receptor (TfnR) during EGF signaling, indicates that reggie-1 is taken up by means of a dynaminindependent, raft-mediated pathway. These findings are very well in line with recent data showing the pathway of entry into cells of reggie-2 as a raft-mediated endocytic pathway. The endocytosis of reggie-2 in response to EGF was also analyzed in this study. Similarly to reggie-1, in growth factor stimulated cells reggie-2 underwent a translocation from the plasma membrane to endosomes where the two reggies were found to colocalize with each other, suggesting that epidermal growth factor signaling might trigger the endocytosis of reggie oligomers. In addition, colocalization with both the late endosomal marker LAMP3/CD63 and epidermal growth factor receptor (EGFR) was detected, again indicating a function for reggies in signal transduction through growth factor receptors. EGFR has been reported to localize in rafts but, although this association is thought to be functional during EGF stimulation, how segregation of EGFR into rafts modulates its endocytosis and signaling is still under debate. Since reggie oligomers have recently been suggested to define a raft subtype, a further aim of this study was to investigate whether the depletion of reggies by means of small interfering RNA could interfere with the signaling and the trafficking through EGFR. Knockdown of reggie-2 resulted in an altered tyrosine phosphorylation of EGFR in response to EGF, while the degree of ubiquitination was not affected. Less efficient phosphorylation of tyrosine residues, especially of those which are docking sites for Grb2 and Shc, led in turn to an impaired activation of p38 and ERK1/2 MAPKs. Depletion of reggie-2 did not affect the early trafficking of activated EGFRs, with receptors being endocytosed and delivered to late endosomes as efficiently as in control cells. This would be in line with the normal degree of ubiquitination observed for EGFR, as ubiquitin moieties have been proposed to represent sorting tags that ensure receptor endocytosis into early endosomes and its proper intracellular trafficking. On the contrary, after prolonged EGF stimulation, depletion of reggie-2 resulted in a decreased downregulation of both receptor-bound ligand and EGFR, and in their accumulation in intracellular vesicles, thus pointing to a role for reggie-2 in the degradative pathway. Taken all together, these data ndicate that the association of EGFR with reggie-microdomains is likely to be important for proper receptor trafficking and signaling.
In Deutschland leiden 10-20% der Erwachsenen unter Allergien, wovon 16-36% durch Inhalationsallergene verursacht werden, von denen die Birkenpollen die hauptsächliche Ursache der allergischen Rhinitis vom Frühling bis Frühsommer in Mitteleuropa sind. Als häufigste Typ 1 Allergie ist die Birkenpollenallergie in 70% der Fälle mit einer kreuzreagierenden Nahrungsmittelallergie verbunden. Die Studienlage und die stetig steigende Inzidenz atopischer Erkrankungen weisen auf die außerordentliche Bedeutsamkeit einer effizienten Diagnostik hin, wobei die in-vitro Diagnostik neben Anamnese und Hauttests eine immer bedeutendere Rolle spielt. Mit Tests wie dem Westernblot können einzelne Allergenepitope größenmäßig erfasst und sichtbar gemacht werden. Diese genaue Differenzierung der Proteinbestandteile des Allergenspektrums erlaubt eine exaktere Einschätzung des Antikörperspektrums jedes einzelnen Patienten. In dieser vorliegenden Studie soll die Wertigkeit der Westernblot-Technologie im Rahmen der in-vitro Diagnostik pollenassoziierter Nahrungsmittelallergien bezüglich der Sensitivität, Spezifität, Praktikabilität und des Epitopspektrums bei Patienten mit pollenassoziierter Nahrungsmittelallergie beurteilt werden. Mit dem Pricktest und einer ausführlichen Anamnese als Auswahlverfahren wurden 30 Patienten einer Kontrollgruppe, 30 einer Gruppe für Birkenpollen-Allergiker und 32 einer Gruppe für Birkenpollen-Allergiker mit pollenassoziierter Nahrungsmittelallergie zugeordnet. Zusätzlich wurden die korrespondierenden Seren zuerst mit dem Immulite 2000® (Festphasen-basierender Chemilumineszens-Immunoassay) der Firma DPC-Biermann (Bad Nauheim) auf Birkenpollenallergene und kreuzreagierende Nahrungsmittelallergene getestet. Danach wurden die Seren mit dem Westernblot AlaBLOT®, DPC-Biermann (Bad Nauheim) und dem AlaBlot® Allergenstreifen des spezifischen Birkenpollenallergens T3 untersucht, zu dessen Auswertung eine nach WHO-Nomenklatur angefertigte Schablone verwendet wurde. Die Ergebnisse der Tests wurden mittels deskriptiver statistischer Methoden analysiert. Es konnte gezeigt werde , dass die Wertigkeit der Westernblot Technologie (Alablot Spezifisches IgE®, DPC Biermann, Bad Nauheim) im Rahmen der in-vitro Diagnostik von Birkenpollenallergien und birkenpollenassoziierter Nahrungsmittelallergien vergleichbar ist mit der spezifischen IgE-Technologie (Immulite 2000®, DPC Biermann, Bad Nauheim). Bei Birkenpollenallergikern erreichten beide Tests eine identische Sensitivität von 93%. In der Effizienz übertraf der Westernblot den spezifischen IgE-Test sogar in einem Fall: Mit Bet v 6 erreichte er eine höhere Effizienz mit 99,3% als der spezifische IgE-Test. Der Immulite 2000 erreichte eine Effizienz von 96,7%. Mit Bet v 1 und Bet v 2 erreicht der Westernblot eine 95% Effizienz und lag damit nur knapp unter dem spezifischen IgE-Test. Bei den Birkenpollenallergikern mit pollenassoziierter Nahrungsmittelallergie war die Sensitivität ebenfalls bei beiden diagnostischen Tests identisch mit 100%. Ebenso identische Werte wiesen beide Tests in der Spezifität von 100% auf. In der Effizienz lag der Westernblot nur kurz hinter dem spezifischen IgE-Test. Der spezifische IgE-Test erreichte eine Effizienz von 100% und der Westernblot 98,4%. Mit dem Westernblot wurde kein spezifisches Birkenpollen-Allergenepitop identifiziert, das speziell bei Patienten mit pollenassoziierter Nahrungsmittelallergie auftrat und somit ein Identifikationsepitop wäre. Die Epitopverteilung war bei Pollenallergikern und pollenassoziierten Nahrungsmittelallergikern ähnlich. Allerdings bestand ein Unterschied der beiden Allergikerkollektive in der mittleren Anzahl der Epitope. Die durchschnittliche Anzahl von allergenen Epitopen lag bei den Seren der Patienten mit pollenassoziierter Nahrungsmittelallergie mit 6,06 Epitopen deutlich über dem der reinen Pollenallergiker mit 3,83 Epitopen. Obwohl der Westernblot Nachteile in der Praktikabilität gegenüber dem spezifischen IgE-Test aufweist, stellt er durch die vergleichbaren Sensitivitäten und Spezifitäten und die Fähigkeit, Antikörper gegen einzelne Antigenbestandteile zu differenzieren, eine Alternative zum spezifischen IgE-Test in der Diagnostik von Birkenpollenallergikern mit oder ohne pollenassoziierte Nahrungsmittelallergie dar. Der höhere Durchschnitt an Epitopen bei Patienten mit pollenassoziierter Nahrungsmittelallergie erleichtert in der Diagnostik die schnellere Abgrenzung gegenüber reinen Pollenallergikern und beweist das Vorliegen eines komplexen Sensibilisierungsspektrums. Durch den Westernblot könnte durch die exakte Differenzierung der Allergenspektren eine individuellere spezifische Immuntherapie („patient-tailored-therapy“) ermöglicht werden, was besonders für Allergiker mit einem komplexen Sensibilisierungsspektrum von großer Relevanz wäre. Nach Identifikation der für den jeweiligen Patienten relevanten Epitope könnte die spezifische Immuntherapie an das Sensibilisierungspektrum angepasst werden und dadurch irrelevanten oder sogar unerwünschten Immunantworten vermieden werden
Bei Operationen am offenen Herzen kann in den Herzkammern verbliebene Restluft zur Entstehung von Gasembolien führen, die ihrerseits neurokognitive Defizite verursachen. Die Flutung des Thorax mit Kohlendioxid soll hierbei geeignet sein, die im Herzen verbleibende Luftmenge zu verringern. Ein protektiver Effekt von Kohlendioxid-Insufflation auf die postoperative Gehirnfunktion wurde bisher jedoch noch nicht in klinischen Studien nachgewiesen. In unserer Studie waren 80 Patienten einbezogen, die sich einer Herzklappenoperation mit Sternotomie unterziehen mussten. Sie wurden randomisiert in eine Therapie- und eine Kontrollgruppe. Die präoperativen Untersuchungen der Patienten beinhalteten eine neurokognitive Testbatbatterie aus 6 Einzeltests und die Messung auditorischer Ereignis-korrelierter Potentiale (P300) als Maß für die präoperative Gehirnfunktion. Die neurokognitiven Tests und die P300-Messungen wurden am 5. postoperativen Tag unter gleichen Bedingungen wiederholt. Als neurokognitives Defizit wurde eine Verschlechterung von mindestens 20 % zur Voruntersuchung in 2 oder mehr Tests definiert. Die Gruppen wiesen keine signifikanten Unterschiede bezüglich wichtiger klinischer Parameter auf. Insbesondere die gemessenen Latenzen der P300-Messung unterschieden sich präoperativ nicht zwischen den beiden Gruppen. Fünf Tage nach der Operation waren diese Latenzen im Gruppenvergleich signifikant verlängert im Vergleich zur Vormessung. Die Gruppen unterschieden sich nicht im Vergleich der Parameter Mortalität, Auftreten von zerebrovaskulären Ereignissen und Durchgangssyndromen, sowie bezüglich der Intubationszeiten und der Krankenhausaufenthaltsdauer. Ebenso konnten in der neurokognitiven Testbatterie keine signifikanten Unterschiede dargestellt werden. Wir konnten in dieser Studie zeigen, dass die Verlängerung der postoperativ gemessenen P300-Latenz, die einen objektiven Messwert für Gehirnschäden nach Operationen am offenen Herzen darstellt, durch die Flutung des Operationsfeldes mit CO2 signifikant reduziert wurde. Die klinischen Befunde und neurokognitiven Tests korrelierten nicht zwangsläufig mit diesen Ergebnissen, stellten sich jedoch für diese Form der Studie als ungeignet heraus, da sie nicht empfindlich genug reagieren und nicht optimal für dieses Patientenkollektiv verwendbar waren. Trotzdem sollte die Kohlendioxid-Insufflation bei allen Operationen am offenen Herzen eingesetzt werden um die Entstehung von neurokognitiven Defiziten nach der Operation zu reduzieren oder gar ganz zu verhindern.
Ziel: Evaluation der transpulmonalen Chemoembolisation TPCE als symptomatisches, palliatives Verfahren für die Therapie inoperabler primärer und sekundärer Lungentumoren. Material und Methoden: 69 Patienten (46 Männer, 23 Frauen; Durchschnittsalter: 60,9 Jahre) mit primären und sekundären Lungentumoren wurden mittles TPCE im Zeitraum von 2001 bis 2005 in durchschnittlich 3,36 Sitzungen (Range: 2 - 10 Sitzungen) behandelt. Dabei litten 17 Patienten (14 Männer, 3 Frauen; Durchschnittsalter: 64,5 Jahre; Range: 44 - 78 Jahre) an inoperablen primären Lungentumoren, 52 weitere (32 Männer, 20 Frauen, Durchschnittsalter: 59,8 Jahre; Range: 33 - 83 Jahre) zeigten Metastasen verschiedenen Ursprungs. Nach Punktion der Vena femoralis wurden die tumorversorgenden Pulmonalarterien selektiv sondiert und unter Ballonprotektion 5 - 10 mg Mitomycin C und 5 - 10 ml Lipidol sowie Microspheren (Spherex) (Durchmesser: 20 - 70 μm) appliziert. Pro Sitzung wurden Läsionen nur eines Lungenlappens behandelt. Die Diagnose und Auswertung erfolgte im 4-Wochen-Intervall mittels nativer sowie kontrastmittelverstärkter, computertomographischer Bildgebung. Das Follow-up erstreckte sich hierbei über einen Zeitraum von sechs Monaten bis zu zwei Jahren für Patienten mit primären Tumoren; für Patienten mit sekundären Tumoren lag die Nachsorgezeit zwischen sechs Monaten und 2,25 Jahren. Ergebnisse: Die Behandlung wurde von allen Patienten ohne größere Nebenwirkungen und Komplikationen toleriert; Laborparameter wurden nicht relevant beeinflusst. Eine hohe sowie moderate Lipiodolaufnahme konnte in 17 Fällen (24,6%) computertomographisch verifiziert werden, während sich in 52 Fällen (75,4%) eine niedrige Lipiodolaufnahme zeigte. Nach Beurteilung morphologischer Kriterien wurde eine Volumenreduktion der embolisierten Areale bei 20 Patienten (29,0%) um im Mittel 13,9 ml (53,9%) erreicht, während sich bei 14 Patienten (20,3%) eine Größenkonstanz zeigte. In 35 Fällen (50,7%) kam es zu einer Volumenzunahme der behandelten Tumoren. Hierbei betrug das durchschnittliche Tumorwachstum 29,4ml (131,0%). Schlussfolgerung: Die transpulmonale Chemoembolisation (TPCE) stellt eine gut verträgliche palliative Therapiemaßnahme zur Reduzierung der Tumorvolumina bei Patienten mit primären und sekundären Lungentumoren dar.
Die Fortschritte in der Molekularbiologie innerhalb des letzten Jahrzehnts und die Aufschlüsselung des menschlichen Genoms sowie Verfeinerungen der Gentechnik haben wesentlich dazu beigetragen, dass die molekularen Ursachen vieler Erkrankung besser verstanden werden können. Das EEC-Syndrom ist ein Paradebeispiel eben jener Entwicklung. Noch vor 20 Jahren war die Fachwelt im Unklaren darüber, welche Ursachen einem Symptomkomplex, bei dem ektodermale sowie mesodermale Strukturen gleichzeitig betroffen sind und wie man es dann unter dem EEC-Syndrom zusammenfasst, zu Grunde liegen. Die Entdeckung von p63, als homologes Gen des Tumorsuppressorgen p53, im Jahr 1997 hat zu einem besseren Verständnis der Entstehung und Pathogenese des EEC-Syndroms beigetragen. Die Erbinformationen von Patienten mit EEC-Syndrom sowie deren Familienmitglieder können systematisch nach Mutationen des p63 Gens untersucht werden, damit einer genetische Beratung mehr Informationen zu Verfügung stehen. Das Ziel dieser Doktorarbeit ist es, einen Überblick über das Symptomspektrum des EEC-Syndroms zu vermitteln, die genetischen Ursachen darzustellen und diese Erkenntnisse mit den Ergebnissen der Untersuchung des Patientenfalles zu vergleichen. Bei der Beschreibung der Symptome wurde besonderes Augenmerk auf die Fehlbildungen im Mund-, -Kiefer- und Gesichtsbereich gelegt. Die Problematik bestand darin, die Fallstudien der medizinischen Literatur und die wissenschaftlichen Quellen aus dem Bereich der Molekularbiologie, mit Bezug zum EEC-Syndrom, zusammenzutragen, gegenüberzustellen und zusammenzufassen. Die wichtigsten Fehlbildungen im Mund-, Kiefer- und Gesichtsbereich sind die unilateral sowie bilateral auftretenden Lippen-, Kiefer- und Gaumenspalten sowie eine Atresie des Ductus nasolacrimalis und Aplasie der Meibomschen Drüsen. Die funktionellen und ästhetischen Störungen, welche mit einer Spalte einhergehen, bedingen eine frühe operative Therapie um eine physiologische Entwicklung des orofazialen Bereichs zu ermöglichen und Sprachbildungsstörungen weitestgehend zu vermeiden. Die Atresie des Ductus nasolacrimalis und eine Aplasie der Meibomschen Drüsen können schon in frühen Jahren Epiphora, schmerzhaften Infektionen der Lidränder und Konjunktividen hervorrufen. Bei ausbleibender Therapie kann dies zur Beeinträchtigungen der Sehfähigkeiten führen.
Von den in dieser Studie 163 untersuchten Patientinnen mit Carcinom der Cervix uteri wurden 56 mit entweder postoperativer oder alleiniger Radiochemotherapie und 107 mit entweder postoperativer oder alleiniger Radiotherapie behandelt. Die Radiotherapie bestand bei allen 163 Patientinnen aus perkutaner Hochvolttherapie, in 129 Fällen kombiniert mit intrakavitärer Kontaktbestrahlung. Die Chemotherapie bestand aus der wöchentlichen Gabe von Cisplatin. 62 Patientinnen wurden vor der Therapie operiert. Das mittlere Alter bei Diagnosestellung lag bei 55 Jahren mit eine Range von 21 bis 84 Jahren. Das Tumorstadium der untersuchten Patientinnen lag zwischen I und IVa, wobei die meisten Patientinnen Tumoren im Stadium II (36,8 %) oder III (27,6 %) aufwiesen. Allerdings wurde in vielen Fällen, in denen keine Operation erfolgte, das Tumorstadium nach FIGO und bei operierten Patientinnen das Tumorstadium nach TNM-Klassifikation erfasst. Bei 96,3 % der Tumoren handelte es sich histopathologisch um ein Plattenepithelcarcinom, in 3,7 % um ein Adenocarcinom. Obwohl 6 verschiedene Therapiemodalitäten eingesetzt wurden, war vor allem der Vergleich der Gruppe, die eine Radiochemotherapie erhalten hatten, mit jener, die eine alleinige Radiotherapie erhielt, von besonderem Interesse. Die akuten und chronischen Nebenwirkungen wurden nach den Richtlinien der RTOG-EORTC beurteilt. An 54 Patientinnen konnte über die Nachsorge hinaus ein Fragbogen zugesendet werden, der in Anlehnung an die Kriterien des LENT-SOMA Konzepts die subjektive Morbidität der Patientinnen abfragte. Die Gesamt 2-JÜR lag bei 70 %, die Gesamt 5-JÜR bei 58 % mit einer Rezidivrate für das Gesamtkollektiv von 14,1 %. Bei 17,4 % der Patientinnen traten Fernmetastasen sowie in 8 % der Fälle Lymphknotenmetastasen auf. Das Überleben bei Radiochemotherapie stellte sich gegenüber alleiniger Radiotherapie als verbessert (2-JÜR bei RCT von 82 % vs. 2-JÜR bei RT von 64% sowie 5-JÜR bei RCT von 69 % vs. 5-JÜR bei RT von 52 %) und die Rezidivrate (RCT 9 % vs. RT 14,1 %) als vermindert dar. Auch Fernmetastasen wurden in der RCT-Gruppe seltener verzeichnet (RCT 10,7 % vs. RT 18,3 %). Lediglich der Lymphknotenbefall war in beiden Gruppen nicht relevant unterschiedlich (RCT 7,1 % vs. RT 8,4 %). Postoperative Patientinnen wiesen zwar keine höhere Rezidivfreiheit jedoch längere Überlebensintervalle als nicht operierte Patientinnen auf. Die längsten Überlebensintervalle ließen sich für die postoperative RCT-Gruppe ermitteln. Im Vergleich wurden vor allem hämatogene Nebenwirkungen von Schweregrad 3 oder 4 in der Gruppe, die mit kombinierter Radiochemotherapie behandelt wurde, sehr viel häufiger festgestellt (RCT 35,7 % vs. RT 2,9 %). Allerdings wurde bei 32 Patientinnen der RT-Gruppe kein regelmäßiges Blutbild angefertigt. Die Therapie konnte in den meisten Fällen im geplanten Umfang erfolgen. Gastrointestinale Nebenwirkungen wurden in beiden Gruppen festgestellt, wobei keine großen Unterschiede zu beobachten waren. Akute Nebenwirkungen des Schweregrads 3 der Blase wurden in 2,5 % der Patientinnen ermittelt. An der Vagina war dies ebenfalls in 2,5 % der Fall. Urogynäkologische Nebenwirkungen des Schweregrads 4 wurden nicht verzeichnet. Es wurden ebenso wenig gastrointestinale Nebenwirkungen vom Grad 4 und insgesamt lediglich in 3 Fällen vom Grad 3 registriert, wobei diese alle in der RT-Gruppe (2,8 %) vorkamen. Die chronischen Nebenwirkungen waren insgesamt ebenfalls in der RCT-Gruppe etwas häufiger (RCT 17,9 % vs. RT 14 % für kumulative Häufigkeit aller chronischen Nebenwirkungen von Schweregrad 3 und 4), wobei die gastrointestinalen Nebenwirkungen in beiden Gruppen ähnlich waren (RCT 10,7 % vs. RT 10,3 % für kumulative Häufigkeit von Grad 3 und 4). Urologische Spätfolgen vom Grad 3 oder 4 wurden in der RCT-Gruppe jedoch weitaus häufiger ermittelt (kumulative Häufigkeit RCT 7,1 % vs. RT 1,9 %). Als weiterer Prognosefaktoren für Überleben wurde vor allem das Tumorstadium und ein Karnofsky-Index >70 identifiziert, wohingegen das Alter (ausgenommen die Gruppe der Patientinnen <80 Jahre) bei Therapiebeginn und vorhergehende operative Eingriffe keinen Einfluss auf die Prognose zu haben schienen. Vor allem für das Entstehen von chronischen Nebenwirkungen wurde eine Korrelation zwischen applizierter Gesamtdosis und Schwere sowie Häufigkeit von Spätfolgen der Schweregrade 3 oder 4 festgestellt (Für BED <110 Gy gastrointestinale chronische Nebenwirkungen Grad 3 und 4 in 4,5 % und der Blase in 3,4 % vs. BED >110 Gy gastrointestinale chronische Nebenwirkungen Grad 3 und 4 in 23,5 % und der Blase in 3,9 %). Patientinnen, die Grunderkrankungen wie Diabetes oder Herz-Kreislauf-Erkrankungen in ihrer Anamnese hatten, litten etwas häufiger an gastrointestinalen Spätfolgen vom Schweregrad 4, während Spätfolgen vom Schweregrad 3 in der Gruppe ohne diese Grunderkrankungen häufiger ermittelt wurden. Bei der Befragung der Patientinnen wurden vor allem häufige Darmkrämpfe, Durchfälle und Schmerzen im Beckenknochen angegeben. 42,6% der Patientinnen gaben negative Auswirkungen der Therapie auf ihr Sexualleben an. Insgesamt deckt sich das Ergebnis aus dieser Arbeit mit den Ergebnissen der großen randomisierten Studien nach denen eine Radiochemotherapie eine Verbesserung der Prognose mit einer eher geringen Verstärkung von akuten und chronischen Nebenwirkungen für Patientinnen mit Carcinomen der Cervix uteri darstellt.
Das Volumen von tierischen Zellen ist durch äußere und innere Einflüsse Veränderungen unterworfen. Um die zelluläre Homöostase zu gewährleisten und bedrohliche Volumenänderungen zu verhindern, verfügen die meisten Zellen daher über regulatorische Mechanismen zur Verringerung (regulatory volume decrease, RVD) oder Erhöhung (regulatory volume increase, RVI) des Zellvolumens. Darüber hinaus finden diese Mechanismen auch im Rahmen physiologischer Prozesse, wie z. B. der Zellbewegung oder der Proliferation Verwendung. Der RVD erfordert einen Sensor-Mechanismus, der die Veränderung des Zellvolumens registriert. Die nachfolgende Signaltransduktion führt zur Aktivierung von Transportmechanismen, die v. a. dem Export von K+- und Cl--Ionen, aber auch organischen Osmolyten, dienen und zum Ausstrom von Wasser aus der Zelle führen, bis das Sollvolumen erreicht ist. Bisher ist noch nicht sicher, welcher Mechanismus den RVD einleitet; in verschiedenen Geweben wurden Hinweise auf mehrere mögliche Kandidaten gefunden. In dieser Arbeit wurde der RVD von HaCaT-Zellen, einer humanen Keratinozyten-Zelllinie hinsichtlich der Beteiligung des Aktin-Zytoskeletts mit mikroskopischen, pharmakologischen und molekularbiologischen Methoden untersucht. HaCaT-Zellen schwellen in hypotonem Medium schnell an (30 s) und führen einen RVD durch, der nach ca. 5 min das Ausgangsvolumen wieder herstellt. Der RVD von HaCaT-Zellen ist vom Einstrom extrazellulärer Ca2+-Ionen abhängig. Dieser Einstrom erfolgt durch einen Kanal, der durch die Inhibitoren von stretch activated channels (SAC) Gd3+ und GsMTx-4, sowie den spezifischen Inhibitor des transient receptor potential vaniloid 4 (TRPV4), Rutheniumrot, gehemmt werden kann. TRPV4 wird in HaCaT-Zellen exprimiert. Der RVD und der damit verbundene Einstrom von Ca2+-Ionen, nicht aber das Anschwellen der Zellen werden durch den Abbau des Aktin-Zytoskeletts durch 2 μM Cytochalasin D (CD) gehemmt. Die Hemmung durch CD ist reversibel; nach dem Entfernen von CD bildet sich innerhalb von 30 min erneut ein Netzwerk von Aktinfilamenten aus. Ein zwei-stufiges Absenken der Osmolarität (jeweils ca. 20%), zunächst in Anwesenheit von CD führt zu einer Volumenzunahme, löst aber keinen RVD aus. Auch nach dem Entzug von CD bleibt das Volumen konstant erhöht. Erst das zweite Absenken löst eine Volumenregulation aus, allerdings nur bis zu dem Volumen, das nach dem Entfernen von CD etabliert war. Die mikroskopische Struktur des Aktin-Zytoskeletts von HaCaT-Zellen ändert sich während des RVD kaum. Durch die Messung der Fluoreszenz von gebundenem Rhodamin-Phalloidin konnte ein vorübergehender Anstieg der Menge von Aktinfilamenten (F-Aktin) während des RVD gezeigt werden. Ein quantitativer biochemischer Ansatz zeigt, dass die relative Menge des Triton- X-100-löslichen Anteils des Aktin-Zytoskeletts im gleichen Zeitraum zunimmt. Der RVD von HaCaT-Zellen hängt ebenfalls von der Geschwindigkeit der Osmolaritätsänderung ab; die langsame Verringerung der Osmolarität (≤ 5 mosM/min) führte zum Anschwellen, nicht aber zum RVD. Auf Basis der erzielten Ergebnisse wird ein Modell für den RVD von HaCaTZellen vorgeschlagen, bei dem der Anstieg des Zellvolumens zu einer Zunahme der mechanischen Spannung im kortikalen Zytoskelett führt. Dadurch wird – indirekt, etwa durch Phospholipase A2, oder direkt - TRPV4 aktiviert. Dies führt zu einem Einstrom von extrazellulären Ca2+-Ionen und über Ca2+-abhängige Aktin-bindende Proteine (z. B. Gelsolin) zu einer Reorganisation des Aktin-Zytoskeletts (Gel-Sol-Übergang) und verbunden damit zu einer Abnahme der mechanischen Spannung. Ca2+-Ionen und kurze Aktinfilamente aktivieren Transportmechanismen, die zum Ausstrom von K+- und Cl-- Ionen und einer Abnahme des Zellvolumens führen.
Die vorliegenden Arbeit analysiert 270 Traumapatienten, die durch das am Klinikum der Johann Wolfgang Goethe-Universität Frankfurt stationierte NEF in den Schockraum der Universitätsklinik eingeliefert wurden. Der Beobachtungszeitraum erstreckt sich von Anfang Januar 2004 bis einschließlich August 2007. Als Grundlage der Studie dient der Vergleich der präklinischen Daten des Notarzteinsatzprotokolls mit den klinischen Daten, die im Schockraum erhoben wurden. Ziel der Studie war es, den Stand der präklinischen Traumaversorgung darzustellen. Eine mögliche Überversorgung sowie eine Unterversorgung soll anhand präklinischer Maßnahmen, wie die Durchführung einer endotrachealen Intubation, die Anlage einer Thoraxdrainage und die prophylaktische Immobilisation der Halswirbelsäule erfasst werden. Insgesamt bestand für 28,1 % der Patienten eine präklinische Intubationsindikation. In internationalen Studien werden Indikationen von 16 % bis 29 % angegeben und somit bestätigt. Um eine präklinische Unterversorgung hinsichtlich der endotrachealen Intubation festzustellen, wurden notwendige Intubationen innerhalb der ersten 15 Minuten im Schockraum analysiert. Nach Einzelfallprüfung zeigt sich, dass 4,5 % der Patienten, die vom NEF in den Schockraum eingeliefert wurden, als unterversorgt bezeichnet werden können. Die rasche Indikation im Schockraum zur Sicherung des Atemwegs mittels endotrachaealer Intubation, ergab sich in mehr als der Hälfte der Fälle (55,6 %) durch eine stark eingeschränkte Vigilanz (GCS<9). Zur Detektion einer hinsichtlich der endotrachealen Intubation bestehenden präklinischen Überversorgung, wurden die am Unfallort zur Intubation führenden Indikationen analysiert. Hierbei zeigte sich, dass nur ein Patient (1,47 %) ohne anerkannte Indikation, nur aufgrund des Unfallmechanismus und der zu erwartenden Verletzungen ohne klinisches Korrelat endotracheal intubiert wurde. Ein Gruppenvergleich von Patienten mit und ohne Intubation zeigte signifikante Unterschiede in Bezug auf die anhand des Injury Severity Scores erhobenen Verletzungsschwere. Die Ergebnisse dieser Studie mit 4,5 % der Patienten, die präklinisch hinsichtlich der Atemwegssicherung unterversorgt und den 1,47 % der Patienten, die überversorgt waren, sind Ausdruck der eher zurückhaltenden Indikationsstellung einer endotrachealen Intubation unter präklinischen Bedingungen unter Berücksichtigung des engen präklinischen Zeitfensters. 12,2 % der Patienten benötigten nach dem Trauma eine Thoraxdrainage. Um eine präklinische Unterversorgung hinsichtlich der Anlage einer Thoraxdrainage zu ermitteln, wurde die Dringlichkeit und die Indikation der im Schockraum gelegten Drainagen beurteilt. Patienten, die innerhalb der ersten 15 Minuten nach Ankunft in der Klinik eine Drainage erhielten, wurden als unterversorgt eingestuft. Per Definition dieser Studie sind 33,3 % der Patienten, die eine Drainage benötigten, unterversorgt, das entspricht 4,1 % vom gesamten Patientenkollektiv. Von diesen Patienten hatten mehr als 90 % auffällige Atemmuster und 54,5 % waren endotracheal intubiert und beatmet. Trotz therapeutischer Maßnahmen, wie die Sauerstoffgabe oder die Intubation, war die periphere Sauerstoffsättigung bei den Unterversorgten in 45,5 % nicht zufriedenstellend (SpO2 < 90 %). In 45,5 % der Fälle war die Traumaursache mit der offensichtlichen Gefahr eines Pneumothorax eine Stichverletzung im Thoraxbereich. Als Ursachen für diese Mängel in der Patientenversorgung sind die eingeschränkten präklinischen diagnostischen Möglichkeiten, die Invasivität der Maßnahme mit den daraus resultierenden Komplikationen und die zeitlich aufwendige, auch für lange Jahre tätige Notärzte seltene Maßnahme der Thoraxdrainagenanlage zu nennen. Die Unsicherheit in Diagnostik und Therapie lassen das präklinische Konzept des „scoop and run“ mit dem sofortigen Transport in die Klinik vorteilhaft erscheinen. Die Ergebnisse der Immobilisation der Halswirbelsäule als prophylaktische Maßnahme, um Sekundärschäden durch Rettung und Transport abzuwenden, zeigen eklatante Mängel in der Patientenversorgung. Mehr als ein Drittel (35,9 %) der Patienten mit aufgrund des Unfallmechanismus klarer Indikation zur Durchführung der Protektion wurden ohne Immobilisation der Halswirbelsäule in die Klinik eingeliefert. Um diese Versäumnisse zu analysieren, erfolgte ein Vergleich der Gruppe mit und ohne HWS-Protektion. Patienten, die eine HWS-Protektion erhielten, hatten anhand des Injury Severity Scores erhoben signifikant schwerere und multiplere Verletzungen als Patienten ohne Protektion. Unter Berücksichtigung des Unfallmechanismus führten Stürze aus größer Höhe und Verkehrsunfälle häufiger zur Anwendung einer Zervikalstütze als Stürze aus geringer Höhe. Die Vigilanz hatte hingegen keinen Einfluss auf die Häufigkeit der HWS-Immobilisation, obwohl der bewusstlose Traumapatient eine relativ eindeutige Indikation darstellt. Von den 270 Patienten dieser Studie haben sich 2,9 % eine Verletzung der Halswirbelsäule zugezogen, davon 0,37 % mit einer instabilen Fraktur in diesem Bereich. Da Frakturen der Wirbelsäule sich häufig nicht aus der präklinischen eingeschränkten Diagnostik ergeben, ist es dringend erforderlich, unter Berücksichtigung des Unfallmechanismus und der Umstände am Unfallort, Sekundärschäden durch die Anlage eine Zervikalstütze abzuwenden. Um einen Vergleich mit anderen Kliniken zu ermöglichen, wurden Patientenkollektiv und Einsatzaufkommen analysiert. Hier zeigt sich eine Dominanz der männlichen Traumapatienten in der Altersgruppe der Berufstätigen, wie sie in anderen Traumazentren beschrieben wird. Auch der jahreszeitliche Verlauf mit einer Häufung der Traumapatienten in den Sommermonaten und ein typischer zirkadianer Rhythmus, die das Verkehrsaufkommen und das Freizeitverhalten der Bevölkerung wiederspiegeln, zeigt, dass von einem repräsentativen Patientenkollektiv ausgegangen werden kann. Der größte Anteil der Patienten hatte hinsichtlich der Traumaursache einen Unfall im Straßenverkehr (41,5 %), gefolgt von Stürzen aus unterschiedlichen Höhen (36,7 %). Gewalttaten mit einem Anteil von knapp 12 % als Traumaursache spiegeln das Patientenkollektiv einer Großstadt wie Frankfurt am Main wieder. Zur Objektivierung der Ergebnisqualität der präklinischen Patientenversorgung wurde der Mainz Emergency Evaluation Score (MEES) erhoben. Entsprechend ihrem Ausgangszustand konnten 87 % der Patienten stabil oder mit einem entsprechen dem MEES verbesserten Zustand der Vitalparameter in die Klinik transportiert werden. Maßnahmen wie die suffiziente Analgesie und Verbesserungen im Bereich der Atmung durch Sauerstoffgabe und endotracheale Intubation sind dafür wesentlich verantwortlich. Die präklinische Patientenversorung und die Struktur des Rettungswesens in Deutschland genießt international einen herausragenden Ruf. Dennoch konnten Defizite in der Erkennung und Behandlung von Traumapatienten festgestellt und in dieser Studie bestätigt werden. Um diese Defizite langfristig beheben zu können, sollte ein kontinuierliches Qualitätsmanagement implementiert werden. Auf eine Verbesserung der Dokumentationscompliance in der präklinischen Phase sollte geachtet werden, um eine Qualitätsbewertung regelhaft durchführen zu können. Kontinuierliche Schulungsmaßnahmen und regelmäßiges Training durch Simulation von Notfallsituationen sollten das notwendige Wissen praxisnah vermitteln und vertiefen. Simulationstraining, wie es im „Frankfurter Institut für Notfallmedizin und Simulation (FINeST)“ angeboten wird und Schulungsprogramme mit neuen Lernkonzepten müssen regelmäßig angeboten und ausgebaut werden, um die hohe Qualität des Rettungsdienstes in Deutschland zu sichern und weiter zu verbessern.
Das Ziel der Studie bestand einerseits in der Untersuchung der Zusammenhänge zwischen der sich im Vorschulalter entwickelnden Theory of Mind und dem sich ebenfalls zu diesem Zeitpunkt ausbildenden episodischen Gedächtnis unter der Berücksichtigung verschiedener potentieller Einflussfaktoren, wie beispielsweise den sprachlichen und exekutiven Fähigkeiten der Kinder. Auf der anderen Seite sollten zudem die Veränderungen innerhalb der einzelnen Konstrukte im zeitlichen Verlauf zwischen dem vierten und fünften Lebensjahr abgebildet werden. Dazu wurden 40 Kindern an zwei im Abstand von einem Jahr stattfindenden Erhebungszeitpunkten verschiedenste Aufgaben zur Erfassung ihrer jeweiligen Fähigkeiten in den unterschiedlichen kognitiven Bereichen vorgelegt. Das Durchschnittsalter der Kinder zum Zeitpunkt der ersten Messung betrug M = 38.73 Monate (SD = 2.84) und beim zweiten Messzeitpunkt M = 51.03 Monate (SD = 2.89). Anhand der erhobenen Daten konnte gezeigt werden, dass neben dem Zeitverständnis vor allem die Fähigkeit der dreijährigen Kinder zur Perspektivübernahme einen signifikanten Beitrag zur Erklärung ihrer späteren Kompetenzen auf dem Gebiet des episodischen Gedächtnisses leistet. Weiterhin konnten mittels der zwei Messzeitpunkte sowohl die quantitativen als auch qualitativen Veränderungen innerhalb der unterschiedlichen Theory of Mind-Kompetenzen bzw. innerhalb des sich wandelnden Repräsentationsverständnisses abgebildet werden. Zudem konnte ebenfalls die bedeutende Rolle der Sprache als optimales Medium zum verbalen Austausch über die verschiedenen Perspektiven von sich und anderen sowie über vergangene, gegenwärtige oder zukünftige Erlebnisse konstatiert werden. Im Gegensatz zu den Befunden anderer Studien scheint hingegen den vorliegenden Befunden nach dem Einfluss der exekutiven Fähigkeiten auf die Theory of Mind-Kompetenzen der Kinder keine so grundlegende Bedeutung zuzukommen.
Einfluß der Lagerung auf die Oxygenierung während der Einlungenventilation in der Thoraxchirurgie
(2008)
Einleitung: Die Einlungenventilation ist für thoraxchirurgische Eingriffe unerläßlich, um optimale Operationsergebnisse zu erzielen. Die hierbei vorgenommene funktionelle Trennung der Lungenflügel ermöglicht die Ruhigstellung des OP-Situs und eine kontrollierte Volumenreduktion. Aufgrund der unterbrochenen Beatmung einer Lunge gelangt desoxygeniertes, gemischt-venöses Blut in den Systemkreislauf und senkt dort den O2-Gehalt (Rechts-Links-Shunt). Das Ausmaß der durch eine Einlungenventilation entstehenden Hypoxämie ist sehr variabel, bislang nicht voraussagbar und unterliegt einer Reihe von Faktoren, welche die Größe der Durchblutung der nicht beatmeten Lunge beeinflussen. Methoden: An 50 konsekutiven Patienten der ASA-Risikogruppen I bis III wurden in Links- oder in Rechtsseitenventilation thoraxchirurgische Eingriffe vorgenommen. Zwischen den Operationstechniken bestanden keine signifikanten Unterschiede. Erhoben wurden zu determinierten Meßzeitpunkten Werte der Blutgasanalyse sowie die Beatmungsparameter. Ergebnisse: In beiden Gruppen zeigten ppeak und pplateau im Verlauf der Narkose fünf Minuten und 30 Minuten nach Beginn der Einlungenventilation eine signifikante Zunahme (p < 0,05), Sauerstoffpartialdruck und Horowitz-Quotient sanken in diesem Zeitraum signifikant (p < 0,05). Nach Wiederaufnahme der DLV bewegten sich die Parameter erneut im Ausgangsniveau. Für das AMV wurden in Linksseitenbeatmung bei DLVEnde signifikant niedrigere Werte in Bezug auf die drei vorangegangenen Meßzeitpunkte verzeichnet. In der Gruppe der Rechtsseitenventilierten wies die Sauerstoffsättigung einzig zum Meßzeitpunkt DLVEnde einen signifikanten Anstieg im Vergleich zu ELV+30 auf (p < 0,05). In der zweiten Gruppe bestand eine Signifikanz zu DLVEnde bereits bei ELV+5. Im Vergleich beider Gruppen wurden für keine der untersuchten Variablen signifikante Differenzen verzeichnet. Schlußfolgerungen: Hinsichtlich der Oxygenierung besteht bei der Anwendung der Einlungenventilation im Rahmen thoraxchirurgischer Eingriffe nach der vorliegenden Untersuchung kein signifikanter Unterschied zwischen der Durchführung in Rechts- und Linksseitenventilation. Im Verlauf der Anästhesie mußten in beiden Gruppen höhere Beatmungsdrücke appliziert werden. Es zeigten sich im Vergleich der Gruppen hinsichtlich aller drei Parameter (pmax; pplateau; PEEP) keine signifikanten Unterschiede. Im Rahmen dieser klinischen Studie wurde erstmals der Einfluß der Lagerung auf die Oxygenierung in Kombination mit einem speziellen Beatmungsregime während der ELV untersucht. Zur Vermeidung einer Hypoxämie unter ELV in Narkose kann hiermit festgestellt werden, daß vor allem die suffiziente Lungenseparation mit einer individuell angepaßten Beatmungsstrategie und der optimalen inspiratorischen Sauerstoffkonzentration für die Aufrechterhaltung der adäquaten Oxygenierung obligat ist.
In der vorliegenden Autopsiestudie wurde die Gefäßmorphologie der Koronararterien bei Dialysepatienten, bei nichtdialysepflichtigen niereninsuffizienten Patienten und bei Nierengesunden direkt miteinander verglichen. Zusätzlich wurde mit Hilfe immun-histochemischer Färbungen das Vorkommen inflammatorische Zellen bei drei Patienten-Gruppen untersucht. In der Studie wurden 86 durch Autopsie gewonnene koronare Gefäße histologisch und immunologisch untersucht. Die Analyse der Präparate wurde anhand dreier Patienten-gruppen durchgeführt. Das zentrale Unterscheidungsmerkmal war die Nierenfunktion: Gruppe 1, (n1=27), Dialysepatienten, mit einer Dialysedauer von mehr als 3 Monaten; Gruppe 2, (n2=29), Patienten mit langzeitbestehender chronischer Niereninsuffizienz; Gruppe 3, (n3=30), Patienten mit normaler Nierenfunktion. An Koronararterien wurden Messungen der Intima- und Mediabreiten im stenotischen und poststenotischen Bereich vorgenommen. In der zweiten Analyse wurde auf Basis immun-histologischer Färbungen das Vorkommen inflammatorischer Zellen bestimmt. Der Vergleich der drei Gruppen hinsichtlich der Breite der Intima und Media im Stenosebereich zeigt eine hohe statistische Signifikanz. So waren sowohl Intima (p<0.01), wie auch Media (p<0,01) im Stenosebereich deutlich dicker bei Patienten mit Niereninsuffizienz (Gruppe 1 und Gruppe 2) als bei Nierengesunden (Gruppe 3). Zwischen Gruppe 1 und Gruppe 2 waren keine statistischen Unterschiede feststellbar (p>0,05). Die poststenotischen Abschnitte der Gruppen 1 und 2 zeigten eine auffällig verbreiterte Gefäßwand. Statistisch gesehen fand sich eine signifikante Verbreiterung der Intima (p<0,05) und eine hochsignifikante Verbreiterung der Media (p<0,01) in den Gruppen 1 und 2 im Vergleich zur Gruppe 3. Zwischen Gruppe 1 und Gruppe 2 waren aus statistischer Sicht keine Unterschiede feststellbar (p>0,05). Die in dieser Studie durchgeführten immunhistologischen Untersuchungen konzentrierten sich auf den Nachweis von glatten Muskelzellen, Makrophagen und T-Lymphozyten. SMA-positive glatten Muskelzellen, bzw. Myofibroblasten zeigten eine hohe Präsenz in atherosklerotischen Plaques aller drei Gruppen. Die größte Dichte an Myofibroblasten wurde jeweils in der fibrösen Kappe nachgewiesen. Der Vergleich der drei Gruppen zeigt eine statistisch signifikant erhöhte SMA-Antigen Expression bei Patienten mit Niereninsuffizienz gegenüber Nierengesunden. Hoch signifikant erhöht sind die Anzahl der Myofibroblasten in der fibrösen Kappe bei Dialysepatienten gegenüber der nichtdialysepflichtigen niereninsuffizienten Gruppe. Die poststenotische Intima zeigte in allen drei Gruppen die höchste Dichte von Myofibroblasten. KP-1-positive Makrophagen und Schaumzellen waren in allen drei Gruppen, mit einem Häufigkeitsmaximum in den Plaquearealen vorhanden. Die Ergebnisse dieser Studie zeigen keine Unterschiede im Vorkommen von KP1 positiven Zellen in atherosklerotischen Plaques zwischen den drei Gruppen. Lediglich für die fibröse Kappe war ein Trend zu einer größeren Menge von Makrophagen bei Dialysepatienten erkennbar. In poststenotischen Abschnitten waren die Makrophagen überwiegend in Intima vorhanden. In der Media wurden nahezu keine inflammatorischen Zellen gefunden. Im Vergleich zu den anderen untersuchten Zellen war die Anzahl der T-Lymphozyten in allen Versuchsreihen am niedrigsten. Die größte CD3-Aktivität konnte in den Plaques nachgewiesen werden. In poststenotischen Abschnitten wurden in Intima sowie in Media nahezu keine Zellen oder nur sehr wenige Zellen gefunden. Die einleitend gestellten vier Fragen können nun wie folgt beantworten werden: - Die Gefäßveränderungen der Koronararterien sind nicht auf den Stenosebereich begrenzt. Bei niereninsuffizienten Patienten zeigte sich auch poststenotisch eine auffällig verbreiterte Gefäßwand. Diese wurde durch Media- und Intimahypertrophie verursacht. - Die Intima und Media im Stenosebereich, wie auch poststenotisch waren bei niereninsuffizienten Patienten deutlich breiter im Vergleich zu Nierengesunden. In diese Studie wurde erstmal gezeigt, dass bei Niereninsuffizienz eine poststenotische Intimaverdickung besteht. - Zwischen Dialysepatienten und nichtdialysepflichtigen niereninsuffizienten Patienten zeigt die Studie keine signifikanten Unterschiede in der Struktur der Koronargefäße. Obwohl die statistischen Daten eine hohe kardiale Letalität und Mortalität bei dialysepflichtigen Patienten zeigen, kann die Studie nicht eindeutig belegen, dass die Dialyse ein eigenständiger kardiovaskuläres Risikofaktor ist. - Das Vorkommen der glatten Muskelzellen in atherosklerotischer Plaque, mit einem Maximum in der fibröse Kappe, war bei niereninsuffizienten Patienten, insbesondere bei Dialysepflichtigen höher. Daraus kann man schließen, dass die Atherogenese nach Beginn der Dialysebehandlung nicht gestoppt wird. Die große Zellendichte in der fibrösen Kappe deutet auf eine höhere Ruptur-Gefährdung hin. Die Dialyse schützt vor einem Tod durch Urämie, verhindert aber nicht die kardiovaskuläre Letalität und Mortalität. Die Beschleunigung der arteriellen Gefäßveränderungen beginnt offenbar schon sehr früh in der Entstehung der Niereninsuffizienz und schreitet während der Dialyse fort. Eine frühzeitige Prävention und konsequente Therapie der bekannten und urämiespezifischen Risikofaktoren sind für eine Prognoseverbesserung wichtig.
Studienziel: Der Stellenwert des abdominellen Ultraschalls bei Patienten mit Morbus Crohn (MC) ist bei aktivem Krankheitsverlauf hinsichtlich morphologischer Veränderungen gut untersucht. Im Gegensatz dazu gibt es nur wenige Analysen hinsichtlich Patienten ohne Krankheitsaktivität. In der vorliegenden Studie wurden Patienten mit MC unabhängig von Krankheitsaktivität oder Symptomen einbezogen und hinsichtlich sonographischer abdomineller intestinaler und extraintestinaler Befunde untersucht. Ein weiterer Schwerpunkt lag dabei auch bei der Detektion einer primär sklerosierenden Cholangitis (PSC), die bekanntermaßen häufig gleichzeitig bei chronisch entzündlichen Darmerkrankungen (CED) auftritt. Eine periportale Lymphadenopathie bei Patienten mit PSC ist in der Literatur beschrieben, deren Prävalenz und Ursache bei Patienten mit CED aber unklar. In einem weiteren Studienteil wurde die Genauigkeit der abdominellen Sonographie bei der Detektion einer perihepatischen Lymphadenopathie bei Patienten mit CED untersucht. Methode: Bei 255 Patienten mit MC (117 m, 138 w, Altersdurchschnitt 38 ±14 Jahre) erfolgte eine sonographische Untersuchung des Abdomens mit Beurteilung der Darmwand des Dünn- und Dickdarms. Lagen pathologische Befunde vor, kamen weiterführende diagnostische und gegebenenfalls auch therapeutische Methoden (z.B. Endoskopie, Computertomographie, Biopsie oder Operation) zum Einsatz. Die Krankheitsaktivität wurde mittels Crohn Disease Activity Index (CDAI) bestimmt. Außerdem wurden 310 Patienten mit CED hinsichtlich periportaler Lymphadenopathie (Größe, Anzahl) sonographisch untersucht. Parallel erfolgte eine laborchemische Erhebung von Cholestaseparametern. Eine virale Ursache oder Autoimmunhepatitis wurde bei erhöhten Leberfunktionsund Cholestaseparametern ausgeschlossen. In Folge wurde das Vorliegen einer PSC durch eine endoskopisch retrograde Cholangiographie (ERC) evaluiert falls serologisch keine anderweitige Ursache gefunden werden konnte. Ergebnis: Bei 46/255 (18 %) der Patienten mit MC konnte sonographisch eine transmurale Entzündungsreaktion (TMR) des Darmes mit oder ohne Fistelbildung nachgewiesen werden. Dabei zeigten 29/46 (63 %) der Patienten einen aktiven (CDAI > 150) und 17/46 (37 %) der Patienten einen inaktiven Krankheitsverlauf (CDAI ≤ 150). Bei den Patienten ohne Krankheitsaktivität und TMR waren sonographisch 4 interenterische, 7 blind endende bzw. perirektale Fisteln und bei 6 Patienten eine isolierte TMR nachweisbar. Die gleichzeitig erhobenen sonographischen Befunde anderer Organe hatten bei 25/255 (10 %) eine diagnostische Konsequenz und eine therapeutische Konsequenz bei 9/255 (4 %) Patienten. Eine perihepatische Lymphadenopathie konnte sonographisch bei 27/310 (9 %) Patienten detektiert werden, bei 9 (33 %) von diesen war serologisch eine Virus- oder Autoimmunhepatitis als Ursache nachweisbar. Bei den verbleibenden 18 Patienten konnte bei fast allen (17/18, 94 %) Patienten mittels ERC eine PSC nachgewiesen werden. Pathologische Cholestaseparameter wurden bei 43/310 (14 %) bestimmt, von diesen konnte bei 5 (12 %) Patienten eine Virus- oder Autoimmunhepatitis als Ursache diagnostiziert werden. Die bei den verbleibenden 38 Patienten durchgeführte ERC zeigte bei 15 (39 %) Patienten das Vorliegen einer PSC. Entsprechend war nach Ausschluss einer Virus- oder Autoimmunhepatitis der sonographische Nachweis einer periportalen Lymphadenopathie für das Vorliegen einer PSC genauer als die konventionell durchgeführte Bestimmung der Cholestaseparameter (PPV 94 % und 39 % [p < 0,001]). Zusammenfassung: Die routinemäßig durchgeführte abdominelle Sonographie bei Patienten mit CED kann pathologische Befunde mit diagnostischer und therapeutischer Konsequenz bei symptomatischen und auch asymptomatischen Patienten erheben. Sie stellt somit eine leicht verfügbare und wertvolle Screeningmethode dar. Der sonographische Nachweis einer periportalen Lymphadenopathie stellt, nach Ausschluss einer anderen hepatischen Ursache, einen hohen prädiktiven Indikator zur Diagnose einer gleichzeitig bestehenden PSC dar.
Background and objectives: Constrictive pericarditis (CP) is the result of a spectrum of primary cardiac and non-cardiac conditions. Little data exists on the cause-specific survival after pericardiectomy in the modern era. The impact of pericardial calcification (CA) on survival is unclear. We sought to determine the association of etiology of CP, CA and other clinical variables with long-term survival after pericardiectomy. Methods: We analyzed the records of 163 patients who underwent pericardiectomy for CP over a 24-year period at a single center. The diagnosis of CP was established by surgical report. Vital status was obtained by the Social Security Death Index. The Kaplan Meier method was used to estimate overall survival and survival by etiology group. Cox proportional hazards regression analysis was performed to assess the effect of various causes for CP on longterm survival while adjusting for age. Results: The etiology of CP was idiopathic in 75 patients (46%), prior cardiac surgery in 60 (37%), radiation treatment in 15 (9%) and miscellaneous in 13 patients (8%). Vital status was obtained in 160 patients (98%). Median follow-up was 6.9 years (range: 0.8 to 24.5 years). Perioperative mortality for all patients was 6%. Idiopathic CP had the best prognosis (7 year survival: 88%, 95% confidence interval [CI] 76% to 94%) followed by postsurgical (66%, 95% CI 52% to 78%) and postradiation CP (27%, 95% CI 9% to 58%). In bootstrap-validated proportional hazards analyses, predictors of poor survival were prior radiation, worse renal function, higher pulmonary artery pressure (PAP), abnormal left ventricular (LV) systolic function, lower serum sodium level, and older age. Pericardial calcification had no impact on survival. Conclusion: Long-term survival after pericardiectomy for CP is determined by the underlying etiology of constriction, LV systolic function, renal function, serum sodium, and PAP. Patients with postsurgical as well as postradiation CP have a survival inferior to patients with idiopathic CP. Perioperative Mortality is low. The relatively good survival after pericardiectomy in patients with idiopathic CP emphasizes the safety of pericardiectomy in this group.
Die Verwendung von transkriptionellen Elementen des FXIIIA Gens zur Erhöhung der FVIII-Expression in megakaryozytischen und monozytischen Zellen. Berücksichtigt man den direkten Zugang zum Blutstrom, den immunologischen Hintergrund und die Beteiligung an der Blutgerinnung, wären Megakaryozyten und monozytische Zellen optimale Zielzellen für eine Gentherapie der Hämophilie A. Dennoch waren die Versuche, rFVIII in primären hämatopoetischen Zellen unter Verwendung eines CMV-Promoters zu exprimieren, bisher nicht effektiv. Ein Teil des Fehlschlagens wird der nur unzureichenden Transkription der CMVPromoter in hämatopoetischen Zellen zugeschrieben. Um die FVIII-Expression in hämatopoetischen Zellen zu verbessern, wurden regulatorische Elemente des FXIIIA-Gens in die FVIII-Expressionsvektoren einkloniert. Die Enhancer-Region (enh) und die 5’untranslatierte Region des FXIIIAGens wurden, einzeln und in Kombination, vor dem CMV-Promoter des Expressionplasmids pcDNA3.1 einkloniert. Zusätzlich zu den verstärkenden Elementen und den Promotern wurden sowohl B-Domänen-deletierter FVIII (BDD FVIII) als auch die Vollversion des FVIII („full length“ FVIII) in die Expressionsplasmide eingebaut. Die fertigen Vektoren wurden in die megakaryozytische Zelllinie K562, die humane embryonale Nierenzelllinie 293T und in CD14-Monozyten transfiziert. Als Methoden dienten die Elektroporation (Amaxa) und die Lipofektion (FuGene 6). Die Transduktionseffizienz wurde über fluoreszierende Proteine (EGFP-cDNA [N2]) gemessen, deren Sequenz in die Zellen als Kontrolle mittransfiziert wurde. Die FVIII-Expressionslevel wurden über chromogene Assays und RT-PCR analysiert. Mit dieser Studie war es uns möglich zu zeigen, dass die FVIII-Expressionsrate unter Verwendung der 5’untranslatierten Region des FXIIIA-Gens in Megakaryozyten und monozytischen Zellen signifikant gesteigert werden kann.
Diese Untersuchung beschreibt den peri- und postinterventionellen Verlauf von Patienten, die wegen eines Lebertumors einer chirurgischen oder radiologischen Intervention unterzogen wurden. Das Untersuchungsregime war prospektiv, je 12 Patienten wurden einer operativen, einer TACE oder einer LITT unterzogen und insgesamt mindestens über 9 Monate postinterventionem nachuntersucht. Das Hauptaugenmerk lag auf der Analyse des Lebervolumens das computertomographisch erfasst wurde und der Serumverläufe des Hepatocyte Growth Factor (HGF). Bei den 36 Patienten, die über mindestens 9 Monate nachbeobachtet werden konnten, wurden insgesamt 302 computertomographische Volumendaten erhoben und 314 Laboruntersuchungen vorgenommen. Von diesen 36 Patienten verstarben 14 (je 5 in der chirurgischen und der TACE-, 4 in der LITTGruppe) während des Nachuntersuchungszeitraumes, bei 14 Patienten war ein Tumorrezidiv nachweisbar (6 in der chirurgischen, 5 in der TACE- und 3 in der LITT-Gruppe). Zusammenfassend lassen sich folgende Ergebnisse formulieren: 1. Es findet sich eine tendenzielle Lebervolumenabnahme bei LITT-Patienten. Die chirurgischen Patienten erzielen im Schnitt am Ende des Untersuchungszeitraums in etwa das präoperative Ausgangsvolumen. Das Volumen der TACE-Patienten zeigt keine ausgeprägten Volumenänderungen. 2. Das maximale Lebervolumen korreliert mit der Körperoberfläche mit einem Lebervolumen- Körperoberflächenverhältnis von etwa 0,865 l/m². 3. Patienten, die radiologisch-interventionell behandelt wurden, wiesen niedrigere HGFSerumkonzentrationen auf als die chirurgische Kontrollgruppe. 4. Patienten mit HCC wiesen deutlich höhere Serumkonzentrationen von HGF auf als Patienten mit Metastasen, Patienten mit Metastasen eines Mammakarzinoms niedrigere als Patienten mit anderen Metastasen. Im Unterschied zu der Vergleichsgruppe in der einige Rezidive beobachtet werden konnten, entwickelte keine der Mammatumorpatienten ein Rezidiv. 5. Bei Patienten, die im Verlauf ein Rezidiv entwickelten, zeigten sich deutlich höhere HGFKonzentrationen als bei Patienten ohne Rezidiv. 6. Patienten mit erhöhten Serumtransaminasen wiesen postinterventionell höhere HGFAntworten auf als Patienten mit niedrigeren Serumtransaminasenkonzentrationen. Diese Ergebnisse decken sich mit denen anderer Arbeitsgruppen.
Antiproliferative und proapoptotische Mechanismen des Morphins - Konsequenzen für die Krebstherapie
(2008)
Im Rahmen dieser Arbeit sollte geprüft werden, ob Morphin in der Prostatakarzinomtherapie eingesetzt werden kann. Prostatakrebs ist bei Menschen eine der vier häufigsten aber kaum therapierbare Krebserkrankung. Nach dem Wiederauftreten des Karzinoms weist diese eine extrem hohe Mortalitätsrate auf. Morphin hemmt in MCF7-Zellen, die wie Prostatakarzinome zu den Adenokarzinomen gehören, das Tumorwachstum bei klinisch relevanten Plasmakonzentrationen und weist einen scheinbar μ-Opioid-Rezeptor unabhängigen antiproliferativen Effekt auf. In Kombination mit Naloxon kann dieser Effekt noch gesteigert werden. Somit könnte in Patienten das Tumorwachstum gehemmt werden, ohne die klassischen Nebenwirkungen hervorzurufen. Für den antiproliferativen Effekt ist die Stabilisierung von p53 notwendig. Prostatakarzinome schienen für eine Therapie mit Morphin prädestiniert, da p53 nur sehr selten in diesen Karzinomen mutiert ist. Für die Experimente wurde die LNCAP Prostatakarzinomzelllinie eingesetzt. Da Morphin weder das Tumorwachstum, noch die Zellproliferation in LNCAP-Zellen hemmte, scheint Morphin für die Behandlung von Prostatakarzinomen nicht geeignet zu sein. Durch Untersuchung der Angiogenese in LNCAP Tumoren konnte gezeigt werden, dass eine geringere Vaskularisierung keine verminderte Tumormasse zur Folge hat. Für eine erfolgreiche Krebstherapie scheint es im Gegenteil wichtig zu sein, eine normale Vaskularisierung in Tumoren wiederherzustellen. Die unterschiedlichen Morphinsensitivitäten der beiden Adenokarzinomzelllinien führte zu der Hypothese, dass der μ-Opioid-Rezeptor - zumindest partiell - doch an der Vermittlung des antiproliferativen Effekts des Morphins beteiligt sein könnte. Morphin induziert verschiedene Effekte in MCF7-Zellen, während LNCAP-Zellen kaum auf Morphin reagierten. Es sollte daher untersucht werden, warum MCF7-Zellen sensitiver auf Morphin ansprechen. Durch Überlebenstests mit MCF7-Zellen konnte gezeigt werden, dass eine Behandlung der Zellen mit Morphin in Kombination mit exogenem Glutathion das Überleben der MCF7-Zellen im Vergleich zu morphinbehandelten Zellen signifikant steigern konnte. Dies war ein Hinweis, dass Morphin erstens die Bildung von ROS induziert und dies zweitens in einem Ausmaß geschieht, dass die Überlebensrate der MCF7-Zellen konzentrationsabhängig gehemmt wurde. In weiteren Experimenten zeigte sich, dass die Inkubation der MCF7-Zellen mit Morphin weder die endogene Glutathionkonzentration noch die Expressionsraten der detoxifizierenden Enzyme SOD1 und P5 moduliert. Morphin induziert bei Konzentrationen von 100 μM und 1000 μM in MCF7-Zellen eine signifikant gesteigerte Superoxidanionenbildung. Wie bei den MCF7 Überlebenstests konnte exogen gegebenes Glutathion die durch 100 μM Morphin induzierte Superoxidanionenbildung unterdrücken. Die verstärkte Bildung der Superoxidanionen ist auf Morphin beschränkt, da sie nicht durch die Gabe von Fentanyl, Levomethadon oder Oxycodon induziert werden konnte. Die Bildung der Superoxidanionen könnte Morphin durch die Modulation einer plasmamembranständigen NADH Oxidase hervorrufen. Weiterhin wurden die Folgen einer chronischen Morphingabe im Rückenmark untersucht. Es wird vermutet, dass Morphin im Rahmen einer chronischen Behandlung Apoptose in GABAergen Neuronen auslöst. Für die neuronenspezifische Apoptose nach chronischer Morphingabe konnten durch FACS-Analysen ebenfalls Hinweise gefunden werden. Mittels vergleichender Proteomanalyse konnte festgestellt werden, dass VDAC1 im Rückenmärkgewebe von Tieren, die eine beginnende Morphintoleranz aufweisen, verstärkt exprimiert wurde. Neue Untersuchungen zeigen, dass VDAC1 in der Plasmamembran als Redoxenzym fungieren kann. Dort ist es mit einer NADH Oxidase in den PMOR Komplex eingebunden, der eine wichtige Rolle in der Regeneration von NAD+ aus NADH spielt und so Überleben und Zellwachstum ermöglicht. Eine Störung des PMOR Komplexes hat die Bildung von Radikalen zur Folge. In dieser Arbeit wird die Hypothese aufgestellt, dass Morphin durch Modulation der plasmamembranstädnigen NADH Oxidase in MCF7-Zellen die Bildung von Superoxidanionen induziert. Als Konsequenz könnte VDAC1 verstärkt phosphoryliert werden, um die NAD+/NADH Homöostase aufrecht zu erhalten. Im Laufe der chronischen Morphingabe wird postuliert, dass sich derart viele Superoxidanionen akkumulieren, dass schwerwiegende Schäden an den Makromolekülen vorliegen und die Zelle daher in die Apoptose geht.
Zielsetzung: Die Aufmerksamkeitsdefizit- / Hyperaktivitätsstörung (ADHS) gehört zu den häufigsten psychischen Störungen im Kindesalter. Eine entscheidende Rolle in der Genese des Krankheitsbildes kommt einer genetischen Prädisposition zu, ohne dass die bisherigen Studien einen einheitlichen Befund spezifischer Genvariationen ergaben. Das Ziel der vorliegenden Arbeit besteht darin, zu überprüfen, inwieweit die Ausprägung bestimmter phänotypischer Erscheinungsbilder von ADHS-Patienten, Defizite neuropsychologischer Funktionen, Aspekte von Aufmerksamkeit und Impulskontrolle sowie komorbide aggressive und dissoziale Verhaltensweisen, mit dem Vorkommen bestimmter Genotypen in Anfälligkeitsgenen einhergeht. Methode: 70 Kinder mit ADHS wurden mit Fragebogenverfahren (Impulsivitätsfragebogen IVE, Achenbachskalen) und neuropsychologischen Verhaltenstests (WCST, FAIR, Go/NoGo) untersucht. Mittels Mediansplit wurde die Stichprobe hinsichtlich sämtlicher untersuchter Items dichotomisiert, jeweils in zwei Gruppen mit niedrigen und hohen Wertebereichen. Anschließend wurde die Verteilung einzelner Genpolymorphismen zwischen beiden Gruppen verglichen. Als molekulargenetische Indikatoren wurden folgende Polymorphismen untersucht: DRD4 Exon III VNTR, SLC6A3 (DAT1) 40bp VNTR, COMT Val108/158Met, MAOA 30bp VNTR sowie SLC6A4 (5-HTTLPR, SNP rs25531, Intron II VNTR). Ergebnisse: Im Einzelnen ergaben sich die folgenden relevanten Befunde: Die 10/10-Repeat-Variante in SLC6A3 war signifikant mit einer erhöhten Anzahl von Perseverationsfehlern im WCST assoziiert (p=.046). Der 4 bzw. 4/4- und 4/3- Genotyp im MAOA-Gen waren im Vergleich zur 3 bzw. 3/3-Variante hochsignifikant mit niedrigeren Qualitätswerten im FAIR assoziiert (p=.005), gingen gleichzeitig signifikant mit mehr Omission-Errors in Treat 2 der Go/NoGo Aufgabe einher (p=.03). Der 4 bzw. 4/4-Genotyp zeigte außerdem einen Trend für vermehrte Perseverationsfehler im WCST (p=.063). Der 3 bzw. 3/3-Genotyp, isoliert betrachtet, zeigte einen tendenziellen Effekt für die Skala „delinquentes Verhalten“ der CBCL (p=.07). Die L/L-Variante des 5-HTTLPR-Polymorphismus in SLC6A4 war in Treat 1 der Go/NoGo Aufgabe signifikant häufiger in der Gruppe mit wenig Commission-Errors (p=.04). 5-HTTLPR-Polymorphismus und SNP rs25531 zeigten in Treat 1 der Go/NoGo Aufgabe einen hochsignifikanten Zusammenhang der LA/LA-Variante und der Gruppe mit wenig Commission-Errors (p=.004). Weiter war der 12/12-Genotyp des Intron II VNTR-Polymorphismus in SLC6A4 signifikant mit einem erhöhten Schweregrad aggressiver Verhaltensweisen in der CBCL assoziiert (p=.018). Schlussfolgerung: Es ist davon auszugehen, dass an der Ausprägung von ADHS zahlreiche Gene mit jeweils geringem Effekt beteiligt sind. Unsere Befunde legen nahe, dass bestimmte Allelvarianten mitunter einen stärkeren Einfluss auf die Ausprägung spezieller Subsymptome haben. Obwohl bei bestimmten Genotypen unterschiedlicher Anfälligkeitsgene teilweise ähnliche Auswirkungen auf Neurotransmitterebene diskutiert wurden, zeigten sich in der vorliegenden Studie nicht immer vergleichbare Übereinstimmungen hinsichtlich der phänotypischen Merkmale. In der Literatur werden bisweilen inkonsistente Phänotypen ein und derselben Allelvariante berichtet. Neben einer Präzisierung des Phänotyps sollten künftige Untersuchungen daher insbesondere auch die funktionelle Interaktion einzelner Genvarianten, additive Geneffekte sowie Gen- Umwelt-Interaktionen berücksichtigen.
Die Kraftfähigkeiten werden in ihrer Bedeutung für den Boxsport immer noch unterschätzt. Die vorliegende Arbeit soll dazu beitragen, die Akzeptanz des Krafttrainings zu erhöhen und Berührungsängste abzubauen. Die Arbeit zeigt, dass man sich auch heute noch im Hochleistungsbereich des Boxsports Fehler leistet, die die Effizienz des Trainings negativ beeinflussen können. Viele der Spitzenathleten erreichen gute Leistungen nicht wegen des guten Trainings, sondern trotz des schlechten Trainings. Besonders im Bereich des Krafttrainings bestehen deutliche Defizite. Sogar die weltbeste Nation im Amateurboxen, Kuba, hält zurzeit immer noch die Kraftausdauer für den entscheidenden Faktor im Bereich Kraft. So trainiert man hier auch immer noch mit der Methode des Zirkeltrainings an Stationen mit typischen Kraftausdauerreizen (vgl. OTANO 2006). Mit der dieser Arbeit zugrunde liegenden Studie wurden aktuelle Erkenntnisse im Bereich Kraft aufgegriffen und aufgezeigt, dass man mit Kraftausdauer und Zirkeltraining alleine nicht dem Anforderungsprofil im Boxen gerecht werden kann und das man mit verändertem Krafttraining noch deutlich effektiver sein könnte. Krafttraining sollte gerade mit jungen Boxern durchgeführt werden, um möglichen muskulären Dysbalancen und Überlastungsschäden vorzubeugen (vgl. KITTEL et al. 2008). In dieser Untersuchung mit Spitzenboxern hat sich das Krafttraining außerdem als bedeutende Leistungsreserve im Boxsport dargestellt. Es stellt eine Möglichkeit zur Anhebung der schnellkraftrelevanten neuromuskulären Leistungsfähigkeit dar, die mit sportartspezifischem Training allein nicht erreicht werden kann (vgl. SCHLUMBERGER et al 2002). Alte Vorurteile, z.B. das Krafttraining langsam mache, können mit derartigen Ergebnissen relativiert werden. An ihre Stelle soll das Wissen um die richtige Einbindung von Krafttraining in den Trainingsprozess treten und damit die Leistung der Boxsportler weiter verbessert werden. BUCHWALD schreibt bereits 1984, dass die Zielstellung, Boxschläge mit maximaler Geschwindigkeit und Härte im Ziel zu landen, nur bei entsprechender Ausbildung der dafür notwendigen konditionellen Fähigkeiten (z.B. Explosivkraft, Maximalkraft) realisiert werden kann. Dennoch wird es vornehmlich älteren Trainern schwer fallen, sich beispielsweise an die längeren interseriellen Pausen beim IK-Training zu halten. Aber längere Pausen zeugen eben nicht von Faulheit, sondern vom Wissen um physiologische Wiederherstellungsprozesse. Um internationalen Anschluss zu haben, ist gezieltes hartes Krafttraining notwendig. Diese Notwendigkeit ist von vielen Trainern im Deutschen Box Verband noch nicht erkannt. Neben vielen anderen Faktoren ist dies einer der Gründe, warum die deutschen Boxer bei der Olympiade 2008 keinen einzigen Kampf gewinnen konnten. Bei den Schwimmern und auch in anderen Sportarten werden die gleichen Fehler wie bei den Boxern gemacht. So postuliert SPIKERMANN (1993) funktionelles Krafttraining und bereitet dann die Nationalmannschaftsschwimmer lediglich mit Therabändern über Monate hinweg auf die Kraftbelastungen im Schwimmen vor (Eigenbeobachtungen am OSP Rhein-Neckar). Auch hier zeugen die Olympia-Ergebnisse von der schlechten Arbeit. ALLERBORN postuliert spezifisches Krafttraining und gibt zu Bedenken, dass das Zusatzgewicht nicht zu schwer sein dürfe, da sonst die Bewegungskoordination leide. Er übersieht dabei, dass die spezielle Bewegung mit Zusatzgewichten niemals exakt der Wettkampfbewegung entspricht. Aus diesem Grund sollte sich das Krafttraining vor allem auf allgemeine Kraftübungen reduzieren. Beim Training der einzelnen Einflussfaktoren auf die Wettkampfleistung im Boxen ergibt sich häufig ein Problem: Sie beschreiben immer nur einen Teil eines Kollektivs von Einflüssen. Bei einer ungünstigen Konstellation können manche Einflüsse andere überdecken. Für die Trainingspraxis bedeutet dies, dass wenn sich ein Trainer auf die Verbesserung eines Parameters wie die Kraftfähigkeiten konzentriert, er aber dafür andere wichtige Einflussfaktoren, wie z.B. die taktische Schulung oder die psychologische Betreuung bei einer Vorbereitung vernachlässigt, dann kommt der Kämpfer seinem Trainingsziel trotz verbesserter Kennwerte nicht näher (vgl. PFEIFFER 2001, 290). Auch in der dieser Arbeit zugrunde liegenden Studie konnte nicht das Optimum an Verbesserungen erzielt werden, weil die einzelnen Trainingsinhalte nicht gut aufeinander abgestimmt waren. Allerdings lag die Problematik hier nicht darauf, dass man sich nur auf das Krafttraining konzentrierte und andere Trainingsinhalte vernachlässigte, sondern man überforderte die Sportler vielfach indem man verschiedenste Trainingsinhalte konzeptlos vermischte. So stellte auch SCHLUMBERGER (2000) in zwei Studien fest, dass ausgeprägtere Explosivkraftverbesserungen dadurch verhindert worden sein könnten, dass das neuromuskuläre System durch Trainingsreize außerhalb der Studien zu vielen konkurrierenden (anaerob-ermüdenden) Reizen ausgesetzt gewesen sein könnte (vgl. auch HÄKKINEN 1988). Die von ZATSIORSKY et al. (2008) beschriebene Gefahr, dass Sportler, die mit maximalen Lasten trainieren, leicht ‚ausbrennen‘ können, kann durch diese Studie nicht bestätigt werden. Das Gegenteil war der Fall – Maximalkrafttraining wirkte stark motivierend auf die Probanden und hatte so einen positiven Einfluss auf die gesamte Trainingseinstellung. Lediglich nach Krafttrainingseinheiten mit submaximalen Lasten zu Beginn der Krafttrainingsperiode klagten die Probanden anfänglich über Muskelschmerzen durch die ungewohnte Belastung. Überlegungen, wonach Schnelligkeitsleistungen gegen geringe äußere Widerstände unabhängig sind von der Maximalkraft (ALLERBORN; RÖTHIG / GRÖSSING) konnten mit dieser Studie widerlegt werden. Richtig ist, dass der Einfluss bei leichten Widerständen ab- und bei schweren Widerständen zunimmt (BÜHRLE 1985), allerdings wird er auch bei geringsten Widerständen vorhanden sein. Falsch sind Aussagen von ALLERBORN (2000, 62), wonach Maximalkrafttraining an sich nicht schneller oder schnellkräftiger macht. Es hat sich auch die Aussage von BÜHRLE et al. (1982) bestätigt, wonach Sportler, die über ein hohes koordinatives Niveau verfügen, Zuwächse der Maximalkraft besonders effektiv in Bewegungsschnelligkeit umsetzen können. Es erscheint in der Vorbereitung auf einen Wettkampf sinnvoll, neben dem Training mit submaximalen und maximalen Kontraktionen der in Untersuchungen von WILSON et al. (1993), SCHMIDTBLEICHER / HEMMLING (1994) und SCHLUMBERGER (2000) geforderten weiteren Explosivkraftbetonung mit ballistischen Kraftübungen und Sprüngen im DVZ gerecht zu werden. Die Wahrscheinlichkeit des Transfers der neuromuskulären Anpassungen auf dynamische Schnellkraftsituationen im koordinativen Muster einer bestimmten Zielbewegung könnte so möglicherweise gesteigert werden. Detaillierte Belastungsvorgaben für ein derartiges Training fehlen allerdings häufig (vgl. SCHLUMBERGER (2000). Allerdings kann aus Sicht der neuromuskulären Leistungsbereitschaft ein Training mit maximalen Kontraktionen und reaktives Sprungkrafttraining mit einem Mindestabstand von drei Stunden am gleichen Tag durchgeführt werden. Nach einer typischen Hypertrophieeinheit sollten nach SCHMIDTBLEICHER / FRICK (1998) mindestens 72 Stunden bis zum Sprungkraftraining liegen.
The growth of blood vessels is crucial for organ growth in the embryo and repair of wounded tissues in the adult. An imbalance in this process contributes to numerous malignant, inflammatory, ischemic, infectious and immune disorders (Ferrara et al., 2003). Postnatal neovascularization occurs through the recruitment of progenitor cells and angiogenesis. Integrins are heterodimeric cell surface molecules and are the main receptors for extracellular matrix proteins. Regulation of integrin activation is crucial during embryonic development and during adult life. Dysregulation of integrin activity leads to severe diseases. In this study, we have demonstrated that Rap1, a small GTPase regulating integrin activity, and its GEF Epac1 are expressed in both EPC and endothelial cells. Moreover, the pharmacological activator of Epac activates the small GTPase Rap1 in progenitor cells. In parallel the angiogenic growth factors VEGF and bFGF activate Rap1 in endothelial cells. In addition, the regulation of Rap1 activity in EPC and in endothelial cells plays an important role in the regulation of migration and adhesion to matrix proteins, by regulating the activity of different integrins, a mechanism known as integrin inside‐out signaling. Furthermore, regulation of Rap1 activity affects probably indirectly through outside‐in signaling of integrins the activity of several and crucial proteins such PKB/Akt and focal adhesion kinase in endothelial cells. In line with these results, we have demonstrated that Rap1 activity affect angiogenesis, homing of EPC to ischemic tissues and thereby postnatal neovascularization. The understanding how Rap1 regulates integrin activity in endothelial cells is still not completely clear, for example we have demonstrated that the known effectors of Rap1 mediating the increase of integrin activity in T and B cells, such as RAPL and RIAM are, respectively, either not increasing integrin activity or not expressed in endothelial cells. We aim to find the effector of Rap1 promoting integrin activity in endothelial cells and how RAPL regulates integrin functions and angiogenesis. Moreover data from us and others using genetic models and generation of Rap1a or Rap1b deficient mice or deficient for Rap1a and Rap1b led to embryonic lethality suggesting that Rap1 is a key node protein during embryonic development. The development of conditionnal Rap1a/b endothelial/pericytes restricted deficient mice will help us to decipher more precisely the role of Rap1 during vascular development and angiogenesis.
Das Ziel des adaptiven Entwurfs von Substanzbibliotheken ist es, die vollständige biologische Testung einer molekularen Screeningbibliothek zu vermeiden. Stattdessen erfolgt, geleitet durch Optimierungsalgorithmen, eine "intelligente" Navigation durch den chemischen Raum, um so bevorzugt Substanzen mit gewünschten Eigenschaften auszuwählen. In einer retrospektiven Studie wurden die Optimierungsalgorithmen "Zufallssuche", "Simulated Annealing", "Evolutionsstrategie" und "Partikelschwarmoptimierung" im Hinblick auf den Entwurf von Bibliotheken von Serinproteaseinhibitoren systematischen verglichen. Die Gesamtzahl verfügbarer Substanztestungen wurde auf 300 beschränkt, um Laborbedingungen zu simulieren. Als Ergebnis zeigten sich besonders die Evolutionsstrategien für einen Einsatz in einer Niedrigdurchsatzscreening-Kampagne geeignet, da diese effizient mit großen Populationen und wenigen Iterationen arbeiteten. Der zweite Teil dieser Arbeit beschreibt den erfolgreichen Entwurf einer fokussierten Bibliothek von RNA-Liganden. In einer hybriden, prospektiven Optimierungsstudie wurden nach dem Vorbild einer iterativen Niedrigdurchsatzscreening-Kampagne vom Computer vorgeschlagene Moleküle im Labor getestet. Die Substanzen wurden auf Inhibition einer spezifischen molekularen Wechselwirkung im Replikationszyklus von HIV getestet (Tat-TAR-Interaktion). In vier Generationen wurden 9 von 170 untersuchten Verbindungen positiv auf Inhibition der Tat-TAR-Interaktion getestet (Trefferquote: 5,3%), wobei lediglich 0,089% der Verbindungen der Screeningbibliothek untersucht wurden. Die zwei potentesten Kandidaten wiesen einen IC50 von 51 uM bzw. 116 uM auf.
The geodynamic processes and the chemical and thermal evolution of the mantle beneath the Kaapvaal craton (South Africa) was investigated with further regard to diamond formation. For this, 31 coarse-grained peridotites and 21 individual subcalcic garnets from heavy mineral concentrates (HMC) from the Finsch mine were studied for their major and trace element compositions, Lu-Hf and Sm-Nd isotope composition. Furthermore, processes in the Earth’s mantle that follow kimberlite sampling and propagation were studied in polymict peridotite breccia from Kimberley mines. Inter mineral equilibrium of the peridotites was tested by comparing the results from different, independent thermometers. These, well equilibrated peridotites stem from a restricted pressure of 5 to 6.5 GPa (depth ~160-200 km) and a temperature range of 1050-1250°C, following the 40 mW/m2 conductive geotherm. The majority of the samples display a well developed anti-correlation of oxygen fugacity with pressure, which is in contrast to the sheared and oxidised, younger kimberlite erupted peridotites from Kimberley. All analysed samples have homogeneous trace element mineral chemistry. Variations in trace elements among Finsch peridotites reflect their complex nature and the intricate development of the subcratonic mantle. The 3.6 Ga is the oldest crustal age recorded in the Kaapvaal craton, and is confirmed by the Lu-Hf model age of a highly radiogenic subcalcic garnet in this study. Therefore, this age probably represents the oldest depletion (partial melting event) of the subcratonic mantle beneath the Kaapvaal craton. Both, subcalcic garnets and Finsch peridotites yield Lu-Hf isochron ages of around 2.5 Ga, which probably represent the last depletion event of the Kaapvaal craton. Several older (than 2.5 Ga) depletions were also necessary to explain higher isochron initials of the both isochrones. The Cr# and HREE concentrations and ratios of the Finsch subcalcic garnets and peridotites indicate that partial melting of the Kaapvaal craton happened at different depths. One group of subcalcic garnets (group-1) experienced depletion at high pressure in the garnet stability field and another one (group-2) at low pressures in the spinel or plagioclase stability field. Major and trace elements indicate that up to 50%, of the melt was remover from the primitive (primer) mantle in at least two melting events. Thus, first continental crust was created early (> 2.5 Ga) from high degrees of partial melting of the lithospheric mantle. According to the Sm-Nd isotope signatures at least two metasomatic events took place significantly after 2.5 Ga. As monitored by group-1 subcalcic garnets, the first enrichment was produced by a fluid and occurred at around 1.3 Ga. The second metasomatic event was much later at 500-300 Ma ago and has changed both Nd and Hf isotopic compositions of group-2 subcalcic garnet as well as some Finsch peridotites. During partial melting any carbon species will be dissolved in the melt and removed from the residue. Therefore, any diamond growth before the last depletion (~2.5 Ga) would have been probably completely removed from the lithospheric mantle. Consequently, carbon was apparently reintroduced into the system, i.e. during Metasomatism, and triggered the growth of diamonds. The Sm-Nd isotope systematics of the subcalcic garnets of this study indicates that enrichment occurred at ~1.3 Ga or later, which implies non-Archean, late diamond growth in Finsch. Fertilisation of the subcontinental craton associated with the percolation of group-2 (~120 Ma) or even younger (~90 Ma) group-1 kimberlites and their precursors are not observed in Finsch peridotites, but are well presented in mantle xenoliths from Kimberley. Therefore, these younger events were studied on specific mantle xenoliths, polymict breccia from Kimberley. A polymict peridotite found at the Boshof road dump, Kimberley, represents a mechanical mixture of upper mantle clasts and minerals (opx, cpx, garnet and olivine) of different lithologies, cemented by fine-grained olivine and minute amounts of interstitial ilmenite, phlogopite and sulphide. According to Ni in garnet thermometry, single porphyroclastic garnets were sampled and mixed during ascent in a 100 km stratigraphic column, starting from ~250 km until ~120 km. During this ascent, melt has reacted with the porphyroclasts and at theirrims neoblastic minerals were formed, i.e. neoblastic opx around opx porphyroclast, neoblastic garnet around garnet porphyroclast, and neoblastic opx around cpx porphyroclast. Analyses of those neoblastic minerals indicate that volatile-rich, kimberlite-like melt was the agent that collected the mantle minerals and amalgamated this xenolith. Several complex processes were responsible for the formation of the polymict breccia. They comprise melt degassing at high pressures that probably created “explosive” Brecciation of the cratonic roots (~250 km), propagation of the melt that collected different porphyroclasts on a way and amalgamation at around 120 km. The whole process of “explosive” brecciation, turbulent transport and mixing of mantle porphyroclasts and melt, porphyroclast dissolution and neoblast precipitation happened very fast and was part of the kimberlite formation. Therefore, the here studied sample probably represents one frozen part (with variable mantle clasts) of the kimberlitic magma precursor, with kimberlite eruption at ~90 Ma years ago in Kimberley.
Diese Arbeit teilt sich in zwei Themenblöcke, deren zentrales Element Borat-Anionen darstellen, die unterschiedlichste Funktionen erfüllen. Durch entsprechende Wahl der Substituenten am Bor können sowohl Anionen mit schwach koordinierenden Eigenschaften erzeugt werden, als auch Borate, die sich zum Einsatz als Ligand in der Koordinationschemie eignen. ...
Ziel der vorliegenden Arbeit war es zu klären, ob die Resektion symptomatischer, als benigne eingeschätzte US-BI-RADS® III Läsionen (BBIII-Läsionen) mit dem HHMT im Prinzip möglich ist und eine gute Option darstellt. Aus dem Kollektiv der im Zeitraum von 7/2000 – 5/2006 in drei Brustzentren an 846 Frauen durchgeführten sonographischen Vakuumbiopsien (n=1000), wurden 374 BBIIILäsionen ausgewählt. Diese wurden zur histologischen Sicherung mit der Intention einer Komplettresektion mit dem Hand-Held-Mammotome® angegangen. In allen Fällen wurde die minimal-invasive Biopsie als Alternative zu einer bestehenden Indikation zur offenen Biopsie aufgrund der Symptomatik vorgenommen. In 343 Fällen bestand der Verdacht auf ein Fibroadenom, in 31 Fällen sollte eine symptomatische Zyste entfernt werden. Der Altersgipfel in dieser Patientinnengruppe lag zwischen 21 und 30 Lebensjahren. Fast die Hälfte (47 %) dieser benignen Veränderungen trat in den oberen äußeren Quadranten der Mamma auf. Drei Viertel der Mammaläsionen (77 %) waren bis 2 cm groß. In 96,3 % der Fälle bestätigte sich durch die gewonnene Histologie die Benignität der Verdachtsdiagnose. Alle als Zysten eingeschätzten Läsionen stellten histologisch auch Zysten dar. Von den anderen als benigne eingeschätzte Läsionen waren 77 % Fibroadenome, 12 % mastopathische Areale davon ein Drittel herdförmige Fibrosen und zwei Drittel herdförmige Adenosen. In 0,3 % ergab sich eine Narbe und in 7 % andere histologische Entitäten wie z.B. Lymphknoten oder Lipome. In 1,6 % ergab sich ein Karzinom und in 0,8 % eine ADH bzw. ALH. In 1,3 % ergab der histologische Befund eine B3-Läsion. Hiermit konnte durch das histologische Ergebnis die Korrektheit der Einteilung in BI-RADS® III bestätigt werden, in der eine Malignität unter 2 % vorliegen sollte. In 86 % aller Biopsien war nach vier Tagen ein Hämatom im Biopsiegebiet nachweisbar. Davon waren drei Viertel nach vier Monaten komplikationslos ohne Intervention resorbiert. Die Rate an Komplikationen mit 3,5 % über den gesamten Zeitraum der Erhebung war sehr niedrig. Hierbei handelte es sich um zwei Wundinfekte, einen Abszess, eine unstillbare Blutung am OP-Tag und drei Abbrüche. Zwei davon wegen Schmerzen und einen Abbruch aufgrund einer Hyperventilationstetanie. Es gab im ganzen Zeitraum sechs Hämatome, die punktiert wurden. Schwerwiegende Komplikationen gab es nicht. Alle als benigne eingeschätzten Läsionen wurden mit der Intention der Komplettresektion angegangen. Zuerst war nur die 11G Nadel auf dem Markt. Nach 2002 gab es auch die 8G Nadel, die allein aufgrund der größeren Menge an Gewebe, das gewonnen werden kann, größere Befunde leichter komplett entfernen kann. Mit der 8G Nadel gelang eine sonographische Komplettentfernung bei Befunden unter 1 cm in 100 % der Fälle, bei Befunden von 1 cm bis 2 cm in 93 %, und bei Befunden zwischen 2 cm und 3 cm in 86 % der Fälle. Um die Rate der histologischen Komplettresektion nach Hand-Held-Mammotome® abschätzten zu können, haben wir analog aus dem Gesamtkollektiv der 1000 Vakuumbiopsien die 54 Fälle einer gut messbaren Läsion, die nach der minimal-invasiven Biopsie operativ exzidiert wurden, untersucht. Dabei fanden wir in einem Drittel eine histologische Komplettentfernung, in einem Drittel fanden sich Reste bis 5 mm und in einem weiteren Drittel war der Tumorrest zwischen 6 mm und 10 mm groß, unabhängig von der Größe der Läsion. Man muss also davon ausgehen, dass nach sonographisch eingeschätzter Komplettresektion in zwei Drittel der Fälle mit Resten des Tumors zu rechnen ist. Bei B3 und B5 Läsionen darf somit nicht auf die Nachoperation verzichtet werden, und es erscheint nicht sinnvoll, bei bildgebend komplett entfernten Karzinomen auf die definitive Operation zu verzichten. Die sonographisch gesteuerte Vakuumbiopsie ist eine sinnvolle Option zur sonographischen Komplettresektion von symptomatischen, als benigne eingeschätzte Mammaläsionen mit hoher diagnostischer Sicherheit, guter Durchführbarkeit, geringen Komplikationen, und sehr guter Kosmetik, die zudem unter ambulanten Bedingungen in Lokalanästhesie durchführbar ist.
Stickstoffmonoxid (NO) ist ein evolutionär konservierter pleiotroper Botenstoff. Im Nervensystem fungiert NO als Transmitter, als Komponente des unspezifischen Immunsystems wirkt es bakterizid, und im kardiovaskulären System vermittelt es Vasodilatation und Inhibition der Thrombozytenaggregation. Die Regulation der Aktivität und Verfügbarkeit der drei NO-Synthase-Isoformen (NOS) ist außerordentlich komplex, erfolgt unter anderem durch zahlreiche Proteininteraktionen und ist durch eine bemerkenswerte Dynamik der subzellulären Verteilung der NOS gekennzeichnet. Die molekularen Mechanismen dieser Prozesse sind gegenwärtig nicht vollständig verstanden. NOSIP (NOS interagierendes Protein) wurde initial als ein Protein identifiziert, das die subzelluläre Verteilung von endothelialer NOS (eNOS) verändert. Überexpression von NOSIP bewirkt eine Umverteilung der eNOS von der Plasmamembran in intrazelluläre Kompartimente, die zu einer signifikanten Aktivitätsminderung führt. Im Hinblick auf die Bedeutung der subzellulären Lokalisation in der Regulation der eNOS-Aktivität und lokaler Verfügbarkeit von NO war es das Ziel der vorliegenden Arbeit, die subzelluläre Verteilung von NOSIP zu charakterisieren. Immunfluoreszenzmikroskopische Untersuchungen zeigten, dass sich endogenes NOSIP vorwiegend im Zellkern findet. In Datenbankanalysen wurde kein klassisches nukleäres Lokalisationssignal (NLS) identifiziert. Bei genauer Betrachtung der Primärsequenz fand sich jedoch eine diskontinuierliche Sequenz mit einer Häufung basischer Aminosäuren. Sukzessive Mutation dieses hypothetischen Motivs führte zu einer Umverteilung des Proteins aus dem Zellkern ins Zytoplasma. Mittels Pulldown-Experimenten konnte gezeigt werden, dass NOSIP an das zur Kernimportmaschinerie gehörende Adapterprotein Importin-α bindet, während NLS-defiziente Mutanten nicht mehr in der Lage waren diese Interaktion einzugehen. Wie Heterokaryon-Experimente belegten, wandert NOSIP zwischen Zellkern und Zytoplasma. Dies deutet auf einen dynamischen nukleären Import- und Exportmechanismus hin, der die Grundlage für eine Interaktion mit zytoplasmatisch lokalisierter eNOS darstellt. Der nukleäre Export von NOSIP wurde durch Leptomycin B nicht beeinflusst, welches den Export von Proteinen blockiert, die eine Leucin-reiche nukleäre Export-Sequenz (NES) besitzen. Zusammengefasst belegen die in dieser Arbeit erhobenen Daten, dass NOSIP ein vorwiegend nukleäres Protein ist. Obwohl diese Verteilung durch ein atypisches zweiteiliges NLS vermittelt wird, umfasst der nukleäre Import von NOSIP die Interaktion mit Importin-α, welches typischerweise den Import von Proteinen vermittelt, die über ein klassisches NLS verfügen. NOSIP ist nicht topographisch im Zellkern fixiert, sondern wandert konstant zwischen Zellkern und Zytoplasma. Da der nukleäre Export von NOSIP nicht durch Leptomycin B beeinflusst wird, erscheint es unwahrscheinlich, dass NOSIP an die typische CRM1-Bindungsstelle für Frachtproteine bindet. Dies lässt sich gut mit der Tatsache in Einklang bringen, dass NOSIP kein Leucin-reiches NES besitzt. Unabhängige Beobachtungen unserer Arbeitsgruppe weisen darauf hin, dass NOSIP in der G2-Phase des Zellzyklus aus dem Zellkern ins Zytoplasma transloziert, wodurch eNOS in dieser kritischen Phase der Zellteilung inhibiert werden kann.
Die weltweit steigende Teilnehmerzahl bei Volks- und Marathonläufen zeigt, dass sich das Langstreckenlaufen in den letzten Jahren zum Volkssport entwickelt hat [Merz, 2004]. Das Streben vieler Freizeitläufer, außergewöhnliche sportliche Leistungen zu erbringen und beim Marathon an die eigenen Grenzen zu stoßen, birgt jedoch auch die Gefahr von Überlastungsreaktionen und Verletzungen besonders des Kniegelenks [Hohmann et al., 2005]. In welchem Maße die Belastungen beim Langstreckenlaufen physiologische Grenzen überschreiten und damit den hyalinen Gelenkknorpel schädigen sowie die Gonarthroseentstehung begünstigen, konnte bislang noch nicht eindeutig geklärt werden. Ziel unserer Studie war es, den hyalinen Knorpel im Kniegelenk zu quantifizieren (Knorpelvolumen und -dicke), um auf dieser Grundlage Rückschlüsse auf ein möglicherweise erhöhtes Arthroserisiko bei Marathonläufern ziehen zu können. Zu diesem Zweck erfolgte die Untersuchung aller Probanden, mit einem weit verbreiteten MRT-Gerät (1.5 T Magnetom Symphony, Siemens). Spezielle MRT-Sequenzen (qMRT) in Kombination mit digitalen Bildbearbeitungsprogrammen ermöglichen eine exakte drei-dimensionale Analyse der quantitativen Knorpelparameter Volumen und mittlerer Dicke im Kniegelenk. Bei den Wettkampfanfängern (5 Frauen und 6 Männer; 39.5 ± 4.8 Jahre; 75.9 ± 18.2 kg; BMI 25.1 ± 3.5 kg/m2) erfolgten die MRT-Messungen zu Beginn ihrer sechsmonatigen Vorbereitung auf den Frankfurt-Marathon und in den ersten Tagen nach dem Rennen. Die durchschnittliche Laufleistung der Marathon-Debütanten, die im Schnitt seit 3 Jahren freizeitmäßig joggten, lag bei 34 km/Woche während des sechsmonatigen Marathontrainings. Die fortgeschrittenen Wettkampfläufer (12 Männer; 37.9 ± 7.4 Jahre; 75.2 ± 5.4 kg; BMI 23 ± 1.3 kg/m2) wurden vor und nach einem Trainings- und Wettkampfjahr untersucht, in dem sie ein durchschnittliches Laufpensum von 67 km pro Woche absolvierten. Eine validierte T1-gewichtete Gradientenechosequenz mit Wasseranregungstechnik (FLASH: TR = 49 ms, TE = 10.3 ms, FA = 30°, Auflösung = 0.156 mm x 0.156 mm, Schichtdicke 1.5 mm, Matrix = 512 Pixels x 512 Pixels, Bildausschnitt [FOV] = 160 mm x 160 mm) diente zur Akquisition koronarer Datensätze des femoralen und tibialen Knorpels (jeweils laterales und mediales Kompartiment) und transversaler Datensätze des patellaren Gelenkknorpels. Nach manueller Segmentierung und 3D-Rekonstruktion erfolgte die Analyse der quantitativen Knorpelparameter. Die Veränderungen von Knorpelvolumen und mittlerer Knorpeldicke im Zeitverlauf wurden prozentual dargestellt und die Signifikanz mittels gepaartem T-Test berechnet. Bei den Wettkampfanfängern zeigte sich keine signifikante Reduktion der Knorpeldicke oder des Knorpelvolumens, lediglich am lateralen Femur war eine signifikante Reduktion von Knorplvolumen (-3.2 ± 3.0 %, p = 0.012) und mittlerer Knorpeldicke (-1.7 ± 1.6 %, p = 0.010) zu finden. Da jedoch die Schwankungen vom Knorpelvolumen im Tagesverlauf und nach 50 Kniebeugen größer sind als die prozentualen Veränderungen am lateralen Femur, kann die berechnete signifikante Abnahme nicht als relevanter Knorpelverlust oder -verschleiß interpretiert werden. Die fortgeschrittenen Wettkampfläufer wiesen in keinem der fünf Knorpelkompartimente des Kniegelenks (laterale und mediale Tibia, lateraler und medialer Femur und Patella) eine signifikante Zu- oder Abnahme der Knorpelparameter auf. Die Ergebnisse dieser Studie legen den Schluss nahe, dass die andauernden und hohen axialen Lasten beim Langstreckenlaufen, vom Kniegelenksknorpel der Marathon-Debütanten und etablierten Wettkampfläufer gut toleriert werden. Insgesamt liefert die quantitative Analyse der Knorpelmorphologie im Kniegelenk keine Anhaltspunkte für ein erhöhtes Risiko der vorzeitigen Arthroseentstehung bei Marathonläufern.
Das proinflammatorische Zytokin Interleukin (IL)-18 scheint an einer Vielzahl von Entstehungsprozessen pathologischer Erkrankungen, darunter rheumatoide Arthrits und Artherosklerose, sowie Tumorwachstum und Metastasierungsfähigkeit von Tumoren, beteiligt zu sein. Da die biologische Aktivität der Matrix-Metallo-Proteinase-9 (MMP-9) ebenfalls entscheidenden Einfluss auf die Pathologie dieser Erkrankungen hat, wurden die Auswirkungen von IL-18 auf die MMP-9-Produktion in peripheren Blutmonozyten (PBMC) untersucht. Darüber hinaus richtete sich unser Augenmerk auf die Möglichkeiten einer immunopharmakologischen Intervention mittels anti-Tumor-Nekrose-Faktorα (anti-TNFα) oder IL-10. In der vorliegenden Arbeit konnte gezeigt werden, daß die MMP-9-Produktion in PBMC durch IL-18 gesteigert wird. Dabei ist die Potenz von IL-18 bei der Freisetzung von MMP-9 vergleichbar mit derjenigen von TNFα. Durch die Verwendung neutralisierender monoklonaler Antikörper konnte gezeigt werden, dass die Freisetzung von MMP-9 von einer endogenen TNFα-Produktion abhängig ist. Während IL-18 und TNFα die Protease induzieren, ergibt eine Inkubation mit IFNγ keine Effekte auf die Freisetzung von MMP-9 in den PBMC. Die hier beschriebene Induktion von MMP-9 durch IL-18 ließ sich ebenfalls in humanen Vollblutkulturen nachweisen. Das antientzündliche Zytokin IL-10 ist in der Lage, die Sekretion von MMP-9 sowohl aus unstimulierten als auch aus PBMC, die zuvor mit IL-18 inkubiert wurden, konsequent zu unterdrücken. Die Produktion des tissue inhibitor of metalloproteinase-1 (TIMP-1) bleibt von einer Stimulation mit IL-18 unberührt, wohingegen eine Zugabe von IL-10 die Sekretion von TIMP-1 aus PBMC steigert. Die vorliegende Arbeit erweitert somit die proentzündlichen Wirkungsweisen von IL-18 auf PBMC, betont die herausragende Rolle einer intermediären TNFα-Produktion und stellt einen Zusammenhang her zwischen den biologischen Funktionen von IL-18 und der pathologischen Potenz von MMP-9.
Bisherige zellfreie Labormethoden und in-vitro-Diagnostik zielen darauf ab, die Zeit von der Auslösung der Gerinnung bis zur Gerinnselbildung zu messen. Sie sind aber nicht für die Messung der Wirksamkeit von rFVIIa als Medikament geeignet, das für seine hämostatische Wirksamkeit die Funktionen von Blutzellen, besonders Plättchen, benötigt. Außerdem erfassen diese Gerinnungsteste nur einen bestimmten Abschnitt der Gerinnung und ein Zeitablauffenster, welches einen geringen Anteil (<5 %) des insgesamt gebildeten Thrombins erfasst und die Dynamik der Thrombingenerierung unberücksichtigt lässt. Die Plättchen und ihre Physiologie spielen aber die Hauptrollle in der Phospholipid-Präsentation die auf der Plättchenmembran erfolgt. Dies ist Voraussetzung für eine individuell ausreichende Thrombinbildung. Die Erfassung des endogenen Thrombinpotentials (ETP) in plättchenreichem Plasma, wie sie in dieser Arbeit verwendet wurde, überwindet diese methodischen Nachteile der etablierten Teste. Damit lässt sich eine individuelle Wirkungs- und Risikovorhersage erstellen, da hämostaserelevante Charakteristika wie z.B. Erkrankungen, Komedikation, Geschlecht, Umwelt- und lebensstilabhängige Faktoren, in die Untersuchungen einbezogen werden. In dieser Arbeit wurde mit dem Thrombingenerierungstest (TGT) eine Methode etabliert und evaluiert, die inter- und intraindivuellen Unterschiede in der Thrombinbildung in plättchenreichem Plasma (PRP) zeigt. Ausgehend von den dargestellten in-vitro Ergebnissen mit gesunden Probanden wurde die Wirksamkeit von rFVIIa im TGT, zusätzlich vergleichend und validierend mit Hilfe der Durchflusszytometrie (FACS), bei Patienten mit Thrombasthenie Glanzmann untersucht. Diese sind aufgrund einer thrombozytenfunktionsstörungsbedingten Blutungsneigung in den plasmatischen Gerinnungstesten unauffällig. Evaluiert wurden hetero- und homozygote Patienten mit unterschiedlichen zugrundeliegenden Mutationen. Zuerst wurden Proben von einer Familie in-vitro untersucht, dann eine Patientin, die im Rahmen eines zahnärztlichen Eingriffs (ex-vivo-in-vitro) unter Einbindung der klinischen Beobachtung überwacht wurde. Der TGT zeigt eine deutliche prohämostatische Wirksamkeit von rFVIIa bei allen Probanden und Patienten, FACS erfasst die zugrundeliegenden Zellfunktionen. Dabei werden Unterschiede zwischen gesunden Probanden, heterozygoten und homozygoten Patienten aufgezeigt, die diagnostisch und therapeutisch verwertbar sind. Unterschiedliche Mutationen und weitere ursächliche thrombozytäre Mechanismen schlagen sich in entsprechenden Änderungen der gemessenen FACS-Parameter nieder, die zum großen Teil mit den TGT-Werten für ETP und PEAK korrelieren. Die TGT-Werte zeigen, gerade für die Patientin EG, deren Behandlung mit rFVIIa überwacht wurde, eine stärkere Korrelation mit der Klinik als die FACSMethode. Diese wiederum erfasst die zellfunktionsbedingten Ursachen analytischer. Die Ergebnisse dieser Arbeit zeigen, dass die Messung und Auswertung der TGT-Parameter ETP und PEAK, in geringerem Maße LT und TTP, die prohämostatische Wirkung Zellfunktions-basierter Medikamente in plättchenreichem Plasma erfasst. Damit erlaubt sie über die Charakterisierung von Gerinnungsstörungen hinaus prädiktive Aussagen über die individuell angemessene Dosierung von rFVIIa (NovoSeven®).
Das klarzellige Nierenzellkarzinom (RCC) ist bei eier Inzidenz von 9 / 100 000 vor allem gekennzeichnet durch seine hohe Mortalität. Die Ursache dafür ist multifaktoriell, eine späte Diagnose, lokal fortgeschrittenes Wachstum, Fernmetastasierung und das Fehlen einer suffizienten Chemo-, bzw. Immunotherapie spielen eine entscheidende Rolle. Der Mangel an therapeutischen Optionen erfordert weitergehende Forschungsmaßnahmen zur Aufklärung der Tumormetastasierungsstrategien und zur Entwicklung antitumoraler Therapien. Migration und Extravasation werden als essentielle Parameter des Metastasierungsprozesses beschrieben. In einem modellhaft geschaffenen Metastasierungsszenario wurde das dynamische Verhalten von Integrinrezeptoren bei der Adhäsion von Tumorzellen am Gefäßendothel oder der Matrix beobachtet. Zu diesem Zweck wurden mehrere Nierentumorzelllinien, teilweise auch unter Blockade- oder Stimulationsbedingungen, diesem Interaktionsprozess ausgesetzt. Die Zellen wurden in biologischen Assays, fluorometrisch, mittels konfokaler Laserscanmikroskopie und mikrobiologisch auf der RNA-, der Protein- und der zellulären Ebene bezüglich Veränderungen von Protoonkogenen, Tumorsuppressoren und Adhäsionsmolekülen untersucht. Der Nachweis auf RNA-Ebene erfolgte mittels PCR, auf der Protein-Ebene mit Hilfe von Western-Hybridisierung und Durchflusszytometrie. Ferner wurden im Rahmen dieser Arbeit funktionelle Adhäsionsstudien und Verdrängungsassays auf Endothelzellen und Matrixproteinen durchgeführt, um mögliche Unterschiede der Malignität in Bezug auf das Migrationsverhalten der Nierentumorzellen aufzuzeigen. Dabei konnte erstmalig eine transiente Integrinrezeptorreduktion auf Nierentumorzellen nach Kontakt zum Endothel mit einer sich anschließenden Re-Expression nachgewiesen werden. Für einen umschriebenen Zeitraum wird die Zell-Zell- und Zell-Matrix-Adhäsion der Tumorzellen reduziert. Dieser Adhäsionsverlust ist verbunden mit einem schnellen und reversiblen Verlust der Integrin-Subtypen α2β1, α3β1 und α5β1. Begleitend wurde eine reduzierte Expression intrazellulärer Signalkaskadenproteine wie PKCδ, PKCε, PKCγ, MEK1, ERK1, p38, p38 phosph., JNKphosph., JNK und RACK1 beobachtet. Zusammen scheinen diese Prozesse in eine dynamische Tumorzell-Migrationsstrategie involviert zu sein. Mutmaßlich spielen die dynamischen und reversiblen Veränderungen des Integrin Rezeptorprofils eine wichtige Rolle im Bereich der Tumorzellinvasion, indem die Zellen von einem adhäsiven Zustand weg, hin zu einem motilen und invasiven Status transformiert werden. Eine einzelne Zelle kann sich so im Sinne einer Metastase aus dem initialen Tumoraggregat loslösen, ein gleiches Phänomen für die Migration der Tumorzellen aus dem Gefäßsystem in das Zielgewebe wird vermutet. Allerdings muss besonders herausgestellt werden, dass die Dynamik der transendothelialen Invasion auch integrin-unabhängige Phasen beinhaltet, die ganz offensichtlich für eine zielgerichtete Motilität verantwortlich ist. Während dieser Interaktion von Tumorzellen mit Zellen des Gefäßsystems konnten außerdem morphologische Veränderungen der Tumorzellen im Sinne eines Entdifferenzierungsprozesses beobachtet werden. Der Auslöser dieses Effektes ist durch weitere Forschungsaktivitäten zu klären. Aufgrund der multifunktionalen Wirkungsweise der Integrinrezeptoren erscheint als therapeutisches Ziel die Wiederherstellung der ursprünglichen, physiologischen Integrinbalance anzustreben. Weniger die Expressionsdichte eines einzelnen Integrintyps, als vielmehr die Balance, respektive Dysbalance mehrerer Integrin-Untereinheiten reguliert Zell-Zell und Zell-Matrix Interaktionen und trägt dadurch zur Prävention der Disseminierung des lokal fortgeschrittenen bzw. metastastasierten Nierenzellkarzinomes bei.
Seit ca. 1973 werden die schriftlichen Staatsexamina in Deutschland in Anlehnung an das amerikanische Prüfungssystem mit Einfachauswahlfragen (auch als MC-Fragen bezeichnet) durchgeführt. Dieser Fragentypus hat sich auch für universitäre Prüfungen durchgesetzt, trotz ungeklärter Validität und Eignung dieses Fragentyps. Das Ziel dieser Arbeit bestand darin, den Einfluss von Formatunterschieden bei inhaltlich identischen Fragen auf das Prüfungsergebnis aufzuzeigen Hierzu wurden klassische MC-Fragen mit Freitextfragen sowie mit Mehrfachauswahlfragen verglichen. Es wurden fachspezifische Klausuren während der Übergangszeit von der 8. ÄAppO von 1989 auf die jetzt gültige 9. ÄAppO von 2002 so konstruiert, dass inhaltsidentische Fragen in einer Version als MC-Fragen, in der anderen Version in anderem Format gestellt wurden; jeweils eine Hälfte der teilnehmenden Studierenden diente als Kontrollgruppe für die Fragestellung in anderem Format. Ausgewertet wurden 11 Klausuren mit jeweils 15 MC-Fragen und 15 alternativen Fragen im Zeitraum SS 2004 bis WS 2004/2005 in den Fächern Augenheilkunde, Dermatologie, Orthopädie, Psychiatrie, Rechtsmedizin und Urologie, mit insgesamt 1219 teilnehmenden Studenten. MC-Fragen (55%) wurden im Mittel häufiger korrekt beantwortet als AW-Fragen (25%) und FT-Fragen (33%). Wenn bei Auswahlfragen Studierende mit vier von fünf zutreffenden Entscheidungen ebenfalls einbezogen werden, kommen etwa 52% der Studierenden auf „richtige“ Antworten. Insbesondere bei Freitextfragen gab es große fragenspezifische Unterschiede, in einigen Fällen wurden Freitextfragen häufiger zutreffend beantwortet als inhaltsidentische MC-Fragen. Diese Unterschiede legen nahe, dass aktives Wissen mit MC-Fragen nicht prüfbar ist. Teilwissen konnte mit Fragen in den klassischen MC-Formaten nicht ermittelt werden. Wie exemplarisch in dieser Arbeit gezeigt wird, werden bei Fragen im MCFormat für die Entscheidung richtig/falsch nicht alle Aussagen berücksichtigt. Ergebnisse aus MC-basierten Prüfungen ergeben einen deutlich höheren Anteil richtiger Antworten, als dem aktuellen Wissen entspricht; häufig scheint die Entscheidung zwischen zwei Alternativen geraten zu werden. Bei einer Umformulierung in Freitextfragen ergeben sich häufig größere fragenspezifische Differenzen, die suggerieren, dass mit MC-Fragen aktives Wissen nicht prüfbar ist. Die vorliegenden Untersuchungen begründen Zweifel an der Eignung von ausschließlich MC-basierten Prüfungen für die Prüfung höherer Wissensebenen, eine Validität MC-basierter Prüfungen für klinisches Alltags- und Basiswissen scheint nicht gegeben zu sein.
Ziel herkömmlicher Behandlungsmethoden chronischer oder traumatischer Knorpeldefekte ist die Wiederherstellung der Gelenkfunktion. Die Transplantation autologer Chondrozyten verspricht hier eine dauerhafte Korrektur des Knorpeldefekts. Ein Problem der autologen Chondrozytentransplantation (ACT) ist jedoch die Tatsache, dass die im Rahmen der ACT notwendige Invitro-Expansion der Chondrozyten oft mit einem Funktionsverlust im Sinne einer Dedifferenzierung in Fibroblasten bzw. einem Überwachsen durch Fibroblasten einhergeht. Im Rahmen dieser Dissertation sollte daher untersucht werden, inwieweit die Expansion von Chondrozyten auf eine Proliferation einzelner Vorläuferzellen zurückzuführen ist und ob sich die Frequenz von Vorläuferzellen in Chondrozytenbiopsaten quantifizieren lassen. Es zeigte sich, dass das Wachstum von Chondrozyten auf die Proliferation von Vorläuferzellen zurückzuführen ist, die unter den verwendeten Kulturbedingungen zur Ausbildung von Chondrozytenkolonien führen. Die Frequenz der koloniebildenden Einheiten (CFU-Ch) lag – in Abhängigkeit von den gewählten Kulturbedingungen – bei durchschnittlich 3,4–7,6 Kolonien pro 1000 Chondrozyten, wobei eine Beschichtung der Kulturplatten mit Kollagen und eine Substitution des Zellkulturmediums mit FGF zu einer hohen Korrelation zwischen der eingesetzten Zellzahl und der gemessenen Anzahl koloniebildender Einheiten (R2 = 0,9643) führte, die im Durchschnitt bei 7,6 CFU-Ch pro 1000 ausplattierter Chondrozyten lag. Bei Verwendung von Zellkulturmedien ohne Zytokinzusatz (DMEM) bzw. mit FGF- (CBM) oder TFG-β-Supplementation (CDM) zeigten sich deutlich unterschiedliche Ausprägungen der Chondrozytenkolonien in Bezug auf die Morphologie. So führte FGF-haltiges Medium zu einem ausgeprägten Wachstum fibroblastenähnlicher Zellen, während sich die Chondrozytenstruktur und Färbung mit Alcianblau am ehesten durch DMEM und TGF-β1-haltiges CDM erhalten ließ. Das hier etablierte Testverfahren erlaubt eine zuverlässige Quantifizierung von koloniebildenden Einheiten und könnte geeignet sein, Vorläuferzellen weiter zu charakterisieren, die zur Regeneration von funktionellem Gelenkknorpel beitragen.
The production of quarkonia, the bound state of an heavy quark with its anti-particle, has for a long time been seen as a key process to understand the properties of nuclear matter in a relativistic heavy-ion collision. This thesis presents studies on the production of quarkonia in heavy-ion collisions at the new Large Hadron collider (LHC). The focus is set on the decay of J/Psi and Upsilon-states into their di-electronic decay channel, measured within the central detectors of the ALICE detector.
Das Ziel dieser vorliegenden Studie war, innerhalb eines mit Individualschäften versorgten Hüfttotalendoprothesen-Kollektivs den Anteil korrekt implantierter ebenso wie fehlpositionierter Hüftschäfte festzustellen, Planungsabweichungen zu quantifizieren und mögliche Zusammenhänge von Schaftposition und Patientenmerkmalen zu untersuchen. EBRA (EinBildRöntgenAnalyse) ist ein Computerprogramm zur Messung der Migration von Endoprothesenkomponenten. Ursprünglich wurde es zur Migrationsmessung der Hüftpfanne eingesetzt. Um die Migration des Prothesenschaftes ausmessen zu können, benötigt man die spezielle FCA (femoral component analysis) Software. EBRA-FCA benötigt digitale Röntgenserien, deren einzelne Bilder von dem Programm auf ihre Vergleichbarkeit hin überprüft werden und nur vergleichbare Bilder der Serie werden zur Messung herangezogen. Zwischen einem festgelegten Referenzpunkt am Trochanter major und der Prothesenschulter wird die Migration gemessen. Die Genauigkeit der Methode wird in der Literatur mit +/- 1 mm angegeben. In dieser Studie machte man sich die hohe Präzision des EBRA-FCA-Systems in der Messung auch kleinster Distanzen im Röntgenbild zu nutze. Es wurden indirekt Distanzen in ein und demselben Röntgenbild ausgemessen. Dabei waren die Messabläufe identisch zur Migrationsmessung. Folglich wurde EBRA-FCA angewendet, um die Frage nach dem korrekten, der Planung entsprechenden Sitz des Hüftschaftes zu beantworten. Die CTX-Individualendoprothese (Orthopedic Services, Mainhausen, Deutschland) wird seit 1992 implantiert. Bei Patienten mit ausgeprägter Dysplasiecoxarthrose oder mit Besonderheiten am proximalen Femur, die eventuell nach Umstellungsosteotomien auftreten können, wird die Indikation zur Individualendoprothese gestellt. Das Kollektiv der hier vorliegenden Studie umfasst insgesamt 91 Patienten mit 107 Hüfttotalendoprothesen, wobei es sich bei allen Fällen um zementfreie CTX-Individualprothesen handelt. Sämtliche Prothesen wurden zwischen 1995 und 2003 an der orthopädischen Universitätsklinik in Frankfurt am Main durch unterschiedliche Operateure eingesetzt. Krankenblätter, Operationsberichte, prä- und postoperativ gefertigte Röntgenbilder mit einem einheitlichen Film Fokus-Abstand lagen in allen Fällen für die Untersuchung vor. Die Daten der präoperativen Planung wurden von der die individuelle CTX-Prothese herstellenden Firma in Unkenntnis der postoperativen Implantationsdaten geliefert. Die postoperative Auswertung der Röntgenbilder mit EBRA erfolgte hierbei für jeden Patienten mehrfach und durch mindestens zwei Untersucher. Die statistische Auswertung der Abweichungen der Implantationstiefen in Abhängigkeit von unterschiedlichen Einflussgrößen (Antetorsionswinkel, Operationszugang, zurückliegende Femurosteotomie) erfolgte mit den Wilcoxon Mann Whitney-, Kruskal Wallace- oder Spearman-Tests. 59 Hüftschäfte waren relativ zur präoperativen Planung zu hoch, 16 auf den Millimeter genau und 32 zu tief implantiert. Tatsächlich waren 71% der in die Femora implantierten Hüftschäfte korrekt, d.h. mit der präoperativen Planung auf den Millimeter identisch oder um bis zu maximal 5 mm von dieser abweichend implantiert. 29% der implantierten Hüftschäfte waren fehlpositioniert, d.h außerhalb der Toleranzgrenze von +/- 5 mm zur präoperativen Computerplanung. Ein prädiktiver Wert für die zu erwartende Position des CTX-Hüftschaftes wurde in keiner der untersuchten Zielgrößen wie Body Mass Index, Voroperation am koxalen Femur, Zugangsweg oder unphysiologischem Antetorsionswinkel gefunden. Unter Berücksichtigung des endoprothetisch schwierig zu versorgenden Kollektivs wird es als Erfolg angesehen, dass die Abweichung maximal 1,1 cm und der Mittelwert der Abweichung 0,1 cm betrug. Eine zementfreie Versorgung von Femora mit abnormer Markraumanatomie gemäß präoperativen Planungsvorgaben scheint mit der CTX-Individualprothese möglich. EBRA-FCA war in der modifizierten Anwendung geeignet, die Position des Implantates im Femur zu vermessen.
Fragen nach der Struktur von Sprachkompetenz sind aktuell in der pädagogisch-psychologischen Diagnostik von besonderer Bedeutung. Da sprachliche Kompetenzen als wesentlicher Bestandteil von Bildung angesehen werden, finden sie in empirischen Studien zu Schülerleistungen immer stärkere Beachtung. Neben der Feststellung von Ausprägungen der sprachlichen Kompetenzen wird die Differenzierbarkeit von Teilbereichen der Sprachkompetenz betrachtet, wenn spezifische sprachliche Phänomene getrennt beobachtet und beschrieben werden sollen. Die vorliegende Arbeit nähert sich der Frage nach der Struktur von Sprachkompetenz aus einer psychologisch-diagnostischen Perspektive. Auf der Grundlage von Daten einer deutschen Large-Scale-Studie und unter Bezug auf Theorien und Modellen der Psycholinguistik, der Entwicklungspsychologie und der psychologischen Diagnostik geht sie der Frage nach, welche Teilbereiche der Sprachkompetenz sich empirisch differenzieren lassen – wie sich also die Struktur von Sprachkompetenz aus Sicht der Diagnostik darstellen lässt. Darüber hinaus wird analysiert, ob sich spezifische Zusammenhänge zwischen einzelnen sprachlichen Teilbereichen empirisch auffinden lassen, die vor dem Hintergrund bekannter Theorien und Modelle der Struktur von Sprachkompetenz darzustellen und zu erklären sind. Schließlich wird untersucht, ob sich bestimmte Personengruppen hinsichtlich der strukturellen Zusammenhänge in ihrer Sprachkompetenz unterscheiden und inwiefern kognitive Grundfähigkeiten als Teil der Struktur von Sprachkompetenz zu betrachten sind. Bisher liegen nur wenige verallgemeinerbare, empirische Befunde zur Struktur der sprachlichen Kompetenzen deutscher Schülerinnen und Schüler vor. Dies ist vor allem darin begründet, dass die Durchführung vergleichender Studien über viele Jahrzehnte im deutschen Bildungssystem unüblich war und sich die Erfassung von Sprachkompetenz oft auf den Bereich der Defizitdiagnostik beschränkte. Dort, wo repräsentative Daten verfügbar sind, decken sie in der Regel nur einige wenige sprachliche Teilbereiche ab. Die vorliegende Arbeit beruht auf den Daten der umfassenden und differenzierten Erhebung von Sprachkompetenzen im Rahmen der Studie Deutsch Englisch Schülerleistungen International (DESI). DESI untersuchte im Schuljahr 2003/2004 die sprachlichen Leistungen von Schülerinnen und Schülern der neunten Jahrgangsstufe in Deutschland. Sie wurde von der Ständigen Konferenz der Kultusminister der Länder in der Bundesrepublik Deutschland (KMK) im Jahre 2000 in Auftrag gegeben. Entsprechend der aktuellen Forschungslage zur Dimensionalität von erst- und fremdsprachlichen Kompetenzen wurden in den DESI-Tests jeweils mehrere produktive und rezeptive Kompetenzbereiche unterschieden: Sowohl im Deutschen als auch im Englischen wurden die Kompetenzen im Lesen und Schreiben erfasst, im Englischen zusätzlich im Hören und Sprechen. In beiden Sprachen wurden zudem sprachpragmatische und grammatikalische Aspekte der Sprachbewusstheit getestet, im Deutschen wurde darüber hinaus ein schriftlicher Test zur Argumentation eingesetzt. Lexikalische und orthographische Aspekte von Sprachkompetenz wurden im Deutschen in gesonderten Tests abgebildet und im Englischen als Komponenten von Lückentexten erfasst. Zusätzlich zu den insgesamt zwölf Testverfahren ergänzten Fragebögen zu Lehr-Lern-Bedingungen, Hintergrundfaktoren und motivationalen Aspekten sowohl für Schülerinnen und Schüler als auch für Lehrpersonen, Fachkollegien, Schulleitung und Eltern die Erhebung. An der Haupterhebung von DESI nahmen 10 632 Schülerinnen und Schüler aus 219 Schulen teil, darunter 40 Schulen mit bilingualem Sachfachunterricht. Diese Daten bieten eine ideale Grundlage für die Analyse der Struktur von Sprachkompetenz bei Schülerinnen und Schülern. Die Fragestellungen der vorliegen Arbeit beschäftigen sich damit, die Struktur von Sprachkompetenz innerhalb der beiden Sprachen zu beschreiben und in ein gemeinsames Modell zu integrieren. Methodisch berücksichtigt wird dabei die hierarchische Schachtelung der Daten. Dadurch wird ein theoriegeleitetes Modell der Struktur der Sprachkompetenz empirisch abgebildet. Darauf aufbauend wird analysiert, wie dieses Modell speziell auf die Mehrebenenstruktur der Daten anzupassen ist, ob also die Struktur von Sprachkompetenz auf Individualebene und auf Klassenebene für beide Sprachen getrennt und gemeinsam unter Beibehaltung des Modells für die Gesamtstichprobe dargestellt werden kann. In einem weiteren Schritt wird analysiert, ob das gefundene Modell der Struktur von Sprachkompetenz sich in spezifischen Untergruppen unterscheidet, hierzu gehören Mädchen und Jungen sowie Schülerinnen und Schüler mit unterschiedlichem Sprachhintergrund. Abschließend wird untersucht, welche Bedeutung den kognitiven Grundfähigkeiten im Gesamtmodell der Struktur von Sprachkompetenz zukommt.
Hintergrund und Fragestellung Medizinische Fehlerberichtssysteme dienen als Instrument zum Erfassen von Daten aus dem Bereich der Patientensicherheit und sollen das Lernen aus den berichteten Fehlern ermöglichen. Erfahrungen hierzu liegen hauptsächlich aus dem Umfeld der Kliniken vor, für den ambulanten bzw. hausärztlichen Bereich gibt es noch wenige Kenntnisse. Ziel dieser Arbeit ist die Erstellung und Erprobung eines praxistauglichen, deutschsprachigen Fehlerberichts- und Lernsystems für hausärztlich tätige Mediziner/innen. Weiterhin soll die Verwendung und Nutzerakzeptanz nach einem Jahr Betrieb untersucht werden. Methoden Zur Festlegung der Eigenschaften des zu erstellenden Systems wurden drei existierende Berichtssysteme analysiert, eine Befragung der Teilnehmer einer Pilotstudie (PCISME) durchgeführt sowie juristische Aspekte untersucht. Das System wurde mit Hilfe etablierter Softwareentwicklungsmethoden erstellt. Nach einem Jahr Laufzeit wurden Daten zur Verwendung des Systems ermittelt und die veröffentlichten Berichte und abgegebenen Benutzerkommentare insbesondere bezüglich Aussagen zum Feedbacksystem und zur Nutzerfreundlichkeit untersucht. Ergebnisse Im Oktober 2004 wurde mit „Jeder Fehler zählt“ das erste Fehlerberichts- und Lernsystem für Hausärzte in Deutschland freigegeben. Es ist ein komplett offenes, freiwilliges, anonymes und externes System. Die Eingabe der Fehlerberichte erfolgt über ein im Internet frei zugängliches Formular. Ausgesuchte Fehlerberichte werden von wissenschaftlichen Mitarbeitern kommentiert und veröffentlicht. Benutzer können zu den Berichten und in einem Diskussionsforum ebenfalls Kommentare eingeben. Weiterhin werden Berichte und Analysen in Fachzeitschriften publiziert. Im ersten Jahr gingen 149 Berichte ein, laut Aussagen von 23 Benutzern ist das Berichten einfach durchzuführen. Es wurden 11 „Fehler des Monats“ veröffentlicht, zu denen insgesamt 123 Kommentare abgegeben wurden. Zu 43 veröffentlichten „Fehler der Woche“ wurden 146 Kommentare abgegeben. Im Diskussionsforum wurden 46 Einträge vorgenommen. Die Beiträge der Benutzer sind zum weit überwiegenden Teil konstruktiv und sachbezogen und enthalten häufig konkrete Tipps und Hinweise zur Vermeidung von Fehlern. In deutschen und österreichischen Fachzeitschriften wurden insgesamt 11 Berichte publiziert. Diskussion Das System führt Eigenschaften der untersuchten Systeme mit eigenen Ansätzen zusammen. Da wegen der Anonymität der Berichtenden keine Möglichkeit zum Nachfragen besteht, ist für eine gute Verwertbarkeit der Berichte eine möglichst hochwertige textuelle Beschreibung der Ereignisse notwendig. Diese war in der überwiegenden Zahl der Berichte gegeben. Aus Sicht der aktiven Nutzer stellt das System grundsätzlich einen wertvollen Beitrag zur Qualitäts- und Fehlerkultur dar. Schlussfolgerung Die regelmäßige Nutzung der Internetseiten, die dort abgegebenen Kommentare und die Veröffentlichungen der Berichte in den Zeitschriften zeigen, dass auch einzelne Berichte das Lernen aus Fehlern ermöglichen können. „Jeder Fehler zählt“ kann als hypothesengenerierendes System mit vielfältigen Ansätzen zur weiteren Forschung aufgefasst werden. Bereits im ersten Jahr des Betriebs konnten wertvolle Erfahrungen gesammelt werden, die in die kontinuierliche Weiterentwicklung des Systems einfließen. Diese fokussiert auf Verbesserungen der Feedbackmethoden sowie auf eine höhere Nutzung des Systems.
The dissertation, ”Coping with emergent hearing loss”, is written in English and is based on the diversity of problems connected to hearing loss and the adaptation of hearing aids. The research was carried out in Denmark and involves adults with an emergent hearing loss, who have decided to become hearing aid users. The data is analyzed through methods of cultural anthropology with focus on the following topics: How do the new users cope with the status passage towards being hearing aid users, how do they integrate the hearing aids into their lives, and what are the involved learning processes. What are the consequences of the provision by the state of free hearing aids, their free adaptation as well as free batteries, and does the state take part in the construction of the social group of new hearing aid users? The method is based on qualitative field work. Two public hospitals were helpful in identifying 24 new users, who acquired a free hearing aid through the hearing health care system. Through ENTs and private dispensers 17 further respondents joined the study – these acquired their hearing aids with a considerable state subsidy but mostly they themselves contributed financially as well. The 41 respondents between the ages of 42 to 92 years of age came from a wide range of professions and were followed throughout 2003 und 2004. After an in-depth qualitative interview, the contact to the respondents was maintained in order to follow the process of integration into their lives. When possible, the respondents were accompanied to their appointments in the private or public clinics. Moreover, interviews with experts from the public hearing health care system, politicians and user organisations were carried out, and the general public debate on the hard of hearing and hearing loss was followed and recorded. The second chapter gives an overview of the position of audiology in Denmark, of epidemiological information on hearing loss in the Danish society and statistics to the use of hearing aids. Moreover, basic information is given about the functioning of the human ear, the auditive perception and diagnosis and classification of hearing loss as well as a short introduction to the hearing aid technology. The structure of the further thesis divides the material into three pillars that make the discussion of the interaction processes possible. (1) The user’s interaction with the lifeworld concerns the meaning of hearing in relation to social participation. For some of the users, a good sense of hearing was essential to communicate freely and uphold their position in relation to others, whereas other respondents paid less attention to the information they acquired through their sense of hearing. A number of the respondents were selective and only used their hearing aids in specific situations, whereas another group discontinued the use of their hearing aids for various reasons. Status passages that hold specific challenges like a new work place or a new marriage motivate the continued everyday use. On the whole, the thesis illustrates that hearing loss is a socially dividing factor that complicates the interaction with others. In comparison to other bodily impairments or diseases, the hearing loss is rarely used as occasion to unite with fellow sufferers, join patient organisations or form self help groups. (2) The users’ interaction with the institutions The medical anthropologist Arthur Kleinman conceptualises health care as a moral process in which essential issues are at stake for the users. Different factors interact in the process: the training of the experts, allocation of funds, the quality of the technology, the dispensing procedures and the motivation and individual characteristics of the new users. The integration of the hearing aid into the lifeworld can be compared to a learning process, for which reason the learning theory of the anthropologist Gregory Bateson is outlined. Susanne Bisgaard’s own theory lists the meaning creating elements that serve as motivation for the users to counteract contingency (occurrences that influence the adaptation negatively). In the interaction between individual and society, the individual can apply strategies in order to eliminate stumbling blocks. (3) The users’ interaction with the technology A number of theorists from Anthropology as well as Science and Technology Studies are discussed in order to question their validity with regard to human action autonomy vs. technological determination and test the theoretical models with regard to their usability for the thesis. Hearing aids have a supporting function in everyday life and have the capability of moderating the user’s perception of sound. The alienating experience of hearing one’s own voice amplified, of wearing a foreign body in the ear and the different strategies that emerge from the more or less successful handling of the technology is reported by way of case stories and quotes from the interviews.
This work presents the study on the suitability of single-crystal CVD diamond for particle-detection systems in present and future hadron physics experiments. Different characterization methods of the electrical and the structural properties were applied to gain a deeper understanding of the crystal quality and the charge transport properties of this novel semiconductor material. First measurements regarding the radiation tolerance of diamond were performed with sensors heavily irradiated with protons and neutrons. Finally, detector prototypes were fabricated and successfully tested in various experiments as time detectors for minimum ionizing particles as well as for spectroscopy of heavy ions at the energy ranges available at the SIS and the UNILAC facilities of GSI. ...
Präkallikrein spielt als Kontaktphasenprotein eine wichtige Rolle in der endogenen Aktivierung der Blutgerinnung. Ein hereditärer Präkallikreinmangel ist sehr selten und wird meist wegen der Unauffälligkeit bezüglich einer Blutungsneigung nur zufällig aufgrund einer verlängerten aktivierten partiellen Thromboplastinzeit (aPTT) festgestellt. In der vorliegenden Arbeit wurde die genetische Variabilität des Präkallikrein-Gens bei PK-Mangel-Patienten sowie in der Normalbevölkerung untersucht. Für die Untersuchungen wurde zunächst die DNA einer phänotypisch unauffälligen Kontrollgruppe bestehend aus 200 gesunden Blutspendern auf Genvariationen im PKGen analysiert. Nach der Isolierung und der Amplifikation der DNA wurde mit sämtlichen Proben zunächst ein Mutations-Screening mittels dHPLC durchgeführt. Auffällige Abschnitte und solche, bei denen häufige und/oder mehrere Polymorphismen bereits bekannt waren, wurden sequenziert. Auf diese Weise wurden neun Polymorphismen in den kodierenden bzw. die Exone flankierenden Genabschnitten nachgewiesen. Davon wurden drei (c.-438G>A; c.490-5T>C; c.689T>A) erstmals beschrieben. Nach der Untersuchung der Normalbevölkerung wurde eine Genanalyse bei sieben Patienten mit einem stark ausgeprägten PK-Mangel durchgeführt. Insgesamt wurden dabei sechs verschiedene Mutationen nachgewiesen, davon zwei Missense-Mutationen, eine Nonsense-Mutation, zwei kleine Deletionen und eine kleine Insertion. Zwei dieser Mutationen wurden bereits in der Literatur beschrieben, die vier weiteren wurden im Rahmen dieser Arbeit erstmals aufgezeigt. Da insgesamt bisher in der Literatur lediglich fünf unterschiedliche Mutationen des Präkallikrein-Gens beschrieben wurden, erhöht sich die Anzahl der bekannten Präkallikreingendefekte durch die Ergebnisse der vorliegenden Arbeit auf das nahezu Doppelte. Eine der Mutationen (c.689T>A, p.Ile230Asn) wurde auch bei einem Blutspender nachgewiesen. Da es sich um eine hochkonservierte Aminosäure handelt und durch die Mutation eine neue N-Glykosilierungsstelle in dem Protein generiert wird, ist eine Beeinträchtigung der Proteinfunktion sehr wahrscheinlich. Allerdings kann erst nach weiteren funktionellen Untersuchungen ausgeschlossen werden, dass es sich um einen seltenen, für die Proteinfunktion wenig bedeutenden Polymorphismus handelt. Somit sind zusammengefasst zwei Aspekte in dieser Arbeit behandelt worden. Zum einen wurde der Frage nach dem Ausmaß der natürlich vorkommenden genetischen Variabilität des Präkallikrein-Gens nachgegangen, zum anderen wurde der Versuch unternommen, Sequenzvarianten zu finden, die verantwortlich sind für die phänotypische Variabilität bei PK-Mangel. Beide Fragestellungen sind von grundsätzlichem Interesse für die biomedizinische Forschung. Möglicherweise wird es damit dann möglich sein, Krankheitsentstehungen und ihre Verläufe besser zu verstehen und damit eine noch effektivere und nebenwirkungsärmere Therapie einzusetzen.
Auch knapp zwanzig Jahre nach der Wiedervereinigung des deutschen Nationalstaates in Frieden und Freiheit kommt der Frage nach dessen zukünftigem außenpolitischem Kurs seitens der Wissenschaft große Aufmerksamkeit zu. Mit den revolutionären Ereignissen der Jahre 1989/90 und der unverhofft gelingenden „Wende“ war für manchen zeitgenössischen Beobachter auch die Rückkehr des „deutschen Problems“ in Europa unmittelbar verbunden. Würde das zukünftig wieder vollständig souveräne Deutschland weiterhin fest im Westen eingebunden bleiben oder sich entlang historischer Vorerfahrungen erneut stärker nach Osten hin orientieren? Würde es am Leitmotiv eines in die NATO eingebundenen europäischen Deutschland festhalten oder doch nach einem deutschen Europa streben? Auf diese Fragen ließen sich aufgrund der zentralen theoretischen Annahmen der diskursbestimmenden Paradigmen der politikwissenschaftlichen Teildisziplin der Internationalen Beziehungen recht eindeutige – wenn auch völlig unterschiedliche – Prognosen ableiten. Für die einen bestand kein Anlass zur Sorge, da ein Bruch mit dem handelsstaatlichen, zivilmächtigen und institutionalisierten Außenpolitikstil weder den deutschen Interessen noch der inzwischen fest geformten Rolle beziehungsweise Identität des deutschen Nationalstaats entspräche. Der außenpolitische Kurs des größeren und souveränen Deutschlands werde daher maßgeblich von Kontinuität geprägt sein, lautete die zuversichtliche Prognose des liberalistischinstitutionalistischen Lagers. Die zweite Gruppe von Forschern hingegen hielt die Anpassung der deutschen Außenpolitik an die veränderten systemischen Bedingungen und eine Neuausrichtung aufgrund des absolut wie relativ vergrößerten Machtpotentials aus ihrer 2 realistischen Sicht für unausweichlich. Deutschland werde erneut eine am nationalen Interesse orientierte klassische Großmachtpolitik betreiben, so dass es zu einem erheblichen Wandel der deutschen Außenpolitik kommen werde.
Die Frage nach Kontinuität oder Wandel deutscher Außenpolitik diente damals als ein wichtiges Schlachtfeld des innerdisziplinären Theorienwettstreits und ist bis heute, wenn auch in fortlaufend veränderter Form, ein von vielen beachtetes Forschungsfeld geblieben. Die vorliegende Arbeit sollte als ein Beitrag zu einer vielstimmigen Debatte verstanden werden, die, obwohl sie gelegentlich schon als beinahe erledigt galt, dennoch immer wieder in aktualisierter Form aufkam und inzwischen seit beinahe zwanzig Jahren andauert. Die Befunde des vorliegenden Forschungsprojektes sprechen, ohne zu viel vorweg zu nehmen, jedenfalls dafür, dass deutsche Außenpolitik auch auf absehbare Zeit ein wichtiges politikwissenschaftliches Forschungsfeld bleiben, ja zukünftig noch an Relevanz gewinnen wird.
In dieser Einleitung werden zunächst die im Diskursraum zentralen Argumente dafür erörtert, weshalb die Erforschung der Entwicklung deutscher Außenpolitik aus Sicht der Experten ein lohnenswertes Unterfangen darstellt (1.1). Hieran schließt sich die rahmengebende Darstellung des bisherigen Stands und Verlaufs der Forschung zu diesem Thema an (1.2), bevor die eigenen Forschungsinteressen und die sich daraus ergebenden Forschungsfragen dargelegt werden und ein kurzer Überblick darüber gegeben wird, was den Leser bei der Lektüre der anschließenden Kapitel erwartet (1.3). ...
5-LO is the key enzyme in the biosynthesis of proinflammatory leukotrienes. It catalyses the conversion of arachidonic acid to the hydroperoxy intermediate 5(S)-hydroperoxy-6- trans-8,11,14-cis-eicosatetraenoic acid (5-HpETE). In a second step 5-LO catalyses a dehydration reaction forming the unstable epoxide intermediate 5(S)-trans-5,6-oxido-7,9- trans-11,14-cis-eicosatetraenoic acid (leukotriene A4 , LTA4). The 5-LO gene is subjected to versatile regulation mechanisms. Apart from regulation by DNA-methylation and histone acetylation / deacetylation 5-LO gene expression can be regulated by the differentiation inducers calcitriol (1,25-dihydroxyvitamin D3) and transforming growth factor beta (TGFβ) 5-LO gene expression. In the myeloid cell lines Mono Mac 6 (MM6) and HL-60, differentiation with both agents caused a prominent upregulation of 5-LO mRNA level, of 5-LO protein expression and of 5-LO activity. Treatment with calcitriol alone already has an impact on 5-LO gene expression which is additionally potentiated by TGFβ treatment. Previous nuclear run-off analysis and reporter gene analysis could not associate the 5-LO promoter with the induction of 5-LO mRNA expression mediated by calcitriol and TGFβ. Inclusion of the 5-LO coding sequence (cds) and inclusion of the 5-LO cds plus the last four introns of the gene (J to M) in the 5-LO promoter construct pN10 led to an enhanced reporter gene activity. The inductions were dependent on vitamin D receptor (VDR) and retinoid x receptor (RXR) cotransfection. Therefore the work was concentrated on identifying elements outside the 5-LO promoter region which contribute to the calcitriol / TGFβ effect on 5-LO mRNA expression. Insertion of the LTA4 hydrolase coding sequence – a coding sequence of similar size - instead of the 5-LO cds led to a loss of the calcitriol / TGFβ effect (pN10LTA4Hcds 1-fold induction). Therewith, it was proven that the presence of the 5-LO cds is crucial for the upregulating effect of calcitriol / TGFβ on 5-LO mRNA level. Cloning of the SV40 promoter instead of pN10 upstream of the 5-LO cds still showed inducibility by treatment with the inducers which argues for a promoter unspecific effect. Insertion of the 5-LO cds in a promoterless basic vector (pGL3cds) displayed same inductions by calcitriol / TGFβ treatment as the 5-LO promoter 5-LO cds construct (pN10cds). Thus, the effect of the inducers is not dependent on the 5-LO promoter under the in vitro conditions of the reporter gene assay. Hence, further cloning was done with promoterless constructs. Through 5-LO cds deletion constructs a positive regulating region in exon 10 to 14 was discovered. To adapt the natural gene context the last four introns (J-M) of the 5-LO gene were inserted in a promoterless construct containing exon 10 to 14 (pGL3cdsΔABInJM). 5end deletion constructs of it revealed putative vitamin D responsive elements (VDREs) in exon 12 and intron M. Mutation of the putative VDREs led to a reduced calcitriol effect –more prominent when the putative VDRE in intron M was mutated (reduction of 40%). Moreover another putative VDRE in exon 10 with an adjacent SMAD binding element (SBE) was detected. SMAD proteins are effector proteins of TGFβ signalling. Gelshift experiments demonstrated in vitro binding of the VDR-RXR heterodimer to those three putative VDREs. By chromatin immunoprecipitation (ChIP) assay in vivo binding of VDR and RXR was shown to the VDRE in the region of exon 10, exon 12 and intron M. 8h and 24h incubation with calcitriol / TGFβ resulted in enhanced expression of VDR in each of the examined regions. The VDR is able to bind to the VDRE without its ligand, whereas this goes along with corepressor recruitment and thus the VDR has a repressive effect on transcription. Histone H4 acetylation was increased when MM6 cells were treated for 8h or 24h with calcitriol or the combination of calcitriol / TGFβ. This finding implies that at that point of time corepressors associated with the VDR are replaced by coactivators. It seems convincing that 5-LO transcription is mainly promoted by calcitriol alone which leads to a more accessible chromatin structure. Previous data indicated that calcitriol and TGFβ upregulate 5-LO RNA maturation and 5- LO transcript elongation. Thus several elongation markers were investigated by ChIP analysis: Histone H3 lysine 36 (H3K36) trimethylation and H4K20 monomethylation were detected in the analysed regions in exon 10, exon 12 and intron M. In region exon 10 the H3K36 trimethylation status was enhanced after 24h calcitriol or calcitriol / TGFβ treatment. An increased H4K20 monomethylation status in all regions was observed when MM6 cells were treated for 24h with calcitriol / TGFβ. 24h treatment with both agents also enhanced the recruitment of the elongation form of RNA polymerase II, which is phosphorylated at serine 2 of the carboxyterminal domain, to the investigated regions. These findings prove the positive regulating role for calcitriol and TGFβ on 5-LO transcript elongation. A putative mechanism of the effect of calcitriol and TGFβ on 5-LO RNA maturation might be the elevated phosphorylation of serine 2 of the RNA Polymerase II which is known to be followed by recruiting polyadenylating factors.
IL-22 ist ein TH17-Signaturzytokin und wird primär von aktivierten T- und NK-Zellen produziert. Die Literatur beschreibt IL-22 als immunregulatorisches Signalmolekül, welches vor allem bei Infektionen und Entzündungsprozessen eine wichtige Rolle spielt. Typische IL-22-induzierte Gene sind beispielsweise Akut-Phase-Proteine, β-Defensine sowie Matrixmetalloproteasen. In dieser Arbeit wurde erstmals gezeigt, dass IL-22 die IFNγ-induzierte iNOS-Expression in humanen DLD-1 Kolonkarzinomzellen massiv verstärkt. Eine gestörte iNOS-Induktion mit folglich extensiver NO-Produktion trägt zu entzündlichen Veränderungen und zur Tumorentstehung bei. Insbesondere gibt es stichhaltige Belege, welche iNOS und NO in Verbindung mit Krebs als potentes Mutagen, als Angiogenesefaktor, als Verstärker der Protoonkogenexpression und als Inhibitor der Apoptose charakterisieren. Demzufolge ist gerade die Identifikation von Signaltransduk-tionswegen von Interesse, welche das Potential zur Regulation der iNOS-Expression in epithelialen Kolonkarzinomzellen besitzen. Der Nachweis des IL-22-Rezeptorkomplexes sowie einer STAT3-Phosphorylierung belegte die IL-22-Responsivität der hier verwen-deten DLD-1 Kolonkarzinomzellen. Der Transkriptionsfaktor STAT3 gilt als prominentes Signalmolekül in der Signaltransduktionskette von IL-22. In der aktuellen Literatur wird STAT3 aufgrund seiner antiapoptotischen und proliferativen Eigenschaften als Onkogen definiert. Sowohl in Patienten mit Morbus Crohn als auch im humanen Kolorektalkarzinom ist eine Überexpression von STAT3 und iNOS beschrieben. Unter Verwendung einer STAT3-spezifischen siRNA konnte der Nachweis erbracht werden, dass STAT3 ein essen-tieller Faktor in der IL-22-vermittelten Induktion der iNOS-Expression ist. Luciferase-Reporterstudien zeigten, dass IL-22 die humane iNOS-Promotoraktivität in DLD-1 Zellen, welche die Photinus pyralis (Firefly)-Luciferase unter Kontrolle eines 16kb-iNOS-Promotor-konstrukts überexprimieren (DLD-1/pXP2-16kb), erhöht. Somit kann eine Regulation der Transkription durch IL-22 angenommen werden. Dennoch vermag diese Arbeit die Frage nach den transkriptionellen Regulationsmechanismen der IL-22-vermittelten iNOS-Expres-sion in DLD-1 Zellen nicht abschließend zu beantworten. Eine Beteiligung ausgewählter Parameter der Zellaktivierung wie beispielsweise NFκB, STAT1α oder IRF-1 an der IL-22-vermittelten iNOS-Induktion konnte durch die vorliegende Arbeit ausgeschlossen werden. Neben transkriptionellen Regulationsmechanismen übernimmt auch die Regulation der iNOS mRNA-Stabilität eine wichtige Funktion bei der Induktion der iNOS-Expression. Allerdings zeigten auch hier die Ergebnisse der vorliegenden Arbeit, dass IL-22 die iNOS-mRNA nicht stabilisieren kann. Dies bekräftigt wiederum die Annahme, dass IL-22 auf transkriptioneller Ebene den iNOS-Promotor reguliert. Weitere Versuche zeigten auch, dass IL-22 spezifisch an der iNOS-Expression in Kolonkarzinomzellen beteiligt ist und keinen generellen Verstärker der IFNγ-induzierten Genexpression darstellt. Beachtet man hierbei die bedeutende Rolle von STAT3 und iNOS bei Entzündung und Karzinogenese, so repräsentiert IL-22 möglicherweise eine neue Zielstruktur für immuntherapeutische Interventionen im Rahmen dieser Erkrankungen. Der zweite Abschnitt der vorgelegten Arbeit beschäftigte sich mit der Regulation der IL-22-Sekretion im Kontext von Sepsis und systemischer Entzündung. Es stellte sich die Frage, inwiefern IL-22 in diesem komplexen klinischen Syndrom der Sepsis nachzuweisen ist. In diesem Zusammenhang zeigte sich, dass sowohl eine generelle T-Zellaktivierung sowie verschiedene Stimuli der angeborenen Immunität, hier im Besonderen ein hitze-inaktiviertes Lysat von Staphylococcus epidermidis, eine vermehrte IL-22-Produktion anre-gen. Eine wichtige Frage ist hier die pharmakologische Beeinflussung der IL-22-Sekretion. Da bei der Therapie einer Sepsis die Behandlung mit niedrig dosierten Glukokortikoiden Erfolg versprechend ist, wurde im Folgenden der Einfluss des klassischen antientzünd-lichen Pharmakons Dexamethason auf die IL-22-Sekretion in PBMC untersucht. Es konnte eindrucksvoll gezeigt werden, dass Dexamethason sowohl auf mRNA- als auch auf Proteinebene einen sehr potenten Inhibitor der S. epidermidis-induzierten IL-22-Sekretion darstellt. Um die in vitro-Daten der IL-22-Sekretion nach Immunaktivierung humaner PBMC durch in vivo-Experimente zu ergänzen, wurde ein kürzlich etabliertes Nagermodell der schweren Sepsis mit akutem Verlauf verwendet (CLI; caecum ligation and incision). In diesem Modell ist IL-22 im Vergleich zu unbehandelten Tieren signifikant erhöht. In Über-einstimmung mit den in vitro-Experimenten in humanen PBMC hat die Applikation von Dexamethason im CLI-Modell die Hemmung der IL-22-Produktion zur Folge. Zur Abrun-dung dieser Ergebnisse wurde das Serum von Patienten mit einer Peritonitis-bedingten Sepsis untersucht und es konnte erstmals eindrucksvoll gezeigt werden, dass IL-22 in dieser Patientengruppe signifikant erhöht ist. Zum aktuellen Zeitpunkt ist die Rolle von IL-22 in der Sepsis noch nahezu unbekannt. Daher ist zu klären, wie die eingehend beschriebene IL-22-vermittelte Aktivierung der epithelialen Immunabwehr, die systemische Immunsuppression über die Induktion von IL-10 sowie das proinflammatorische und destruktive Potential von IL-22 in Einklang zu bringen sind.
Die kombinierte Radiochemotherapie erzielt bei vielen Tumorerkrankungen höhere Remissionsraten als eine Monotherapie. Jedoch ist bis heute nicht eindeutig geklärt, ob dieser gesteigerte Effekt auf einer Addition der Wirkungen zweier unabhängiger Einzelbehandlungen beruht, oder ob es sich um einen Synergismus, also eine wechselseitige Verstärkung, handelt. Weiterer Klärungsbedarf besteht beim Einfluß der Reihenfolge und des zeitlichen Abstands zwischen Bestrahlung und Applikation des Chemotherapeutikums auf den Therapieerfolg. Zur Beantwortung dieser Fragen wurden in dieser Arbeit Ehrlich-Aszites-Tumorzellen (EAT) unterschiedlich lange mit 25 nmol/l Paclitaxel inkubiert und mit verschiedenem zeitlichen Abstand entweder vorher oder nachher einmalig mit gamma-Strahlung mit einer Dosis von 2 Gy bestrahlt. Als Vergleichsparameter diente das Überleben der Zellen, das mit dem Makrokolonietest bestimmt wurde. Bei kontinuierlicher Inkubation mit Paclitaxel konnten folgende Erkenntnisse gewonnen werden: * Das Überleben ist bei Inkubation mit Paclitaxel gefolgt von Bestrahlung (P --> B) immer geringer als bei Bestrahlung gefolgt von Inkubation mit Paclitaxel (B --> P). * Das Überleben nimmt mit zunehmendem zeitlichen Abstand bei B --> P zu. * Die Reihenfolge der Applikation ist bis zu einem Abstand von 6 Stunden unerheblich. * Das Überleben nimmt bis zu einem Abstand von 9 Stunden bei P --> B ab, danach steigt es wieder. * Ein Abstand von 9 Stunden zwischen Paclitaxelzugabe und Bestrahlung ist optimal in Bezug auf ein möglichst geringes Überleben. Bei zeitlich begrenzter Inkubation mit Paclitaxel ergaben sich folgende Resultate: * Das Überleben ist bei zeitlich begrenzter Inkubation mit Paclitaxel gefolgt von Bestrahlung (Pw --> B) außer bei einem Abstand und einer Inkubationsdauer von 3 Stunden geringer als bei Bestrahlung gefolgt von zeitlich begrenzter Inkubation mit Paclitaxel (B --> Pw) * Mit zunehmender Inkubationsdauer sinkt das Überleben sowohl bei B --> Pw als auch bei Pw --> B. * Bei einer Inkubationsdauer von 3 und 6 Stunden und einem Abstand von 3 und 6 Stunden ist die Reihenfolge der Verabreichung beider Noxen unerheblich. * Mit zunehmender Inkubationsdauer vergrößert sich der Abstand der Überlebensraten zwischen B --> Pw und Pw --> B. * Bei zeitlich begrenzter Inkubation mit Paclitaxel mit bis zu 12 Stunden wird bei keiner Probe ein so geringes Überleben erreicht wie bei kontinuierlicher Inkubation mit Paclitaxel. Bei kontinuierlicher Inkubation mit Paclitaxel konnten von der Reihenfolge abhängige Überlebensraten verzeichnet werden, die auf einen Synergismus schließen lassen, wenn Paclitaxel vor der Bestrahlung angewandt wird. Der in Kap. 2.3.1 beschriebene Wirkmechanismus von Paclitaxel kann diesen synergistischen Effekt erklären. Bei einem Abstand von 9 Stunden ist dieser Effekt am stärksten ausgeprägt. Des weiteren konnte gezeigt werden, dass Paclitaxel keinen Einfluß auf die Reparaturvorgänge nach Bestrahlung hat. Die Versuche mit zeitlich begrenzter Inkubation mit Paclitaxel lassen darauf schließen, dass die Zellen nach beendeter Disposition das Chemotherapeutikum abbauen oder ausscheiden können. Ebenso läßt sich ein Synergismus nicht eindeutig nachweisen. Mit den Ergebnissen dieser Arbeit und unter Berücksichtigung der Literatur zu diesem Thema (Kap. 6) muß ein allgemeiner strahlensensibilisierender Effekt des Paclitaxels weiterhin kritisch betrachtet werden, da er neben Konzentration und Inkubationsdauer auch von der Zellart abhängt. Die verwendeten EAT-Zellen zeigen eine erhöhte Strahlenempfindlichkeit durch Paclitaxeleinfluss. Diese Arbeit hat zu drei als zuverlässig einzustufende Kernaussagen geführt: 1) Die Reihenfolge P --> B ist der umgekehrten Reihenfolge klar überlegen. 2) Der optimale zeitliche Abstand liegt bei 9 Stunden. 3) Die kontinuierliche Inkubation erzielt bessere Ergebnisse als die zeitliche begrenzte Inkubation. Überträgt man diese in vitro gewonnen Resultate auf die klinische Praxis, so ließe sich mit 24-Stunden-Infusionen über 5-7 Tage eventuell nicht nur der therapeutische Nutzen gegenüber den derzeit meist verwendeten 1- bis 3-Stunden-Infusionen ein- bis dreimal pro Woche steigern, sondern auch die auftretenden Nebenwirkungen senken.
Das Ziel dieser Arbeit war es, RNA-Strukturen als potentielle Zielstrukturen für die Medikamentenentwicklung zu untersuchen. Hierbei ging es im Speziellen um die Anwendung Virtueller Screening Verfahren für die RNA-Liganden-Vorhersage. Hierzu wurde die als TAR-Motiv (transactivating response element) bekannte RNA-Struktur der mRNAs des HI-Virus ausgewählt. Diese Struktur wurde gewählt, da mit den vier PDB-Einträgen 1ANR, 1ARJ, 1LVJ und 1QD3 bereits experimentell motivierte Strukturmodelle zum Beginn der Untersuchung vorlagen. Ausschlaggebend war hierbei auch das Vorhandensein eines Tat-TAR-FRET-Assays im Rahmen des SFB 579, in welchem diese Arbeit angefertigt wurde. Die Aufmerksamkeit, welche dem HI-Virus im Rahmen der Bekämpfung der Immunschwächekrankheit bereits zukam, führte bei dem gewählten Testmodell ebenfalls zu einem, wenn auch immer noch überschaubaren Datensatz bereits getesteter Substanzen, der als Grundlage für einen Liganden-basierten Ansatz als erste Basis dienen konnte. Basierend auf diesen Voruntersuchungen ergaben sich die weiteren Schritte dieser Arbeit. Die Arbeit lässt sich zusammenfassend in vier zum Teil parallel verlaufende Phasen einteilen: Phase 1:Bestandsaufnahme bekannter Informationen über die Zielstruktur · experimentell bestimmte Zielstrukturen · experimentell bestimmte Liganden/Nichtliganden der Zielstruktur Phase 2: Ableiten eines ligandenbasierten Ansatzes zur Vorhersage von potentiellen Bindern der Zielstruktur aus Substanzbibliotheken, der nicht auf Strukturdaten der Zielstruktur beruht. Phase 3: Analyse der bekannten Konformere der Zielstruktur auf konstante Angriffspunkte für ein spezielles Liganden-Design. Phase 4: Einbinden der bekannten Strukturinformationen der Zielstruktur zur weiteren Verfeinerung der Auswahlverfahren neuer Kandidaten für die weitere experimentelle Bestimmung des Bindeverhaltens. Im Rahmen dieser Arbeit konnten mittels der Anwendung von künstlichen neuronalen Netzen in einem ligandenbasierten Ansatz durch virtuelles Screening der Chemikalien-Datenbanken verschiedener Lieferanten fünf neue potentielle TAR-RNA-Liganden identifiziert werden (drei davon mit einem Methylenaminoguanidyl-Substrukturmotiv), sowie als „Spin-Off“ durch die Anwendung der ursprünglich nur für den Tat-TAR-FRET-Assay vorgesehenen Testsubstanzen in einem Kooperationsprojekt (mittels CFivTT-Assay) zwei neue potentiell antibakterielle Verbindungen identifiziert werden. Die Beschäftigung mit der offensichtlichen Flexibilität der TAR-RNA und damit einer nicht eindeutig zu definierenden Referenz-Zielstruktur für das Liganden-Docking führte zur Erstellung eines Software-Pakets, mit dem flexible Zielstrukturen – basierend auf den Konformer-Datensätzen von MD-Simulationen – auf konstante Angriffspunkte untersucht werden können. Hierbei wurde ausgehend von der Integration eines Taschenvorhersage-Programms (PocketPicker) eine Reihe von Filtern implementiert, die auf den hierzu in einer MySQL-Datenbank abgelegten Strukturinformationen eine Einschränkung des möglichen Taschenraums für das zukünftige Liganden-Design automatisiert vornehmen können. Des Weiteren ermöglicht dieser Ansatz einen einfachen Zugriff auf die einzelnen Konformere und die Möglichkeit Annotationen zu den Konformeren und den daraus abgeleiteten Tascheninformationen hinzuzufügen, so dass diese Informationen für die Erstellung von Liganden-Docking-Versuchen verwendet werden können. Ferner wurden im Rahmen dieser Arbeit ein neuer Deskriptor für die Beschreibung von Taschenoberflächen eingeführt: der auf der „Skalierungs-Index-Methode“ basierende molekulare SIMPrint. Die Beschäftigung mit der Verteilung der potentiellen Bindetaschen auf der Oberfläche der Konformerensemble führte ferner zur Definition der Taschenoberflächenbildungswahrscheinlichkeit (Pocket Surface Generation Probability – PSGP) für einzelne Atome einer Zielstruktur, die tendenziell für die Einschätzung der Ausbildung einer potentiell langlebigen Interaktion eines Liganden mit der Zielstruktur herangezogen werden kann, um beispielsweise Docking-Posen zu bewerten.
Die vorliegende Arbeit beschäftigt sich mit der geochemischen und isotopischen Analyse detritischer Zirkonminerale aus rezenten Sedimenten des weit verzweigten Orange- und Vaal River Flusssystems in Südafrika. Zirkone kristallisieren überwiegend aus krustalen Schmelzen und sind äußerst resistent gegenüber jeglicher Zerstörung und damit ein idealer Kandidat zur Rekonstruktion früherer Krustenbildungsprozesse der geologischen Erdgeschichte. Der kombinierte Ansatz der U-Pb Altersdatierung, der Hf Isotopie und der Spurenelementgeochemie mittels Laserablation und des Einsatzes induktiv-gekoppelter Sektorfeld- und Multikollektormassenspektrometer ermöglicht es die krustale Wachstums- und Entwicklungsgeschichte des südafrikanischen Kratons zu erfassen. Die mehr als 1200 U-Pb Analysen der Zirkone weisen 4 tektonische Hauptphasen des südafrikanischen Kontinents nach: 1. die Panafrikanische Orogenese (0.5-0.7 Ga), 2. das Namaqua-Natal Faltengürtelorogen (1.0-1.3 Ga), 3. die Kheis Orogenese (1.8-2.0 Ga) und 4. die westliche Kaapvaal-Kratonisierung (2.9-3.2 Ga). Allerdings zeigt sich, dass die 13 Probenlokationen überwiegend lokale bzw. regionale U-Pb Altersdaten ihrer umgebenden Herkunftsgebiete liefern. Die Hf Isotopie der Zirkone der verschiedenen tektonischen Hauptphasen Südafrikas stellen ihre differenzierte Akkretions- und Aufschmelzungsgeschichte dar. Die panafrikanischen Zirkone zeigen eine ausgeprägte Durchmischung von juvenilem und recyceltem Material. Die mesoproterozoischen (Namaquan) Zirkone entstanden aus juvenilem Magma während eines Inselbogen-Kontinent-Kollisionsereignisses. Die paläoproterozoischen und archaischen Zirkone sind Produkte von aufgeschmolzener prä-existierender kontinentaler Kruste oder vom Mantel abstammende Schmelzen, die durch kontinentale Kruste kontaminiert wurden. Die berechneten Hf Modellalter, so genannte „Mantelextraktionsalter" ergeben zwei Maxima, die zwei Stadien juvenilem Krustenwachstums einschließen, einmal vor 1.4 und 3.2 Ga. Dieses krustale Wachstum zeigt eine Übereinstimmung mit den progressiv episodischen Modellen von Nagler & Kramers (1998) sowie Condie (2000) mit Höhepunkten zwischen 3.0 und 2.0 Ga sowie den Studien von Wang et al. (2008) mit krustalen Wachstumsperioden von 1.6 bis 2.2 und 2.9 bis 3.4 Ga auf dem Nordamerikanischen Kontinent und auf dem Gondwana-Kontinent (Australien) von Hawkesworth & Kemp 2006) und implizieren wohl ein globales kontinentales Krustenwachstum. Die Abgrenzung und Wiedererkennung der Zirkone anhand der chemischen Zusammensetzung zu möglichen Muttergesteinen zeigen noch keine viel versprechenden Ergebnisse. Generell weisen die Zirkone eine magmatische granitoide Zusammensetzung kontinentalen Ursprungs auf. Eine Auffälligkeit stellen die erhöhten Spuren- und leichten Seltenenerdelemente in Zirkonen jeglicher Altersklassen dar. Nachfolgende Arbeiten müssen zeigen, wie und ob diese Anreicherungen Einfluss auf die chemische Zusammensetzung, die U-Pb Datierung und vor allem die Hf-Isotopie der Zirkone haben.
The dissertation deals with the general problem of how the brain can establish correspondences between neural patterns stored in different cortical areas. Although an important capability in many cognitive areas like language understanding, abstract reasoning, or motor control, this thesis concentrates on invariant object recognition as application of correspondence finding. One part of the work presents a correspondence-based, neurally plausible system for face recognition. Other parts address the question of visual information routing over several stages by proposing optimal architectures for such routing ('switchyards') and deriving ontogenetic mechanisms for the growth of switchyards. Finally, the idea of multi-stage routing is united with the object recognition system introduced before, making suggestions of how the so far distinct feature-based and correspondence-based approaches to object recognition could be reconciled.
Die Dissertation möchte einen kritischen Blick auf die Interkulturelle Pädagogik in Deutschland werfen. Nach einer Auseinandersetzung mit den Inhalten des Fachgebietes folgt eine soziologische und psychologische Herangehensweise, die das Ziel verfolgt, einen erweiterten Blick auf die Thematik interkultureller Inhalte zu richten. Anschliessend werden verschiedene Theatertechniken und -projekte vorgestellt, die beispielhaft zeigen sollen wie die Absichten der Interkulturellen Pädagogik in die Gesellschaft transferiert werden können.
Die trimeren P2X–Rezeptoren sind nicht–selektive Kationenkanäle, die durch Adenosintriphosphat (ATP) aktiviert werden. Es gibt sieben Untereinheiten (P2X1–7). P2X–Rezeptoren sind in nahezu jedem Gewebe exprimiert und dort an den verschiedensten physiologischen Vorgängen beteiligt. Neben den „Cys–Loop“–Rezeptoren und den ionotropen Glutamat–Rezeptoren stellen die P2X–Rezeptoren eine eigenständige Familie von Neurotransmitter–gesteuerten Rezeptoren dar. Eine Untereinheit der trimeren P2X–Rezeptoren besteht aus den intrazellulären N– und C–Termini und zwei Transmembrandomänen, die über eine große extrazelluläre Domäne verbunden sind. Da weder ein P2X–homologes lösliches Protein für Kristallisationsstudien noch ein Gewebe zur Aufreinigung großer Mengen von P2X–Rezeptorprotein zur Verfügung steht, stützen sich Struktur–Funktions–Studien auf einzelpunktmutierte Rezeptoren in heterologen Expressionsystemen. Einige Aminosäuren, die bei Austausch gegen Alanin eine deutliche Verschiebung der Dosis–Wirkungs–Kurve von ATP bewirken und von denen daher vermutet wird, dass sie an der Agonisten–Bindung beteiligt sind, wurden bereits identifiziert. Ob sich die Agonisten–Bindungstasche der P2X–Rezeptoren zwischen zwei Untereinheiten, wie bei den nikotinischen Acetylcholin–Rezeptoren, oder innerhalb einer Untereinheit, vergleichbar mit den ionotropen Glutamat–Rezeptoren, befindet, ist weitgehend ungeklärt. Um die Lokalisation der ATP–Bindungstasche zu bestimmen, wurden, basierend auf vorhandener Literatur, potenziell an der ATP–Bindung beteiligte Aminosäuren des P2X1–Rezeptors durch zielgerichtete Mutagenese gegen Cysteine ausgetauscht und die P2X–Rezeptormutanen in Xenopus laevis–Oozyten exprimiert. Das Ziel dabei war, quervernetzte Cystein–Mutanten durch Disulfidbrückenbildung zwischen den substituierten Cysteinen zu identifizieren und so die Distanz von Aminosäure–Seitenketten, die an der Agonisten–Bindung beteiligt sind, zu bestimmen. Für die biochemischen Untersuchungen wurden entweder alle neu gebildeten Proteine der Oozyten metabolisch durch Inkubation mit radioaktivem [35S]–Methionin oder selektiv die Plasmamembran– ständigen Proteine mit Sulfo–NHS–Fluoreszenz–Farbstoffen markiert. Die Rezeptormutanten wurden affinitätschromatographisch über ein N–terminales Hexahystidyl–Motiv unter nicht–denaturierenden Bedingungen aufgereinigt und mit nicht–reduzierender SDS–Polyacrylamid–Gelelektrophorese (PAGE) auf Expression sowie mit Blauer–Nativer–PAGE auf korrekte Trimerisierung überprüft. Darüber hinaus wurden homologe Cystein–Substitutionen einer P2X2–1–Chimäre, welche dieselben Bindungseigenschaften des P2X1–Rezeptors besitzt, mittels der Zwei–Elektroden–Spannungsklemme charakterisiert (TEVC). Die Koexpression der verschiedenen P2X–Mutanten ergab eine spontane Quervernetzung über Disulfidbrücken zwischen den P2X1 K68C– und F291C–Mutanten, die in nicht–reduzierenden SDS–PAGE–Gelen über eine Dimerbildung nachgewiesen werden konnte. Dies deutet auf eine geringe Distanz zwischen diesen Cystein–substituierten Aminosäuren hin. Die Ausbildung der Disulfidbrücke konnte nach Reduktion der Quervernetzung während der Aufreinigung und durch Zugabe von ATP verhindert werden. In funktionellen Studien der P2X2–1 K68C/F291C–Doppelmutante war es entsprechend möglich die Disulfidbrücke reversibel zu reduzierenden. In den Mutantenkanäle exprimierenden Xenopus–Oozyten wurde der geringe Rezeptorstrom durch Reduktion mit DTT ca. 60fach potenziert und dadurch überhaupt messbar gemacht. Die Reoxidation durch H2O2 wurde wie in den biochemischen Experimenten in Anwesenheit von ATP ebenfalls verhindert. Da die Aminosäuren K68 und F291 des P2X1–Rezeptors möglicherweise an der Agonisten–Bindung beteiligt sind, sind diese Ergebnisse die ersten direkten experimentellen Hinweise auf die Aposition von Domänen benachbarter Untereinheiten, die an der Agonisten–Bindung beteiligt sind. Demnach befindet sich die ATP–Bindungstasche an der Grenzfläche zwischen zwei Untereinheiten der P2X–Rezeptoren. Die Koexpression homologer Cystein–substituierter P2X2–, P2X3– und P2X4–Rezeptoren zeigte analog zu den P2X1–Experimenten eine spontane Dimerisierung der P2X2 K69C– und F289C–Mutanten. Eine mäßige Quervernetzung von zwei Untereinheiten der P2X3 K63C– und F280C– sowie der P2X4 K67C– und F294C–Mutanten konnte nach Anwendung einer ca. 0,5 nm langen Cystein–spezifischen quervernetzenden Substanz erreicht werden. Die paarweise Kombination der P2X1–, P2X2–, P2X3–und P2X4–Cystein–Mutanten zeigte selbst nach Anwendung quervernetzender Substanzen nur in der Kombination von P2X1–K68C und P2X2–F289C eine Quervernetzung von zwei unterschiedlichen Untereinheiten eines heteromeren P2X1/2–Rezeptors. Diese Kombination konnte in elektrophysiologischen Messungen durch Reduktion der Disulfidbrücke spezifisch messbar gemacht und somit die Heteromerisierung dieser Untereinheiten eindeutig aufgezeigt werden. Zusammenfassend deutet die geringe Distanz der an der Quervernetzung beteiligten Cystein–Mutationen der P2X1–, P2X2– und homomeren P2X1/2–Rezeptoren auf ein konserviertes strukturelles Motiv dieser P2X–Subtypen hin, welches in P2X3– und P2X4–Rezeptoren nicht konserviert zu sein scheint. Diese Ergebnisse liefern wichtige Hinweise auf die generelle Struktur der P2X–Rezeptoren und werden maßgeblich zur Interpretation einer zukünftigen Kristallstruktur beitragen.
Der Behandlungserfolg maligner Erkrankungen mit konventionellen Chemotherapeutika wird durch hohe Morbiditäts- und Mortalitätsraten infolge schwerer Nebenwirkungen aufgrund der unselektiven Wirkung auf den proliferierenden Zellpool und durch zunehmende Resistenzentwicklungen gegen das jeweils eingesetzte Therapeutikum limitiert. Zusätzlich wirken konventionelle Chemotherapeutika bei niedrig-malignen Tumoren mit geringer Proliferationsrate nur unzureichend. Intensive Forschungen beschäftigen sich deshalb mit der Entwicklung spezifischer Therapeutika, die ausschließlich den entarteten Zellklon angreifen, indem sie den zur Transformation der Zelle führenden molekularen Mechanismus, der zur Störung der Induktion oder des Ablauf des programmierten Zelltodes (Apoptose) oder zur gesteigerten Zellprogression führt, gezielt antagonisieren. SRC-Kinase-Inhibitoren gehören zu diesen innovativen Substanzen der so genannten „Molecular Targeted Therapy“. Sie hemmen selektiv SRC-Kinasen, die zur Gruppe der intrazellulären Nicht-Rezeptor-Tyrosinkinasen zählen und an der Pathogenese verschiedener malignen Erkrankungen beteiligt sind. Ihr antiproliferatives Potential konnte in vitro sowohl in der Therapie solider Tumoren, als auch der CML und CLL nachgewiesen werden. In dieser Dissertation wurde gezeigt, dass die neuen SRC-Kinase-Inhibitoren AZD0424, AZD0530 und AZM559756 bei Einsatz mikromolarer Konzentrationen in der Lage sind, in Bcr-Abl-, c-Kit- und PDGF-negativen B-Zell-Lymphomzelllinien Apoptose zu induzieren und die Zellprogression durch Beeinflussung des Zellzykluses zu unterdrücken. Dabei erwies sich die Substanz AZD0424 als der am stärksten wirksame Apoptose-Induktor. Durch umfangreiche Untersuchungen der Responder- (DOHH-2 und WSU-NHL) und Nonresponderzellen (Jurkat und Raji) zur Apoptosekaskade konnten die Schlüsselmoleküle des durch die neuen SRC-Kinase-Inhibitoren induzierten programmierten Zelltodes identifiziert werden. So lies sich die Aktivierung des extrinsischen und intrinsischen Apoptoseweges nachweisen. In Responderzellen erfolgten eine Aktivierung von Initiator- (-8 und -9) und Exekutorcaspasen (-3, -6 und -7), die Zerstörung des mitochondrialen Membranpotentials sowie die Spaltung von Bid, Rb und PARP. Des Weiteren konnten in den Responderzellen eine Downregulation von antiapoptotischen Bcl-xl und eine Downregulation der Apoptoseinhibitoren Survivin, cIAP-1 und c-Flip als apoptosevorantreibene Schritte identifiziert werden. Ebenso lies sich ausschließlich in den behandelten Responderzellen eine Downregulation der c-Abl-Kinase und eine Verminderung der Akt-Phosphorylierung nachweisen. Die Untersuchung der basalen Expression der SRC-Kinasen in den getesteten Lymphomzelllinien bestätigte, dass SRC-Kinasen in unterschiedlichen malignen Erkrankungen fehlgesteuert sind und sich durch ein vom Normalzustand abweichendes Expressionsmuster auszeichnen. Des Weiteren konnten Lyn, Fyn und Lck als Haupteffektor-SRC-Kinasen der neuen SRC-Kinase-Inhibitoren identifiziert werden: so lies sich in allen behandelten Zellen eine Downregulation der SRC-Kinase Lck sowie der phosphorylierten Isoformen p-Lck-Tyr505 und p-Lyn-Tyr507 nachweisen. Durch vergleichende Western Blot Analysen zwischen Responder- und Nonresponderzelllinien gelang es, Charakteristika der Zellen zu identifizieren, die Erklärungen für das unterschiedliche Ansprechen der Zellen auf SRC-Kinase-Inhibitoren anbieten. So wurde gezeigt, dass sich Responderzellen im Gegensatz zu Nonresponderzellen durch eine deutlich geringere c-Myc Expression auszeichnen. Somit deckt diese Arbeit die molekularen Mechanismen der durch SRC-Kinase-Inhibitoren induzierten Apoptosekaskade in B-Zell-Lymphomzellen auf, zeigt wesentliche Schlüsselmoleküle der SRC-vermittelten intrazellulären Signaltransduktion auf, die letztendlich zur Initiierung des programmierten Zelltodes und der Inhibition der Zellzyklusprogression führen und identifiziert entscheidende, für das Ansprechend der Zellen verantwortliche Proteine. Zusammenfassend konnte mit dieser Arbeit gezeigt werden, dass die neuen SRC-Kinase- Inhibitoren großes antiproliferatives Potential in B-Zell-Lymphomzellen besitzen. Damit stellen sie eine neue, aussichtsreiche Therapieoption in der Behandlung der Lymphomerkrankungen dar. Insbesondere für die Therapie der niedrig-malignen Non-Hodgkin-Lymphome, für die es trotz zahlreicher Forschungsbestrebungen bis heute keine kurativen Behandlungsmöglichkeiten gibt, könnten mit diesen Substanzen verbesserte Heilungschancen erzielt werden. Durch die Aufdeckung der molekularen Mechanismen der durch SRC-Kinase-Inhibitoren induzierten Apoptose, die sich in der Tat von denen der konventionellen Zytostatika unterscheiden, ergibt sich ferner die Möglichkeit, durch eine Kombination beider Chemotherapeutika synergistische Erfolge in der Behandlung maligner Erkrankungen zu erreichen. So könnten zum einen durch Einsatz niedriger Wirkstoffdosen die Nebenwirkungen für den Patienten reduziert werden. Zum anderen könnten mittels der neuen SRC-Kinase-Inhibitoren Resistenzen gegen konventionelle Zytostatika überwunden werden. Somit liefert diese Arbeit wesentliche Grundlagen für weitere, aussichtsreiche in vivo Untersuchungen der SRC-Kinase-Inhibitoren bezüglich einer Optimierung der Therapie der Lymphomerkrankungen.
Die Einführung von Imatinib hat die Behandlung der CML revolutioniert, leider wird die Wirksamkeit dieses Medikaments überschattet durch das Vorkommen von primären und sekundären Resistenzen, welches Gegenstand vieler laufender Studien ist. Wir haben untersucht ob ein Mangel an einer aktiven Tyrosinphosphatase, der PTP-1B, Ursache einer solchen Resistenz gegen Imatinib in bcr-abl positiven Zellen sein kann. Zu diesem Zweck konstruierten wir eine Substratfalle, die einerseits in der Lage ist PTP-1B zu binden, allerdings keine/ kaum katalytische Aktivität besitzt. Eine solche dominant-negative Mutante wurde in K562 Zellen kloniert und mit einem überexprimierendem Klon hinsichtlich CML-prägenden Veränderungen (Differenzierungsverhalten mittels FACS-Analysen, veränderte Signaltransduktion mittels Western Blot und Wachstumsverhalten mittels Zellzahlbestimmung, etc...) untersucht. Hiernach konnten wir zeigen, dass ein Mangel an aktiver PTP-1B zu einer Resistenz gegen Imatinib in bcr-abl positiven Zellen führt.
The epithelial absorbing cells of the small intestinal villi, the enterocytes, are the main protagonists for the transport of nutrients from the intestinal lumen to the interstitial fluids. The oriented flow of nutrients is carried out by different and complementary transport systems present in the apical and the basolateral domains of the enterocyte’s plasma membrane. One of the distinctive characteristics of those intestinal cells is the presence of numerous structurally distinct protrusions (referred as microvilli) on the apical surface of the plasma membrane. They confer the brush-like appearance of the microvillus border (commonly referred to as the "brush border") typically observed in the light microscope. Over the years, there has been considerable interest to study the molecular mechanisms driving the transport of molecules across the intestinal brush border membrane (BBM). Defects have been described to cause a variety of pathological conditions, such as disorders in the metabolism of saccharides (glucose and galactose malabsorption, lactose intolerance), amino acids (Hartnup disease, aminoacidurias), ions (sodium and potassium in the case of familiar diarrhea), metals (zinc in acrodermatitis enteropathica) and cholesterol lipids (cardiovascular diseases). In particular, the essential role of the BBM in regulating the delicate balance between cholesterol influx and efflux from the lumen to the enterocyte has been recently highlighted through the genetic analysis of individuals suffering of cholesterol disorders as well as in several clinical studies involving the use of dietary plant sterols (phytostrerols) or specific protein inhibitors blocking essential components of the cholesterol absorption/resorption pathway. ...
Die Lyme-Borreliose stellt in Deutschland mit ca. 60.000 Neuinfektionen pro Jahr die am häufigsten durch Zecken übertragene Zoonose beim Menschen dar. Obwohl adäquat antibiotisch therapiert, konnte in wenigen Fällen bei Patienten mit Erythema migrans eine persistierende Borrelieninfektion nachgewiesen werden. Die zugrunde liegenden Mechanismen einer möglichen Antibiotikaresistenz sind jedoch nur unzureichend untersucht. Im Rahmen der vorliegenden Studie wurde daher der Frage nachgegangen, ob und wie B. burgdorferi der inhibitorischen Wirkung von Antibiotika entgehen. Basierend auf einer vergleichenden Proteomanalyse von antibiotisch behandelten und unbehandelten Borrelienzellen, sollten Unterschiede in den Proteinsignaturen einzelner Moleküle, als Ausdruck einer koordinierten Abwehrreaktion aufgezeigt werden. Die unter subinhibitorischen Antibiotikakonzentrationen inkubierten Borrelienzellen wiesen mikroskopisch keine morphologischen Veränderungen auf. Gleichermaßen konnten keine signifikanten Unterschiede in der Proteinexpression nachgewiesen werden. Sichtbare, strukturelle Veränderungen liessen sich erst in Gegenwart von 0,5mg/l bis 1mg/l Penicillin bzw. Doxycyclin nachweisen, was der MHK beider Antibiotika entsprach. Die unter identischen Bedingungen durchgeführte Proteomanalyse ergab eine deutliche Veränderung bei 14 Proteinen der mit Penicillin-behandelten Borrelienzellen und 5 Proteinen der mit Doxycyclin-behandelten Borrelienzellen. Mit Ausnahme eines einzelnen Proteins waren alle anderen Moleküle durch eine signifikante Repression gekennzeichnet. Interessanterweise wurde die Expression bei drei Proteinen sowohl von Penicillin als auch von Doxycyclin beeinflusst. Mittels massenspektrometrischer Analyse (MALDI-TOF-MS) konnten insgesamt 9 zytoplasmatische Proteine und ein membranständiges, porenbildendes Protein (p66) eindeutig identifiziert werden. Von den im Zytoplasma lokalisierten Proteinen besitzen vier Proteine als Isomerasen, Transferasen, bzw. Kinasen enzymatische Aktivität und ein Protein (FtsZ) ist bei der Zellteilung beteiligt. Die Ergebnisse dieser Studie lassen vermuten, dass Borrelien auf Penicillin und Doxycyclin mit einem koordinierten Regulations- bzw. Abwehrmechanismus reagieren, der in unterschiedliche Stoffwechselprozesse eingreift. Inwieweit dieser Antibiotika-induzierte Prozess als Stressantwort zu deuten ist oder Teil eines Resistenzmechanismus darstellt, sollte Gegenstand zukünftiger Untersuchungen sein.
Die Hyperhomocysteinämie ist in zahlreichen Untersuchungen als Risikofaktor für kardiovaskuläre Erkrankungen beschrieben worden. Lebertransplantierte Patienten weisen im Mittel zu 50-70% einen erhöhten Homocysteinspiegel auf. Aufgrund der immunsuppressiven Therapie steigt bei diesen Patienten zudem das Risiko für Hypertonien, Diabetes, Malignome, kardiovaskuläre Erkrankungen und Hyperlipidämien. Das Ziel der vorliegenden Arbeit war es, die Veränderungen des Serumhomocysteinspiegels nach achtwöchiger Einnahmezeit von Folsäure oder LMTHF placebokontrolliert, in einer randomisierten Doppelblindstudie zu untersuchen. Die zu Beginn erhobenen Laborparameter der drei Patientengruppen (L-MTHF, Folsäure und Placebo) wiesen keinerlei signifikante Unterschiede auf. Nach achtwöchiger Einnahmezeit konnte in der L-MTHF-Gruppe eine signifikante Reduzierung des Serumhomocysteinspiegels um 37% beobachtet werden. In der Folsäure-Gruppe kam es acht Wochen nach Studienbeginn zu einer nicht signifikanten Abnahme um 24% des Ausgangswertes. Der Spiegel der Placebo-Gruppe blieb weitgehend unverändert. Zwei Wochen nach Absetzen der Studienmedikation (Woche 10, Auswaschphase) lag der Serumhomocysteinwert der L-MTHF-Gruppe verglichen mit der Folsäure- und Placebo-Gruppe immer noch am niedrigsten. Die Ergebnisse dieser Studie deuten darauf hin, dass bei Patienten nach Lebertransplantation, L-MTHF im Vergleich zu Folsäure zu einer effektiveren Senkung des Serumhomocysteinspiegels führt. Ob die dauerhafte Einnahme von L-MTHF vor dem Hintergrund des Risikofaktors „Hyperhomocysteinämie“ auch prospektiv die Gefahr der mit ihr assoziierten Erkrankungen verringert, muss in weiteren grösser angelegten Studien untersucht werden.
Poly(pyrazol-1-yl)borate, die sogenannten Skorpionate, repräsentieren eine der etabliertesten Ligandenklassen in der Koordinationschemie und finden aufgrund ihrer Vielseitigkeit zahlreiche Anwendungen. In den letzten Jahren hat sich ein besonderes Interesse an Bis- und Tris(pyrazol-1-yl)boratliganden entwickelt, die mehrere Skorpionateinheiten im selben Molekül vereinen und dadurch kooperative Effekte zwischen den Metallionen fördern. Diese Liganden können sowohl Einsatz in der homogenen Katalyse als auch in den Materialwissenschaften finden. Die bisher in unserer Arbeitsgruppe entwickelten ditopen Bis(pyrazol-1-yl)borate des Typs L (Abb. 3.1) weisen allerdings eine recht hohe Hydrolyseempfindlichkeit auf, deren Ursache wahrscheinlich im elektronenschiebenden Charakter und der Raumerfüllung der Alkylsubstituenten begründet liegt. Im Rahmen der vorliegenden Arbeit wurden daher zunächst die ditopen Skorpionatliganden M2[3] und M2[6] mit Phenyl- und Pentafluorphenylsubstituenten dargestellt, die in darauf folgenden Hydrolysestudien eine im Vergleich zu L erheblich höhere Beständigkeit gegenüber Feuchtigkeit zeigten. Die Umsetzungen der Liganden Li2[Lpara] (Dissertation Dr. Susanne Bieller; Frankfurt 2005) und Li2[6] mit MnII-chlorid verdeutlichten, dass sich das C6F5-substituierte Heteroskorpionat auch in Bezug auf sein koordinationschemisches Verhalten vom tertButyl-substituierten Liganden unterscheidet. Während Li2[Lpara] mit MnCl2 zu einem chlorid-überbrückten, makrozyklischen, dinuklearen Mangankomplex reagiert, wird mit Li2[6] das in Abb. 3.2 dargestellte Koordinationspolymer {(MnCl2)2(Li(THF)3)2[6]}∞ erhalten. Die Ladung der anionischen Polymerkette wird durch Lithium-Gegenionen ausgeglichen. Um die Bildung von diskreten Komplexen einerseits bzw. von Koordinationspolymeren andererseits gezielt steuern zu können, wurden die mit sterisch anspruchsvollen Pyrazolylsubstituenten versehenen Liganden M2[4], M2[5] und M2[7] (Abb. 3.1) dargestellt. Im Zuge der Kristallisation von Li2[4] zeigte sich, dass diese Verbindung eine hohe Affinität für Chloridionen besitzt. Auch in Anwesenheit eines Überschusses Kronenether führen Spuren des Halogenids zur Ausbildung des in Abb 3.3 gezeigten dinuklearen, chloridverbrückten Lithiumkomplexes Li2Cl[4]. Die ausgeprägte Komplexbildungstendenz lässt Li2Cl[4] im Hinblick auf die Entwicklung von Anionenrezeptoren interessant erscheinen. Komplexe, in denen zwei Metallionen durch zwei Heteroskorpionatliganden in eine makrozyklische Struktur eingebunden werden (Tmeta/para in Abb. 3.4), konnten im Rahmen dieser Arbeit nicht isoliert werden. Ein Hinweis, warum dieses Strukturmotiv ungünstig sein könnte, wurde durch die Charakterisierung des auf einem partiell hydrolysierten Derivat von Li2[Lpara] beruhenden CoII-Makrozyklus Co2[23]2 erhalten. Die Analyse der Strukturparameter dieser Verbindung deutet an, dass die Bildung eines Makrozyklus im Fallder unhydrolysierten Heteroskorpionate aufgrund sterischer Wechselwirkungen zwischen den Pyrazolylringen und der Phenylenbrücke benachteiligt sein sollte. Obwohl zwischen Aryl- und Alkyl-basierte n Heteroskorpionaten erhebliche Unterschiede hinsichtlich ihrer Neigung zur hydrolytischen Zersetzung erkennbar sind, zeigen beide Ligandentypen ähnliche Labilitäten gegenüber der stark Lewis-aziden Verbindung Brommanganpentacarbonyl. Die Reaktionen von Li2[Lpara], Li2[3] und Li2[6] mit Mn(CO)5Br führten zur Spaltung von B-N-Bindungen, die in allen drei Fällen durch Kristallisation des in Abb. 3.5 gezeigten, pyrazolid-verbrückten MnI-Carbonylkomplexes 21 dokumentiert werden konnte. Im Gegensatz zu den Heteroskorpionatliganden zeigen oligotope phenylenverknüpfte Homoskorpionate keine Tendenz, sich unter dem Einfluss von Mn(CO)5Br zu zersetzen. Reaktionen der di- und tritopen Tris(pyrazol-1-yl)borate Li2[15], Li2[16] und Li3[18] lieferten die in Abb. 3.6 dargestellten Mangantricarbonylkomplexe (Mn(CO)3)2[15], (Mn(CO)3)2[16] und (Mn(CO)3)3[18] in guten Ausbeuten. Neben der Darstellung dieser, für materialwissenschaftliche Fragestellungen (Koordinationspolymere, Metallorganische Netzwerke) interessanten Liganden, wurde im Rahmen der vorliegenden Arbeit auch der Frage nachgegangen, ob die Verknüpfung zweier Heteroskorpionateinheiten Auswirkungen auf die katalytische Aktivität entsprechender Rhodium-Cyclooctadien-Komplexe in der Polymerisation von Phenylacetylen hat. Sterisch anspruchsvolle Pyrazolylsubstituenten tragende monotope Rhodium-Cyclooctadien- Skorpionatkomplexe konnten in dieser Reaktion bereits erfolgreich als Katalysatoren eingesetzt werden und lieferten regioselektiv cis-transoid-verknüpftes Poly(phenylacetylen). Zunächst wurden die in Abb. 3.7 dargestellten Rhodiumkomplexe (Rh(cod))2[3] und (Rh(cod))2[6] von Bis(pyrazol-1-yl)boraten, die keine sterisch anspruchsvollen Pyrazolylsubstituenten tragen, synthetisiert. Ähnlich wie der analoge einkernige Komplex Rh(cod)[H2Bpz2 ] zeigten (Rh(cod))2[3] und (Rh(cod))2[6] keinerlei katalytische Aktivität. Daher sollten im Anschluss die mit Phenylpyrazolylgruppen ausgestatteten Derivate (Rh(cod))2[5] und (Rh(cod))2[7] synthetisiert und im katalytischen Prozess eingesetzt werden. Im Verlauf dieser Experimente stellte sich heraus, dass die Reaktionen der Alkalimetallskorpionate Li2[5] und K2[7] mit (Rh(Cl)(cod))2 nicht zu den Zielverbindungen, sondern zur Zersetzung der Ligandgerüste führen. In beiden Fällen konnte das Abbauprodukt 22 isoliert werden (Abb. 3.8). Weitere Untersuchungen ergaben, dass 22 in der Lage ist, Phenylacetylen in guten Ausbeuten und regioselektiv (cis-transoid-verknüpftes Poly(phenylacetylen)) zu polymerisieren. 22 stellt somit ein gut zugängliches und leicht zu modifizierendes Katalysatorsystem dar, dessen Optimierung Thema zukünftiger Untersuchungen sein wird.
The respiratory chain is composed of protein complexes residing in the inner mitochondrial membrane of eukaryotes or in the cytoplasmic membrane of prokaryotes. This cellular energy converter transforms a redox potential stored in low potential substrates into an electrochemical potential across the respective membrane. Typical respiratory chains contain the complexes I, II, III and IV named according to their sequence in the respiratory chain reaction. Electrons of low potential substrates enter at complex I or II and are passed via complex III to complex IV where they are transferred to oxygen. The transport of electrons between the complexes is mediated by small electron shuttles like quinol or cytochrome c. Two different models describe their exchange either by (1) random collision of freely diffusible electron shuttles and membrane protein complexes or (2) arrangement of the complexes in supercomplexes enabling direct channeling of electron shuttles. In the Gram positive bacterium Corynebacterium glutamicum, the complex III to complex IV electron shuttle cytochrome c is not diffusible but a covalently bound part of the diheme cytochrome subunit QcrC of complex III. Therefore, the complexes III and IV have to form a supercomplex for electron transduction. The aim of this thesis was to purify and characterise this obligatory supercomplex III/IV of C. glutamicum. To gain sufficient biomass of C. glutamicum as starting material for purification, a phosphate buffered minimal medium was developed that enabled yield of total 120 g wet cell mass (38 g dry mass) in 12 L (6×2 L) shaking cultures. The determined conversion factor of glucose into biomass was 0.46 g/g indicating an intact respiratory chain. The yield was increased by bioreactor cultivation to ~690 g wet cell mass (~220 g dry mass) in ~10 L culture volume. A previously described homologous expression system was applied that produces the complex IV subunit CtaD with a fused Strep-tag II to facilitate purification. Affinity purifications using the Strep-tag II affinity to Strep-Tactin resin yielded a mixture of complexes and supercomplexes. Two supercomplex III/IV versions named supercomplex A and B and free complex IV were identified in this mixture by size exclusion chromatography, redox difference spectroscopy and two dimensional polyacrylamide gel electrophoresis including blue native polyacrylamide electrophoresis. The here presented downscaled blue native polyacrylamide electrophoresis method with analysis times of ~1 h enabled efficient screening of factors influencing the stability of supercomplex III/IV. The screening resulted that the integrity of supercomplex III/IV is preserved by using neutral detergents at minimal detergent to protein ratios for solubilisation and low detergent concentrations for purification and storage slightly above the required critical micellar concentration. Furthermore, pH <=7.5 is required for stability of supercomplex III/IV. Large biomass yields enabled upscaling of supercomplex III/IV affinity purification. Application of the identified stability conditions resulted in affinity purified samples free of supercomplex B. The major component supercomplex A was efficiently separated from residual free complex IV by preparative size exclusion chromatography. Concentration of purified supercomplex A by ultracentrifugation resulted in integrity of the supercomplex for several days at 4 °C. Purified supercomplex A contains ten different previously described subunits. The heme content of supercomplex A relative to the protein mass is heme A: 6.0 μmol/g, heme B: 6.5 μmol/g, and heme C: 5.8 μmol/g determined by redox difference spectroscopy and biochemical protein quantification. This indicates an equimolar ratio of complex III and complex IV in supercomplex A. Supercomplex A has quinol oxidase activity that is inhibited by stigmatellin or sodium azide. The turnover number of transferred electrons per complex III monomer is 148 s−1 at 25° C. The homogeneity and stability of the prepared supercomplex A enabled the growth of threedimensional crystals of up to 0.1 mm in length. Their composition of supercomplex A was verified by redox difference spectroscopy of intact crystals and blue native polyacrylamide electrophoresis of dissolved crystals. The crystals diffracted X-rays corresponding to a resolution of ~10 Å. Electron microscopy of negative stained samples revealed the uniform shape of purified supercomplex A particles with dimensions of 22 × 9 nm in the view plane. Combined heme quantification, size determination, determined activity, symmetry considerations, and particle shape indicate that supercomplex A has a central dimer of complex III and two monomers of complex IV on opposite sides. This conformation is functionally reasonable because it provides each complex III monomer with one complex IV monomer as electron acceptor. Therefore, the stoichiometry of supercomplex A is most likely III2IV2. The sensitivity of supercomplex A to detergents indicated a role of phospholipids in its stability. Therefore, a method for phospholipid identification and quantification was developed that is suitable for detergent solubilised crude and purified membrane protein samples. The analysis combines separation of phospholipid classes according to their head group by normal phase high performance liquid chromatography with evaporative light scattering detection. Calibration with external standard allows quantification of phospholipid amount in the range of 0.25-12 μg. The method is verified by analysing the phospholipid content of the well characterised complex III of Saccharomyces cerevisiae. The reduction of its phospholipid content during its purification steps is monitored. The complex III sample purified to crystallisation quality contains the phospholipid content that was also observed in previously reported structures determined by X-ray crystallography. Purified stable supercomplex A from C. glutamicum revealed a large content of bound phospholipids. The main differences between intact supercomplex A and a mixture of potentially disintegrated smaller complexes is that intact supercomplex A has a doubled phosphatidic acid content and an increased phosphatidyl glycerol content. The importance of the small anionic phosphatidic acid for mediation of contacts between complexes in a supercomplex is discussed. The total phospholipid content of stable supercomplex A is sufficient for a complete belt surrounding the supercomplex in the membrane plane. This indicates that also all essential internal phospholipid binding positions are occupied and potentially stabilise supercomplex A.
The function of APOBEC3G in the innate immune response against the HIV infection of primary cells
(2008)
In the past few years the regulation of HIV-1 replication by cellular cofactors has been a major topic of ongoing research. These factors potentially represent new targets for antiviral therapy as resistance will be minimized. However this requires a better understanding of the interaction of HIV-1 with these cellular factors and the immune system. The virus infects the cells of the immune system, beginning with macrophages and dendritic cells as primary target cells during transmission. The cellular cofactor, APOBEC3G was found to be an antiviral factor in macrophages, dendritic cells and primary T cells. APOBEC3G is a cytidindeaminase which causes G->A hypermutations in the HIV-Genome. Another protein which has a strong inhibitory effect on the HIV infection is Interferon alpha (IFN-alpha), however the exact reason for this has not yet been elucidated. The bacterial protein, Lipopolysaccharide (LPS) also induces a strong antiviral state in macrophages. In micro-array analysis it was shown that APOBEC3G was upregulated after the stimulation with both IFN-alpha and LPS in macrophages. The goal of this work was to investigate the role of APOBEC3G in the innate immune response to APOBEC3G. For this, the expression of APOBEC3G was examined in HIV-1 target cells after stimulation with IFN-alpha or LPS and the effect of the protein on the viral infection was examined. In the first experiments it could be shown through real time quantitative PCR that APOBEC3G was overexpressed after the stimulation with IFN-alpha or LPS. This result could be shown in monocytes derived macrophages from different blood donors. It was also shown that the overexpression of APOBEC3G correlated directly with the concentration of IFN-alpha. Through mutational analysis it could be then shown that the overexpressed APOBEC3G protein was also functional in the cells. In order to show that this was the result of APOBEC3G, the protein was the regulated through lentiviral vectors. After transduction of cell lines with lentiviral vectors containing APOBEC3G, the infection was inhibited by up to 70%. The infection was restored after the addition of shRNAs against APOBEC3G. For the further experiments, CD34+ stem cells were used. The cells were transduced the day after thawing with lentiviral vectors containing an eGFP marker gene and either APOBEC3G or shRNAs against APOBEC3G. The CD34+ cells were then cultivated and differentiated to macrophages. The cells transduced with Lentiviral vectors containing APOBEC3G had a very high expression of APOBEC3G in the cells, however the cells transduced with shRNA against APOBEC3G did not show a reduction in the protein expression. The infectivity of the transduced CD34+ and CD34 derived macrophages was then examined. It was expected that the cells transduced with APOBEC3G would show a reduced HIV-1 infection, and the cells transduced with shRNA against APOBEC3G would show an increase in infection. After the transduction and differentiation the CD34+ cells from the 3 donors were stimulated and infected with wild type HIV-1 and Vif defective HIV-1 virus. Vif is a viral protein that can bind to APOBEC3G leading it to the proteasome for degradation. The cells from the first donor transduced with APOBEC3G, were very difficult to infect. In general the shRNA against APOBEC3G had little effect on the course of infection; presumably, the shRNA against APOBEC3G was not active in most of these cells. Only the cells from the first donor showed an increase in HIV infection after the transduction with the shRNAs against APOBEC3G, this was most notably the case in the cells stimulated with IFN-alpha, which usually show very little infection. This work showed that APOBEC3G plays an important role in the innate immune response to HIV-1. The effect of APOBEC3G is both cell type as well as donor dependent. Recently, an interesting study also showed that there is a correlation between the expression of APOBEC3G in HIV infected individuals and their progression to AIDS. A better understanding of the role that APOBEC3G plays in the innate immune response would help in the search of new therapeutic possibilities. This could be done by inhibiting the Vif-APOBEC3G interaction in order to increase the amount of active APOBEC3G in the cells or increasing the APOBEC3G concentration in the cells in some manner.
Die Onkogenese geht mit einer Deregulation des Zellzyklus einher. Dabei spielt unter anderem die Regulation verschiedener krebsrelevanter Transkriptionsfaktoren eine wichtige Rolle. Ein Interaktionspartner und Regulator vieler dieser Faktoren ist das LIM-only Protein FHL2. Es ist bereits bekannt, dass sich der FHL2-Status zwischen normalen und entarteten Zellen in allen bisher untersuchten Geweben unterscheidet. Im Rahmen dieser Arbeit konnte erstmals gezeigt werden, dass dies auch im Brustgewebe der Fall ist. FHL2 wird in fast allen aggressiven Mammakarzinomen überexprimiert, nicht aber im Normalgewebe und nur schwach in nicht-invasiven "DCIS". Dies weist darauf hin, dass die FHL2-Menge mit der Aggressivität des Tumors korreliert. Weiterhin konnte hier zum ersten Mal nachgewiesen werden, dass FHL2 in die Zellzyklusregulation involviert ist. Am G1/S-Übergang kann FHL2 die Cyclin D1-Expression induzieren, was letztendlich zu einer Phosphorylierung des RB-Proteins und zum Eintreten der Zelle in die S-Phase führt. Wichtiger aber ist die hier gezeigte FHL2-abhängige Induktion von p21CIP/WAF, ein Zellzyklusinhibitor, der unter anderem auch in der G2/M-Kontrollpunkregulation involviert ist und normalerweise über p53 reguliert wird. Diese Induktion resultiert dort in einem verlangsamten Kontrollpunktübergang, wogegen eine Reduktion des FHL2-Gehalts einen beschleunigten G2/M-Übergang zur Folge hat. Zusätzlich zeigten Expressionsanalysen mit synchronisierten Brustkrebszellextrakten dass FHL2 zellzyklusabhängig exprimiert wird, mit einem Maximum am G2/M-Kontrollpunkt. Im Rahmen dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass die p21-Expression in den hier verwendeten Brustkrebszelllinien p53-unabhängig ist und ausschließlich von FHL2 abhängt. Hierbei wird die FHL2-abhängige p21 Expression wahrscheinlich über die Aktivierung des c-jun-Transkriptionsfaktors im MAPK-Signaltransduktionsweg induziert. In vivo und in vitro Interaktionsstudien haben eine Interaktion von FHL2 mit c-jun gezeigt, wobei die Interaktion über die ersten beiden LIM-Domänen vermittelt wird. Der FHL2-c-jun-Komplex bindet an die AP-1-Sequenz innerhalb des p21-Promotors und induziert dadurch p21. Dies führt zu einer Inhibition verschiedener CDE/CHR-regulierter Proteine wie CDC25C oder Plk1 und zu einer verzögerten Zellzyklusprogression. In diesem Zusammenhang konnte im Rahmen dieser Arbeit gezeigt werden, dass die FHL2-Expression nicht nur zu einer verlangsamten Proliferation führt, sondern auch zur Fähigkeit der Zelle zum zellmatrixunabhängigen Wachstum beisteuert. Es scheint auf den ersten Blick widersprüchlich, dass FHL2 für einen intakten G2/M-Kontrollpunkt und eine geringere Proliferationsrate sorgt, gleichzeitig aber zur Tumorentwicklung beiträgt. Es ist allerdings bekannt, dass Tumore ihr Wachstum verlangsamen bevor sie metastasieren. Auch führt ein erhöhter p21-Gehalt im Cytosol zu einer Inhibition der Apoptose, einer weiteren Eigenschaft von Tumoren. FHL2 ist daher ein signifikanter Faktor in der Onkogenese des Mammakarzinoms und aufgrund der differentiellen Expression in vielen Tumoren ein interessantes Ziel für Krebstherapien.
Visual information is processed hierarchically in the human visual system. Early during processing basic features are analysed separately while at later stages of processing, they are integrated into a unified percept. By investigating a basic visual feature and following its integration at different levels of processing one can identify specific patterns. In certain visual impairments, these patterns can function defectively and their detailed study can clarify the cause of the visual deficit. Here we investigate orientation as a basic feature and use a property of the visual system called adaptation. Adaptation occurs as a decrease in the level of neural activity during repetitive presentation of the same stimulus. Psychophysical studies have shown that adaptation transfers interocularly, meaning that if only one eye is adapted the other eye shows also adaptation effects. Our aim was to investigate interocular transfer by means of functional magnetic resonance imaging (fMRI). Even though adaptation was demonstrated in the fMRI environment, the interocular transfer was never investigated in such a setup. First, we developed a method to measure interocular transfer of adaptation to gratings with fMRI. We then went further to test it in various groups of subjects. In normally sighted humans interocular transfer was present both in early (striate) as well as later visual areas (extrastriate). In subjects with impaired stereovision (with or without normal visual acuity) interocular transfer was absent in the investigated regions. Detailed analysis of the recorded differences between subjects with and subjects without stereovision was performed. The results of this analysis are presented in detail in this book. These results suggest that the neuronal mechanisms involved in the interocular transfer of pattern adaptation share, at least in part, the neural circuitry underlying binocular functions and stereopsis. We conclude that fMRI adaptation can be used for the assessment of cortical binocularity in humans with normal and impaired stereopsis. Further investigations are needed to address more subtle aspects of the lack of interocular transfer. Towards this purpose, through a fourth experiment we propose further directions that might shed more light on the issue of stereovision and its clinical implications. We show that carefully tuned variations in our experimental procedure might reveal other aspects of binocularity in the human visual system. We believe that the method we developed, apart from the interesting results shown here, has a high potential to be further used for other research questions. Following the above summarized ideas, the thesis comprises of three parts (chapters). The first chapter provides the main theoretical backgrounds of the visual system and of the MRI imaging technique, chapter two describes the experimental procedures while the results and their detailed discussion are detailed in chapter three.
Ferrocenbasierte Polymere stellen interessante Verbindungen dar. Sie weisen herausragende optische und/oder elektronische Eigenschaften auf, die sich auf die redoxaktiven Eisenionen sowie die kooperativen Effekte entlang des Polymerstrangs zurückführen lassen. Befindet sich Ferrocen in der Hauptkette und sind die Ferrocenbausteine jeweils über ein einzelnes Atom miteinander verbunden, so ist dieses Brückenelement maßgebend für die substanzspezifischen Merkmale des Makromoleküls. Während bereits effiziente Syntheserouten bekannt sind, auf denen sich Atome der Gruppen 14 bis 16 in die Brücke einführen lassen, bereitet die Synthese borverbrückter Poly(ferrocenylene) große Schwierigkeiten. Gerade diese Stoffklasse wäre aber besonders attraktiv, da Boratome sowohl dreifach als auch vierfach koordiniert vorliegen können und über diese Eigenschaft das Ausmaß der elektronischen Wechselwirkungen entlang des Polymerrückgrats ebenso wie die Struktur des Makromoleküls gezielt beeinflussbar ist. Vor diesem Hintergrund galt es im Rahmen der vorliegenden Arbeit, chemisch stabile Poly(ferrocenylene) mit tetrakoordinierten anionischen Boratbrücken darzustellen. Als Grundlage diente die Adduktbildung zwischen lewissauren 1 ,1'-fc(BRz)zDerivaten und dem lewisbasischen doppelt deprotonierten Ferrocen 1,1 '-fcLi2 x 2/3 TMEDA. Frühere Untersuchungen an BMez-verbrückten di- (35) und tri nuklearen (36) Ferrocenkomplexen haben gezeigt, dass diese Verbindungen extrem empfindlich gegenüber Luft und Feuchtigkeit sind. Auch mussten cyclovoltammetrische Messungen an 35 bzw. 36 bei tiefen Temperaturen (-78 Oe) durchgeführt werden, um zu verhindern, dass es zu einer Zersetzung der Moleküle im Zuge der Fe{fI)Oxidation kam. Im Rahmen dieser Arbeit sind Systeme dargestellt worden, bei denen die labilen BMe2-Gruppen durch BPh2- bzw. Borafluorenylbrücken ersetzt sind. An mononuklearen Verbindungen konnten (Diphenylboryl)ferrocen 57, 1, 1'MBis(diphenylboryl) ferrocen 58 und 9-Ferrocenyl-9-borafluoren 61 isoliert und voIlständig charakterisiert werden (Abb. 53). ....
Im Rahmen dieser Arbeit wurde die Eignung von Pseudorezeptoren im virtuellen Screening untersucht. Hierzu wurde nach intensiver Auseinandersetzung mit bisher bekannten Konzepten ein neues Computerprogramm zur automatischen Konstruktion von Pseudorezeptormodellen entwickelt. Das Ziel von Pseudorezeptoren ist die Konstruktion eines alternativen, artifiziellen Wirtssystems aus bekannten Liganden eines Zielproteins, dessen dreidimensionale Struktur unbekannt ist. Der generierte Pseudorezeptor ist zu verstehen als die Menge aller Pseudoatome, die um die Ausgangssubstanz(en) projiziert werden. Bei multiplen Referenzliganden wird eine Gewichtung der Pseudoatome durchgeführt. Zudem wird ausschließlich von Distanz- und Winkelparametern Gebrauch gemacht, die aus Untersuchungen von Kokristall-strukturen gewonnenen wurden. Eine abschließende Kodierung generierter Pseudorezeptoren als 90-dimensionalen Korrelationsvektor wurde zum virtuellen Screening eingesetzt. In zwei retrospektiven Fallbeispielen wird gezeigt, dass die generierten Pseudorezeptoren für COX-2 und PPARα mit den realen Zuständen ihrer kokristallisierten Bindetaschen in den PDB Einträge 6cox und 2p54 kompatibel sind. Im retrospektiven virtuellen Screening in der Wirkstoffdatenbank COBRA (8.311 Moleküle) nach COX-2 Inhibitoren (136 Aktive) konnte eine Anreicherung der aktiven Strukturen in den ersten zwei Perzentilen gezeigt werden (54% der Aktiven). Zudem konnten 80% der aktiven Moleküle bereits nach Vorhersage von 10% Falsch-Positiven gefunden werden. Im Falle des retrospektiven Screenings nach 94 PPAR Liganden konnten 30% der aktiven Moleküle nach der Vorhersage von 10% Falsch-Positiven entdeckt. Nach 20% Falsch-Positiver wurden 46% der PPAR Liganden wieder gefunden. Weiterhin konnte mit den ligandenbasierten Informationen eines H4 Pseudorezeptors eine Justierung einer potentiellen Bindetasche des Histamin H4 Rezeptors aus einer molekularen Dynamiksimulation vorgenommen werden. Schließlich wurde in einem prospektiven virtuellen Screening nach Histamin H4 Liganden mit einem Pseudorezeptor zwei Strukturen mit unterschiedlichem Grundgerüst und einem Ki ~ 30 µM identifiziert.
Azidothymidin (AZT) wird seit Jahren zur Behandlung der HIV-Infektion im Rahmen von Kombinationstherapien verwendet. Unklar ist, ob Unverträglichkeiten oder Therapieversagen unter AZT auf zu hohe bzw. zu niedrige Medikamenten-konzentrationen im Körper der Behandelten zurückgeführt werden können. Untersuchungen der AZT Serum- und Urinkonzentrationen erfassen nur kurze Zeitfenster. Der Nachweis von Substanzen im Haar erlaubt dagegen die Beurteilung der mittleren Substanzkonzentrationen über längere Zeiträume. Es sollte geklärt werden, ob AZT ins menschliche Haar eingebaut wird und ob damit ein besseres Therapiemonitoring möglich ist. Hierzu wurden die Haare und der Urin von mit AZT behandelten HIV-positiven Patienten untersucht. Die Haare wurden entweder mittel Epilation gewonnen oder post mortem asserviert. In 320 Experimenten wurden zahlreiche Präparationsmethoden sowie chromatographische Verfahren (Flüssig-Flüssig-Chromatographie, Säulenchromatographie, Dünnschichtchromatographie, HPLC) eingesetzt. Während AZT im Urin reproduzierbar quantitativ nachweisbar war, gelang dies in keiner einzigen Haarprobe. Mittels eines AZT-RIA wurde AZT im Haar nachgewiesen (n=15; 16,54 – 461,7 ng/ml (Minimum – Maximum), 108 ± 144 ng/ml (X ± SD), Median 33,1 ng/ml). Da dieses Verfahren aber auch niedrige AZT-Konzentrationen in den Haarproben unbehandelter Kontrollen anzeigte (n=11; 0,77 – 32,6 ng/ml, 8,7 ± 11,9 (x ± SD); Median 1,3), war auch diese Methode ungeeignet. Daraufhin wurden die Haare von 10 HIV-positiven, mit AZT behandelten Patienten nach internationalen Richtlinien entnommen und asserviert. Es erfolgte eine Aufteilung in 4 cm Segemente. Diese wurden 3 mal gewaschen (Wasser, Aceton, Petroleumbenzin). Die Haare wurden im Ultraschallbad bei 50° C methanolisch extrahiert. Die Derivatisierung erfolgte mit N-Methyl-ter-butyldimethyl-silyltrifluor(o)acetamid. Die Proben wurden mittels Gaschromatographie-Massenspektrometrie (SIM-Modus) untersucht. Es zeigte sich, dass in allen Proben in den proximalen Segmenten (0-4 cm) AZT quantitativ nachweisbar war (0,11 – 2,0 ng/mg (Minimum – Maximum), 0,8 ± 0,53 ng/ml (X ± SD), Median 0,67 ng/mg). Es fand sich keine Korrelation zwischen der Tagesdosis und der AZT Menge im Haar. Dagegen bestand eine signifikante Korrelation zwischen der AZT-Tagesdosis bezogen auf das Körpergewicht und der AZT Konzentration im Haar (r2=0,55, p=0,0017). Diese Untersuchungen zeigen, dass AZT mittels GC/MS quantitativ im menschlichen Haar nachweisbar ist. In den proximalen 4 Zentimetern besteht dabei ein linearer Zusammenhang zwischen der auf das Körpergewicht bezogenen Tagesdosis (mg/kg) und der AZT Konzentration im Haar (ng/mg). Ob ein Therapiemonitoring möglich ist, könnte durch die Analyse kürzerer Haarsegmente geklärt werden.
Ziel der vorliegenden Arbeit war es, zwei unterschiedliche regenerative Therapieverfahren, nämlich Emdogain® (SMP) und Emdogain® in Kombination mit Straumann BoneCeramic® (SMP/SBC), anhand von prä- und postoperativen, standardisierten Röntgenbildern auf ihre röntgenologisch sichtbare Defektauffüllung von ein- und zweiwandigen infraalveolären Defekten hin zu vergleichen. In fünf über Deutschland verteilten Zentren wurden in einer randomisierten, kontrollierten Doppelblindstudie 68 Patienten therapiert, 33 Fälle mit SMP allein und 35 mit SMP/SBC. Die präoperativen und postoperativ nach einem Zeitraum von zwölf Monaten erstellten Röntgenbilder wurden mittels Flachbettscanner digitalisiert und mit dem Programm SIDEXIS® ausgewertet. Zur Vermeidung von Fehlinterpretationen wurde die Vorgehensweise des Untersuchers zur Bestimmung der Messwerte vor der Studie anhand von 20 Röntgenaufnahmen einer anderen Studie auf den Leiter der Untersuchung kalibriert. Bestimmt wurden die Messstrecken Schmelz-Zement-Grenze /Restaurationsrand (SZG/RR) zum Defektboden (DB), SZG/RR zum Limbus alveolaris (LA) sowie INFRA. INFRA stellt die Distanz zwischen DB und einer horizontalen Hilfslinie durch den koronalsten Punkt des Alveolarfortsatzes (M3) dar. Schließlich wurde der Defektwinkel (< M3-DB-SZG/RR) bestimmt. Der durchschnittliche Knochenabbau (SZG/RR-DB) der mit SMP/SBC operierten Defekte lag vor der Therapie bei 9,77 ± 3,19 mm und der nur mit SMP behandelten Defekte bei 10,07 ± 2,47 mm. Zwölf Monate nach Therapie konnte eine 13,9 %ige knöcherne Defektauffüllung für Emdogain® allein und 18,1 % für die Kombinationstherapie ermittelt werden. Bezogen auf die infraalveoläre Komponente (INFRA) ist in der Kombinationsgruppe eine 37 %ige (2,19 ± 2,21 mm) und in der SMP-Gruppe eine 26 %ige (1,49 ± 1,89 mm) knöcherne Defektauffüllung erreicht worden. Innerhalb einer Gruppe war die Defektwinkelvergrößerung im Vergleich mit den Ausgangswerten statistisch signifikant, im Gruppenvergleich jedoch nicht. Eine unabhängige statistische Analyse der Ergebnisse mit Hilfe des Wilcoxon- und Mann-Whitney-U-Tests konnte in beiden Gruppen eine statistisch signifikante, wenn auch geringe knöcherne Veränderung des Limbus alveolaris sowie eine Defektwinkelvergrößerung belegen. Diese wurden als Zeichen einer Defekt füllenden, knöchernen Heilung gewertet. Des Weiteren wurde anhand einer multiplen Regressionsanalyse der Einfluss der einzelnen Variablen auf die knöcherne Auffüllung untersucht, wobei sich zeigte, dass die präoperative Größe des infraalveolären Defektes (INFRA) sich statistisch signifikant positiv auf die Defektauffüllung auswirkt. Ein signifikanter Vorteil der Kombinationstherapie gegenüber der alleinigen Anwendung von Emdogain® konnte nicht nachgewiesen werden. Abschließend muss erwähnt werden, dass röntgenologische Studien zur Bewertung regenerativer Verfahren nur als Teilaspekt gewertet werden können. Als Beweis für eine echte Regeneration im Sinne einer Neuformation von Zement, parodontalem Ligament und Knochen sollten röntgenologische Auswertungen mit klinischen Ergebnissen und histologischen Untersuchungen kombiniert werden.
Drogendealer stehen auf der Beliebtheitsskala unserer Gesellschaft nicht gerade auf einem der vorderen Ränge. Im Gegenteil: Drogendealer sind böse, von vielen verachtete und gehasste Menschen. Niemand möchte Drogendealer als Nachbarn haben, keiner ihnen im Dunkeln begegnen. Von Eltern sind sie meist genauso gefürchtet wie Sexualstraftäter. Drogendealer – so sagt der Volksmund – verführen die armen, unschuldigen Kinder unserer Gesellschaft zu Drogen, bringen sie auf die so genannte schiefe Bahn und – noch viel schlimmer – sind dafür verantwortlich, dass die Kinder zu abhängigen, willenlosen Geschöpfen werden, zu Versagern. ...
Ionenkanäle bilden therapeutische Schlüsselstellen für viele Erkrankungen und sind daher vor allem für die pharmakologische und medizinische Forschung von herausragender Bedeutung. Der Forschungsbedarf ist enorm und dementsprechend groß auch die Nachfrage nach elektrophysiologischen Systemen, die eine Analyse von Ionenkanälen und/oder Wirkstoffen im Hochdurchsatz erlauben. Derzeitige Hochdurchsatzsysteme basieren zumeist auf modifizierten Patch-Clamp-Verfahren, weisen aber im Vergleich zu manuellen Patch-Clamp-Systemen noch einige Nachteile auf. In der vorliegenden Arbeit wurde daher im Rahmen eines vom Bundesministerium für Bildung und Forschung geförderten BioChancePlus-Projektes eine alternative Methode, die Fakir-Methode, entwickelt und ihre Einsatzmöglichkeit in Hochdurchsatzsystemen evaluiert. Bei der Fakir-Methode werden Zellen in einem inhomogenen, elektrischen Wechselfeld mit Hilfe dielektrophoretischer Kräfte zu Metallnanoelektroden hin beschleunigt, aufgrund ihrer Bewegungsenergie von letzteren penetriert und dadurch elektrisch kontaktiert. Dies ermöglicht die anschließende, intrazelluläre Messung in physiologischer Lösung. Im Vergleich zur Patch-Clamp-Methode hat die Fakir-Methode die Vorteile, dass das Zytoplasma der Zelle erhalten bleibt und dass mit einer geringen Zelldichte gearbeitet werden kann. Auf der anderen Seite polarisiert die Elektrode schnell und die genaue, intrazelluläre Zusammensetzung während der Messung ist nicht bekannt. Für die Realisierung der Fakir-Methode im Experiment wurde eine Mikrofluidikkammer mit austauschbaren Metallmikro- und Metallnanoelektroden- Chips entwickelt, die die mikroskopische Beobachtung des Kontaktierungsprozesses ermöglichte. Die Charakterisierung der Elektroden erfolgte sowohl durch Potentialmessungen als auch mit Hilfe von Impedanzspektroskopie. Um die dielektrophoretische Attraktion von Zellen genauer steuern zu können, wurde zudem ein Amplitudenmodulator entwickelt. Zellen konnten sowohl einzeln, als auch in Gruppen kontaktiert werden. Intrazelluläre Potentialmessungen von HEK293-Zellen, die den blaulichtgesteuerten Kationenkanal Channelrhodopsin-2 (ChR2) exprimierten, zeigten, dass mit Hilfe der Fakir-Methode von Membranproteinen verursachte Spannungsänderungen gemessen werden können. Beim Fakir-Modell auftretende Schwierigkeiten wurden analysiert und die Ergebnisse genutzt, um ein Konzept für eine hochreproduzierbare Herstellung von Nanoelektroden-Arrays unter Verwendung der 2-Photonenpolymerisations- Technolgie (2PP) zu entwerfen. Für den Einsatz als Biosensoren sind große Zellen besonders geeignet. Eine effektive Vergrößerung von Zellen kann durch die Multi-cell-Elektrofusion erreicht werden. Diese Art der Herstellung von Riesenzellen ist insbesondere deshalb so interessant, weil die Elektrofusion problemlos in ein automatisiertes Mikrofluidiksystem eingebunden werden kann. Neben HEK293-Zellen konnten nach Entwicklung geeigneter Protokolle für die Herstellung von Protoplasten auch Saccharomyces cerevisiae und Pichia pastoris zu Riesenzellen elektrofusioniert werden. Solche Riesenzellen wurden im Rahmen dieser Arbeit biophysikalisch charakterisiert. Neben Kapazitätsmessungen zeigten sowohl die Expression von YFP in den Membranen als auch die Verwendung von fluoresceinhaltiger Patch-Clamp- Pipettenlösung, dass es sich bei den Riesenzellen um einheitliche Kompartimente handelte und somit die gesamte Membranfläche für elektrophysiologische Experimente zur Verfügung stand. Vergleichende Patch-Clamp-Messungen von ChR2-exprimierenden Ursprungs- und Riesenzellen ergaben nicht nur, dass das überexprimierte Protein auch nach der Elektrofusion noch funktional war, sondern auch, dass die Expressionsdichte unverändert blieb. Damit bilden elektrofusionierte Riesenzellen weit über ihre Einsatzmöglichkeiten in Hochdurchsatzsystemen hinaus ein vielversprechendes Werkzeug, um zum Beispiel elektrogene Membranproteine mit geringer Stromamplitude nachzuweisen oder in der giant-inside-out- Konfiguration elektrophysiologische Messungen durchzuführen. Lipophile Anionen können eingesetzt werden, um die elektrischen Eigenschaften der Membranen zu verändern und die Zellstabiliät während des Elektromanipulationsprozesses zu verbessern. Daher wurde für vier verschiedene lipophile Anionen die Spannungsabhängigkeit der Erhöhung der spezifischen Membrankapazität in Patch- Clamp-Experimenten mit HEK293-Zellen analysiert.
Im Rahmen dieser Arbeit werden die Ergebnisse der laparoskopischen Cholezystektomie anhand verschiedener Qualitätsmerkmale überprüft. In die Analyse der Ergebnisse sind ausschließlich Patienten eingegangen, die sich einer isolierten Operation der Gallenblase unterzogen haben. Patienten, bei denen die Cholezystektomie im Rahmen eines großen abdominellen Eingriffs erfolgte, waren ausgeschlossen. Als Grundlage dienten die Auswertungen von 624 Patienten, die bezüglich Indikationsbestimmung, Bluttransfusion, Verweildauer, eingriffsspezifischen Komplikationen, postoperativen Komplikationen, Reintervention und Letalität untersucht wurden. Die erhobenen Befunde wurden im Kontext zu bestehenden Studien und Daten analysiert, um so die Qualität der laparoskopischen Cholezystektomie zu bestimmen. Die gewonnenen Ergebnisse der medizinischer Kennzahlen ermöglichen uns eine wertvolle Standortbestimmung, die in den entsprechenden Bereichen zu belegbaren Verbesserungen der Versorgung führen können. Es wird zunehmend erkannt, dass die Diskussion über die Gestaltung medizinischer Prozesse auf der Basis von Ergebnissen medizinischer Kennzahlen sehr wichtig ist. Dabei ist nicht nur die Aufdeckung von „Schwächen“ ein Antrieb zur Qualitätsverbesserung. Die Orientierung an den „Besten“ im Sinne eines Benchmarking kann ebenfalls wichtige Impulse für eine verbesserte Versorgungsqualität geben. Sieht man die erhobenen Ergebnisse in ihrer Gesamtheit (d.h. Qualitätsberichte), so lassen auffällige Gesamtraten eines Qualitätsindikators und die Kenntnis der Analysen ein Versorgungsproblem im jeweiligen Leistungsbereich erkennen. Studien zur Versorgungsforschung und klinische Forschungsprojekte können in Kenntnis der Ergebnisse zielgenauer geplant und durchgeführt werden. Berufsverbände und wissenschaftliche Fachgesellschaften sind so in der Lage, durch Entwicklung oder Weiterentwicklung von Leitlinien die klinische Praxis in problematischen Bereichen gezielt zu beeinflussen. Die erhobenen Klinikwerte stehen im Vergleich zu allgemeinen Referenzwerten und zeigen in den Jahren 2001 - 2004 nahezu konstante Werte. Die Komplikationsrate (Galleleck 0,4-1,5%, Wundinfektion 1,3-1,8%, Pankreatitis 0,3%, Blutung 0,2-1,4%) ist bei der laparoskopischer Cholezystektomie geringer als bei der offenen Cholezystektomie. Die Rate der Gallengangsverletzung zeigt im Vergleich zur konventionellen Cholezystektomie eine verfahrensunabhänig niedrige Rate (0,2-0,4%). Voraussetzung für eine dem Ausmaß der Verletzung entsprechende Therapie ist eine exakte Einteilung, wie sie unter Anderem von Siewert, Strasberg und Neuhaus entwickelt wurde. Des Weiteren ist die Zeit bis zur Diagnosestellung einer Gallengangsverletzung entscheidend, um so die Kurz- bzw. Langzeitschäden dieser Verletzung zu minimieren. In der Asklepios Klinik Langen kam es in dem Untersuchungszeitraums in einem Fall zu einer Gallengangverletzung. Diese wurde durch eine Hepaticojejunostomie behoben. Zwischen der Cholezystektomie und der Diagnose der Gallengangverletzung lagen 2 Tage. Postoperativ nach laparoskopischer Cholezystektomie wurde der Patient durch zunehmenden Ikterus und steigende Cholestaseparameter auffällig. In der ERCP zeigte sich eine komplette Durchtrennung des DHC (Typ D nach Einteilung von P.Neuhaus et al.). Es wurde eine frühzeitige Hepaticojejunostomie durchgeführt. Der postoperative Aufenthalt, zunächst auf unserer interdisziplinären Intensivstation und später auf Normalstation gestaltete sich unkompliziert. Wie auch in unserem Fall beschrieben werden die besten Ergebnisse nach frühzeitiger definitiver Versorgung erreicht. Gleiches gilt für die Rate der postoperativen Komplikationen, die 2001-2004 zwischen 1,5-3,2% unter den entsprechenden Referenzwerten lag. Der Wert der Konversionsrate von 3 % liegt zum einen unter den Referenzwerten, zum anderen unter dem in der Literatur von 7 % angegebenen Wert. Die wichtigen Aussagen bezüglich der Komplikationen, die letztendlich einen entscheidenden Einfluss auf die Mortalität der Patienten haben, zeigen im Vergleich zu den Werten für Gesamthessen und im Vergleich mit internationalen Daten konstant gute Werte. Nach Auswerten der Daten und im Vergleich zu internationalen Ergebnissen, zeigt sich eine gute Qualität in der Behandlung der akuten Cholezystitis. Die laparoskopische Cholezystektomie stellt weiterhin den Goldstandard in der in der operativen Therapie dar, bedarf jedoch der kritischen Beobachtung und Bewertung von extern.
Ein früherer Vorschlag zum Reaktionsmechanismus der DFPase, der eine Wasseraktivierung durch den Rest H287 postulierte, mußte nach neuen experimentellen Daten verworfen werden. Daher lag zu Beginn der hier vorliegenden Arbeit kein Vorschlag für den Mechanismus der DFPase vor, der die experimentellen Daten erklären konnte. Für das längerfristige Ziel, die katalytischen Eigenschaften der DFPase gezielt verändern zu können, war es daher notwendig, zunächst den Mechanismus der Hydrolyse von Verbindungen wie DFP durch die DFPase näher zu untersuchen. Durch computergestützte Modellierung im aktiven Zentrum der DFPase (Docking) wurde die Bindung von DFP und anderen Substraten der DFPase genauer untersucht und mit vorhandenen experimentellen Daten verglichen. Diese Arbeiten führten auch zur theoretischen Untersuchung des Bindungsverhaltens von O,O-Dialkylphosphoroamidaten als potentiellen Inhibitoren der DFPase. Diese den Dialkylfluorophosphaten strukturell sehr ähnlichen Substanzen werden durch die DFPase nicht umgesetzt. Die Ergebnisse der Dockinguntersuchung führten schließlich zu der Synthese von drei Phosphoroamidaten unter der Untersuchung ihres Verhaltens als Inhibitoren der DFPase. DIe Charakterisierung erfolgte dabei über enzymkinetische Methoden sowie NMR-Experimente. Mit dem stärksten Inhibitor O,O-Dicyclopentylphosphoroamidat gelang die Kristallisation eines Komlexes mit der DFPase, der mit der Methode der Röntgenbeugung strukturell bestimmt werden konnte. Dieser Komplex belegt die Bindung der Phosphorylgruppe von Substraten an das katalytisch wirksame Calciumion im aktiven Zentrum der DFPase und zeigt die vorherrschenden Bindungskräfte zwischen Ligand und Protein auf. Eine Reihe von Mutanten der DFPase, bei denen gezielt die koordinierenden Aminosäuren des katalytischen Calciumions verändert wurden, ergänzte die bereits in früheren Arbeiten erzeugten Mutanten. Die katalyischen Eigenschaften dieser Mutanten und ihre Fähigkeit zur Metallbindung gestatten es, diese Metallbindungsstelle genauer zu beschreiben und lassen zusammen mit den Dockingexperimenten und der Struktur des Inhibitor-Enzymkomplexes vermuten, dass der calciumkoordinierende Aminosäurerest D229 als aktives Nukleophil im Reaktionsmechanismus der DFPase fungiert. Diese Vermutung ließ sich mit experimentellen Daten untermauern. Durch 18O-Isotopenmarkierung konnte gezeigt werden, dass ein Sauerstoffatom von D229 auf das entstehende Produkt übertragen wird. Hierdurch konnte die Existenz eines Phosphoenzymintermediats nachgewiesen werden. Des weiteren gelang es, Kristalle der DFPase zu züchten, die für Neutronenbeugungsexperimente geeignet waren. Im Rahmen dieser Experimente gelang die Aufnahme eines vollständigen Datensatzes und die Lösung der Neutronenbeugungsstruktur der DFPase in einer Auflösung von 2,2 Å. Diese Neutronenstruktur, in der Wasserstoffatome im Unterschied zu Röntgenstrukturen gut sichtbar sind, zeigt eindeutig, dass der Rest D229 wie erforderlich deprotoniert und dass das in der Bindungstasche an das Calciumion koordinierende Wassermolekül nicht als Hydroxid vorliegt. Damit ließ sich die direkte Aktivierung von Wasser durch das Metallion ausschließen. Neben wichtigen Informationen über die Bindungstasche der DFPase lieferte die Neutronenstruktur auch detaillierte Einblicke in das Wasserstoffbrückennetzwerk im zentralen, wassergefüllten Tunnel des Proteins. Über die Bestimmung des Wasserstoff/Deuteriumaustausches von Proteinrückgradamiden konnten weitere Aussagen über die Solvenszugänglichkeit von verschiedenen Proteinbereichen gemacht werden. Für die DFPase konnten strukturell und funktionell ähnliche Proteine identifiziert werden. Neben der Paraoxonase 1 waren dies das Calciumbindeprotein Regucalcin aus Agrobacterium thumefaciens sowie das Drug Resistance Protein 35 aus Staphylococcus aureus. Es konnte gezeigt werden, dass diese Proteine eine der katalytischen Calciumbindestelle der DFPase vergleichbare Metallbindestelle aufweisen und verschiedene Enzymaktivitäten dieser Proteine durch einen Mechanismus mit einem zu D229 analogen Nukleophil erklärt werden können. Ein direkter Vergleich zwischen der DFPase und der humanen Paraoxonase gelang durch Untersuchungen mit fluorogenen Organophosphaten als Substrate. Hierbei konnte zum ersten Mal gezeigt werden, dass die DFPase in der Lage ist, Substrate mit einer P-O Bindung hydrolytisch zu spalten. Die unterschiedlich gute Umsetzung der verschiedenen Substrate durch die beiden Enzyme konnte auf der Grundlage der Proteinstrukturen erklärt werden, wobei für die Paraoxonase postuliert wurde, dass der calciumbindende Aminosäurerest D269 als zu D229 analoges Nukleophil wirkt. Abschließend gelang es, zusätzlich eine Zusammensetzung für eine Enzympräparation zu finden, die eine Gefriertrocknung der DFPase mit nur geringem Verlust an enzymatischer Aktivität erlaubt. Ein solches lagerstabiles Enzympulver ist ein notwendiger Schritt hin zu einer praktischen Anwendung der DFPase für die technische Dekontamination von hochtoxischen Nervenkampfstoffen.
IL-18 ist ein proinflammatorisches Zytokin mit tumorsuppressiven Eigenschaften. Daher befindet es sich derzeit in klinischen Studien der Phase II zur Behandlung immunsensitiver Tumore. Erste Ergebnisse dieser Studien sind vielversprechend, zumal IL-18 im Vergleich zu beispielsweise IL-1Beta und IL-12 eine hohe Verträglichkeit im Menschen aufweist. Die Ergebnisse dieser Arbeit zeigen, dass IL-18 nicht nur in soliden Tumoren, sondern auch in leukämischen Zellen wie AML-Zellen zur Expression eines Genmusters führt, welches hohes antileukämisches Potential aufweist. Diese Erkenntnis wurde mittels einer Microarray-Analyse gewonnen und in unabhängigen Versuchen überprüft. Zu den hochregulierten Genen gehören neben IFNY und Fas-Ligand die in der vorliegenden Arbeit untersuchten angiostatischen Chemokine IP10 und I-TAC sowie EBI3, die Beta-Kette des heterodimeren Zytokins IL-27. Da die Regulation des humanen EBI3-Gens bislang schlecht charakterisiert war, schloss sich eine Promotoranalyse des humanen EBI3-Promotors an. Diese brachte hervor, dass zwei NFKB-Bindungsstellen des Promotors für die Expression von EBI3 unter dem Einfluß von proinflammatorischen Zytokinen unabdingbar sind. Der humane Promotor wurde dabei in dieser Arbeit zum ersten Mal im humanen Kontext betrachtet. Weiterhin konnte zum ersten Mal gezeigt werden, dass IL-27 die Fähigkeit besitzt, humane myeloisch-leukämische Zellen zu aktivieren und Signale in Form von STAT1 und STAT3-Phosphorylierung sowie Hochregulation von SOCS3- Expression zu induzieren. Interessanterweise lassen sich die potentiell tumorsuppressiven Eigenschaften von IL-18 in Bezug auf KG1 Zellen durch eine Zugabe von Zink verstärken. So kommt es unter dem Einfluß von Zink zu einer Verstärkung der Expression von IFNY und EBI3. Dieser synergistische Effekt besitzt allgemeinere Gültigkeit, da die hier durchgeführten Experimente an humanen PBMC zeigten, dass eine Erhöhung des extrazellulären Zinkgehalts um den Faktor 2 im Vergleich zu dem physiologisch zugänglichen Zinkgehalt im Blutplasma zu einer Potenzierung der Freisetzung von IFNY durch die proinflammatorischen Zytokine IL-1Beta, IL-18 und IL-12 führt. Diese Ergebnisse waren besonders in Bezug auf IL-1Beta unerwartet und tragen ihren Anteil zum Verständnis der erhöhten Sensibilität von Leukozyten unter zinksupplementierten Bedingungen bei. Weitere Studien werden zeigen, ob eine Therapie mit IL-18 und möglicherweise auch in Kombination mit Zink eine alternative Option bei AML Patienten bietet, die besonders responsiv auf dieses Zytokin reagieren.
In den letzten 25 Jahren HIV-Forschung wurden einige Medikamente entwickelt, die in der Lage sind, den Ausbruch der Krankheit AIDS hinauszuzögern. Als Gemeinsamkeit dieser Arzneimittel ist die Interaktion mit regulatorischen Proteinen des HIV-Lebenscyclus zu erwähnen. In den letzten Jahren intensivierte sich jedoch auch die Forschung auf RNA als Angriffsort für Wirkstoffe, da sie in zahlreichen biochemischen Prozessen involviert ist. Aufgrund der vielfältigen Sekundär- und Tertiärstruktur der RNA bietet sie Bindungsstellen für Proteine, Antibiotika und weitere kleine Moleküle. Die Affinität zwischen RNA und dem Liganden, z.B. einem Peptid, basiert auf Wasserstoffbrücken, Coulombschen Kräften und Stapelwechselwirkungen. Das Konzept dieser Arbeit bestand darin, peptidische RNA-Liganden zu entwickeln, die u.a. aufgrund von Stacking mit den Nucleobasen der RNA eine starke Bindung eingehen. In Anbetracht der Tatsache, dass lediglich vier unterschiedliche natürliche aromatische Aminosäuren existieren, wurden Synthesewege entwickelt, um eine Vielfalt nicht-natürlicher Bausteine zu gewährleisten. In diesem Projekt wurden (L)-Methionin bzw. (L)-Glutaminsäure als chirale Ausgangsverbindungen, in Abhängigkeit von der benötigten Seitenkettenlänge (C2 für Met, C3 für Glu), verwendet. Der Schlüsselschritt in beiden Syntheserouten ist mit der Heck- bzw. Negishi- Kupplung eine Übergangsmetall-katalysierte C-C-Knüpfungsreaktion. Auf beiden Wegen konnten in zehn Stufen Fmoc-geschützte -Aminosäuren dargestellt werden. Diese Bausteine wurden zusammen mit natürlichen Aminosäuren zu peptidischen Bibliotheken aufgebaut, die entweder über kombinatorische oder parallele Festphasensynthese hergestellt wurden. Über homogene Assays wurden die besten RNA-Binder identifiziert. In ersten Experimenten wurden ausgewählte Peptide auf ihre Affinität zum TAR-Element von HIV-1 untersucht. Ein Farbstoff-markiertes Tat-Peptid wurde in dieser Anwendung vom Test- Liganden verdrängt. Alternativ konnte über die Fluoreszenz der Pyren-Peptide eine direkte Bestimmung von Bindungskonstanten erfolgen. Mit dem Tripeptid 172 (IC50 = 900 nM, Kd = 50 nM) konnte eine vielversprechende Verbindung identifiziert werden. In Untersuchungen mit HIV-1-infizierten HeLa-P4- (IC50 = 125 microM) bzw. MT-4-Zellen (EC50 = 46 microM) wurde die antivirale Eigenschaft von 172 bewiesen. Des Weiteren wurden u.a. für das Peptid 172 antimikrobielle Tests gegen B. subtilis (MIC = 22 microM) und S. aureus (MIC = 31 microM) durchgeführt.
Arabidopsis thaliana besitzt 21 Hitzestress-Transkriptionsfaktoren die von zentraler Bedeutung für die Aktivierung der Hitzestress-Antwort sind. Der HsfA2 ist dabei der am stärksten exprimierte Hsf und akkumuliert in der Pflanze wie andere Hitzestress- Proteine. Nach ca. einer Stunde HS ist die maximale Transkriptmenge zu verzeichnen, während das sehr stabile Protein noch mindestens 21 Stunden nach dem Stress vorhanden ist. Durch Analyse einer SALK T-DNA-Insertionslinie mit einem kompletten HsfA2-Knockout wurden Zielgene des HsfA2 identifiziert. Am stärksten ist die Ascorbat-Peroxidase 2 (APX2) betroffen, deren Transkript in Knockout-Pflanzen fast völlig fehlt. Außerdem sind sHsps, einzelne Mitglieder der Hsp70- und Hsp100-Familien, sowie Transkripte von Genen, deren Funktion noch nicht bekannt ist, reduziert. In transienten GUSReporter- Assays wurde das Aktivierungs-Potential des HsfA2 an den Promotoren der folgenden Gene bestätigt: Hsp18.1-CI, Hsp25.3-P, Hsp22.0-ER, Hsp26.5-MII, Hsp70b und Hsp101-3. Dabei zeigte sich, dass jeweils ca. 0,5kb der stromaufwärts des Startcodons liegenden regulatorischen Sequenzen zur Gen-Aktivierung ausreichen. Für den APX2-Promotor konnte durch Deletionsanalysen zudem das entscheidende HSE-Dimer identifiziert werden. In EMSAs mit rekombinanten GST-Fusions-Proteinen wurde die spezifische Bindung des HsfA2 hier bestätigt, während eine Mutante HsfA2(R98A) nicht mehr an die DNA bindet. Mit Proteinextrakten aus hitzegestresster Arabidopsis-Zellkultur konnte die Bedeutung dieses HSE-Dimers für die Bindung endogener Faktoren im Hitzestress ebenfalls nachgewiesen werden. Auch für die oben genannten Hsps sowie Hsp17.4-CI, Hsa32 und die zwei unbekannten Proteine At1g0370 und At4g21320 konnte die DNA-Bindung des GST-HsfA2 im EMSA gezeigt werden. In der vorliegenden Arbeit wurde HsfA2 erstmals als Voll-Längen-Protein untersucht. Durch Analyse von NLS-Mutanten wurde nachgewiesen, dass nur eine Hälfte der als bipartit vorhergesagten NLS funktionell ist und somit die NLS monopartit ist. Weitere Mutanten wie z.B. Deletionen von Sekundärstruktur-Elementen der DBD oder der Oligomerisierungsdomäne zeigen die Notwendigkeit dieser Bestandteile für die Funktionalität des HsfA2. Außerdem ist offenbar der N-terminale Bereich vor der DBD wichtig für die Proteinstabilität. Um die DNA-Bindungsdomänen aller 21 verschiedenen Arabidopsis-Hsfs auf ihre Bindungsfähigkeit zu untersuchen, wurden Konstrukte verwendet, die jeweils die DBD in Fusion mit dem C-Terminus des HsfA2 enthielten. Diese chimären Hsfs wurden in transienten GUS-Reporter-Assays und EMSAs untersucht. Dabei zeigte sich, dass ein Großteil der Proteine immer an die analysierten DNA-Fragmente bindet, wenn auch mit unterschiedlicher Intensität, während die A6a- und B3-DBDs dies gar nicht oder nur extrem schlecht vermochten. Durch Mutation einzelner Aminosäurereste ließ sich das zumindest für B3 verbessern. Der HsfA3 ist ein weiterer im Hitzestress induzierter Hsf. Allerdings ist sein Transkript erst nach ca. drei Stunden vorhanden und nimmt in der frühen Erholungsphase noch zu. Unter den 21 Hsfs ist er der einzige, der spezifisch durch DREB2A induziert wird. In transienten GUS-Reporter-Assays und EMSAs konnten im HsfA3-Promotor zwei DREs als Bindungsstellen des DREB2A identifiziert werden, die gleichermaßen notwendig sind. Desweiteren wurde das Aktivator-Potential des HsfA3 und fünf DREBs (1A, 1B, 1C, 2A und 2B) an potentiellen Zielgenen untersucht. Dabei konnten drei Gruppen definiert werden: A) Gene die nur durch HsfA3 induziert werden (Hsp18.1-CI, Hsp25.3-P, Hsp70b und Hsp101-3), B) Gene die hauptsächlich durch HsfA3 aber teilweise auch durch DREBs (besonders 2A und 2B) induziert werden (Hsp17.4-CI, Hsp17.6-CII, Hsp26.5-MII und GolS1) und C) Gene die nur durch DREBs induziert werden (RD29A, COR47 und KIN1). In dualen Reporter-Assays wurde die Transkriptionskaskade DREB2A -> HsfA3 -> Hsp bestätigt. Die direkte DNA-Bindung der DREBs bzw. des HsfA3 an den Promotoren wurde in EMSAs nachgewiesen und für Hsp26.5-MII und Hsp18.1-CI durch Kartierung auf kleine Bereiche eingegrenzt. Aus der Literatur ist bekannt, dass HsfA1a/A1b konstitutiv exprimiert werden und ebenfalls Einfluß auf viele Hitzestress-Gene besitzen. So lässt sich spekulieren, dass diese bereits in der frühen Hitzestress-Phase die Induktion der HS-Antwort regulieren könnten, während HsfA2 die Expression von HS-Genen verstärkt und HsfA3 später möglicherweise für die volle Ausprägung der Thermotoleranz wichtig ist.
Die juvenile idiopathische Arthritis (JIA) ist eine Autoimmunerkrankung und die häufigste chronisch-rheumatische Erkrankung im Kindes- und Jugendalter. Erhöhte Spiegel des proinflammatorischen Zytokins Interleukin-18 (IL-18) spielen bei chronisch-entzündlichen Erkrankungen eine pathogenetische Rolle. Im Promotor des IL-18 befinden sich in den Positionen -607 (C/A) und -137 (G/C) Einzelbasen-Mutationen, die die Bindung von Transkriptionsfaktoren beeinflussen können. Diese Polymorphismen konnten in vitro die Transkription des IL-18-Gens und die Expression des Proteins verstärken und sind somit möglicherweise in der Lage, die Empfänglichkeit für oder den Verlauf von Erkrankungen wie der JIA zu verändern. In dieser Arbeit wurde untersucht, ob bestimmte Allele, Diplo- oder Genotypen der IL-18-Promotor-Polymorphismen bei Patienten mit JIA gehäuft auftreten. Zu diesem Zweck wurden die Blutproben von 60 Patienten und 134 gesunden Kontrollpersonen mittels sequenzspezifischer PCR auf das Vorliegen der Polymorphismen getestet. In der Literatur existieren für die Assoziation der JIA und anderer chronischentzündlicher Erkrankungen zu IL-18-Promotor-Polymorphismen unterschiedliche Angaben. Werden Assoziationen gefunden, so deuten sie in Bezug auf den -607-Locus darauf hin, dass -607 AA protektiv wirkt, -607 CC aber eine Krankheitsempfänglichkeit vermittelt. Den -137-Locus betreffend sind die Ergebnisse widersprüchlicher. Viele Studien zeigen bezüglich beider Polymorphismen keinerlei Assoziation. In dieser Studie konnte eine Krankheitsassoziation weder für die Allel- noch die Diplotyp- oder Genotyp-Häufigkeiten nachgewiesen werden, ebenfalls nicht für einzelne Genotypenkombinationen. Anzunehmen ist, dass die erhöhten IL-18-Spiegel bei chronisch-entzündlichen Erkrankungen nicht allein auf Einzelbasen-Mutationen zurückgehen, sondern durch Wechselwirkungen innerhalb eines komplex geregelten biologischen Systems zu Stande kommen. Ein Ansatz, der allein auf die Auswirkungen der Polymorphismen auf Genebene abzielt, ist möglicherweise zu kurz gefasst.
Helicobacter pylori (H. pylori) ist ein spiralförmiges, gram-negatives und mikroaerophiles humanpathogen. Seit seiner ersten Isolierung 1983 gilt H. pylori als eine der häufigsten Ursachen für entzündliche Prozesse des gastrointestinalen Traktes (u.a. chronische, sowie atrophische Gastritis und Ulzera). Darüber hinaus kann es gastrale Adenokarzinome und Lymphome des MALT (mucosa-associated lymphoid tissue)-Systems induzieren. Einige H. pylori-Stämme besitzen eine Gruppe von ungefähr 30 Genen, die als cag-Pathogenitätsinsel (cagPAI) bekannt ist. Diese Stämme sind häufig mit Magenschleimhautentzündungen, Geschwürbildung und einem erhöhtem Risiko von Magenkrebs verbunden. Die Gene der cagPAI kodieren für ein Typ IV-Sekretionssystem (T4SS), das Protein- Effektor-Moleküle in die Wirtszelle transloziert. In dieser cagPAI befindet sich ebenfalls das Gen für den Pathogenitätsfaktor CagA (cytotoxin associated gene A). Dieses Protein ist, neben Peptidoglykan, eines der beiden bisher bekannten Moleküle, die vom T4SS transportiert werden. In der Zielzelle wird CagA von Kinasen der Src-Familie an den Tyrosinen in den EPIYA-Sequenz-Wiederholungen phosphoryliert und induziert über einen wenig verstandenen Signalweg eine starke Elongierung und Migration der infizierten Epithelzellen. In diesem Zusammenhang wurde der Einfluss von c-Abl auf die zellulären Prozesse während einer Infektion mit H. pylori untersucht. Die erarbeiteten Daten zeigen deutlich, dass c-Abl ein wichtiges Zielmolekül in der H. pylori-induzierten Zellmigration ist. Durch den Einsatz von spezifischen Inhibitoren der c-Abl-Kinase konnte die Zellelongierung signifikant reduziert werden. Nach Transfektion eines shRNA-Vektors in eine humane Adenokarzinom- Zelllinie wurde eine stabile c-Abl-„Knockdown“-Zelllinie hergestellt. Infektion dieser Abl- AGS-Zellen mit H. pylori induzierte ebenfalls nicht mehr die Zellelongierung. Da wie erwartet die Blockierung der Src-Kinasen ebenfalls den H. pylori-vermittelten Phänotyp inhibierte, sollte in weiteren Experimenten geklärt werden, ob c-Abl- und Src- Kinasen ähnliche Mechanismen aktivieren, die zur Zellmotilität beitragen. Es konnte gezeigt werden, dass Src-Kinasen bereits nach 10-30 min nach der Infektion aktiviert und sehr früh nach 45-60 Minuten wieder inaktiviert wurden. In in-vitro Kinase-Experimenten konnte darüber hinaus beobachtet werden, dass c-Abl dagegen erst nach 60-90 min aktiviert wurde und anschließend über einen längeren Zeitraum aktiviert blieb. Diese unterschiedlichen Kinetiken deuten darauf hin, dass beide Kinasen in der H. pylori-Infektion differentiell reguliert werden und unterschiedliche Funktionen übernehmen. Es wurde bereits publiziert, dass Src-Kinasen CagA direkt in den EPIYA-Motiven phosphorylieren. In dieser Arbeit konnte mittels Ko-Immunpräzipitationen gezeigt werden, dass zwischen c-Abl und CagA eine stabile physikalische Interaktion induziert wird. Des Weiteren konnte gezeigt werden, dass c- Abl CagA direkt phosphoryliert und diese c-Abl-vermittelte Phosphorylierung ein wichtiger Schritt in der H. pylori-induzierten Zellmotilität spielt. Zusammengefasst kann ein Model aufgestellt werden, dass c-Abl die CagA Phosphorylierung über einen langen Zeitraum aufrechterhält und somit die frühe Inaktivierung von Src ersetzt. Die Aktivität von Proteinkinasen wird häufig über Tyrosinphosphorylierungen reguliert. Im Gegensatz zu Src wurden die in der Literatur schon für c-Abl beschriebenen Phosphorylierungsstellen Tyrosin 245 und 412 während einer H. pylori-Infektion nicht phosphoryliert. Eine Phosphorylierung von Tyrosin 245 ließ sich nur durch Stimulation der Zellen mit Natrium-Vanadat und H2O2 erzielen. Interessanterweise korrelierte die c-Abl Aktivität aber mit einer H. pylori-induzierten Zunahme der c-Abl-Proteinmenge. Da die mRNA-Menge nicht variierte, handelte es sich vermutlich um eine Stabilisierung von c-Abl im Komplex mit CagA. Anstelle der Tyrosin-Phosphorylierung konnte die Phosphorylierung von Threonin 735 während einer H. pylori-Infektion nachgewiesen werden. Die bisher nur in geringer Anzahl vorliegenden Veröffentlichungen beschreiben, dass die Phosphorylierung von Threonin 735 eine Rolle in der zellulären Lokalisierung der Kinase spielen könnte. Mit Hilfe von konfokaler Mikroskopie und subzellulärer Fraktionierung, konnte nach H. pylori- Infektion eine Translokation von c-Abl von der typischen zytosolischen Verteilung in die Fokalkomplexe nachgewiesen werden. Ein weiterer Aspekt dieser Arbeit war erste Anhaltspunkte zur Identifizierung der bis heute völlig unbekannten Kinase zu finden, die für die Phosphorylierung von c-Abl an diesem Lokus verantwortlich ist. Bemerkenswert dabei ist, dass diese Phosphorylierung unabhängig von CagA ist, aber trotzdem ein funktionierendes T4SS voraussetzt. Dies konnte durch den Einsatz von Mutationen im T4SS von H. pylori nachgewiesen werden. Dieser Befund deutet darauf hin, dass weitere Faktoren von H. pylori existieren, die über das T4SS in die Zielzellen injiziert werden und an der Regulierung von c-Abl beteiligt sind.
In-vitro-Studie zur Toxizität von Wasserstoffperoxid als Wirkstoff von dentalen Bleachingprodukten
(2008)
Fast alle derzeit angebotenen Bleichmittel basieren auf der Wirkung von Wasserstoffperoxid (H2O2). Während die aufhellende Wirkung und die Wirkungen auf die Zahnhartsubstanz und Restaurationen von Bleichmitteln sehr intensiv wissenschaftlich untersucht wurden, gibt es weitaus weniger Untersuchungen, die die Nebenwirkungen von H2O2 auf das Weichgewebe und die Zellen untersuchen. Ziel dieser In-vitro Studie war es, die Zytotoxizität von H2O2 in verschiedenen Konzentrationen und Einwirkzeiten zu untersuchen. Dies erfolgte quantitativ an Zellkulturen humaner Gingivafibroblasten und qualitativ an histologischen Schnittpräparaten humaner Gingiva, die H2O2 in unterschiedlichen Einwirkzeiten und unterschiedliche Konzentrationen ausgesetzt wurden. Im Zellkulturversuch konnte gezeigt werden, dass H2O2 ab einer Konzentration von 5% und ab einer Einwirkzeit von 15 Sekunden zu einer signifikant höheren Anzahl an toten Zellen führte, als die Kontrollgruppe. Die zytotoxische Wirkung von H2O2 war auch nach einer vierundzwanzigstündigen Erholungsphase der Zellen nicht reversibel. Die histologischen Schnittpräparate zeigten destruktive Veränderungen durch 10%iges und 30%iges H2O2 im Binde-und Fettgewebe der Dermis, das Epithel und das Stratum basale blieben unversehrt. Obwohl die Ergebnisse dieser In-vitro Studie nicht direkt auf In-vivo Verhältnisse übertragbar sind, liefern sie einen Beleg für das Gefahrenpotential von H2O2. Von der Anwendung von H2O2 ab Konzentrationen von 5% ohne ärztliche Aufsicht ist abzuraten.
Schwerpunkt der vorliegenden Arbeit war die Formulierungsentwicklung eines nanopartikulären Arzneistoffträgers für Zytostatika zur Gewinnung einer „Drug Targeting“ Zubereitung. Im Fokus der Arbeit stand dabei die Stabilität der unterschiedlichen Zubereitungen. Die untersuchten Partikel waren dabei auf Basis von humanem Serumalbumin. Mittels einer etablierten Desolvatationsmethode ließen sich reproduzierbar Nanopartikel im Größenbereich von 200 nm herstellen. Zur Partikelgrößenbestimmung bediente man sich sowohl der hotonenkorrelationsspektroskopie (PCS) als auch der Analytischen Ultrazentrifugation (AUZ). Bei der Untersuchung verschiedener HSA-Chargen, stellte sich heraus, dass das Ausgangsmaterial einen Einfluss auf die Partikelgröße besaß. Nichtsdestotrotz waren die Partikelgrößenschwankungen aufgrund von unterschiedlichen HSA-Chargen gering. Durch Einlagerung von Doxorubicin in die Partikelmatrix kam es zu einer wesentlichen Partikelvergrößerung, so dass die resultierten Partikel eine Größe von etwa 400 nm aufwiesen. Die Inkorporation des Arzneistoffs in die Partikelmatrix war reproduzierbar und stabil. Auch der Einsatz von Serumalbumin aus rekombinanter Quelle erwies sich als geeignet um Nanopartikel herstellen zu können. Allerdings waren unbeladene Partikel aus diesem Material wesentlich größer als Nanopartikel, die aus dem Standardmaterial hergestellt wurden. Doxorubicinbeladene Partikel zeigten wiederum eine vergleichbare Größe wie Partikel aus HSA. Allerdings war die Beladung der rHSA-Nanopartikel geringer als die der SA-Nanopartikel. Dies zeigte sich besonders bei der geringeren Quervernetzung von 40%. Als Fazit lässt sich sagen, dass prinzipiell eine Herstellung von sowohl Leerpartikeln als auch Doxorubicin-beladenen Partikeln möglich war. Die Biodegradierbarkeit von Nanopartikeln ist eine wichtige Voraussetzung für einen therapeutischen Einsatz kleinpartikulärer Strukturen, damit diese nicht im Körper kumulieren. Zudem könnte bei nicht abbaubaren Partikeln die Idee der intrazellulären Freigabe des eingebetteten Arzneistoffs aus der Partikelmatrix nicht verwirklicht werden. Vorversuche haben gezeigt, dass sich Nanopartikel auf Basis von HSA mit einer Reihe von Enzymen abbauen lassen. Versuche, Nanopartikel aus rHSA enzymatisch abzubauen, führten zu vergleichbaren Abbaukinetiken wie bei Partikeln aus HSA. Zu den eingesetzten nzymen zählten Proteinase K, Protease, Trypsin, Pankreatin, Pepsin und Cathepsin B, die mit Partikel aus rHSA mit den Quervernetzungen 40, 60, 80 und 100% inkubiert wurden. Alle Abbaukinetiken zeigten dabei, dass die Abbaugeschwindigkeit vom Grad der Quervernetzung abhängig war. 40% quervernetzte Nanopartikel wurden am schnellsten, 100% quervernetzte Partikel am langsamsten enzymatisch degradiert. Die Abbauversuche mit Cathepsin B bei zwei verschiedenen pH-Werten zeigten, dass die Wahl des richtigen pH-Werts entscheidend für einen effektiven Abbau ist, denn nur bei einem pH-Wert von 5,4 wurden die Nanopartikel von Cathepsin B abgebaut. Im Gegensatz dazu, wurden die Nanopartikel bei pH 6,4 kaum degradiert. Des Weiteren wurden Beladungsversuche von HSA-Nanopartikeln mit Cisplatin durchgeführt. Dabei wurden im ersten Schritt Adsorptionsversuche an gelöstes HSA durchgeführt, da viele Arzneistoffe eine hohe Plasmaeiweißbindung besitzen, wenn sie sich im Blutkreislauf des Menschen befinden. Diese Tatsache sollte bei der Herstellung von arzneistoffhaltigen Nanopartikel auf Basis von humanem Serumalbumin ausgenutzt werden. Vor dem eigentlichen Desolvatationsprozess wurden gelöstes HSA und Cisplatin bei unterschiedlichen pH-Werten und für unterschiedliche Zeitintervalle inkubiert, um eine Adsorption des Cisplatins an das Protein zu erreichen. Dadurch soll es bei der anschließenden Desolvatation zu einer effektiveren Inkorporation des Arzneistoffs kommen. Die Ergebnisse haben gezeigt, dass bei sauren pH-Werten die Adsorption schwächer ausfällt als bei einem pH-Wert von 8,0. Zudem war die Adsorption umso ausgeprägter, je länger die Inkubation stattfand. Bei einem pH-Wert von 8,0 führten steigende Konzentrationen an eingesetztem Cisplatin bei konstanter Menge an HSA, zu höheren Konzentrationen an adsorbiertem Arzneistoff. Prozentual gesehen, führten aber zunehmende Mengen an eingesetztem Cisplatin zu geringeren Adsorptionsraten. Als Fazit muss aber festgehalten werden, dass Cisplatin eine geringe Tendenz zur Adsorption an gelöstes HSA zeigte. Die Herstellung von Cisplatin-beladenen HSA-Nanopartikeln zeigte, dass die Desolvatation bei pH 8,0 zu guten Ergebnissen führte. Zum einen wiesen die erhaltenen Nanopartikel gute physikochemische Eigenschaften mit nahezu quantitativen Partikelausbeuten auf, zum anderen besaßen die Partikel eine hohe Beladungseffizienz. Dabei galt, je höher die eingesetzte Menge an Cisplatin war, umso mehr Cisplatin wurde in die Matrix der Partikel eingelagert. Die Dauer der zuvor stattfindenden Adsorption spielte dabei eine eher untergeordnete Rolle im Vergleich zu den Adsorptionsversuchen. Eine Erklärung für diese Beobachtung könnte sein, dass die Zugabe des Desolvatationsmittels Ethanol, in welchem Cisplatin sehr schwer löslich ist, zu einer verstärkten Interaktion zwischen Arzneistoff und Protein führt und diese Komponenten zusammen ausfallen, nahezu unabhängig von der zuvor stattfindenden Adsorptionsphase. Um die Idee einer „Drug Targeting“ Zubereitung umsetzen zu können, wurden mit Hilfe von Polyethylenglykol-Ketten sowohl Leerpartikel als auch arzneistoffbeladene Nanopartikel auf ihrer Oberfläche mit monoklonalen Antikörpern modifiziert. Als Verum wurde dabei Trastuzumab verwendet, als Kontrolle diente ein IgG-Antikörper von Sigma, der kein Target besitzt. Sowohl eine adsorptive Bindung als auch die kovalente Kopplung der Antikörper an die Oberfläche der nanopartikulären Strukturen konnte reproduzierbar durchgeführt werden. Dabei spielte es keine Rolle, ob die Partikel mit Arzneistoff beladen waren oder nicht. Trastuzumab zeigte ein hohes Maß an adsorptiver Bindung an die Oberfläche von HSA-Nanopartikeln, die bei dem Kontollantikörper nicht festgestellt werden konnte. Von allen Partikelpräparationen wurden die Partikelgröße, die Größenverteilung, das Zetapotential und die Partikelausbeute bestimmt. Durch das Aufbringen neuer Oberflächenstrukturen, kam es zu keiner wesentlichen Veränderung der Partikelgröße bzw. der Oberflächenladung. Durch die zahlreichen Umsetzungsschritte, die für eine Oberflächenmodifikation nötig sind, kam es bei Nanopartikeln ohne Arzneistoffbeladung zu einem Verlust an Partikelausbeute. Da die Doxorubicin-beladenen Partikel viel größer waren als Leerpartikel, ließen sie sich einfacher und effektiver abzentrifugieren, was in einem geringeren Partikelausbeuteverlust sichbar wurde. Da die Gefriertrocknung zu den Standardmethoden zählt Zubereitungen eine gute Haltbarkeit zu verleihen, wurden eine Reihe von nanopartikulären Zubereitungen der Lyophilisation unterzogen und im Hinblick auf ihre Langzeitstabilität unter verschiedenen Lagerungsbedingungen getestet. Dabei stellte sich heraus, dass es mittels Gefriertrocknung möglich war aus HSA-Nanopartikelsuspensionen einfach und reproduzierbar Lyophilisate herzustellen. Als geeignete Hilfsstoffe kristallisierten sich dabei die Zucker Sucrose, Trehalose, der Zuckeralkohol Mannitol und Emulgatoren wie Tween® 80 und Pluronic® F68 heraus. Als ungeeignet zeichnete sich der Einsatz von L-Arginin und eines Natriumphosphat-Puffers pH 8,0 ab. Larginin führte schon vor dem Gefriertrocknen zu einer Partikelvergrößerung, die nach der Lyophilisation noch ausgeprägter war. Puffer auf Basis von Natriumsalzen führen zu einem starken pH-Shift während des Gefriertrocknungsprozesses. Dies führte beim Einsatz des Phosphat-Puffers pH 8,0 zu einem starken Partikelwachstum. Gefriertrocknungsprozesse mit unterschiedlichen Geräten haben gezeigt, dass der Zusatz von Sucrose bzw. Trehalose oder Mannitol ab einer Konzentration von 2% (m/V) zu guten physikochemischen Eigenschaften der rekonstituierten Proben führte. Hilfsstoffkombinationen, wie sie in der Literatur beschrieben sind, waren für die Stabilisierung der nanopartikulären Strukturen nicht nötig. Die Langzeitlagerungsstabilitätsdaten der gefriergetrockneten HSA-Nanopartikel über 13 Wochen bei unterschiedlichen Temperatur- und Luftfeuchtigkeitsbedingungen zeigten eine Überlegenheit der Hilfsstoffe Sucrose und Trehalose im Vergleich zu Mannitol. Als geeignete Hilfsstoffkonzentration stellte sich hier ein 3%iger (m/V) Zusatz heraus. Versuchsansätze mit unterschiedlichen Gefriertrocknern und somit unterschiedlichen Prozessen zeigten, dass nicht nur die Auswahl der Hilfsstoffe, sondern auch die Bedingungen des Gefriertrocknungsprozesses Einfluss auf die Lagerungsstabilität hatten. Ein kontrollierter Prozess zeigte sich dabei gegenüber dem schnellen Einfrieren mittels Stickstoff als überlegen. Von Nanopartikelsuspensionen mit den Hilfsstoffen Trehalsoe, Sucrose und Mannitol wurden die Glasübergangstemperaturen bestimmt. Die Ergebnisse deckten sich im Wesentlichen mit den in der Literatur beschriebenen Daten, so dass schlussgefolgert werden kann, dass die HSA-Nanopartikel keinen wesentlichen Einfluß auf die Glasübergangstemperatrur hatten. Zusätzlich wurde die Restfeuchte der Lyophilisate direkt nach der Gefriertrocknung und nach 13 wöchiger Einlagerungszeit bestimmt. Die Proben wiesen direkt nach dem Prozess eine Restfeuchte von ungefähr 3% auf, durch Lagerung der Partikel bei erhöhter Luftfeuchtigkeit kam es zu einem Anstieg des Wassergehalts in den Proben. Mit den Hilfsstoffzusätzen Trehalose, Sucrose und Mannitol ließen sich auch Doxorubicin-beladene HSA-Nanopartikel gefriertrocknen. Dabei kam es nach der Rekonstitution dieser Partikel zu keinem Austreten des eingelagerten Arzneistoffs. Zusätzlich wurden oberflächenmodifizierte Partikel lyophilisiert. Dabei bestand die Modifikation zum einen aus Methoxypolyethylenglykol-Ketten. Zum anderen wurden über NHS-PEG-Mal Crosslinker kovalent monoklonale Antikörper auf die Oberfläche von HSANanopartikeln gebunden. Zusätzlich wurden auch HSA-NP in Suspension einer Untersuchung bezüglich Langzeitlagerungsstabilität unterworfen. Dabei wiesen auch HSA-Nanopartikel in Suspension bei verschiedenen Einlagerungsbedingungen eine hohe Stabilität auf. Partikel, die über einen Zeitraum von 210 Tagen eingelagert wurden, zeigten bei den Temperaturen 4°C, 20°C und 30°C im Hinblick auf Partikelgröße und Polydispersität kaum Veränderungen. Die Lagerung der Nanopartikel bei Minusgraden führte allerdings zu Mikropartikeln. Bei der Untersuchung der Partikelüberstände hinsichtlich herausgelöstem HSA zeigte sich, dass je höher die Lagerungstemperatur und je länger die Einlagerung war, umso mehr HSA löste sich aus der mittels Glutaraldehyd fixierten Matrix heraus. Bei den eingefrorenen Partikeln löste sich über die gesamte Lagerungszeit kein Protein aus den Nanopartikeln heraus. Zellkulturexperimente zeigten, dass im Gegensatz zu Kontrollzubereitungen, Nanopartikel, die an ihrer Oberfläche therapeutisch wirksame Antikörper trugen, spezifisch von Krebszellen aufgenommen wurden und im Zellinneren den eingebetteten Arzneistoff freisetzten. Daraus resultierte eine spezifische Toxizität dieser Zubereitungen gegenüber Tumorzellen. Dies ist ein erster Ansatz, um zeigen zu können, dass durch nanopartikuläre Trägersysteme die unerwünschten Nebenwirkungen der unspezifisch wirkenden Zytostatika reduziert werden können. In weiteren Versuchen, vor allem mit Hilfe von in vivo Versuchen muss gezeigt werden, dass das Partikelsystem stabil genug ist, ausreichend lang im Körper zirkulieren zu können. Nur so ist das Trägersystem in der Lage, sein Zielgewebe zu erreichen. Zudem müssen Tierversuche die in der Literatur beschriebene Anreicherung des Partikelsystems im Tumorgewebe verifizieren. Dies ist nur möglich, wenn die Nanopartikel in der Lage sind, das Gefäßsystem im Bereich des Tumorgewebes zu verlassen und anschließend in die Tumormasse einwandern können. Nur dann können die in den Zellkulturversuchen gezeigten Effekte greifen.
In dieser Arbeit wurden Interaktionen zwischen Tumorzellen und Fibroblasten und die Rolle von MMPs auf Tumorwachstum und Invasion untersucht. Die Studien erfolgten in dem in vitro Modell der organotypischen Zellkulturen, in dem eine Haut-ähnliche Situation rekonstruiert wird. Hierbei wachsen maligne Epithelzellen auf einer extrazellulären Matrix (Kollagen Typ I) in enger Nachbarschaft zu hierin eingebetteten Fibroblasten und bilden ein mehrschichtiges Epithel. Dabei sind Epithelien von malignen Keratinozyten durch ein Fehlen einer definierten Struktur und Polarität charakterisiert. Im HaCaT-Tumormodell konnte der essentielle Beitrag des Tumorstromas zur Tumorprogression nachgewiesen werden da eine Steigerung der Malignität von HaCaT-Tumorzellen bis hin zur Metastasierung nur durch Wachstum in der in vivo Umgebung der Nacktmaus nicht aber durch Selektion in vitro induzierbar war. In der vorliegenden Arbeit wurden humane Fibroblasten und ihre Interaktion mit den prämalignen HaCaT Zellen in vitro analysiert. Interessanterweise, kam es nur in der Anwesenheit von Fibroblasten zu einer Kollagengel-Degradierung. Diese Beobachtungen gingen mit einer Expressionsänderung von MMPs sowie von angiogenen Faktoren, wie VEGF und PDGF, einher. Ferner zeigte sich, dass in der OTK in der Abwesenheit von Fibroblasten MMP-2 geringer exprimiert wurde und vorwiegend in den oberen Zellschichten des Epithels zu detektieren war. Parallel dazu konnte in diesen Zellschichten eine gesteigerte Proliferationsaktivität nachgewiesen werden. In Anwesenheit von Fibroblasten jedoch wurde MMP-2 vorgefunden. Die Kollagengel-Degradierung in der Anwesenheit der Fibroblasten korrelierte auch mit einer verringerten TIMP-1/TIMP-2-Expression. Die geringe TIMP-2-Expression führt zu einem Anstieg von MMP-2, welches direkt den Prozess der Kollagengel-Degradierung in der OTK fördert. TIMPs spielen nicht nur in die Regulation der MMP Expression sondern auch in der anderer Wachstumsfaktoren, wie VEGF und PDGF, eine Rolle. Während wir in der OTK keinen Zusammenhang zwischen einer VEGF- und TIMP-Expression detektieren konnten, wurde PDGF in der OTK in der Abwesenheit der Fibroblasten stärker exprimiert. In Folge einer MMP-Inhibition mit einem MMPI (Ro28-2653) der selektiv MMP-2/MMP-9 hemmt, konnte die Kollagengel-Degradierung aufgehalten werden. Nach der Behandlung mit Ro28-2653 wurden die Expression der Proteine MMP-1/MMP-2 signifikant herrunterreguliert. Dagegen war eine Verringerung der MMP-9-Expression nur zu Beginn der Behandlung detektierbar. In der OTK wurde zusätzlich initial VEGF in Folge einer MMP-Inhibition herunterreguliert. Ab der dritten Woche war die VEGF-Expression in behandelten und unbehandelten Proben vergleichbar hoch. PDGF wurde zunächst herunterreguliert, später ab der zweiten Woche signifikant hochreguliert. PDGF ist in der Lage eine TIMP-1-Expression zu induzieren. In der OTK trifft dies für TIMP-1 und TIMP-2 zu. ECM und BM Degradierung sind eine der Vorraussetzungen für Gefäßsprossung. Es kam in vivo bei malignen HaCaT-ras-A-5RT3-Tumoren in Folge einer MMP-Inhibition (Ag3340) zu einer Induzierung der Gefäßreifung und der Zerstörung kleiner, unreifer Blutgefäße. Zusätzlich ließ sich mit MRT und Hochfrequenzsonographie eine Reduzierung der Tumorgröße; des relativen Blutvolumens und ein Anstieg des mittleren Gefäßdurchmessers bei therapierten Tieren detektieren. Dieser Anstieg des mittleren Gefäßdurchmessers, quantifiziert mittels „Vessel Size Imaging“, unterstützt die Annahme, dass eine MMP-Inhibition vorwiegend die kleinen unreifen Gefäße zerstört. Die großen und reifen Gefäße sind gegen eine anti-angiogene Therapie resistent. Immunhistologische Analysen verifizierten diese Ergebnisse. Zusammenfassend konnte gezeigt werden, dass Fibroblasten bei der Tumorinvasion von malignen Keratinozyten eine fundamentale Rolle spielen. Nur in der Anwesenheit der Fibroblasten war eine MMP-2-Expression nachweisbar Wahrscheinlich stimulieren Tumorzellen Fibroblasten - über parakrine Mechanismen - MMP-2 zu synthetisieren. In vivo spielen MMPs und TIMPs und Wachstumsfaktoren, wie VEGF und PDGF, eine wichtige Rolle beim Prozess der Angiogenese. Dies ließ sich mit nicht-invasiver Bildgebung bei HaCaT ras A 5RT3 Tumoren unter MMP-Inhibition anhand des Nachweises einer zunehmenden Gefäßreifung und des Rückgangs der kleinen, unreifen Gefäße zeigen.
Typ 1 Diabetes mellitus ist eine Glucoseverwertungsstörung, die durch die utoimmune Zerstörung der insulinproduzierenden β-Zellen des Pankreas bedingt wird. Es wird davon ausgegangen, dass zu 40 - 50 Prozent exogene Faktoren und zu 50 - 60 Prozent genetische Faktoren an der Pathogenese beteiligt sind. Die Gene der HLA-Region sind dabei etwa zu einem Drittel an der genetischen Disposition beteiligt. HERV K18, ein HERV der im ersten Intron des CD 48 Gens auf Chromosom 1q21.2-q22 lokalisiert ist, verfügt über einen Bereich der für ein Superantigen (SAg) codiert. In Studien wurde eine Vβ7-T-Zellen-Expansion in Pankreata bei neumanifestiertem Typ 1 Diabetes mellitus nachgewiesen, die auf die SAg Wirkung des env Gens des HERV K18 zurückzuführen war. Es wurde anschliessend postuliert, dass SAg Autoimmunerkrankungen hervorrufen indem sie T-Zellen, genauer autoreaktiver CD4+ Vb17-T-Lymphozyten, aktivieren, die spezifisch für Autoantigene sind. Humane endogene Retroviren (HERV) machen 8 % des menschlichen Genoms aus und werden mit der Entstehung von verschiedenen Autoimmunprozessen in Verbindung gebracht, wie Rheumatoide Arthritis oder Multipler Sklerose. Unterschiede in der DNA-Sequenz des HERV K18 könnten eine prädisponierende Wirkung von Untergruppen des endogenen Retrovirus für eine Typ 1 Diabetesmanifestation erklären. 20 kb stromaufwärts des 5 LTREndes findet sich ein hochpolymorpher Mikrosatellitenmarker dessen Polymorphismen ebenfalls von Bedeutung sein könnten für die Entstehung von Typ 1 Diabetes mellitus. Nicht nur die mittels SAg getriggerte polyklonale Aktivierung autoreaktiver CD4+ Vb17-T-Lymphozyten könnte zu Typ 1 Diabetes mellitus führen, auch über eine Veränderung der CD48-Expression könnte es einen kausalen Zusammenhang mit der Pathogenese des Typ 1 Diabetes geben. In der Untersuchung der HERV K18-Polymorphismen fand sich bei beiden, also HERV 8594 und HERV 8914, weder in der Genotypenverteilung noch in der Transmissionsanalyse ein Hinweis für eine Kopplung mit Typ 1 Diabetes mellitus. Ebenso zeigte die Analyse des Mikrosatelliten zeigte keine signifikanten Unterschiede. Unsere Ergebnisse zeigen somit weder eine Assoziation des HERV K18, noch der ihm benachbarten Genregion mit Typ 1 Diabetes mellitus. Der zweite Teil der vorliegenden Arbeit beschäftigt sich mit einem Polymorphismus im Areal 2q33, welches immunologisch betrachtet von essentieller Bedeutung ist. Es beherbergt Gene, deren Moleküle an der Zelloberfläche exprimiert werden und die als regulierende Signale in der T-Zell- Aktivierung fungieren. Zu den wichtigsten zählen CD28, CTLA 4 sowie ICOS. CTLA 4 ist bei der Entstehung des Typ 1 Diabetes mellitus, Morbus Basedow, Hashimoto Thyreoiditis sowie Myasthenia gravis involviert. Durch die gengeographische Nähe des ICOS zum CTLA 4 besteht die Möglichkeit, dass auch ICOS mit Typ 1 Diabetes gekoppelt ist. Innerhalb des Intron 4 des ICOS befindet sich ein alter, hochkonservierter und hochpolymorpher Mikrosatellit, genannt SARA 47. In der Transmissionsanalyse fiel auf, dass das Allel 93 ausschliesslich transmittiert wurde und das Allel 95 hingegen eher retiniert wurde. Besonders deutlich wird dieser Effekt in der isolierten Betrachtung der maternalen Transmission. Hier wird vor allem die protektive Wirkung des Allels 95 deutlich. In der Kopplungsanalyse des SARA 47 mit CTLA 4 wird der Haplotyp 93-A ausschliesslich transmittiert und ist somit ein prädisponierender Faktor in der Entstehung des Typ 1 Diabetes mellitus. Die gekoppelten Haplotypen 95-G sowie 99-A hingegen wirken eher protektiv. Durch den in dieser Arbeit untersuchten Mikrosatelliten wird die Bedeutung der Region 2q33 in der Pathogenese von Typ 1 Diabetes mellitus untermauert.
Die akute myeloische Leukämie (AML) ist charakterisiert durch einen Differenzierungsblock sowie aberrante Selbsterneuerung („self-renewal“) hämatopoetischer Vorläuferzellen im Knochenmark (Grignani, 1993). Bei Patienten mit akuter Promyelozyten-Leukämie (APL), einem Subtyp der AML, bezeichnet als M3 gemäß FAB(„French-American-British“)-Klassifikation, ist dieser Phänotyp induziert durch die spezifischen Leukämie-assoziierten chromosomalen Translokationen t(15;17) sowie t(11/17). Beide involvieren einen identischen Anteil des Retinsäure-Rezeptors Alpha (RAR-Alpha) und jeweils entweder Gene der Promyelozyten-Leukämie (PML) oder promyelozytäre Zinkfinger (PLZF). Durch homologe Oligomerisierung, vermittelt durch die PCC(“coiled-coil”)-Domäne beim PML (Grignani, 1999) und die BTB/POZDomäne beim PLZF (Benedetti, 1997), formieren die Fusionsproteine PML/RAR und PLZF/RAR-Alpha in vivo HMW(“high molecular weight“)-Komplexe (Melnick, 1999). Im Vergleich zum RAR-Alpha von Wildtyp-Zellen zeigen diese erhöhte Affinität zu “Histone-Deacetylase-Recruiting-Nuclear- Corepressor”-Komplexen, was über aberrante Rekrutierung der Histon- Deazetylase zu konstitutiver Hypoazetylierung der Histone und schließlich zur Blockade der Transkription von Genen, die für eine Ausdifferenzierung von hämatopoetischen Vorläuferzellen bedeutsam sind, führt. Gegenstand der vorliegenden Dissertation ist das molekulare Targeting der Oligomerisierungsdomänen von PML/RAR-Alpha und PLZF/RAR-Alpha in vitro. Hierfür werden retrovirale Vektoren mit artifiziellen Fusionsgenen kloniert. Diese bestehen aus jeweils PCC-ABL oder POZ-ABL, welche sich aus der ABLKinase des Philadelphia-Chromosoms BCR/ABL und den spezifischen Oligomerisierungsdomänen von PML/RAR-Alpha und PLZF/RAR-Alpha zusammensetzen sowie den Peptiden PCC und POZ mit analogen Strukturen zu diesen Domänen. Fusionen der ABL-Kinase mit den Oligomerisierungsdomänen von PML und PLZF führen wie bei BCR (Beissert, 2003) zur konstitutiven ABLAktivität und vermitteln IL-3-unabhängiges Wachstum von Ba/F3-Zellen (murine Pro-B-Zelllinie). Die jeweils koexprimierten Peptide lagern sich an die analogen Proteinstrukturen von PCC-ABL und POZ-ABL an und stören deren homologe Oligomerisierung, was die IL-3-Unabhängigkeit gänzlich aufhebt. Dies wird über Wachstumskurven, Durchflusszytometrie (FACS) und Westernblot gezeigt. Folgend werden Vektoren zur Koexpression der kompletten APLcharakterisierenden Fusionsgene PML/RAR-Alpha und PLZF/RAR-Alpha zusammen mit identischen Peptiden kloniert, um mit diesen Sca1+/lin--selektionierte, murine, hämatopoetische Stammzellen zu infizieren. Deren Differenzierungsgrad wird über Zählung der Kolonien-formenden Einheiten (“Colony Forming Units” - CFUs), über deren Kolonie-Morphologie, deren Zytologie sowie Stammzell- und Differenzierungsoberflächenmarker bestimmt. Die Kontrollen mit alleiniger Expression der Fusionsproteine sowie zusammen mit vertauschten Peptiden zeigen die bekannte Morphologie von Promyelozyten, während die Koexpression der interferierenden Peptide zu deutlich akzelerierter Ausdifferenzierung führt. Eine erhöhte Replating-Effizienz durch die aberrante Fähigkeit zur Selbsterneuerung, eine typische Eigenschaften leukämischer Blasten, wird unter Einfluss interferierender Peptide nicht beobachtet. Hierfür wird ursächlich eine Störung der HMW-Komplex-Bildung beschrieben. Die Fusionsproteine PML/RAR-Alpha und PLZF/RAR-Alpha werden durch dieses Targeting über Westernblot nicht mehr nachgewiesen und somit als proteasomal degradiert angenommen. Das Vorliegen der Fusionsgene von PML/RAR-Alpha und PLZF/RAR-Alpha in den bei diesen Experimenten verwendeten Zellen kann auf RNA-Ebene über RT-PCR gezeigt werden. Zusammenfassend beschreibt die Koexpression von spezifischen Peptiden, die mit Oligomerisierungsdomänen von Fusionsproteinen, wie hier PML/RAR-Alpha und PLZF/RAR-Alpha, interferieren, einen neuen, vielversprechenden Ansatz bei der Therapie von Leukämien.
Experimentelle Analyse der auslösenden Reize für das Verhalten von Königinnen der Gattung Apis
(2008)
Bei Honigbienen werden im Rahmen der Kolonievermehrung zahlreiche junge Königinnen aufgezogen, von denen letztlich nur eine einzige pro Bienenvolk verbleibt. Die Eliminierung überzähliger Königinnen erfolgt im direkten Kampf der Königinnen gegeneinander. Dabei endet dieser Kampf zwischen zwei jungen unbegatteten Königinnen stets mit dem Tod einer Konkurrentin. Der Kampf der Königinnen ist der zentrale Mechanismus zur Sicherung der Monogynie. Diese Arbeit greift die Fragen auf, welche Reize das aggressive Verhalten der Königin auslösen und wo diese lokalisiert sind. Grundlage der Untersuchungen ist ein Biotest, in dem das Stechverhalten der Königin innerhalb einer Versuchsarena quantifiziert werden kann. Hierbei zeigte sich, dass der Ablauf des Verhaltens dem unter natürlichen Bedingungen im Bienenvolk entspricht. Das Auftreten des Stechverhaltens wurde bei Königinnen verschiedenen Alters und Fertitilitätszustandes untersucht. Es wurde gezeigt, dass das Stechverhalten bei frisch geschlüpften, begatteten und älteren Königinnen, die bereits Eier legen, vorhanden ist. Zur Untersuchung phylogenetischer Aspekte wurden die Verbreitung sowie die interspezifische Wirksamkeit der Auslöser des Stechverhaltens bei insgesamt fünf Apisarten untersucht. Hierbei zeigte sich, dass die Auslöser des Stechverhaltens über die Artengrenzen hinweg wirksam sind. Dies weist darauf hin, dass die Auslöser des Stechverhaltens phylogenetisch an der Wurzel innerhalb des Genus Apis sind. Arbeiterinnen lösen das Stechverhalten dagegen nicht aus. Es zeigte sich allerdings, dass die als Pseudoköniginnen zwischen Arbeiterinnen und Königinnen intermediären eierlegenden Arbeiterinnen der Kaphonigbienen A. m. capensis die Auslöser des Stechverhaltens besitzen und ebenso wie eine Königin mit Stechverhalten auf eine Königin reagieren. Dies weist darauf hin, dass die Auslöser des Stechverhaltens neben der Sicherung der Monogynie möglicherweise noch eine weitere Funktion besitzen, die nicht im Zusammenhang mit der Kolonievermehrung (Schwarmvorgang) steht. Im Gegensatz zu den europäischen Unterarten von Apis mellifera treten bei der in Ägypten endemischen A. m. lamarckii sehr viele Jungköniginnen auf, die sich während der Schwarmphase zunächst tolerieren. In vergleichenden Untersuchungen mit A. m. carnica Königinnen wurde der Frage nachgegangen, ob die Variabilität des Stechverhaltens und dessen Auslöser hierfür Ursache sind. Hierbei wurde deutlich, dass die Auslöser des Stechverhaltens bei A. m. lamarckii Königinnen reduziert sind. Dies kann im biologischen Kontext als eine ökologische Anpassung an die Produktion vieler kleiner Schwärme verstanden werden. Ziel weiterer Analysen war eine Charakterisierung der Auslöser durch das schrittweise Eingrenzen und die Übertragung der biologischen Aktivität. Es wurde experimentell nachgewiesen, dass antennaler Kontakt für das Auslösen des Stechverhaltens notwendig ist. Hierbei zeigte sich, dass die über Kontakt wahrgenommenen Auslöser auf den abdominalen Tergiten lokalisiert sind. Untersuchungen der Tergitoberfläche mit dem Rasterelektronenmikroskop gaben hier weitere Hinweise. Auf der Kutikula der abdominalen Tergite von frisch geschlüpften Königinnen sind Sekretprotuberanzen zu erkennen, die bei älteren Königinnen zunehmen. In diesem Bereich liegen die von Renner und Baumann (1964) beschriebenen subepidermalen Tergittaschendrüsen. Da die Auslöser des Stechverhaltens in diesem Bereich lokalisiert sind, ist zu vermuten, dass diese Sekretprotuberanzen den Tergittaschendrüsen entstammen und die Auslöser des aggressiven Verhaltens enthalten. Zum Nachweis einer chemischen Natur der Auslöser wurde ein Entfernen und Übertragen von Oberflächensubstanzen auf Attrappen untersucht. Hierbei zeigte sich, dass die Auslöser durch Abwischen der Tergite entfernt und durch Aufreiben übertragen werden können. Das Entfernen durch Extraktion sowie eine Übertragung der Auslöser durch das Auftragen von Extrakten war mit dem unpolaren Lösungsmittel n-Pentan möglich. Hierdurch wurde klar belegt, dass es sich bei den über Kontakt wahrgenommenen Auslösern des Stechverhaltens um chemische Reize handelt. Zur Eingrenzung der Komponenten wurde das biologisch aktive Extrakt durch eine präparative Gaschromatographie schrittweise fraktioniert. Anschließend wurde die biologische Aktivität dieser Fraktionen im Biotest bestimmt. Die weitere Identifikation der Komponenten in der biologisch aktiven Fraktion erfolgte durch Analyse der Massenspektren, chemische Reaktionen sowie Vergleiche mit Referenzen. Beim Vergleich der biologisch aktiven Fraktion mit den inaktiven Fraktionen wurden alle Komponenten analysiert, die ausschließlich in der aktiven Fraktion enthalten waren. Hierbei wurden die drei langkettigen Ester Hexadecyllinoleate, Hexadecyloleate und Octadecylpalmitoleate identifiziert. Diese bei Arbeiterinnen nicht vorhandenen Ester wurden ebenfalls in den Tergitextrakten von Apis florea und Apis cerana Königinnen nachgewiesen. Eine Identifikation des biologisch aktiven Isomers durch dessen Synthese und Nachweis im Biotest gestaltet sich aufgrund der Vielzahl möglicher Stereoisomere sehr aufwendig und sprengt deutlich den Rahmen dieser Doktorarbeit. Den Ergebnissen zu Folge ist davon auszugehen, dass die auf den dorsalen Tergiten der Königin nachgewiesenen langkettigen Ester Hexadecyllinoleate, Hexadecyloleate und Octadecylpalmitoleate, die den dort befindlichen subepidermalen Tergittaschendrüsen entstammen und über Kontaktperzeption von der Königin wahrgenommen werden, die Auslöser für das aggressive Verhalten zwischen Königinnen sind.
Das Bcr-Abl Onkogen kodiert für eine Nichtrezeptor-Tyrosinkinase, welche durch die aktivierte Abl-Tyrosinkinaseaktivität zur malignen Transformation hämatopoetischer Zellen führt. Bei etwa 95% der Patienten mit chronischer myeloischer Leukämie (CML) und etwa 30% der erwachsenen Patienten mit akuter lymphatischer Leukämie (ALL) läßt sich das Bcr-Abl Onkogen nachweisen. Die Bcr-Abl positive ALL zeichnet sich dabei durch eine besonders schlechte Prognose trotz intensiver Polychemotherapie aus. Mit dem Abl-Tyrosinkinaseinhibitor Imatinib steht eine kausale Therapieoption für Patienten mit Bcr-Abl positiver Leukämie zur Verfügung. Die ersten klinischen Studien begannen 1999. Dabei zeichnen sich jedoch Patienten mit CML in Blastenkrise und Patienten mit ALL durch eine hohe Rate an Therapieversagern aus. Dies betrifft sowohl das direkte Therapieversagen (sog. primäre Resistenz) als auch die frühzeitige Entwicklung von Rezidiven nach initialem Therapieansprechen (sog. sekundäre Resistenz). Das von der Leber synthetisierte Akute-Phase-Protein α1-saures Glykoprotein (AGP) bindet Imatinib mit hoher Affinität. Dies führt zur Verringerung der freien Imatinibkonzentration. Da Imatinib nur in freier Form aktiv von der Leukämiezelle aufgenommen wird, könnte die Serumkonzentration von AGP das Therapieansprechen auf Imatinib beeinflussen. Tierexperimentelle Daten konnten dies belegen. Daten bei Menschen liegen jedoch nur wenige vor. Überwiegend stammen diese Daten von Patienten mit CML in chronischer Phase, zudem sind die Ergebnisse teilweise wiedersprüchig. Ob die AGP Konzentration bei Patienten mit CML in Blastenkrise oder Bcr-Abl positiver ALL einen Einfluss auf die Wirkung von Imatinib hat, ist aufgrund fehlender Daten unklar. In dieser Arbeit konnte die Bedeutung des APG als Resistenzmechanismus und Prognosefaktor für die Behandlung von Patienten mit CML in Blastenkrise und Bcr-Abl positiver ALL sowohl in vitro als auch in vivo belegt werden. In vitro führten Patientenseren mit steigender Konzentration von AGP zu einer signifikanten Abschwächung der Wirkung von Imatinib auf die Bcr-Abl positive Zelllinie BV173. In vivo wurde der Zusammenhang zwischen der AGP Konzentration und dem Erfolg der Therapie mit Imatinib bei 42 erwachsenen Patienten mit Bcr-Abl positiver ALL (32 Patienten) bzw. CML in Blastenkrise (10 Patienten) untersucht. 25 Patienten (59,5%) erreichten unter der Therapie mit Imatinib als einziges zytoreduktives Medikament eine komplette Remission. Patienten, die eine komplette Remission erreichten, hatten signifikant niedrigere AGP Werte, als Patienten, die keine komplette Remission erreicht hatten. Ein AGP-Wert im Normbereich hatte einen positiven Vorhersagewert von 86% und eine Spezifität von 88% bezüglich des Erreichens einer kompletten Remission. Patienten mit erhöhten AGP Werten hatten verglichen mit Patienten mit normwertigen AGP Konzentrationen eine jeweils signifikant kürzere mediane Zeit bis zur Krankheitsprogression (1,5 Monate vs. 4,9 Monate), kürzere mediane krankheitsfreie Überlebenszeit (1,4 Monate vs. 4,7 Monate), kürzere mediane Gesamtüberlebenszeit (3,9 Monate vs. 16,5 Monate) sowie niedrigere Fünfjahresüberlebensrate (4% vs. 36%). Damit belegt diese Arbeit mit dem bisher größten Patientenkollektiv und dem bisher längsten Beobachtungszeitraum die Bedeutung von AGP als Prognosefaktor für die Imatinibbehandlung von Patienten mit CML in Blastenkrise und Bcr-Abl positiver ALL und liefert einen Beitrag zum Verständnis der Resistenzentstehung. Möglicherweise könnte die Bestimmung von AGP in Zukunft zur Therapiestratifizierung beitragen.
Als chronisch entzündliche systemische Erkrankung mit dominanter Manifestation an den Gelenken kann die rheumatoide Arthritis in ihrem progredienten Verlauf mit den derzeit existierenden krankheitsmodifizierenden Antirheumatika oft nicht vollständig aufgealten werden. Dies hat irreversible Knorpeldestruktion und Knochenusuren mit schwerwiegenden Einbußen der Gelenkfunktion zur Folge. In der Literatur gibt es überzeugende Hinweise auf eine wichtige Rolle der T-Zellen in der Immunpathogenese der RA, die neben verschiedenen Mechanismen der erworbenen Immunität auch matrixdegradierende Prozesse der fibroblastenartigen Synoviozyten (FLS) propagieren. Die Freisetzung proinflammatorischer Zytokine aus Makrophagen wie IL-1β, TNF-α und IL-18 führt wiederum zur Induktion der ebenfalls entzündungsfördernden T-Zell-Zytokine IL-2 und IFN-γ. Die Bedeutung von IL-17, einem anderen T-Zellzytokin, war zum Zeitpunkt der Durchführung dieser Arbeit noch nicht verstanden, und IL-23 war noch nicht entdeckt. In der vorliegenden Arbeit wurden periphere mononukleäre Zellen (PBMC) aus dem Venenblut (systemische Komponente) und der Synovialflüssigkeit (SFMC, lokale Komponente) von RA und Kontroll-Patienten (andere Formen der Arthritis) mittels Ficoll-Gradient Dichtezentrifugation separiert und die Subpopulationen von T-Zellen durch fluoreszierende Antikörper gegen die Oberflächenmerkmale CD4, CD8, CD45RA und CD45RO mittels FACS-Analyse identifiziert, um ihr Verteilungsmuster in den systemischen und lokalen Kompartimenten zu erfassen. Außerdem wurden T- Zellen bezüglich ihres Aktivierungsstatus durch Markierung mit anti-CD69-Antikörpern und das intrazelluläre Zytokinexpressionmuster (IL-2, IFN-γ, IL-10) nach Sekretionshemmung durch Monensin und anschließender Permeabilisierung der Zellen mittels Saponin auf Einzelzellniveau untersucht. Der Einfluss von autologen und allogenen FLS auf die T-Zellen hinsichtlich der oben genannten Aktivierungsparameter (CD69 und Zytokinexpression) wurde zudem in vitro an einem autologen und allogenen Kultur-System durch Koinkubation von peripheren mononukleären Zellen mit FLS von RA Patienten untersucht. Hierbei kamen FLS, die aus der Synovialmembran und aus der Synovialflüssigkeit gewonnen wurden, nach der 4. bis 5. Passage in der Langzeitkultur zum Einsatz. Eine präferentielle Akkumulation von CD45RO+ Memory T-Zellen wurde ex vivo sowohl in den Subpopulationen von CD4+ als auch CD8+ T Zellen in allen untersuchten Synovialflüssigkeiten unabhängig von der Arthritisform bzw. Grundkrankheit festgestellt. Außerdem zeigte sich sowohl bei RA- als auch bei Kontrollpatienten mit anderen Arthritisformen sowohl in den CD45RA+ naiven als auch CD45RO+ Memory CD4+ und CD8+ T-Zellen in der Synovialis im Vergleich zum Blut eine erhöhte CD69 Expression als Ausdruck eines frühen Aktivierungszustandes. Trotzdem konnte nur bei einem geringen Anteil dieser T-Zellen die Expression von IL-2 detektiert werden. Dies zeigt eine präferentielle Rekrutierung einwandernder Memory T-Helfer- und –Suppressorzellen ins Gelenk, aber eine zumeist inkomplette Aktivierung sowohl von naiven als auch von Memory T-Zellen bei RA- und Kontrollpatienten. Die Patienten mit RA und anderen Arthritisformen unterschieden sich jedoch hinsichtlich der Expression von IL-10, einem entzündungshemmenden Zytokin, und IFN-γ in den PB- und SF-T-Zellen. Hier schien vor allem die Subpopulation von CD8+ T-Zellen einen relevanten Beitrag zur gesteigerten IL-10-Expression zu leisten. Entsprechend konnte im Koinkubationsexperiment demonstriert werden, dass nur die CD8+ T-Suppressorzellen durch FLS komplett aktiviert und zu einer anhaltenden IL- , IFN-γ- und IL-10-Produktion stimuliert wurden, während FLS bei den CD4+ T-Helferzellen die Expression von IL-2 hemmten. Die Anwesenheit der Synovialisfibroblasten erzeugt somit bei den CD4+, nicht aber bei den CD8+ T-Zellen einen Anergiezustand. Daher scheinen FLS zu RA-typischen Zytokinexpressionsmustern in den CD4+ und CD8+ T-Zellen durch unterschiedliche Mechanismen (Aktivierung von CD8+ T-Zellen versus Anergie der CD4+ T-Zellen) beizutragen. Die Aktivierung von MHC-I-restringierten CD8+ T Zellen sowie die Regulation von MHC-II restringierten CD4+ T Zellen durch FLS führt zu einer Modulierung der TH1/Th2 Zytokinbalance im Sinne entzündungshemmender Regulationsmechanismen. Bei der schweren RA Synovialitis sind diese Mechanismen aber offensichtlich unzureichend, um den Entzündungsprozess effektiv zu kontrollieren.
Einleitung In einem medizinischen Notfall kann schnelles und strukturiertes Handeln für das Überleben des Patienten von entscheidender Bedeutung sein. Die hierfür benötigten Fertigkeiten sollten bereits im Rahmen der medizinischen Ausbildung erlangt und evaluiert werden. Die objektive, strukturierte klinische Prüfung (OSCE) ist ein valides und reliables Prüfungsformat zur Evaluierung praktischer Fertigkeiten. Jedoch werden in den traditionellen OSCE-Stationen nur isolierte Fertigkeiten bzw. Komponenten eines klinischen Arbeitsablaufes beurteilt. Was fehlt, ist eine valide Repräsentation der Realität in der Klinik. Doch gerade die Kompetenz, einzelne Fertigkeiten und Fähigkeiten in einen klinischen Arbeitsablauf zu integrieren, ist in der Notfallmedizin von entscheidender Bedeutung. Daher wurden im Rahmen der hier vorliegenden Studie die so genannten „Emergency Case OSCE Stations“ (ECOS) entwickelt. Hier müssen die Studierenden das komplette Notfallmanagement vom Auffinden des Patienten über die Einleitung der Primärmaßnahmen bis zur Organisation der weiteren Behandlung demonstrieren. Im ersten Teil der vorliegenden Studie wird die Durchführbarkeit der ECOS im Rahmen einer praktischen Prüfung für das Fach Notfallmedizin untersucht. Dabei soll untersucht werden, ob die ECOS eine mit den traditionellen OSCE-Stationen vergleichbare Machbarkeit, Reliabilität und Akzeptanz erreichen können. Im Jahr 2003 trat die neue Approbationsordnung für Ärzte in Kraft, durch die die medizinische Ausbildung einen stärker praxisorientierten Ansatz erhalten sollte. In der alten ÄAppO spielte das Fach Notfallmedizin eine untergeordnete Rolle mit nur wenig praktischem Training. Im Rahmen der Umsetzung der neuen ÄAppO erfuhr die Notfallmedizin durch die Einführung des eigenständigen Querschnittsbereiches Notfallmedizin eine deutliche Aufwertung entsprechend ihrer Wichtigkeit für das Überleben der Patienten. Der zweite Teil der Studie beurteilt, welchen Effekt das neue simulationsbasierte Curriculum im Fach Notfallmedizin auf die Fertigkeiten der Studierenden hat, einen Notfall zu handhaben. Methode Im ersten Teil der Studie absolvierten 45 Studierende einen 10-Stationen-OSCE-Parcours bestehend aus 6 ECOS sowie 4 traditionellen OSCE-Stationen. Sie wurden hierbei anhand einer fallspezifischen Checkliste beurteilt. Im Anschluss an jede Station sowie im Anschluss an den Gesamtparcours vervollständigte jeder Studierende einen Fragebogen, um die ECOS und traditionellen OSCE-Stationen zu evaluieren. Im zweiten Teil der Studie wurde eine kontrollierte, verblindete Untersuchung mit 44 Studierenden durchgeführt. Die Studierenden waren alle in ihrem letzten Ausbildungsjahr. 22 der Studierenden haben nach der alten ÄAppO studiert und waren somit Teil der Kontrollgruppe. Die 22 Studierenden der Interventionsgruppe absolvierten ihre medizinische Ausbildung nach der neuen ÄAppO. Das neue Ausbildungskonzept im Fach Notfallmedizin besteht aus einem simulationsbasierten Training mit theoretischen Unterrichtseinheiten, um die Algorithmen aus der Vorlesung zu wiederholen, und aus standardisierten Szenarien in einer realistischen Umgebung. Das Training basiert auf den Basic Life Support- (BLS) und den Advanced Cardiac Life Support- Kursen (ACLS) der American Heart Association sowie auf einem studentischen Bedürfnissen angepassten Advanced Trauma Life Support-Training (ATLS). Auch weitere häufige und lebensbedrohliche Notfallsituationen wurden in das Simulationstraining integriert. Die Beurteilung erfolgte anhand eines 10-Stationen-OSCE-Parcours mit einem Maximum von 4 Monaten nach Abschluss der Intervention (Simulationstraining). Alle Studienteilnehmer waren gegenüber dem Studienprotokoll verblindet. Die Prüfer und Simulationspatienten waren des Weiteren gegenüber der Gruppenzugehörigkeit der Studierenden verblindet. Ergebnisse Wir konnten in der vorliegenden Studie zeigen, dass die ECOS im Rahmen einer OSCE durchführbar sind. Auf Seiten der Studierenden und auch der Prüfer zeigte sich eine hohe Akzeptanz. Die ECOS wurden als wesentlich realistischer im Vergleich zu den traditionellen OSCE-Stationen gewertet. Die Reliabilitätsanalyse mittels Cronbachs α ergab für die ECOS eine gute Reliabilität mit 0.793. Im zweiten Teil der Studie konnten wir einen signifikant positiven Effekt des neuen Curriculums auf die Fertigkeiten und das Verhalten der Studierenden in einem Notfall nachweisen (p< 0.0001 bis p = 0.016). Schlussfolgerung Die ECOS bieten eine gute Alternative zu den traditionellen OSCE-Stationen mit einer guten Reliabilität und bieten hierbei die Möglichkeit, das Notfallmanagement der Studierenden in einem realistischen Szenario zu beurteilen. Das neue Curriculum im Querschnittsbereich Notfallmedizin verbessert erheblich die Kompetenzen der Studierenden in einem medizinischen Notfall.
In einer retrospektiven Analyse von 94 Fällen wurde unter besonderer Berücksichtigung des Kyphosewinkels eine Empfehlung zur Therapie der Spondylitis herausgearbeitet. Die Patienten waren in den Jahren 1991 bis einschließlich 1997 aufgrund einer Spondylitis an der Orthopädischen Universitätsklinik Friedrichsheim in Frankfurt am Main in stationärer Behandlung. Die Ergebnisse wurden durch Auswertung der Krankenakten, Ausmessung der Röntgenbilder und einer Nachuntersuchung von 61 Patienten im Mittel von 4,6 Jahren nach dem stationären Aufenthalt erhoben. Das Durchschnittsalter der Patienten lag bei 56 Jahren. Von 94 Fällen waren 12 spezifische und 82 unspezifische Spondylitiden. Der Erregernachweis gelang in 49% der Fälle; Staphylococcus aureus war der am häufigsten nachgewiesene Keim (46%). Mycobacterium tuberculosis wurde bei 6 Patienten kulturell (13%) und in 9 Fällen histologisch (10%) nachgewiesen. Bei der Nachuntersuchung war die Beurteilung der Schmerzfreiheit in der ventralen und dorso-ventralen Patientengruppe identisch. Beide Methoden hatten den größten Anteil an schmerzfreien Patienten. Eine neurologische Symptomatik zu Therapiebeginn hatten 25 Patienten. Am Therapieende hatte sich bei 16 Patienten die Neurologie vollständig zurückgebildet. Zu einer Teilrückbildung der Neurologie kam es in 4 Fällen, und bei 5 Patienten wurden zur Rückbildung der Neurologie keine Angaben gemacht. Die Blutsenkungsgeschwindigkeit und das C-reaktive Protein waren zu Behandlungsbeginn erhöht, und die Leukozyten lagen im Normbereich. 9 Patienten wurden konservativ behandelt. 34 Patienten wurden einer ventralen Spondylodese zugeführt und 37 Patienten wurden dorso-ventral operiert. Weitere 14 Patienten wurden von dorsal mittels Fixateur interne stabilisiert. Bei 8 der 14 Patienten wurde der Entzündungsherd von dorsal ausgeräumt, und 9 der 14 Patienten bekamen zusätzlich dorsal, dorso-lateral oder transpedikulär Knochenspäne implantiert. Die durchschnittliche Knochenspaneinbauzeit war bei den ventralen und dorso-ventralen Spondylodesen etwa gleich lang (Brustwirbelsäule 5 respektive 5,4 Monate, Lendenwirbelsäule 3,8 respektive 3,9 Monate). Die durchschnittliche radiologische Ausheilung der Spondylitis bei den dorsalen Spondylodesen und den konservativ behandelten Patienten dauerte ebenfalls etwa gleich lang (Brustwirbelsäule 6,9 respektive 7,8 Monate, Lendenwirbelsäule 4,4 respektive 5 Monate). Für die Dauer des Knochenspaneinbaus scheint eine zusätzliche dorsale Stabilisierung unbedeutend. In den Fällen, bei denen eine Ausräumung des Entzündungsherds und Knochenspanimplantation erfolgte, ließ sich eine schnellere knöcherne Ausheilung der Spondylitis erkennen. Demzufolge scheint die Herdausräumung mit konsekutiver Knochenspanimplantation wesentlich für die Ausheilung der Spondylitis zu sein. Die Durchbauungsrate der nochenspanspondylodesen lag in allen Gruppen jeweils bei 100% (vorausgesetzt ein zeitlich kompletter, radiologischer Verlauf eines Patienten lag zur Beurteilung vor). Eine intraoperative Aufrichtung der kyphosierten Wirbelkörper gelang in 71 von 85 Fällen (84%). Die größten effektiven Korrekturgewinne wurden mit der dorso-ventralen Spondylodese erzielt (Vergleich präoperativ zu follow-up). Der größte Korrekturverlust entstand in den ersten drei postoperativen Monaten. Postoperative Korrekturverluste traten bei den ventralen Spondylodesen bis zu 3 Monaten, bei den dorso-ventralen Spondylodesen bis zu 6 Monaten und bei den dorsalen Spondylodesen über 6 Monate hinaus auf. Ursache hierfür ist die noch mangelnde Tragfähigkeit des im Umbau befindlichen Gewebes. Eine Ausheilung der Spondylitis trat in allen Fällen ein. Zwei Patienten entwickelten 1 Jahr respektive 1,5 Jahre später ein Rezidiv (2%). Basierend auf den Erkenntnissen dieser Arbeit ist die dorso-ventrale Operation zur Therapie der Spondylitis zu favorisieren. Durch die ventrale Spondylodese kommt es zu einer beschleunigten Ausheilung der Spondylitis. Eine intraoperative Aufrichtung des erkrankten Wirbelkörpersegments kann die Statik der Wirbelsäule wiederherstellen respektive erhalten. Eine Progredienz der Kyphose wird damit dauerhaft verhindert. Außerdem können Schmerzen und neurologische Defizite schnell behoben werden. Mit einem Fixateur interne kann das Operationsgebiet von dorsal gesichert werden. Eine Frühmobilisation des Patienten wird ermöglicht, was im Hinblick auf Komplikationen durch Immobilisation insbesondere bei älteren oder multimorbiden Patienten wesentlich erscheint. Weiterhin erlaubt die intraoperative Probeentnahme eine Erregerbestimmung mit zugehörigem Antibiogramm und eine histologische Diagnose. Bei geringer knöcherner Destruktion kann eine alleinige ventrale Operation mit Herdausräumung und Knochenspanimplantation ausreichend sein. Eine mehrwöchige Phase der postoperativen Immobilisation sollte bei diesem Vorgehen berücksichtigt werden. Eine konservative Therapie empfiehlt sich bei Patienten, deren Ausmaß der Erkrankung (knöcherne Destruktionen) sehr gering ist, oder die aufgrund ihres Allgemeinzustands nicht operabel sind.
Ziel dieser Studie war es, ein Verfahren zur Kryokonservierung von Ovarialgewebe bei Krebspatientinnen soweit zu optimieren, dass den betroffenen Frauen vor der onkologischen Therapie eine Entnahme von Ovarialgewebe und die Kryokonservierung angeboten werden kann. Bisher durchgeführte Untersuchungen von Mitarbeitern unserer Arbeitsgruppe und auch von anderen zeigen, dass eine Kryokonservierung von Ovarialgewebe bzw. von Follikeln prinzipiell möglich ist. Nach Reimplantation in den Körper kam es bisher zu zeitweiligem Follikelwachstum in den Transplantaten. Langfristige Funktion, oder eine Schwangerschaft konnte bisher international sechs Mal erzielt werden (vgl. 4.6) Untersucht wurden Biopsate von sechs Patientinnen im Alter von 22 – 38 Jahren. Die Proben wurden nach dem Frankfurter Protokoll langsam eingefroren. Es wurden drei verschiedene Kryoprotektanden verwendet um herauszufinden, welches die besten Ergebnisse erzielt und zwar 1,2-Propandiol (PROH), Ethylenglykol (EG) und Dimethylsulfoxid (DMSO). DMSO ist der meist benutzte Kryoprotektand (Gosden et al. , 1994; Baird et al. , 1999), Q Hovatta( 2003) sagt, dass das langsame Einfrieren mit den kryoprotektanden PROH, EG und DMSO die meist etabilierte Methode sei. In der vorliegenden Arbeit wurde gezeigt, dass die Ergebnisse mit Ethylenglykol (EG) bessere Resultate erzielten, als die mit Dimethylsulfoxid. Aufgrund der Studie von Siebzehnrübl, 2000, wurde auf die schnelle Einfriermethode zugunsten der langsamen verzichtet. Die Auswertung der Proben erfolgte durch Messung der Konzentration von 17-ß Estradiol und Progesteron. Die Messungen fanden zu drei verschiedenen Zeitpunkten statt, nach drei Stunden, nach sechs Stunden und nach 24 Stunden. Der Anstieg der Konzentration in dem Zeitraum von 3 – 24 Stunden kann als Indikator für die Vitalität des Ovarialgewebes genutzt werden (vgl. Isachenko V. et al., 2002). Da die Anstiegswerte der Hormonkonzentration im Zeitraum von 3 – 6 Stunden zu nah aneinander lagen und der Zeitraum auch zu kurz war, um eine Aussage zu treffen, beruhen die Ergebnisse auf den Anstieg im Zeitraum zwischen 3 – 24 Stunden. Verglichen wurden die drei kryokonservierten Gruppen noch mit zwei Frischgewebe Gruppen, einer Kontrollgruppe und einer mitDie Anstiegswerte der ormonkonzentration für Estradiol lagen im Durchschnitt bei 5,38 pg/ml bei den kryokonservierten Gruppen. Die Frischgewebe Gruppen hatten einen durchschnittlichen Anstieg um 7,20 pg/ml. Es ist zwar ein Unterschied zu erkennen, dennoch die die Resultate bei den kryokonservierten Gruppen recht gut. Von den kryokonservierten Gruppen hat die EG-Gruppe mit einem Anstieg von 5,61 pg/ml am besten abgeschnitten. Bei den Propandiol Werten sieht es ähnlich aus. Die kryokonservierten Gruppen erzielten einen durchschnittlichen Anstieg um Faktor 2,78 und die Frischgewebe Gruppen um Faktor 5,62. Die Werte sind deutlich niedriger also die des Estradiol. Interessant zu erwähnen ist der große Unterschied beim Progesteron zwischen der Kontrollgruppe 3,09 und der FSH-Gruppe 8,15. Isachenko V. et al., 2002 haben keine signifikante Werte für die Progesteronkonzentration erhalten und daher auf die Auswertung verzichtet. Die Progesteronwerte in dieser Arbeit hingegen stimmen bedingt mit denen des Estradiol überein. Genauere Aussagen darüber könnte man sicher noch treffen, wenn die Stichprobe größer wäre. Die in dieser Arbeit beschriebenen Versuche zeigen, dass die Vitalität durch langsames Einfrieren erhalten bleibt und die besten Ergebnisse mit dem Kryoprotektanden Ethylenglykol (EG) erzielt werden. Die Methode ist einfach in die Praxis umzusetzen und scheint daher als praktikabel und sinnvoll.
This work presents a contribution to the literature on methods in search of lowdimensional models that yield insight into the equilibrium and kinetic behavior of peptides and small proteins. A deep understanding of various methods for projecting the sampled configurations of molecular dynamics simulations to obtain a low-dimensional free energy landscape is acquired. Furthermore low-dimensional dynamic models for the conformational dynamics of biomolecules in reduced dimensionality are presented. As exemplary systems, mainly short alanine chains are studied. Due to their size they allow for performing long simulations. They are simple, yet nontrivial systems, as due to their flexibility they are rapidly interconverting conformers. Understanding these polypeptide chains in great detail is of considerable interest for getting insight in the process of protein folding. For example, K. Dill et al. conclude in their review [28] about the protein folding problem that "the once intractable Levinthal puzzle now seems to have a very simple answer: a protein can fold quickly and solve its large global optimization puzzle simply through piecewise solutions of smaller component puzzles".
Methodik: Die Daten von 1553 Patienten mit Knotenstrumen, die in den Jahren 2004 und 2005 im Bürgerhospital Frankfurt am Main operiert worden sind, wurden analysiert. Patienten mit einem bereits klinisch manifestem C-Zell-Karzinom, mit einem Rezidiv oder mit einem durch ein genetisches Familienscreening (MEN 2a, MEN 2b, fCZK) entdeckten C-Zell-Karzinom wurden aus der weiteren Analyse vorerst herausgenommen und in einer gesonderten Gruppe zusammengefasst. Im weiteren Verlauf erfolgte die Aufteilung der 1553 Patienten in einen Teil, der bereits mit vorbestimmten basalen Calcitoninwerten in das Bürgerhospital überwiesen wurde und in einen anderen Teil, bei dem diese Bestimmung erstmalig im Rahmen des im Bürgerhospital routinemäßig durchgeführten Calcitoninscreenings bei Strumapatienten erfolgte. Bei beiden Gruppen wurden dann diejenigen Patienten näher betrachtet, die einen pathologischen, präoperativen, basalen Calcitoninwerte hatten. Die Grenzwerte für ein pathologisches Ergebnis wurden hierbei nach Geschlecht differenziert: für Männer galt basal 10 [ng/l], für Frauen hingegen 5 [ng/l]. Auf einen pathologisch hohen basalen Calcitoninwert folgte in der Regel bei jedem Patienten ein Calcitoninstimulationstest mit Pentagastrin (i.v. Injektion von 0,5 [mikro-g/kg Körpergewicht], Bestimmung des CT bei Minute 0, 2, 5 10, höchster gemessener CT-Wert galt als stimuliertes CT (sCT)). Hier lagen die Grenzwerte auch nach Geschlecht differenziert bei 100 [ng/l] für Männer und 50 [ng/l] für Frauen. Nach dem Ergebnis des Stimulationswertes richtete sich die Wahl der Operationsmethode: Fiel der Stimulationstest pathologisch aus, so wurde eine Thyreoidektomie (TTX) oder isthmuserhaltende Thyreoidektomie (IPTB) durchgeführt. War der Stimulationstest dagegen negativ, so wurde eine subtotale Entfernung der Schilddrüse angestrebt. Bei allen Patienten erfolgte postoperativ neben der histologischen auch eine immunhistologische Untersuchung des entfernten Schilddrüsengewebes, sowie eine erneute Bestimmung der basalen und stimulierten Serumcalcitoninwerte. Stellte sich in der Immunhistologie eine C-Zell-Pathologie heraus, so wurde bei dem betroffenen Patienten weiterhin noch eine genetische Analyse auf das Vorliegen eines MEN 2a, 2b oder familiären C-Zell-Karzinoms durchgeführt. Die statistische Analyse der Daten erfolgte rein deskriptiv. Dabei wurden das arithmetische Mittel, der Median, die Range und der Quartilabstand verwendet. Die Bestimmung einer Signifikanz war zur Beantwortung der Fragestellung nicht nötig. Ergebnisse: Von den 1553 Patienten hatten insgesamt 120 ein präoperativ erhöhtes Calcitonin. Von diesen 120 Patienten hatten 14 ein C-Zell-Karzinom, 40 eine C-Zell-Hyperplasie und 66 keine C-Zell- Pathologie. Trennt man diese Gruppe der 120 Patienten in diejenigen, die schon von extern mit einem gemessenen Calcitoninwert kamen (Gruppe A) und diejenigen bei, denen intern im Bürgerhospital im Rahmen des routinemäßigen Calcitoninscreenings erstmals der basale Calcitoninwert bestimmt wurde (Gruppe B), so entfallen auf die Externen 37 und auf die Internen 83 Patienten. Bei den externen Patienten gab es 11 C-Zell-Karzinome (30 %), 22 CZell-Hyperplasien (60 %) und vier Patienten hatten keine C-Zell-Pathologie (10 %). Bei den intern bestimmten Patienten gab es drei C-Zell-Karzinome (4 %), 18 C-Zell-Hyperplasien (22 %) und 62 Patienten hatte keine C-Zell-Pathologie (74 %). Im präoperativ erfolgten Calcitoninstimulationstest waren in der Gruppe A 27 der 36 getesteten Patienten pathologisch stimulierbar. Von den neun nicht stimulierbaren Patienten hatten 6 eine CZH und drei keine CZP. In der Gruppe B waren 14 der 57 getesteten Patienten pathologisch stimulierbar. Von den 43 nicht stimulierbaren Patienten hatten 9 eine CZH und 33 keine CZP. Bei den extern überwiesenen Patientinnen fand sich kein Fall mit einem basalen Calcitoninwert über 5 [ng/l] und unter 10 [ng/l]. Die Zahl derjenigen Patientinnen, die intern bestimmt worden sind und diese Kriterien erfüllten lag bei 39. Von diesen 39 Patientinnen hatte eine Patientin ein C-Zell-Karzinom, drei eine C-Zell-Hyperplasie und 35 hatten keine C-Zell-Pathologie. Die Kosten für die Stimulationstests, die bei diesen 39 Patientinnen mit einem niedrig pathologischen Calcitoninwert von über 5 [ng/l] aber unter 10 [ng/l] in den Jahren 2004 und 2005 angefallen sind, beliefen sich auf 2.073,60 €. Schlussfolgerung: Die Berücksichtigung der verschiedenen Normalbereiche bei der Calcitoninbestimmung von Männern und Frauen und der daraus resultierenden verschieden hohen Grenzwerte führte zu der präoperativen Diagnose von einem C-Zell-Karzinome und drei C-Zell-Hyperplasien (davon ein Indexfall) in der Gruppe der intern bestimmten Patienten, die bei den bisherigen Grenzwerten von 10 [ng/l] basal nicht aufgefallen wären. Nachteilig war eine hohe Anzahl an falsch positiven Ergebnissen bei Patienten die keine C-Zell-Pathologie aufwiesen. Die durch die differenzierten Grenzwerte entstehende finanzielle Mehrbelastung ist zwar deutlich, aber in Anbetracht der Ergebnisse vertretbar, so dass weiterhin eine Differenzierung angestrebt werden sollte.
Prädiktoren der Remission bei Patienten mit Morbus Basedow : eine Verlaufsbeobachtung über 30 Monate
(2008)
Eine Verringerung der Schilddrüsenantikörper, besonders des TSH- Rezeptor- Antikörpers, ist ein Marker für die Voraussagbarkeit einer Remission des Morbus Basedow. Auffallend ist, dass es nicht detektierbare TSH- Level in unbehandelten, sich in Remission befindlichen Patienten gibt. Die klinische Verwertbarkeit dieses Befundes ist jedoch noch nicht hinreichend untersucht. 88 Patienten mit Morbus Basedow wurden im Mittel über einen Zeitraum von dreizig Monaten beobachtet. Zu sieben verschieden Zeitpunkten wurden TSH, fT3, fT4 und die thyroidalen Antikörper gemessen. Drei dieser Zeitpunkte wurden genauer untersucht, eingeteilt in einen Anfangszeitpunkt, einen mittleren Zeitpunkt und einen Endzeitpunkt. Im zuletzt gemessenen Zeitpunkt waren 77 % der Patienten in Remission. In der Gruppe die wir nach thyreostatischer Therapie beobachteten, waren 86 % der Patienten in Remission, in der Gruppe mit L-Thyroxin behandelten Patienten wiesen 80 % der Patienten eine Remission auf. Von den Patienten, die wir unter laufender medikamentöser Therapie untersuchten, hatten 62 % eine Remission. Zu diesem Zeitpunkt bekamen die Patienten, die sich in der Gruppe nach medikamentöser Therapie befanden, im Schnitt für 12 – 18 Monate thyreostatische Medikamente. Patienten, die unter thyreostatischer Medaktion standen, erhielten im Schnitt für 12 – 24 Monate Thyrostatika. Patienten, die nun mit L-T4 behandelt werden, erhielten im Schnitt für 12 - 24 Monate vorab medikamentöse Therapie. Durchschnittliche TSH Werte bei Patienten ohne Therapie sind 1.211 mU/ml (±0.900), bei Patienten, die L-T4 erhielten, 2,255 mU/ml (±3,404) und in Patienten mit antithyroiden Medikamenten 1,695 mU/ml (±2,575). TSH- Level in der Gruppe der unbehandelten Patienten waren signifikant niedriger (p<0.05) als in den Patientengruppen, die Levothyroxin oder medikamentöse Therapie erhielten. TRAK waren signifikant niedriger in der Gruppe der Patienten nach thyreostatischer Therapie (durchschnittlich 1.64±1.55 U/l) als in der mit L-T4 behandelten Gruppe (durchschnittlich 3.578 ±6.428 U/l) oder in der antithyroidalen Gruppe (durchschnittlich 2.758 ±2.741U/l). TRAK war bei allen Patienten, die in Remission blieben, deutlich verringert. Die Patienten, die ein Rezidiv hatten, wiesen im Schnitt weiterhin einen deutlich erhöhten TRAK – Level auf. Anders als in anderen Studien observierten wir nur einen weiblichen Patienten mit undetektierbaren TSH- Level in klinischer und biochemischer Remission. Diese Patientin hatte durchgehend nicht detektierbare TRAK- Spiegel. Der sinkende TRAK während der Behandlung und auch im weiteren Verlauf scheint ein glaubwürdiger Vorhersagewert für eine Remission des Morbus Basedow zu sein. Bei unseren untersuchten Patienten in Remission stellten wir keine bedeutsame Zahl mit nicht nachweisbarem TSH- Level fest. TSH stellt keinen prädiktiven Wert für die Prognose dar. Die Höhe des TRAK – Wertes ist dagegen prognostisch verwertbar.
Ataxin-2 is a novel protein, within which the unstable expansion of a polyglutamine domain can cause Spinocerebellar Ataxia type 2 (SCA2), a neurodegenerative disease which belongs to the group of polyglutamine disorders. SCA2 is characterised by a progressive loss of neurons that first affects the cerebellum and brain stem and then may extend to other areas of the brain, like substantia nigra, motoneurons and thalamus. Several lines of research have attempted to determine therole of ataxin-2 in its normal and mutant version. Different animal models and cell culture approaches to study ataxin-2 function implicated ataxin-2 in RNA processing, embryonic development, apoptosis and cytoskeleton. However, the function of ataxin-2 still remains unclear. In this thesis, a protein interaction approach was chosen as an alternative to gain insights into the cellular function of ataxin-2. Full-length ataxin-2 was used as bait in a yeast two-hybrid screen of human adult brain cDNA. Among five candidate interactor proteins identified, two were the endophilins A1 and A3, proteins involved in vesicle endocytosis. Co-immunoprecipitation studies confirmed the association of these proteins in an endogenous complex of mouse brain. In vitro binding experiments narrowed the binding interfaces down to two proline-rich domains on ataxin-2, which interacted with the SH3 domain of endophilins A1/A3. Ataxin-2 and endophilins A1/A3 colocalised at the endoplasmic reticulum as determined by immunofluorescence microscopy of transfected cell lines, and by centrifugation fractionation studies of mouse brain. Importantly, the pattern observed in transfected cells was conserved in untransfected rat hippocampal neurons. In mouse brain, associations of ataxin-2 with endocytic proteins such as the adaptor CIN85, the ubiquitin ligase c-Cbl and also GRB2, in the last case by means of a SH3 domain array chip, were also demonstrated. GST pull-down assays showed ataxin-2 to interact directly with the SH3 domains A and C of CIN85, the C-terminal SH3 domain of GRB2, and the SH3 domain of Src, a kinase activated after receptor stimulation. Functional studies demonstrated that ataxin-2 affects endocytic trafficking of the epidermal growth factor receptor (EGFR) by reducing the EGFR internalisation after EGF stimulation. Taken together, these data implicate ataxin-2 to play a role in endocytic receptor cycling.
Humanes Perikard kann in vielen chirurgischen Bereichen zu Transplantationszwecken genutzt werden, da keine Abstoßungsreaktion beim Empfänger erfolgt und das Gewebe durch funktionelles, körpereigenes Gewebe ersetzt wird. Die Entnahme humanen Gewebes wird durch das „Gesetz über die Spende, Entnahme und Übertragung von Organen und Geweben (Transplantationsgesetz – TPG)“ und Richtlinien der European Association of Tissue Banks (EATB) geregelt. Von der EATB wurde ein Intervall von 24h nach dem Tod zur Entnahme menschlicher Gewebe festgelegt. Dieses Intervall verkürzt sich auf 12 Stunden, falls die Leiche nicht innerhalb von 4 bis 6 Stunden postmortal gekühlt wird. In der vorliegenden Arbeit wurden humane Perikardproben mit einer Zugfestigkeitsprüfmaschine bis zum Zerreißen gedehnt. Gemessen wurden die Maximalkraft beim Reißen der Probe und die prozentuale Dehnung bei einer Krafteinwirkung von 10 N. Die Ergebnisse zeigen keinen signifikanten Einfluss der Leichenliegezeit auf die biomechanischen Eigenschaften des Perikards. Die Probendicke, das Lebensalter und das Geschlecht zeigten signifikante Einflüsse auf die Reißfestigkeit des Perikards. Die höchste Reißfestigkeit konnte bei dicken Proben, bei einem jungen Alter der Verstorbenen und dem männlichen Geschlecht gemessen werden. Unter mechanischen Aspekten gibt es keine Bedenken das Intervall von 24 Stunden zu verlängern. Eine Verlängerung der Entnahmefrist würde die Anzahl potentieller Spender erhöhen und somit das Angebot humaner Gewebetransplantate steigern. Weiter wurde der Anteil vitaler Zellen in den Perikardproben mit dem Cytotoxicity detection Kit der Fa. Roche bestimmt. Hierbei wird das Gewebe in Phosphatpuffer aufgenommen und die Aktivität der Laktatdehydrogenase (LDH) im Überstand ermittelt. Durch die Bestimmung der LDH- Aktivität vor und nach Zugabe eines Zellmembranlysierenden Detergens konnte auf den Anteil vitaler Zellen einer Probe indirekt geschlossen werden. Es zeigte sich eine gute Korrelation der Leichenliegezeit mit der Anzahl vitaler Zellen im Perikard. Diese Methode könnte man zur Bestimmung der Leichenliegezeit nützen. Man hätte damit in der Rechtsmedizin ein einfaches Instrument zur Bestimmung mittlerer und längerer Leichenliegezeiten. In weiteren Untersuchungen müsste die Methode validiert und eventuell auch auf andere Gewebe ausgedehnt werden.
Die vorliegende quasiexperimentelle Studie geht der Frage nach, welche kognitiven Merkmale sich im hohen Alter als trennscharf für die Abgrenzung einer beginnenden Alzheimer-Demenz von einer Major-Depression erweisen. 186 hochaltrige Patienten, die von April 2001 bis April 2007 in einer geriatrischen Abteilung eines Akutkrankenhauses stationär aufgenommen waren, wurden nach einem bewährten Prozedere fünf Untersuchungsgruppen (Kontrollgruppe, Gruppe der Major-Depression, Gruppe der leichten kognitiven Beeinträchtigung, Gruppe der Alzheimer-Demenz und Gruppe der Alzheimer-Demenz mit einer gleichzeitig bestehenden Major-Depression) zugewiesen. Eine sich anschließende neuropsychologische Untersuchung erfasste kognitive Leistungen wie die verzögerte Reproduktion von verbalem Material, Intrusionsfehler, visuell-räumliche Leistungen, formallexikalische und semantische Wortflüssigkeitsleistungen sowie Benennleistungen. Es zeigte sich, dass kognitive Merkmale wie das mittelfristige verbale Neugedächtnis, geprüft über die verzögerte Reproduktionsrate, die semantische Wortflüssigkeit sowie visuelle Benennleistungen wirksam zwischen einer beginnenden Alzheimer-Demenz und einer Major-Depression unterscheiden. Wenig aussagefähig sind dagegen eine quantitative Analyse von Intrusionsfehlern und eine Prüfung visuell-räumlicher Leistungen mit oder ohne expliziten Sprachbezug. Das in der Literatur vielfach beschriebene spezifische kognitive Profil der Depression der deutlich verminderten exekutiven Leistungen konnte in der hier zugrunde liegenden Studie nicht nachgewiesen werden. Kognitive Plastizitätskennwerte wie Retest- oder Trainingseffekte haben sich im Funktionsbereich des Benennens als differenzialdiagnostisch nicht bedeutsam erwiesen. Auch weisen Trainingseffekte keine größere prognostische Validität auf als Retesteffekte. Interessanterweise konnten bei Alzheimer-Patienten im Funktionsbereich des Benennens erwartungskonträre Retest- und Trainingseffekte nicht unerheblichen Ausmaßes gefunden werden. Diese sind auf weitgehend erhaltene perzeptive Priming-Effekte zurückzuführen und weisen bei Alzheimer-Patienten auf Lernressourcen hin, die rehabilitativ genutzt werden sollten. Verminderte konzeptuelle Priming-Effekte deuten auf eine beginnende Alzheimer-Erkrankung hin, was der Differenzialdiagnostik eine neue Perspektive eröffnet. Da ein zufälliges, gemeinsames Auftreten der beiden Krankheitsbilder Major-Depression und beginnende Alzheimer-Demenz nicht auszuschließen ist, bleibt trotz einer sorgfältigen evidenzbasierten Diagnostik insbesondere bei älteren oder hochbetagten Patienten die Abgrenzung von einer beginnenden Alzheimer-Demenz und einer Major-Depression schwierig.
Synchronized neural activity in the visual cortex is associated with small time delays (up to ~10 ms). The magnitude and direction of these delays depend on stimulus properties. Thus, synchronized neurons produce fast sequences of action potentials, and the order in which units tend to fire within these sequences is stimulusdependent, but not stimulus-locked. In the present thesis, I investigated whether such preferred firing sequences repeat with sufficient accuracy to serve as a neuronal code. To this end, I developed a method for extracting the preferred sequence of firing in a group of neurons from their pair-wise preferred delays, as measured by the offsets of the centre peaks in their cross-correlation histograms. This analysis method was then applied to highly parallel recordings of neuronal spiking activity made in area 17 of anaesthetized cats in response to simple visual stimuli, like drifting gratings and moving bars. Using a measure of effect size, I then analyzed the accuracy with which preferred firing sequences reflected stimulus properties, and found that in the presence of gamma oscillations, the time at which a unit fired in the firing sequence conveyed stimulus information almost as precisely as the firing rate of the same unit. Moreover, the stimulus-dependent changes in firing rates and firing times were largely unrelated, suggesting that the information they carry is not redundant. Thus, despite operating at a time scale of only a few milliseconds, firing sequences have the strong potential to provide a precise neural code that can complement firing rates in the cortical processing of stimulus information.
Die Komplementarität der molekularen Oberflächen und der Pharmakophorpunkte ist ein verbreiteter Konzept im rechnergestützen Moleküldesign. Diesem Konzept folgend wurde die Software SQUIRREL neu entwickelt und in der Programmiersprache Java implemetiert. Die Software generiert die Vorschläge für den bioisosteren Ersatz von Molekülen und Molekülfragmenten. SQUIRREL kombiniert Oberflächen- und Pharmakophoreigenschaften bioaktiver Substanzen und kann im virtuellen Screening und fragment-basierten de novo Design eingesetzt werden. In einer prospektiven Studie wurde SQUIRREL verwendet, um neue selektive PPARalpha-Agonisten aus einer kommerziellen Moleküldatenbank zu identifizieren. Die Software lieferte eine potente Substanz (EC50 = 44 nM) mit über 100facher Selektivität gegenüber PPARgamma. In einer zweiten Studie wurde eine Leitstruktur de novo generiert und synthetisiert. Als Ausgangstruktur diente der bekannte PPARalpha-Agonist GW590735. Während des Designvorgangs wurden zwei Teilstrukturen, die für die Aktivität von GW590735 verantwortlich sind, durch bioisostere Gruppen ersetzt, die von SQUIRRELnovo vorgeschlagen wurden. Die neue Leitstruktur aktiviert PPARalpha in einem zellbasierten Reportergen-Testsystem bei einem EC50 von 0.51 µM.
Diese Arbeit beschreibt wie mit physikalischen Methoden die Glukosekonzentration gemessen werden kann. Die Infrarot-Spektroskopie bietet eine Möglichkeit da die Energie der meisten Molekülschwingungen Photonenenergien im infraroten Spektralbereich entspricht. Hier zeigen Glukosemoleküle charakteristische Absorptionsspektren, die mit spektroskopischen Methoden gemessen werden. Um nicht invasiv zu messen, wurde eine photoakustische Messmethode gewählt. Die Grundidee ist, dass die durch Licht angeregten Moleküle ihre Anregungsenergie teilweise in Form von Wärme abgeben. Da die anregende Strahlung intensitätsmoduliert ist, wird auch die Wärmeentwicklung periodisch verlaufen wodurch periodische Volumenänderungen hervorgerufen werden, die eine Druckwelle erzeugen, die sich durch empfindliche Mikrofone oder Schallwandler erfassen lässt. So kann im MIR auf Grund der hohen Spezifizität, der Glukosegehalt mit sehr hoher Genauigkeit bestimmt werden. Die Wellenlänge der Glukoseabsorptionsbanden im MIR Bereich sind im Wesentlichen gekoppelte C=O Streck- und O–H Biegeschwingungen. Im MIR-Bereich zeigen Spektren zwischen 8,3µm bis 11,1µm fünf glukoserelevanten Banden. Der photoakustische Effekt wird durch die Rosencwaig-Gersho Theorie beschrieben. Die Absorption des Lichtes in der Probe bewirkt eine Temperaturerhöhung, die als Wärme an Umgebung abgegeben wird. Da das eingestrahlte Licht gepulst ist, wird auch die Wärme periodisch abgegeben. Durch die Absorption eines Laserpulses in der Haut entsteht ein Temperaturgradient, die abhängig vom Absorptionskoeffizienten und der Glukosekonzentration ist. Der führt zu einer Diffusion von Wärme im Absorptionsvolumen. Die Hautoberfläche und damit eine dünne Luftschicht über der Hautoberfläche werden durch die Diffusionswärme periodisch mit der Modulationsfrequenz der Laser aufgeheizt, was als Druckschwankungen in Messkammer mit Mikrofon detektiert wird. Im Mitteinfrarot geben Quantenkaskadenlaser die beste Lichtquelle, wegen ihre gute Strahlqualität und hohe optische Leistung. Die verwendete photoakustische(PA) Resonanzzelle ist nach dem Prinzip des Helmholtz-Resonators konzipiert. Der Vorteil des Verstärkungsverhaltens einer resonanten PA-Zelle kann unter Umständen durch Verwendung Volumenreduzierten und mit empfindlichen Mikrofonen ausgestatteten nicht-resonanten PA-Zelle erreicht werde. Zum Erfassung der PA Signale wird eine Kombination aus einen Analog-Digital Wandlerkarte verwendet, die eine gemeinsame Zeitbasis mit der synchronen Lasersteuerung und der Datenerfassung liefert und phasenechte Fourieranalyse der photoakustischen Signale ermöglicht. Es wurde ein Modellsystem entwickelt um photoakustischen Glukosemessungen in vitro zu testen. Dieses „Phantommodell“ besteht aus einer dünnen Polymermembran befestigt in eine Gefäß von nur paar ml Volumen die mit verschiedenen Glukosekonzentrationen gefüllt wurde. Die modulierte Laserstrahlung passiert die Messzelle und dringt durch die Folie in die wässerige Glukoselösung ein. Das Folienmaterial und Dicke wurde so gewählt, dass keineAbsorption im verwendeten MIR-Bereich entsteht. Als Lösung für die jeweiligen Glukosekonzentrationen wurde ein Wasser-Albumin Gemisch verwendet mit einen 10%igen Albuminanteil, die verwendet wurde, um den Proteingehalt der Haut zu imitieren und zu zeigen, dass Eiweiß keinen Störeinfluss im Glukosefingerprintbereich hat. Messungen wurden bei steigenden und fallenden Glukosekonzentration durchgeführt damit gezeigt könnte, dass das Messsignal in der PA- Zelle nicht von der Lufterwärmung in der Zelle stammt, sondern vom PA-Signale der Glukose. Die Glukoseschwankungen in der extrazellulären Flüssigkeit der Epidermis spiegeln die Glukoseschwankungen im Blut gut wider, bei einer Messung am Arm entsteht eine Verzögerung von paar Minuten. Im Daumenballenbereich findet aufgrund der guten Durchblutung ein schneller Austausch der Glukosekonzentration der von uns gemessenen interstitiellen Flüssigkeit mit der Blutzuckerkonzentration statt. Deshalb wurden die in-vivo Messungen am Daumenballen durchgeführt. Das Stratum spinosum ist für uns von Bedeutung, da dies das interstitielle Wasser enthält, in dem der Glukosegehalt mit dem Glukosegehalt im Blut gut übereinstimmt. Die photoakustische Messmethode wird nicht-invasiv durchgeführt. Probanden wird Zucker verabreichet und danach in Abständen von 5 Minuten der Blutzucker konventionell bestimmt und gleichzeitig mittels der photoakustischen Messung am Daumenballen durchgeführt. Mit diesen Daten kann die Korrelation zwischen beiden Methoden bestimmt werden. In vielen in vivo Messreihen zeigen sich bereits in direkter Korrelation zu invasiv genommenen Blutzuckerwerten Korrelationskoeffizienten bis zu R=0,8 und eine damit deutliche Evidenz für einen glukoserelevanten Effekt. Trotz der versprechenden Ergebnisse wird deutlich, dass weitere Entwicklungen notwendig sind, damit das System zu einer direkten Konkurrenz zu der vorhandenen invasiven Meßsystemen werden kann.
Genetic analysis of salt adaptation in Methanosarcina mazei Gö1 : the role of abl, ota and otb genes
(2008)
1. M. mazei ist ein halotolerantes methanogenes Archäon und akkumuliert kompatible Solute als längerfristige Anpassung an erhöhte Osmolarität in der Umgebung. Bei intermediären Salzkonzentrationen (~ 400 mM NaCl) wird vorzugsweise α-Glutamat gebildet und bei höheren Salzkonzentrationen (~ 800 mM NaCl) wird Nε-Acetyl-ß-Lysin zusätzlich zu Alpha-Glutamat synthetisiert. 2. Eine Analyse der intrazellulären Solutezusammensetzung mittels NMR ergab, dass M. mazei Glycin-Betain als Osmolyt akkumulieren kann. Für die Aufnahme von Glycin-Betain konnten zwei putative Glycin-Betain-Transporter in M. mazei identifiziert werden, Ota und Otb. Ota steht für „osmoprotectant transporter A“ und Otb für „osmoprotectant transporter B“. Das Genom von M. mazei wurde, nachdem es vollstänidg sequenziert war, nach Genen durchsucht, die eine Rolle bei der Aufnhame von Glycin-Betain oder anderen kompabtiblen Solute spielen könnten. Dafür wurde die Sequenz eines Substratbindeproteins eines bekannten bakteriellen Glycin-Betain-Transporters, opuAC aus B. subtillis als Referenzsequenz verwendet. Hierbei konnte ein Homolog, otaC, in M. mazei identifiziert werden. otaC ist Teil eines Genclusters, welches für einen ABC-Transporter kodiert. otb wurde bei einer genomweiten Expressionsanalyse zur Salzadaptation von M. mazei identifiziert. Es wurden Gene eines putativen ABC-Transporters identifiziert, die unter Hochsalzbedingungen leicht induziert waren. Es stellte sich heraus, dass es sich hierbei um einen zweiten putativen Glycin-Betain-Transporter handelte. Otb gehört auch zur Familie der ABC-Transporter. Vergleichsanalysen zeigten, dass die beiden Transporter keine große Ähnlichkeit zueinander aufweisen. Die Funktion und Rolle der beiden ABC-Transporter, vor allem von Otb, war zu Beginn dieser Arbeit unklar. 3. Bei Analysen des intrazellulären Solutepools im Wildtyp von M. mazei stellte sich heraus, dass in Anwesenheit von Glycin-Betain die Konzentration von Glutamat und NE- Acetyl-ß-Lysin verringert war. Bei 400 mM NaCl reduzierte Glycin-Betain die Glutamat- Konzentration um 16% und bei 800 mM NaCl um 29%. Besonders deutlich zeigte sich der Einfluß von Glycin-Betain bei der Akkumulation von NE-Acetyl-ß-Lysin. Bei 400 mM NaCl reduzierte Glycin-Betain die Konzentration an NE-Acetyl-ß-Lysin um 60% und bei 800 mM NaCl um 50%. Der Einfluß von Glycin-Betain konnte auf verschiedenen Ebenen in M. mazei beobachten werden. Es konnte gezeigt werden, dass die relative Transkriptimenge von ota unter Hochsalzbedingungen zunimmt. Glycin-Betain reduzierte die Transkription von ota bei verschiedenen Salzkonzentrationen. Die relative Transkriptmenge an mRNA von ota wurde mittels quantitativer real-time PCR (qRT-PCR) quantifiziert und war bis zu 52% reduziert in Zellen, die in Gegenwart von Glycin-Betain gewachsen waren. Die Transkriptmenge von otb war unter den gleichen Bedingungen nicht beeinflusst und zeigte generell keine Zunahme mit der Salinität des Mediums. Des Weiteren konnte ein Effekt von Glycin-Betain auf Ebene der Transportaktivität von Ota gezeigt werden. Hier zeigte sich, dass Zellen, die bei 400 mM NaCl in Gegenwart von Glycin-Betain gezogen waren, eine geringere Transportaktivität aufweisen, als Zellen, die bei 400 mM NaCl ohne Glycin-Betain gewachsen waren. Die Transportaktivität war um 90% geringer. Es muss jedoch berücksichtigt werden, dass es sich bei den Zellen, die ohne Glycin-Betain gewachsen waren, um eine Nettoaufnahme von Glycin-Betain handelte. Im Gegensatz dazu, ist davon auszugehen, dass Zellen, die in Gegenwart von Glycin-Betain gewachsen waren, eine Austaschreaktion zwischen bereits vorhandenem intrazellulärem und extrazellulär angebotenem Glycin-Betain vornehmen. [Die dem letzten Punkt zugrundeliegenden Daten wurden von Silke Schmidt im Rahmen einer Diplomarbeit erhoben, die von mir mitbetreut wurde. Aus Gründen der vollständigen Darstellung des Projektverlaufes werden diese Daten mitaufgeführt.] 4. Zur weiteren Klärung der Rolle und Funktion der beiden putativen Glycin-Betain- Transporter Ota und Otb war es Ziel, Mutantenstudien durchzuführen. Eine Vorraussetzung für die Generierung von Mutanten ist, dass der Organismus auf Agarplatten wächst und Einzelkolonien von einer einzelnen Zelle ausgehend bildet. Dies ist ein wichtiger Punkt bei Methanosarcina spp., die Zellpakete, sogenannte Sarcinen bilden. Deshalb wurde zunächst nach den optimalsten Plattierungsbedingungen gesucht, unter denen M. mazei keine Sarcinen bildet und die Plattierungseffizienz am höchsten war. Die Plattierungseffizienz betrug im Durchschnitt 54%. Für das Einbringen von DNA in die Zellen wurde eine Liposomen-vermittelte Transformation getestet. Ein ähnliches Vorgehen war bereits für Methanosarcina acetivorans beschrieben, konnte bislang aber noch nicht erfolgreich für M. mazei Gö1 und andere Stämme von M. mazei angwendet werden. Erste Schritte zur Anpassung des Transformations-Protokolles beinhalteten das Testen von DOTAP verschiedener Hersteller, sowie die Konzentration an eingesetzter DNA. Das jeweilige Zielgen/Zieloperon, welches deletiert werden sollte, wurde durch eine pac-Kassette ersetzt. Diese kodiert für eine Puromycin-Transacetylase und verleiht dem Organismus Puromycin- Resistenz. Die pac-Kassette wurde von umgebenden Bereichen des Ziellocus flankiert und integrierte mit Hilfe dieser flankierenden Bereiche über doppelt-homologe Rekombination in das Genom. 5. Mit dem oben beschriebenen Verfahren wurden ota::pac- und otb::pac-Mutanten erzeugt und über Southern-Blot Analyse verifiziert. Eine erste Charakterisierung der Mutanten mittels qRT-PCR zeigte, dass auf mRNA-Ebene keine Transkripte von ota in M. mazei ota::pac oder otb in M. mazei otb::pac nachweisbar waren. Zusätzlich konnte auf Proteinebene das Substratbindeprotein OtaC in M. mazei ota::pac und OtbC in M. mazei otb::pac nicht über einen Antikörper gegen das jeweilige Substratbindeprotein nachgewiesen, was die erfolgreiche Deletion bestätigte. Erste phänotypische Charakterisierungen zeigten, dass das Wachstum von M. mazei ota::pac und M. mazei otb::pac unter Hochsalzbedingungen nicht beeinträchtigt und vergleichbar mit dem des Wildtyps war. Auch bei kälteren Wachstumstemperaturen von 22°C wuchsen die Mutanten ohne Phänotyp. 6. Radioaktive Transportstudien mit M. mazei otb::pac zeigten, dass diese Mutante, die noch ein funktionelles Ota besitzt, [14C]Glycin-Betain aufnehmen kann. Es stellte sich heraus, dass diese Mutante eine höhere Transportrate für Glycin-Betain aufwies, als der Wildtyp. Die Aufnahmerate war um einen Faktor 2 höher als beim Wildtyp. Zusätzlich konnten qRT-PCR Analysen zeigen, dass die relative Transkriptmenge an ota in der otb::pac-Mutante um einen Faktor 2 höher war, als im Wildtyp. Umgekehrt konnte dieser Effekt nicht beobachtet werden, d.h. eine erhöhte Transkriptmenge an otb in M. mazei ota::pac. Auf Proteinebene konnte beobachtet werden, dass die intrazelluläre Konzentration an OtaC in der Mutatne leicht höher war als im Wildtyp. Jedoch stellte sich heraus, dass die intrazelluläre Glycin-Betain-Konzentration bei 400 mM NaCl in der Mutante nicht erhöht war verglichen mit Wildtyp, sondern die Konzentrationen gleich waren. Bei höheren Salzkonzentrationen (800 mM NaCl) zeigte sich jedoch ein anderes Bild: die intrazelluläre Glycin-Betain-Konzentration war in der Mutante um 60% erhöht. Dies könnte auf die erhöhte Transportaktivität von M. mazei otb::pac zurückzuführen sein. Die Konzentration anderer kompatibler Solute wie Glutamat und NE-Acetyl-ß-Lysin waren in diesen Zellen bis zu 48% reduziert. In vorherigen Studien konnte gezeigt werden, dass heterolog überproduziertes Ota von M. mazei in E. coli MKH13, eine E. coli-Mutante, die keine Glycin-Betain-Transporter mehr besitzt, die Aufnahme von Glycin-Betain wieder herstellen konnte [die Daten von ota in E. coli MKH13 wurden in der bereits oben erwähnten Diplomarbeit von Silke Schmidt erhoben]. Zur Klärung der Funktion von Otb wurde der gleiche Versuch mit otb in E. coli MKH13 durchgeführt. Jedoch konnte eine heterologe Produktion von Otb aus M. mazei die Aufnahme von Glycin-Betain in E. coli MKH13 nicht wieder herstellen. Hierbei wurde über Western-Blot Analyse sichergestellt, dass Otb tatsächlich in der Membran vorhanden war. Auch Transportstudien mit der Mutante M. mazei ota::pac zeigten, dass diese Mutante kein [14C]Glycin-Betain mehr aufnehmen konnte. Es konnte auch keine Akkumulation von Glycin-Betain mittels NMR in dieser Mutante gemessen werden. Des Weiteren zeigte sich, dass die intrazellulären Konzentrationen an Glutamat und Nε-Acetyl-ß-Lysin bei 400 mM und 800 mM NaCl in der Mutante unbeeinflusst von der Glycin-Betain-Konzentration im Medium waren. Weitere Transportstudien mit M. mazei ota::pac zur Aufnahme von [14C]Cholin zeigten, dass dieses Molekül weder vom Wildtyp, noch von der Mutante aufgenommen wurde. Dieses Ergebnis wurde durch Messung des Solutepools mittels NMR bestätigt. Somit kann ausgeschlossen werden, dass Otb unter den gemessenen Bedingungen weder ein Glycin- Betain-Transporter noch ein Cholin-Transporter in M. mazei ist. Diese Beobachtungen belegen eindeutig, dass Ota der einzige funktionelle Glycin-Betain-Transporter in M. mazei ist, während die Rolle von Otb bislang noch ungeklärt ist. 7. Nε-Acetyl-ß-Lysin, das dominante kompatible Solut in M. mazei bei 800 mM NaCl, wird durch die Enzyme AblA, einer Lysin-2,3-Aminomutase und AblB, einer ß-Lysin- Acetyltransferase synthetisiert. In dieser Arbeit wurde eine Δabl::pac-Mutante generiert, um die Fragen zu klären, ob die beiden Enzyme vom postulierten abl-Operon kodiert werden und wenn ja, welchen Phänotyp eine Nε-Acetyl-ß-Lysin-freier-Mutante bei Salzstress zeigt. NMR-Analysen zeigten, dass in der abl::pac-Mutante kein Nε-Acetyl-ß-Lysin mehr nachweisbar war. Dies belegt, dass die Gene ablA und ablB und deren Genprodukte für die Synthese von NE-Acetyl-ß-Lysin in M. mazei essentiell sind. Unter Hochsalzbedingungen ist das Wachstum von M. mazei abl::pac im Vergleich zum Wildtyp deutlich verlangsamt. Dieses Ergebnis war unerwartet, da eine abl::pac-Mutante von Methanococcus maripaludis unter Hochsalzbedingungen nicht mehr wachsen konnte. Unter Niedrigsalz und bei intermediären Salzkonzentration war das Wachstum von M. mazei abl::pac nicht eingeschränkt und verhielt sich wie der Wildtyp. In Gegenwart von Glycin-Betain akkumulierte die abl::pac-Mutante von M. mazei unter Hochsalzbedingungen 2,4 mal mehr Glycin-Betain als der Wildtyp, um das Defizit im Solutepool auszugleichen und Wachstum bei Hochsalz zu ermöglichen. Dadurch war sie in der Lage, wieder wie der Wildtyp zu wachsen. 8. Der Verlust von NE-Acetyl-ß-Lysin wurde unter Hochsalzbedingungen durch erhöhte Konzentrationen an Glutamat und einem neuen kompatiblen Solut kompensiert. NMRAnalysen zeigten, dass es sich hierbei um Alanin handelte. Bis jetzt wurde die Verwendung von Alanin als kompatibles Solut noch nie beschrieben. Um sicherzustellen, dass Alanin als kompatibles Solut in M. mazei abl::pac dient, wurde die Konzentration bei verschiedenen Salzkonzentrationen gemessen. Die Konzentration an Alanin nahm mit steigender Salzkonzentration zu. Bei 800 mM NaCl war die Konzentration 12 fach erhöht verglichen mit der Konzentration bei 400 mM NaCl. Außerdem redzierte Glycin-Betain die Alanin- Konzentration bei 800 mM NaCl um 58%. Transportexperimente zeigten, dass M. mazei kein Alanin aus dem Medium aufnehmen kann. 9. Erste Analysen möglicher Synthesewege für Alanin zeigten, dass die Alanin- Dehydrogenase nicht auf Transkriptebene unter Hochsalzbedingungen induziert war und somit keine Rolle in der Synthese von Alanin als kompatibles Solut spielen dürfte. Es könnten jedoch Aminotransferasen eine Rolle bei der Biosynthese von Alanin spielen. Des Weiteren sind die Enzyme, die für die Synthese von Glutamat als kompatibles Solut verantwortlich sind, unbekannt. Dies gilt für alle bis jetzt untersuchten Organismen, die Glutamat als kompatibles Solut nutzen. In dieser Arbeit wurde versucht, mit Hilfe der abl::pac-Mutante, die erhöhte Glutamat-Mengen zum Osmoschutz produziert, der Frage nachzugehen, welche Gene/Enzyme eine Rolle spielen könnten bei der Synthese von Glutamat als kompatibles Solut. Dazu wurden unter Hochsalzbedingungen die Transkriptmengen verschiedener Genen, die an der Glutamat-Synthese beteiligt sein könnten, in der Mutante und im Wildtyp untersucht. Hierbei zeigte sich, dass mehrere Gene verschiedener Enzyme unter Hochsalzbedingungen in der Mutante leicht induziert waren. Eines dieser Enzyme ist die Glutaminsynthetase. Dieses Enzym ist für die Umsetzung von Glutamat zu Glutamin unter Verbrauch von ATP verantwortlich. M. mazei besitzt zwei Gene, die für eine putative Gluaminsynthetase kodieren. In M. mazei abl::pac ist unter Hochsalzbedingungen das Gen glnA2 im Vergleich zum Wildtyp (4,03 ± 1,14) leicht induziert (7,63 ± 2,2). Des weiteren konnte in der Mutante eine leichte Induktion von gltB1, gltB2 und gltB3 unter Hochsalz beobachtet werden. Diese Gene kodieren für die einzelnen Domänen einer Glutamatsynthase. Diese ersten Analysen geben einen Hinweis darauf, dass die Synthese von Glutamat als kompatibles Solut über eine gekoppelte Reaktion der Glutaminsynthetase und der Glutamatsynthase verlaufen könnte.
Die vorliegende Arbeit befasst sich mit der übergeordneten Frage nach dem Einfluss der Multikollinearität bei der Spezifikation und Schätzung von latenten nichtlinearen Effekten in Strukturgleichungsmodellen. Da das Multikollinearitätsproblem in latenten nicht-linearen Strukturgleichungsmodellen bisher in der Literatur kaum Beachtung gefunden hat, wird als erstes die Frage beantwortet, welche Relevanz das Vorliegen von Multikollinearität in nichtlinearen Strukturgleichungsmodellen hat. Dabei wird aufgezeigt, dass Multikollinearität von Prädiktoren nicht nur bei linearen Strukturgleichungsmodellen ein Problem darstellt, sondern vor allem bei nicht-linearen Strukturgleichungsmodellen aufgrund des Vorhandenseins nicht-linearer Terme. Da nicht-lineare Terme untereinander in einem höheren Zusammenhang stehen können als lineare Terme eines Strukturmodells, kann es zu Scheineffekten und zu verzerrten Schätzungen der nichtlinearen Effekte kommen. Ein Teststärkeverlust tritt immer ein. Als zweites wird gezeigt, dass die am stärksten vertretene Ansatzklasse zur simultanen Schätzung von Interaktionseffekten und quadratischen Effekten, nämlich die Klasse der Produkt-Indikator-Ansätze, seit ihrer Erstpublikation durch Kenny und Judd (1984) Spezifikationsfehler aufweist, welche in ähnlicher Form auch in jüngeren Publikationen enthalten sind (z.B. bei Lee, Song & Poon, 2004). Spezifikationsfehler machen die ganze Ansatzklasse für Multikollinearität „anfällig“, so dass es theoretisch zu verzerrten Schätzungen oder Scheineffekten kommen muss. Es wird gezeigt, wie man die Spezifikationsfehler korrigieren kann, d.h. wie man die bestehenden Ansätze erweitern muss. Da die latente Prädiktorkorrelation Bestandteil der Spezifikationsfehler ist, stellt sich die Frage, wie groß die Verzerrungen sind, die sich bei der Anwendung der (unkorrigierten) Produkt-Indikator-Ansätze ergeben, wenn die Multikollinearität steigt. Um diese Frage zu beantworten, wird eine Simulationsstudie durchgeführt. Sie zeigt, dass der Zwei-Stufen-Ansatz von Ping (1996) verzerrte Schätzungen der nicht-linearen Effekte produziert. Dieser Ansatz ist ein Vertreter der Produkt-Indikator-Ansätze und enthält die besagten Spezifikationsfehler. In der Simulationsstudie wird außerdem gezeigt, dass die korrekte Erweiterung des Ansatzes von Jöreskog und Yang (1996) zu erwartungstreuen Schätzungen führt. Als drittes wird der Frage nachgegangen werden, welche theoretischen und empirischen Unterschiede zwischen den neuen verteilungsanalytischen Ansätzen LMS (Klein & Moosbrugger, 2000) und QML (Klein & Muthén, 2007), einerseits, und den klassischen Produkt-Indikator-Ansätzen, andererseits, zu erwarten sind. Dazu werden die theoretischen Eigenschaften der verteilungsanalytischen Verfahren, LMS und QML, untereinander und mit der Klasse der Produkt-Indikator-Ansätze verglichen. Ihre theoretischen Eigenschaften werden beim Vorliegen von Multikollinearität betrachtet. Illustriert werden die theoretischen Unterschiede anhand einer Simulationsstudie, die die Ansätze hinsichtlich ihrer Schätzeigenschaften bei steigender Multikollinearität miteinander vergleicht. In der Simulationsstudie werden die theoretisch herausgearbeiteten Vorteile der verteilungsanalytischen Verfahren, LMS und QML, bestätigt. In der Zusammenschau der theoretischen Überlegungen und der Ergebnisse aus den Simulationsstudien zeigt sich, dass Multikollinearität für alle Ansätze zur simultanen Schätzung multipler nicht-linearer Effekte eine Herausforderung ist. Die forschungspraktische und inhaltliche Relevanz des Multikollinearitätsproblems wird anhand eines Beispiels veranschaulicht. Für in jüngster Zeit diskutierte komplexere Modelle (z.B. moderierte Mediatormodelle) wird Multikollinearität ein Kernproblem sein, dem sich alle Ansätze werden stellen müssen oder für das neue Ansätze entwickelt werden müssen.
Die vorliegende Arbeit befasst sich mit der übergeordneten Frage nach dem Einfluss der Multikollinearität bei der Spezifikation und Schätzung von latenten nichtlinearen Effekten in Strukturgleichungsmodellen. Da das Multikollinearitätsproblem in latenten nicht-linearen Strukturgleichungsmodellen bisher in der Literatur kaum Beachtung gefunden hat, wird als erstes die Frage beantwortet, welche Relevanz das Vorliegen von Multikollinearität in nichtlinearen Strukturgleichungsmodellen hat. Dabei wird aufgezeigt, dass Multikollinearität von Prädiktoren nicht nur bei linearen Strukturgleichungsmodellen ein Problem darstellt, sondern vor allem bei nicht-linearen Strukturgleichungsmodellen aufgrund des Vorhandenseins nicht-linearer Terme. Da nicht-lineare Terme untereinander in einem höheren Zusammenhang stehen können als lineare Terme eines Strukturmodells, kann es zu Scheineffekten und zu verzerrten Schätzungen der nichtlinearen Effekte kommen. Ein Teststärkeverlust tritt immer ein. Als zweites wird gezeigt, dass die am stärksten vertretene Ansatzklasse zur simultanen Schätzung von Interaktionseffekten und quadratischen Effekten, nämlich die Klasse der Produkt-Indikator-Ansätze, seit ihrer Erstpublikation durch Kenny und Judd (1984) Spezifikationsfehler aufweist, welche in ähnlicher Form auch in jüngeren Publikationen enthalten sind (z.B. bei Lee, Song & Poon, 2004). Spezifikationsfehler machen die ganze Ansatzklasse für Multikollinearität „anfällig“, so dass es theoretisch zu verzerrten Schätzungen oder Scheineffekten kommen muss. Es wird gezeigt, wie man die Spezifikationsfehler korrigieren kann, d.h. wie man die bestehenden Ansätze erweitern muss. Da die latente Prädiktorkorrelation Bestandteil der Spezifikationsfehler ist, stellt sich die Frage, wie groß die Verzerrungen sind, die sich bei der Anwendung der (unkorrigierten) Produkt-Indikator-Ansätze ergeben, wenn die Multikollinearität steigt. Um diese Frage zu beantworten, wird eine Simulationsstudie durchgeführt. Sie zeigt, dass der Zwei-Stufen-Ansatz von Ping (1996) verzerrte Schätzungen der nicht-linearen Effekte produziert. Dieser Ansatz ist ein Vertreter der Produkt-Indikator-Ansätze und enthält die besagten Spezifikationsfehler. In der Simulationsstudie wird außerdem gezeigt, dass die korrekte Erweiterung des Ansatzes von Jöreskog und Yang (1996) zu erwartungstreuen Schätzungen führt. Als drittes wird der Frage nachgegangen werden, welche theoretischen und empirischen Unterschiede zwischen den neuen verteilungsanalytischen Ansätzen LMS (Klein & Moosbrugger, 2000) und QML (Klein & Muthén, 2007), einerseits, und den klassischen Produkt-Indikator-Ansätzen, andererseits, zu erwarten sind. Dazu werden die theoretischen Eigenschaften der verteilungsanalytischen Verfahren, LMS und QML, untereinander und mit der Klasse der Produkt-Indikator-Ansätze verglichen. Ihre theoretischen Eigenschaften werden beim Vorliegen von Multikollinearität betrachtet. Illustriert werden die theoretischen Unterschiede anhand einer Simulationsstudie, die die Ansätze hinsichtlich ihrer Schätzeigenschaften bei steigender Multikollinearität miteinander vergleicht. In der Simulationsstudie werden die theoretisch herausgearbeiteten Vorteile der verteilungsanalytischen Verfahren, LMS und QML, bestätigt. In der Zusammenschau der theoretischen Überlegungen und der Ergebnisse aus den Simulationsstudien zeigt sich, dass Multikollinearität für alle Ansätze zur simultanen Schätzung multipler nicht-linearer Effekte eine Herausforderung ist. Die forschungspraktische und inhaltliche Relevanz des Multikollinearitätsproblems wird anhand eines Beispiels veranschaulicht. Für in jüngster Zeit diskutierte komplexere Modelle (z.B. moderierte Mediatormodelle) wird Multikollinearität ein Kernproblem sein, dem sich alle Ansätze werden stellen müssen oder für das neue Ansätze entwickelt werden müssen.
Untersuchung möglicher Wege zur Präparation von Nioboxynitriden mittels thermischer Kurzzeitprozesse
(2008)
In dieser Arbeit wurden mögliche Wege zur Präparation von Nioboxynitriden mittels thermischer Kurzzeitprozesse (Rapid Thermal Processing (RTP)) in dünnen Metallfilmen untersucht. Die dafür verwendeten Nb-Filme wurden mittels Magnetronsputtern auf ein thermisch oxidiertes Siliziumsubstrat (SiO2/Si-Substrat) aufgebracht. Die SiO2-Schicht hatte eine Dicke von 100 nm und soll die unerwünschte Reaktion zwischen Si und Nb vermeiden, welche zur Bildung von Niobsiliziden bei der RTP-Temperung führen kann. Um Nioboxynitride zu präparieren wurden Nb-Filme in mehreren Schritten mittels RTP behandelt. Durch die Variation der Ansatzreihenfolge (Oxidation und Nitridierung), der Reaktionsgase (O2, N2, NH3), der Reaktionstemperatur und der Reaktionszeit sowie der Schichtdicke der Proben wurde die Möglichkeit der Bildung von Nioboxynitriden untersucht. Es stellte sich heraus, dass die Bildung von Nioboxynitriden bei der Nitridierung der Nb2O5-Filme in Ammoniak erfolgt. Die Nb2O5-Filme wurden durch die Oxidation der as-deposited Nb-Filme im molekularem Sauerstoff bei 450 °C (nach 5 min Oxidation) bzw. bei 500 °C (nach 1 min Oxidation) hergestellt. Die gebildete Nb2O5-Phase wurde dem orthorhombischen beta-Nb2O5 zugeordnet. Die Oberfläche der Nb2O5-Filme zeigte Rissbildung sowie sichtbare Delamination bzw. Ablösung der Nb-Filme vom Substrat. Dies wird durch das Stressaufkommen im Film bei der direkten Oxidation des as-deposited Films im O2-Strom erklärt. Das Stressaufkommen wird durch eine starke Ausdehnung des Kristallgitters von Niob bei der Bildung des Nb2O5 sowie durch eine hohe Oxidationsrate des as-deposited Nb-Films in O2 hervorgerufen. Das Herabsetzen der Oxidationsgeschwindigkeit verringerte den Stress zwischen dem Metall und Niobpentoxid und verbesserte die Oberflächenqualität des Films nach der Temperung. Eine Herabsetzung der Reaktionsgeschwindigkeit wurde durch die Änderung der Ansatzreihenfolge erreicht. Die Oxidation der vorher nitridierten Nb-Filme führte zu einer langsameren Bildung des Nb2O5 im Vergleich zu den Filmen, die einer direkten Oxidation im O2-Strom ausgesetzt wurden. Dies wurde durch die Barrierefunktion der bei der Nitridierung gebildeten Niobnitride gegen den eindiffundierenden Sauerstoff hervorgerufen. Bei der Oxidation wurde die Diffusion des Sauerstoffes im nitridierten Film durch den Stickstoff gehemmt, was zu einer Abnahme der Oxidationsgeschwindigkeit und somit zu einer langsameren Bildung des Nb2O5 führte. Die Oxidation der zuvor nitridierten Filme führte zu wesentlich niedrigerem Stress zwischen dem Niob und den gebildeten Oxidphasen als zwischen dem Niob und dem Niobpentoxid bei der direkten Oxidation des Niobs in molekularem Sauerstoff. Die weitere Nitridierung der Filme, bei denen bei der Oxidation der bereits nitridierten Filme die Bildung nur einer Nb2O5-Phase erfolgte, führte zur Bildung von zwei Phasen: Nb4N3 und NbxNyOz. Die Zusammensetzung des gebildeten Nioboxynitrides entspricht am wahrscheinlichsten einer Zusammensetzung von NbN0.6O0.2. Sowohl die 200 als auch 500 nm-Filme zeigten nach der dreifachen Temperung eine hohe Porosität. Die hohe Porosität der Probe wurde durch Gasbildung und -diffusion (H2, H2O) im Innern des Films bei der Temperung des Nb2O5-Films in NH3 verursacht. Die EFTEM/EELS-Untersuchungen zeigten, dass sich beim dünnen 200 nm-Film zwei ausgeprägte Zonen (an der Oberfläche – Nb4N3, im Bulk bzw. am Interface – NbxNyOz) gebildet haben. Beim 500 nm-Film zeigte sich, dass die stickstoffhaltigen sowie stickstoff- und sauerstoffhaltigen Zonen, welche entsprechend Nb4N3 und NbxNyOz zugeordnet wurden, im ganzen Film ziemlich gleichmäßig verteilt sind. Ein Hinweis auf die Bildung eines Nioboxynitrides durch die Nitridierung der unvollständig oxidierten Nb-Filme im molekularen Stickstoff wurde nicht gefunden. Bei diesen Temperungen erfolgte die Bildung von unterschiedlichen Oxid- und Nitridphasen. Es wurde festgestellt, dass die Oxidation sowie die Nitridierung der Nb-Filme zu einem texturierten Wachstum der gebildeten Phasen führten. Die SiO2-Schicht auf dem (100)-orientierten Silizium wirkte sich auf das Schichtwachstum des auf das Silizium aufgebrachten Niobs aus und beeinflusste die Kristallstruktur der entstandenen Nb-Schicht und der bei den RTP-Temperungen gebildeten Phasen. Bei dünnen Schichten, wirkt sich dieser Effekt stärker aus, da der Einfluss des Substrates mit wachsender Schichtdicke abnimmt. Die bei der Oxidation gebildeten Nioboxide stellten eine starke Diffusionsbarriere für den bei der Nitridierung eindiffundierenden Stickstoff dar, was zur Aufstauung von Stickstoff in den an der Oberfläche liegenden Filmschichten führte. Die Analyse der erhaltenen SIMS-Daten zeigte, dass bei der Nitridierung der bereits oxidierten Filme die Diffusion des Stickstoffes zwei gleichzeitig ablaufende Prozesse verursacht. Von einer Seite verdrängt der eindiffundierende Stickstoff den Sauerstoff aus dem Film. Andererseits führt die Diffusion des Stickstoffes aufgrund des Schneepflug-Effekts zur Aufstauung des Sauerstoffes in den tiefliegenden Bereichen des Films. Gleichartige Diffusionsprozesse wurden bei der Oxidation der bereits nitridierten Filme beobachtet. Die Nioboxide, welche am Interfacebereich detektiert wurden, bildeten sich durch die Reaktion zwischen Niob und dem aus der SiO2-Schicht ausdiffundierenden Sauerstoff. Die Gegenwart der schon vorhandenen Nioboxide hemmte allerdings die Ausdiffusion des Sauerstoffes aus der SiO2-Schicht des Substrates im Vergleich zu den unoxidierten Filmen.
1.) Die A1AO-ATP-Synthase wurde aus Membranen von P. furiosus unter Erhalt der Struktur isoliert. Das Enzym wurde durch PEG-Fällung, Dichtegradientenzentrifugation, Anionenaustausch-Chromatographie und Gelfiltration zur Homogenität gereinigt. 2.) Die neun aus dem Gencluster vorhergesagten Untereinheiten konnten durch Maldi-TOF-Analysen oder MS/MS identifiziert werden. Die molekulare Masse der A1AO-ATP-Synthase wurde durch LILBID-Analysen zu 730+/-10 kDa bestimmt. 3.) Die funktionelle Kopplung der A1- und AO-Domäne wurde durch Studien mit dem Inhibitor DCCD und TBT nachgewiesen. Weitere ATP-Synthase spezifische Inhibitoren wie DES, Dienestrol und Hexestrol waren in der Lage, das Enzym zu inhibieren. Die I50-Werte betrugen für DES 0,36 mM, für Dienestrol 0,52 mM und für Hexestrol 0,59 mM. 4.) Die ATPase-Aktivität war bei 100°C und pH 6 optimal. Das Enzym hydrolysierte Mg-ATP als bevorzugtes Substrat mit einer maximalen Geschwindigkeit von 1,7 U/mg und einem KM von 0,63 mM. 5.) Die ATPase-Aktivität war Na+-abhängig. Der KM-Wert betrug 0,6 mM. Li+ konnte Na+ substituieren, K+ war dazu nicht in der Lage. Die Wirkung des Inhibitors DCCD (I50 100 μM) konnte durch Zugabe von 5 mM NaCl bis zu einer Konzentration von 0,25 mM aufgehoben werden. Dies war der erste Nachweis einer Na+-abhängigen A1AO-ATP-Synthase. 6.) Das für die c-Untereinheit kodierende Gen wurde aus chromosomaler DNA amplifiziert und sequenziert. Die Genverdopplung konnte bestätigt werden, ebenso die Vorhersage nur einer Ionenbindestelle (Helix 4). Durch LILBIDAnalysen wurde eine Verdopplung der c-Untereinheit aufgrund der molekularen Masse (15,8 kDa) im gereinigten Komplex nachgewiesen. 7.) Die Bildrekonstruktion aus 7400 Einzelbildern zeigte einen Komplex aus zwei Domänen, die durch einen zentralen und zwei periphere Stiele miteinander verbunden sind. Ausgehend von den Summenbildern wurde erstmals eine D-Rekonstruktonsmappe einer A1AO-ATP-Synthase generiert, mit einer Auflösung von 23 Å. In diese 3D-Rekonstruktionsmappe wurden Untereinheiten gelöster Struktur modelliert. Mit Hilfe dieser Daten konnte die voraussichtliche Stöchiometrie der A1AO-ATP-Synthase von P. furiosus zu A3B3CDFE2H2ac10 bestimmt werden. 8.) Durch LILBID-Analysen mit erhöhter Laserintensität wurde ein Subkomplex mit einer molekularen Masse von 233-236 kDa detektiert. Biochemische Daten weisen auf einen Komplex aus einer Kopie der Untereinheit a und 10 Kopien der Untereinheit c hin. Zusammen mit der 3D-Rekonstruktion wurden unabhängige Evidenzien für einen c-Ring bestehend aus 10 Kopien des Monomers mit je 4 transmembranenen Helices und nur einer Ionenbindestelle erhalten. Dies würde eine Na+/ATP-Stöchiometrie von 3,3 ergeben und erklären, warum die A1AO-ATP-Synthase von P. furiosus trotz der V-Typ artigen c-Untereinheit ATP synthetisiert. 9.) Mit dem gereinigten Enyzm wurde eine 3D-Kristallisation durchgeführt. Die resultierenden Kristalle hatten tetraedrische Gestalt, waren 10 x 5 nm groß und wuchsen über einen Zeitraum von 30 Tagen. Die Kristalle beugten Röntgenstrahlen bis zu einer Auflösung von 15 Å. 10.) Zum Nachweis einer möglichen Na+-Abhängigkeit der ATP-Synthase von M. jannaschii wurde ein Na+-armer Puffer mit Sulfit hergestellt, da bereits eine Sulfitabhängigkeit der ATPase-Aktivität nachgewiesen wurde. Es konnte für die A1AO-ATP-Synthase keine Na+-Abhängigkeit der ATPase- Aktivität zwischen 0,07-400 mM nachgewiesen werden. 11.) Ein Subkomplex konnte durch mehrmaliges Auftauen und Einfrieren der A1AO-ATP-Synthase-haltigen Proteinlösung erhalten werden. Der Komplex enthielt die Untereinheiten ABFDacx. Die Untereinheiten C, E und H fehlten dem Komplex, was zu einem Zerfall in hydrophile und hydrophobe Domäne während der Präparation führte. Es konnten in der elektronenmikroskopischen Untersuchung nur Kopfteile detektiert werden. 12.) Die heterolog produzierte A1AO-ATP-Synthase aus M. mazei Gö1 wurde durch das Detergenz Dodecylmaltosid am besten aus der Cytoplasmamembran von E. coli solubilisiert. 13.) TBT ist ein potenter Inhibitor der heterolog produzierten A1AO-ATP-Synthase (I50=60 μM). Der Wirkort konnte durch Vergleichsmessung mit der heterolog produzierten A1-Domäne identifiziert werden. TBT interagiert mit der AODomäne archäeller ATP-Synthasen und ist daher geeignet, die Kopplung der heterolog produzierten A1AO-ATP-Synthase nachzuweisen.
By translocating proteasomal degradation products into the endoplasmic reticulum (ER) for loading of major histocompatibility complex (MHC) class I molecules, the ATP binding cassette (ABC) transporter associated with antigen processing (TAP) plays a pivotal role in the adaptive immunity against infected or malignantly transformed cells. A key question regarding the transport mechanism is how the inter-domain communication and conformational dynamics of the TAP complex are connected during the peptide transport. To identify residues involved in this processes, we evolved a Trojan horse strategy in which a small artificial protease is inserted into antigenic epitopes. After binding, the TAP backbone in contact is cleaved, allowing the peptide sensor site to be mapped by mass spectrometry. Within this study, the peptide sensor and transmission interface have been identified. This region aligns with the cytosolic loop 1 (CL1) of Sav1866 and MsbA. Based on a number of experimental data and the homology to the bacterial ABC exporter Sav1866, we constructed a 3D structural model of the core TAP complex. According to this model, the CL1 and CL2 of TAP1 are extended cytosolic loops connecting the transmembrane helices (TMH) 2 and 3, and TMH4 and 5 respectively, and contact both nucleotide binding domains (NBDs) of the opposite subunit. In contrast to exporters, the cytosolic loop (named L-loop) of BtuCD importer is much shorter, and contacts only one NBD. The data confirm that the CL1 of TAP1 functions as signal transducer in ABC exporters, because it does not interfere with substrate binding but with substrate transport. The peptide contact site identified herein is restructured during the ATP hydrolysis cycle. Importantly, TAP showed a structural change trapped in the ATP hydrolysis transition state, because direct contact between peptide and CL1 is abolished. By cysteine scanning, the most conserved residues within CL1 were identified, which disrupted the tight coupling between peptide binding and transport. Together with Val-288, these residues are essential in sensing the bound peptide and inter-domain signal transmission. To characterize the molecular architecture of CL1, a convenient and minimally perturbing approach was used, which combined cysteine substitution in the CL1 region and determination of accessibility to thiol specific compounds with different properties. These studies revealed that the N-terminal region of CL1 has a good accessibility for hydrophilic (iodoacetamidofluorescein, IAF) and amphiphilic probes (BODIPY maleimide, BM), whereas the C-terminal region is accessible for hydrophobic probe (coumarin maleimide, CM). Kinetic studies of fluorescence labeling suggest that this region displayed a different accessibility to probes when the protein undergoes distinct conformations (e. g. nucleotide free state), thereby reflecting conformational transitions. Fluorescence labeling with BM induces a lost of peptide transport, whereas the peptide binding remains unaffected. These results indicate that covalent modifications of the CL1 residues influenced the inter-domain communication between transmembrane domain (TMD) and NBD. The X-loop is a recently discovered motif in the NBD of ABC exporters, which stays in close contact to the CLs. Moreover, because the X-loop precedes the ABC signature motif, it probably responds to ATP binding and hydrolysis and may transmit conformational changes to the CLs. By substitution of the highly conserved Glu-602 of TAP2 with residues that have different chemical properties, it was shown for the first time that the X-loop is a functional important element, which plays an key role in coupling substrate binding to downstream events in the transport cycle. We further verified domain swapping in the TAP complex by cysteine cross-linking. The TAP complex can be reversibly arrested either in a binding or translocation incompetent state by cross-linking of the X-loop to CL1 or CL2, respectively. These results resolve the structural arrangement of the transmission interface and point to different functions of the cytosolic loops in substrate recognition, signaling and transport.
Basierend auf dem kognitiv-motivationalen Prozessmodell von Vollmeyer und Rheinberg (1998) werden zwei Studien vorgestellt, die sich mit dem selbst regulierten Lernen mit Multimedia im Physikunterricht beschäftigen. Das kognitiv-motivationale Prozessmodell beschreibt, wie die Eingangsmotivation über Mediatorvariablen auf die Leistung, in diesem Fall den Wissenserwerb, wirkt. Wie in früheren Studien gezeigt werden konnte, besteht die Eingangsmotivation aus vier voneinander unabhängigen Faktoren: Herausforderung, Interesse, Erfolgswahrscheinlichkeit und Misserfolgsbefürchtung. Als Mediatorvariablen wurden in beiden Studien die von Schülern verwendeten Strategien, der motivationale Zustand während des Lernens und der funktionale Zustand während des Lernens angenommen. Bei den Strategien handelt es sich genauer gesagt um das beobachtbare Verhalten der Schülers während des Lernens. Mit Motivationalem Zustand sind die gleichen Faktoren wie bei der Eingangsmotivation gemeint, nur dass jetzt die Lerner schon Erfahrung mit der Aufgabe haben. Der funktionale Zustand gibt an, wie sehr ein Lerner auf die Aufgabe konzentriert ist. Ein Konstrukt, das diesen Zustand gut beschreibt, ist Csikszentmihalyis Flow. Ziel der Pilotstudie war es, das Lernen im Schulalltag mit einem Physikprogramm am Computer zu untersuchen. Dazu wurden folgende Hypothesen aufgestellt: 1) Die Eingangsmotivation wirkt auf die Mediatoren. 2) Die Mediatoren wirken auf die Leistung. 3) Die Eingangsmotivation wirkt auf die Mediatoren und diese wiederum auf die Leistung (Prüfung des Prozessmodells). 4) Es gibt Geschlechtsunterschiede bei den Variablen: Eingangsmotivation, hier insbesonders beim Interesse, den Mediatoren und der Leistung. Schüler sollten bei allen Variablen besser abschneiden. In der Pilotstudie hatten 32 SchülerInnen einer 11. Klasse 30 Minuten Zeit, sich ein Physiklernprogramm zum Thema Drehmomente (Wünscher & Ehmke, IPN Kiel, 2002) selbständig zu erarbeiten. Neben der Eingangsmotivation vor Beginn des Lernens (FAM, Rheinberg, Vollmeyer & Burns, 2001) wurde die Motivation und Flow während des Lernens gemessen (FKS; Rheinberg, Vollmeyer & Engeser, 2003; 8 Items aus dem FAM). Die Vorgehensweise am PC wurde mit Hilfe eines Videoüberwachungsprogramms (ScreenVirtuoso) und eines Monitoringprogramms (StatWin) aufgezeichnet. Indikatoren für das Lernen waren die im Anschluss an die Bearbeitung des Lernprogramms in einem Lernfragebogen zu der Lerneinheit erzielte Punktzahl. Als Kontrollvariable wurde zu Beginn das Vorwissen erfasst. Indikatoren für die Strategien waren a) die Schnelligkeit der Bearbeitung (Anzahl der bearbeiteten Abschnitte und Bearbeitungszeit der einzelnen Abschnitte), b) die Aktivität (Mausklicks) und c) die Verwendung der Animationen (Schnelligkeit des Auffindens, Anzahl, Länge und Art und Weise der Nutzung). Die Hypothesen konnten bestätigt werden. Das kognitiv-motivationale Prozessmodell konnte in den meisten Teilen bestätigt werden: Die Eingangsmotivation, vor allem das Interesse, wirkt über Mediatoren, hier besonders über die verwendeten Strategien, auf die Leistung. Die Geschlechtsunterschiede beim Lernen mit einem Physikprogramm am PC (in der Eingangsmotivation, den Vorgehensweisen, und der gezeigten Leistung) waren stärker als erwartet zu Gunsten der Schüler. Die Geschlechtsunterschiede waren bei allen Variablen signifikant. Damit Schülerinnen in dem untersuchten Bereich zukünftig bessere Ergebnisse erzielen, könnte es hilfreich sein, ihr situationales Interesse und die Erfolgszuversicht zu erhöhen. In der Hauptstudie wurde daher der Versuch gemacht, durch eine Veränderung der Instruktion die Motivation, besonders die der Schülerinnen, beim Arbeiten mit einem Physiklernprogramm zu steigern. Hier sollten besonders zwei Faktoren der Eingangsmotivation wichtig sein. Wenn es eine Rolle spielt, für wie fähig sich ein Schüler hält, dann müsste es möglich sein, durch entsprechende Instruktionen die Erfolgswahrscheinlichkeit zu stärken und damit das Lernergebnis zu verbessern. Dies erschien im Hinblick auf die schlechte Erfolgswahrscheinlichkeit der Schülerinnen in der Pilotstudie geboten. Weiterhin wurde der Einfluss, den das Interesse auf die Leistung hat, diskutiert und entsprechend in der Hauptstudie versucht, das Interesse der Schüler zu steigern. Die Hypothesen lauteten: 1) Bei den Experimentalgruppen wird durch die Instruktion die Eingangsmotivation verändert. 2) Da der Einfluss von Vorwissen nicht auszuschließen ist, wird es kontrolliert. Es wird erwartet, dass das Vorwissen mit der Leistung signifikant korreliert. Bei den Experimentalgruppen wird mehr Vorwissen aktiviert als bei der Kontrollgruppe. 3) Durch die Manipulation sollen sich auch die Mediatoren des Lernprozesses verändern. 4) Die Leistung soll sich in Abhängigkeit von der Instruktion in den Experimentalgruppen verbessern. Der Versuchsablauf blieb im Wesentlichen unverändert. In einem 3 x 2 Design wurden 60 Schüler (30 weiblich, 30 männlich) aus der Klassenstufe 11 getestet. Es gab eine Instruktion, worin die Schülerinnen über die Bedrohung durch Geschlechtsrollenstereotype informiert wurden und gebeten wurden, dagegen an zu arbeiten. In einer zweiten Experimentalgruppe sollte das Interesse aller Probanden erhöht werden. Die Ergebnisse waren weitgehend hypothesenkonform. Es konnte gezeigt werden, dass sich mittels der Instruktion die Eingangsmotivation verbesserte und sich dadurch auch Flow-Erleben und Motivation während des Lernens erhöhten, wodurch eine bessere Leistung zustande kommen konnte. Dies ist ein Ergebnis, das für den Schulalltag von Schülern und Lehrern berücksichtigt und umgesetzt werden sollte. Lehrer sollten Schülerinnen in mathematisch-naturwissenschaftlichen Fächern auf das Geschlechtsrollenstereotyp aufmerksam machen, da dies zu besseren Strategien und Leistungen bei deren Lernen führt. Sie sollten überdies das Interesse der Schülerinnen wecken, durch Betonung der persönlichen Relevanz des Themas ebenso wie durch noch zu untersuchende andere, Interesse besser weckende Instruktionen. Allerdings war in der Hauptstudie das Interesse in der Interessegruppe nicht wie erwartet gestiegen, dagegen veränderten sich andere Faktoren der Eingangsmotivation. Die Schüler hielten einen Erfolg für wahrscheinlicher, die Schülerinnen waren ängstlicher. Dennoch verhielten sich die Schülerinnen dieser Gruppe strategisch besser und erzielten auch bessere Leistungen. Die Schüler hatten ein höheres Flow-Erleben, erzielten aber keine besseren Leistungen. In der Stereotypgruppe gab es ebenfalls signifikante Verbesserungen bei allen Prozessvariablen bei den Schülerinnen. Sie hatten erwartungsgemäß eine höhere Erfolgswahrscheinlichkeit, zeigten bessere Lernstrategien und erzielten bessere Leistungen als die Schülerinnen der Kontrollgruppe. Während in der Kontrollgruppe fast alle Geschlechtsunterschiede der Pilotstudie repliziert wurden, gab es in den Experimentalgruppen keine Geschlechtsunterschiede mehr. Insbesondere die Schülerinnen hatten von der Manipulation profitiert. Die Gründe für die Veränderungen in den Experimentalgruppen wurden diskutiert und weitere Forschungsansätze aufgeführt. Erfreulich ist, dass im Schulalltag beim Lernen mit einem Computerprogramm Flow-Erleben erzeugt werden konnte. Ebenfalls erfreulich ist, dass der Benachteiligung von Schülerinnen beim Lernen mit Physikprogrammen wirksam begegnet werden konnte. Der Lernprozess konnte ein weiteres Stück im Schulalltag erforscht werden und mit Hilfe von Monitoringprogrammen konnten objektive Indikatoren für das Vorgehen bzw. die Strategien von Schülern beim Lernen am Computer bestimmt werden. Als günstiger Strategieindikator erwies sich vor allem die Länge und Güte der Nutzung von Animationen. Das kognitiv-motivationale Prozessmodell konnte erneut bestätigt werden und sollte in weiteren Forschungen als theoretischer Hintergrund herangezogen werden.
Die genaueste Darstellung der anatomischen Verhältnisse und pathologischer Veränderungen der Prostata gelingt durch den Einsatz einer Kombination von einer Endorektal und Phased-Array-Oberflächenspule, wie sie auch für die Untersuchungen im Rahmen der vorliegenden Studie verwandt wurde (95; 96). In 70 – 80 % aller Fälle entsteht das Prostatakarzinom in der peripheren Zone (24; 33; 51; 93) und führt in der MRT zu einer charakteristischen Signalabsenkung (24). Prostatakarzinomherde von weniger als 4 mm Größe können in der MRT nicht zuverlässig erkannt werden (83), und andere Krankheitsprozesse können prostatakarzinom-ähnliche Veränderungen in der peripheren Zone hervorrufen, da sie ebenfalls zu Signalabsenkungen führen (42). In diesem Zusammenhang ist die chronische granulomatöse Prostatitis ebenso zu nennen wie BPH-Knoten in der periphere Zone oder eingeblutete bzw. narbig veränderte Bezirke bei Zustand nach Prostatabiopsie (24; 33; 42; 93). Außer in Fällen mit eindeutiger makroskopischer Kapselüberschreitung, die in der MRT relativ sicher identifiziert werden kann, bleibt die Interpretation einer signalabgesenkten Läsion in der peripheren Zone in gewissem Maße subjektiv. Ein exaktes Staging des Prostatakarzinoms ist für eine Therapieentscheidung unerlässlich, da davon abhängt, ob eine kurative radikale Prostatektomie durchgeführt werden kann oder nicht. Die Diagnose eines Prostatakarzinoms wird nach wie vor am einfachsten und kosteneffektivsten durch die Kombination von Messung des Serumwertes des Prostata-spezifischen Antigens (PSA), digitaler rektaler Untersuchung (DRE) und durch transrektalen Ultraschall (TRUS) gesteuerter Biopsie gestellt (69). Mithilfe der histologischen Untersuchung von Biopsiematerial kann sowohl die Ausdehnung des neoplastischen Prozesses als auch der Malignitätsgrad des Karzinoms durch Ermittlung des so genannten Gleason-Scores abgeschätzt werden. Im Gegensatz zu diesen klaren diagnostischen Richtlinien wird die Auswahl des Therapieverfahrens nach wie vor kontrovers diskutiert, da die Erkrankung einen langsamen, subklinischen Verlauf nehmen kann und weil keine eindeutigen Richtlinien über das dem jeweiligen Karzinomstadium angemessene Therapieverfahren existieren. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass die TRUS mit Biopsieentnahme eine Hauptrolle in der Diagnostik des Prostatakarzinoms spielt, beim lokalen Staging jedoch die MRT einen entscheidenden Beitrag zur Beantwortung der Frage leisten kann, ob ein Karzinom auf die Prostata beschränkt ist oder die Organgrenzen bereits überschritten hat. Das weitere Schicksal von Patienten mit unklarem klinischen Befund kann also wesentlich vom korrekten und rechtzeitigen Einsatz der Magnetresonanztomografie abhängen, die beim Staging des Prostatakarzinoms die höchste Genauigkeit aller Untersuchungsmodalitäten bietet, wenn sie mit hoher Bildqualität durchgeführt wird und die Befundung der Bilder durch einen erfahrenen Radiologen erfolgt. In der vorliegenden Doktorarbeit wurden die MRT-Bilder von 81 Patienten mit histologisch gesichertem Prostatakarzinom vor einer radikalen Prostatektomie retrospektiv analysiert. Bei den MRT-Bildern, die in dieser Arbeit analysiert wurden, handelte sich um die T2-gewichtete MRT-Bilder. Auf T2-gewichteten Bildern zeigt die periphere Zone ein homogen helles Signal, das mit der dünnen außen liegenden signalarmen Prostatakapsel kontrastiert. Nach innen ist eine Abgrenzung zur in gemischter Signalintensität dargestellten Pseudokapsel, der zentralen Zone und der Übergangszone möglich (33; 36; 56). Diese T2-gewichteten MRT-Bilder wurden anhand folgender MRT-Kriterien analysiert: * Obliteration des rektoprostatischen Winkels * Irregulär konturierte Kapsel * Großflächiger Kontakt des Tumors zur Prostatakapsel * Asymmetrische Darstellung des neurovaskulären Bündels Bereits in vorhergehenden Studien wurden diese MRT-Kriterien von verschiedenen Autoren untersucht, wie z. B. von Yu et al (95). In dieser Studie wurden die Obliteration des rektoprostatischen Winkels und die Asymmetrie des neurovaskulären Bündels als diejenigen Parameter identifiziert, die die größte Aussagekraft für ein extrakapsuläres Wachstum besitzen. Bei allen Patienten wurden zusätzlich die klinischen Parameter „ präoperativer PSAWert “ und „bioptischer Gleason-Score“ telefonisch von den überweisenden Urologen ermittelt und in die Gesamtanalyse mit einbezogen. Mittels ROC-Analysen wurden optimale Grenzwerte des bioptischen Gleason-Scores und des präoperativen PSA-Wertes zur Unterscheidung eines T3 von einem T2-Tumor ermittelt. Durch Berechnung einer vorwärts gerichteten logistischen Regression wurden dann diejenigen Parameter ermittelt, die einen signifikant unabhängigen Beitrag zur Vorhersage des Tumorstadiums leisten. Als Resultat unserer Arbeit konnte gezeigt werden, dass die "Obliteration des rektoprostatischen Winkels" als radiologischer Parameter und "ein bioptischer Gleason-Score" von größer oder gleich 7 signifikant unabhängige Prädiktoren eines kapsel-überschreitenden Wachstums vom Prostatakarzinom darstellen. Die übrigen von uns analysierten Parameter leisteten darüber hinaus keinen weiteren Beitrag zum präoperativen Staging. Aufgrund des Ergebnisses der vorliegenden Arbeit ist es in Zukunft möglich, das MRT-basierte Staging des Prostatakarzinoms zu standardisieren und somit robuster zu gestalten. Aufgrund der reduzierten Parameter ergibt sich zudem eine erhebliche Vereinfachung der Bildanalyse.